JP6219375B2 - 赤色および遠赤外蛍光色素を用いた生物組織の細胞レベルにおける特性評価 - Google Patents
赤色および遠赤外蛍光色素を用いた生物組織の細胞レベルにおける特性評価 Download PDFInfo
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Description
パテントブルーV、イソスルファンブルー、トルイジンブルー、ヒペリシン、インドシアニングリーン、MVAC、またはドキソルビシンから選択される蛍光色素を、生物組織に対して用いるステップと、
顕微鏡イメージングシステムを用いて生物組織の画像を形成させるステップと、を含み、
顕微鏡的線形または非線形イメージングシステムを用いることによって、生物組織の画像を形成させるステップと、を含み、
蛍光色素の蛍光は、生物組織の形態を細胞スケールにて明らかにすることを特徴とする。
CLSM:共焦点レーザー走査顕微鏡
pCLE:プローブ型共焦点レーザー内視鏡
HES:ヘマトキシリンとエオシン―サフランを用いて染色された組織学的スライド
HNSSC:頭頸部扁平上皮がん
本願開示では、すべての百分率濃度は、他に明記しない限り質量/体積(w/v)をいう。溶液は、他に明記しない限り水溶液である。
(材料)
ヒペリシンはInvitrogen社(フランス国Cergy Pontoise)から、MBはAguettant laboratory社(MB1%注入、フランス国Lyon)から、トルイジンブルー(TB)はFluka社(シグマアルドリッチ社、フランス国St Quentin Fallavier)から、パテントブルー(PB)はGuerbet社(パテントブルーVナトリウム2.5%注入、フランス国Villepinte)から、アクリフラビン塩酸塩(ACF)はシグマアルドリッチ社(フランス国St Quentin Fallavier)から、インフラシアニン(Infracyanine)25mg(ICG)はSERB Laboratoires社(フランス国パリ)から購入された。また酢酸はGyneas laboratories社(酢酸5%、フランス国Goussainville)から提供された。
Institut Gustave Roussy(フランス国Villejuif)にて扁平上皮がん(HNSCC)に対する全(咽頭)喉頭切除または口腔および顎顔面外科手術を経験した合計25人の患者が前向きプロトコルに含められた(2009年1月〜2011年4月)。施設内倫理委員会はこの研究を承認した。またインフォームド・コンセントが全患者から得られた。最大表面積が1cm3である30個の新鮮に収集された組織が、蛍光イメージングの前に病理学者によって臨床的に非腫瘍性粘膜および腫瘍組織として鑑別された。
10匹のオスのウィスター系ラット(体重350g)がJanvier社から購入された。ラットの世話および研究は、実験や他の科学目的に使用される脊椎動物の保護に対する欧州の慣習、EUの指示および動物実験法に関するフランス国の法律に従って実行された。すべての実験プロトコルは、保護委員会およびInstitut Gustave Roussyでの実験における動物の使用によって承認された。アイソレータ中の標準的なケージ中で維持されたラットは、12時間の光/暗サイクルで22〜24℃および50%湿度にて飼育された。また自由に(ad libitum)餌と水が与えられた。
(一般的なサンプル調整)
頭頸部粘膜は、角質化していることが多い。これらのケラチンの層は、色素と光が組織に拡散する際の障壁であるため、サンプルの管腔表面にてテープ剥離(3M外科手術用テープ)によって除去されてもよい。
新鮮な外科サンプルが10%アセチルシステインを用いて2分間処理された後、新鮮な8μMヒペリシン溶液を用いて37℃にて30分間インキュベートされた。
新鮮なサンプルが1%酢酸を用いてリンスされた後、1%TB(w/v)を用いて短時間染色された。蛍光色素の組織への拡散を最適化するために必要な待ち時間(最大5分間)の後、サンプルは1%酢酸にてリンスされた。
外科標本は、10%アセチルシステインを用いて2分間処理された後、0.25%MBにより短時間充填された。待ち時間(最大5分間)の後、サンプルは0.9%塩化ナトリウム溶液にてリンスされた。
外科標本は、10%アセチルシステインによって2分間処理された。その後、0.025%パテントブルー溶液中に10秒間浸された。最後に0.9%塩化ナトリウム溶液中にてリンスされた。
