CN101400996B - 含有由无核血细胞制成的具核红细胞成分的基准对照组合物 - Google Patents
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Abstract
公开了一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物及其制备方法。该基准对照组合物包含由被固定的无核血细胞制成的具核红细胞成分,以及悬浮介质。该无核血细胞具有与所述血液样品中所述具核红细胞基本近似的细胞核尺寸的天然细胞尺寸。该具核红细胞成分可以由马、羊、牛、猫、犬、或猪的红细胞制成;并且基本上不含核酸。该基准对照组合物还可以包括白细胞成分、红细胞成分、血小板成分、网织红细胞成分或其组合。另外,进一步公开了使用该基准对照组合物用于在血液分析仪上测量具核红细胞的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物,并且涉及制造和使用该基准对照组合物以用于在血液分析仪上测定血样中具核红细胞的方法。
背景技术
在临床血液学上,质量对照一直是必需和常规的程序。多种类型的血细胞计数中的精确性,部分地取决于适当的对照产物的使用和使用该对照产物的方法。随着目前有许多型号的设备可用于颗粒计数,通过利用对照产物进行质量对照是必需的,因为仪器故障的可能性总是存在的。保持自动颗粒计数设备的质量对照程序的传统方法一直包括提供新鲜的人类血液作为全血标准。然而,该新鲜血液仅可用一天,因此,人们已开发出多种具有较长产物使用寿命的被制备的对照产物。
在对照产物中通常使用的颗粒类似于或者近似于准备经受分析的颗粒或细胞类型。因此,该颗粒经常被称作类似颗粒。应筛选或者设计该类似颗粒,从而使它们具有类似于仪器中的待分析颗粒或细胞的某些特征。例举的特征和参数包括:在大小、体积、表面特征、颗粒性、光散射性和荧光性等方面的相似性。
目前有多种商品化的基准对照产物可以使用,这些基准对照产物使用不同的经处理的或者被固定的人或动物血细胞作为人类血细胞的类似物。美国专利No.5,512,485(Young等)公开了一种血液学对照物,其包括数种由经处理的和被固定的动物具核红细胞制成的白细胞类似物。商业上可利用的血液学对照物还可以含有红细胞、血小板、网织红细胞和具核红细胞成分,并且它们中有许多由细胞类似物制成。
具核红细胞(NRBCs)或有核红细胞,是未成熟的红细胞。它们通常存在于骨髓,但是不存在于外周血中。然而,在某些疾病比如贫血和白血病中,具核红细胞也存在于外周血中。因此,测量NRBCs具有临床重要性。近年来,人们已报告了数种检测方法,用于测量在血液仪器上的血样中的具核红细胞。美国专利No.5,559,037(Kim等)公开了一种用于具核红细胞和白细胞的流式细胞计数分析的方法。该方法使用了荧光、低角度光散射和轴光损失测量法,以便从白色血样中辨别出NRBCs。美国专利No.5,879,900(Kim等)进一步地公开 了一种辨别NRBCs、白细胞和受损白细胞的方法,以及通过流式细胞仪提供血液样品中的白细胞差别的方法。
美国专利No.5,874,310和5,917,584(Li等)公开了一种通过测量血液样品的两个光散射信号的角度来辨别具核红细胞的方法,并且进一步公开一种通过测量光散射和直流电(DC)阻抗信号来辨别具核红细胞的方法。美国专利No.6,410,330和6,673,618(Li等)公开一种通过使用DC阻抗测量法来确定NRBC的方法。美国专利No.6,472,215(Huo等)公开了一种通过阻抗测量结合三维DC、RF和光散射测量法来辨别具核红细胞的方法。
随着具核红细胞检测方法的发展,人们已经报道了数种含有具核红细胞成分或NRBC类似物的血液学对照物。
美国专利No.6,187,590和5,858,790(Kim等)公开了一种血液学对照物,其包括由经分解的和被固定的鸟类或鱼类红细胞、或者经分解的和被固定的人类淋巴细胞制成的具核红细胞(NRBC)类似物。美国专利No.6,187,590和5,858,790进一步公开制备该NRBC类似物的方法,其使用分解试剂将鸟类或鱼类红细胞分解1~5分钟、接着用固定剂在60~70℃下固定剩余的细胞核直至10分钟。
美国专利No.6,406,915、6,403,377、6,399,388、6,221,668和6,200,500(Ryan等)公开了一种包含来源于具核鸟类血细胞的NRBC类似物的血液学对照物。该方法包括:在缓冲溶液中洗涤鸟类比如火鸡的红细胞、或者小鸡的红细胞,并用戊二醛磷酸盐溶液固定洗涤后的细胞。美国专利No.6,448,085(Wang等)公开了一种血液学对照物,其包含具核红细胞(NRBC)类似物,该类似物是被固定的商品具核小鸡红细胞。
美国专利No.6,653,137和6,723,563(Ryan)公开了制备用于血液学对照物的具核红细胞成分的方法,其通过固定化含有细胞核的血细胞来实现;或者通过从具核血细胞中分解和除去细胞质但保留在细胞核周围的细胞膜的通常结构、然后固定该经处理的具核血细胞来实现。
所有上述参考文献皆公开了使用具核红细胞以便制备具核红细胞成分的技术,该具核红细胞成分用于测量血液样品中具核红细胞所用的基准对照物。
美国专利申请公开No.2005/0136409(Jacobs等)公开了一种含有具核红细胞成分的血液学对照物,及其制备方法。该对照物包括颗粒,比如未固定的马、羊或牛的细胞,该颗粒具有附着于颗粒表面的核酸(DNA或RNA)用于模拟具核红细胞。该方法公开了将RNA共价交联于未固定的红细胞表面,其中该红细胞可以是具核细胞也可以是无核细胞。该覆盖有RNA的无核红细胞可以用于使用荧光测量法的具核红细胞的测量。Jacobs等还公开了,由 覆盖有RNA的马红细胞制成的NRBC类似物可以通过阻抗测量法和光散射测量法来进行测量。
此外,某些无核的红细胞,比如人类、火鸡和鲨鱼红细胞,已经被用于制备用于血液学基准对照物的白细胞亚群,如美国专利No.4,704,364所述。
人们期望能够使用较宽范围的血细胞来源以便用于制备NRBC类似物,尤其使用那些易于获得的无核血细胞。
发明内容
一方面,本发明的目的在于提供一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物,其包括:由用于模拟血样中具核红细胞的被固定的无核血细胞所制成的具核红细胞成分;以及适合将该成分递送至血液分析仪用于测量该具核红细胞的悬浮介质。该无核血细胞具有与待测量的血液样品中的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸。适合本发明目的的无核血细胞包括马、羊、牛、猫、犬、猪的红细胞或其组合物。另外,该具核红细胞成分是基本上不含核酸。
此外,该基准对照组合物可以进一步包含白细胞、红细胞、血小板和网织红细胞成分。[017]另一方面,本发明的目的在于提供一种制造含有具核红细胞成分的基准对照组合物的方法。该方法包括如下步骤:提供具有与待测量的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸的无核血细胞;用固定介质固定无核血细胞;并且在悬浮液介质中悬浮被固定的无核血细胞,从而形成基准对照组合物。该方法可以进一步包括:在固定之前,用球形化试剂接触该无核血细胞接触以使该无核血细胞球形化。
另一个方面,本发明的目的在于提供一种使用该基准对照组合物以用于测量具核红细胞的方法。该方法包括下述步骤:提供含有具核红细胞成分的基准对照组合物,所述成分由用于模拟待测量的血样中具核红细胞的被固定的无核血细胞