外科標本は、10%アセチルシステインによって2分間処理された。次に0.25mg/mlのICGによって2分間、局所的に染色された。最後に0.9%塩化ナトリウム溶液中にてリンスされた。
少数の場合には、サンプルは0.01%(w/v)アクリフラビン塩酸塩によって45秒間、追加的に染色された。次に0.9%塩化ナトリウム溶液中にて1分間リンスされた。これにより、追加的な形態の情報を得るために、トルイジンブルー−アクリフラビンおよびメチレンブルー−アクリフラビンの潜在的な組み合わせに関する議論が可能となった。
ラットにはイソフルラン(誘導用に2.5%、維持用に1.5%)の吸入によって短時間で麻酔がかけられた。次に、1.25%パテントブルー、1%トルイジンブルー、または0.25%メチレンブルーのいずれか100μLがラットの後ろ足(hindpaw)の肉球(footpad)に皮下注射されることによって、リンパ節に向かって5分間拡散された。ラットは静脈内のペントバルビタール注入によって安楽死させられた。また肉眼的に青色の外観を呈する膝窩および/または鼠径部のリンパ節が解剖された。次に、生体外のリンパ節は、共焦点レーザー走査顕微鏡およびプローブ型共焦点レーザー内視鏡(pCLE)を用いてイメージングされた。
DMI400逆転顕微鏡(Leica TCS SPE社、ドイツ国Mannheim)を用いて蛍光イメージングを行った。頭頸部組織とリンパ節は35mmマイクロディッシュに配置された(Ibidi社、フランス国Biovalley)。組織の形態と構造は、以下のレーザー線を用いて評価された:アクリフラビン塩酸塩(励起波長λex=488nm;発光波長λem=500〜600nm);ヒペリシン(励起波長λex=532nm;発光波長λem=550〜650nm);TB、MBおよびPB(λex=635nm;λem=650〜800nm)。1.1mm×1.1mmの視野に対応する10×対物レンズ(乾燥/ NA0.3)、550μm×550μmの視野を有する20×対物レンズ(乾燥/NA0.7)、または275μm×275μmの視野を有する40×対物レンズ(オイル/NA1.25)のいずれかを用いて画像が形成された。異なる組織層の細胞分布および形態をイメージングするために、5μmごとにZ系列が生成された。
SP8逆転多光子顕微鏡(Leica TCS SPE社、ドイツ国Mannheim)を用いて蛍光イメージングを行った。頭頸部組織とリンパ節は35mmマイクロディッシュに配置された(Ibidi社、フランス国Biovalley)。組織の形態と構造は、830nmにおけるパルス幅が100fs、繰り返し率(repetition rate)が80Mhzである830nmレーザー線を用いて評価された。蛍光は580〜680nmの帯域通過フィルタを通じて集められた。画像は550μm×550μmの視野に対応する20×対物レンズ(乾燥/NA0.75)を用いて取得された。異なる組織層の細胞分布および形態をイメージングするために、5μmごとにZ系列が生成された。
CLSMと多光子顕微鏡は、生体内の診断には適していないベンチトップ型(benchtop)装置である。そのため、蛍光画像が次に、マウナケアテクノロジーズ社(フランス国パリ)のご好意によって提供された繊維型イメージングシステムであるCellvizio(登録商標)を用いて追加的に記録された。Cellvizio(登録商標)は、胃腸、尿および肺の管に対してこれまで試験がうまくいっている。pCLEは、レーザー装置に接続された柔軟で繊維型のミニプローブを含む。レーザー装置には、660nm(TB、MBおよびPB励起用)または568nm(ヒペリシン励起用)にて作動する半導体レーザー、高速スキャニングレーザー(1秒あたり8〜12画像のフレーム率)、および蛍光信号を検出するための光ダイオードが備え付けられている。従来の組織病理学とは逆に、標本から得られた「最適な切片」は、横断型ではなく、組織の表面領域に対して正面を向いている(en face)。直径240μmの視野を有する共焦点ミニプローブgastroflex UHD(マウナケアテクノロジーズ社、フランス国パリ)を用いて、データが取得された。30,000本の光ファイバーから構成されるこの繊維束は、横方向の分解能が1μmであって、軸方向の分解能が10μmである。皮膚の表面下55μm〜65μmの異なる深さにて画像が取得された。興味のある所望の領域のより完全な表現を実現するために、より大きな静的な画像を生成することによって、画像の再構築はビデオモザイクソフトウェアを用いて実行された(図1)。様々な解剖学的部位に由来する上皮性悪性腫瘍および非腫瘍性粘膜において、組織の自己蛍光コントロール画像もまた記録された。
以前pCLEおよびCLSMを用いて解析されたサンプルは、頭頸部組織の場合はホルモル(formol)中に、リンパ節の場合はファインフィックス(Finefix)中に固定された後、パラフィン中に包埋され、表面粘膜に垂直となるように3μm厚にて切片化され、ヘマトキシリンとエオシン−サフラン(HES)を用いて染色された。頭頸部組織から得られた組織学的試験および蛍光画像は、頭頸部の病理学を専門とする病理学者によって読解および解釈がなされた。
(トルイジンブルーを用いた頭頸部組織イメージング)
標本の効率的な蛍光イメージングがTB染色の後に直接行われた。表面から60μm下(ガストロフレックス(gastroflex)UHDの焦点面)の至適な拡散が色素充填の15分後に観察された。
標本はMB染色の後即座にイメージングされた。色素が組織から漏れることによって、2時間の期間に蛍光強度とコントラストイメージングがしだいに減少した。
標本はPB染色の後、即座にイメージングされた。青色色素の漏出によって、コントラストイメージングの質の急速な低下(1〜2時間の期間にわたる)が観察された。図4は扁平上皮(図4(a)、図4(b))、導管化生(図4(d)、図4(e))およびHNSCC(図4(g)、図4(h))の高品質な蛍光画像を示す。またこれらの画像は、対応する従来の組織病理学的画像と比較しうる(図4(c)、図4(f)、図4(i))。非病理組織の画像は、細胞質全体でPB色素の分布を示す。がん性のサンプルでは、不均一な細胞形態が容易に識別できた。またこの形態は、核が強く染色される多数の小柱と関連していた。増大した細胞密度もまた、容易に認識された。
サンプルはヒペリシン溶液に37℃にて30分間浸けられた後にイメージングされた。細胞膜および核膜は区別できた。またこれらは細胞質における拡散性の蛍光色素分子染色に関連していた。中程度に分化した扁平上皮がんなどの腫瘍組織の場合(図5)、不均一な細胞分布が蛍光下で観察できた。
標本はICG染色の後に直ちにイメージングされた。
励起光下におけるICGの引き上げ(beaching)によって、蛍光のわずかな減衰が見られた。しかし、イメージング工程を通じて色素の漏出は観察されなかった。図10は、ICGの蛍光が細胞質の全体に分布したHNSCCの高精度蛍光画像を示す。CLSM(A)およびpCLE(B)の両方の画像に対して、細胞の形態は容易に区別できた。また、高度に分化した上皮性悪性腫瘍において、組織構造の破壊はよく観察された。
多重パラメータ(multiparametric)解析がHNSCC標本の画像の質を改善する潜在能力が評価された。上述した色素の1つを用いるだけでは、完全に詳細な組織構造は染色できないからである。まず405nmにおけるレーザー励起に続いて、組織標本の自己蛍光がTB染色またはMB染色と組み合わせられた。HNSCCサンプルがまずTBに充填されることによって、弱い蛍光の組織が境界となる不規則な小柱が強調された(図7(a))。追加的に自己蛍光信号が記録された際に、病理学者は対応するH&E領域に相関する主要な線維症を十分に認識することができた。第2の場合には、MBにより染色された高分化型HNSCCの上皮性悪性腫瘍の小葉が容易に認識された。基質特性は、自己蛍光信号に基づいてエラスチンに富む基質の画像によって補足された(図7(b))。このサンプルでは、MBによってケラチン真珠もまた染色された(黄色の矢印)。すべての画像で、自己蛍光によってもたらされた追加的な情報によって、H&E切片を用いた腫瘍組織の従来の表現に近づくことが可能となった。
我々の予備試験では、健康なリンパ節のみがイメージングされた。
本願開示では、我々は細胞レベルにおける蛍光イメージング、より具体的には、頭頸部組織のイメージングおよびリンパ節、特にセンチネルリンパ節の試験に対する新たな方法を提唱した。
Claims (1)
- 生物組織の形態の画像を生成するための方法であって、
レーザー装置を用いて、前記生物組織に導入されたインドシアニングリーンである近赤外蛍光色素の蛍光を誘導するための励起光を発するステップと、
顕微鏡イメージングシステムを用いて前記生物組織の画像を形成させるステップと、を含み、
前記画像における前記近赤外蛍光色素の蛍光は、前記生物組織の形態を細胞スケールにて明示し、前記顕微鏡イメージングシステムは、前記レーザー装置に接続された柔軟で繊維型のミニプローブを含むプローブ型共焦点レーザー内視鏡を備え、前記柔軟で繊維型のミニプローブは繊維束を含むことを特徴とする方法。
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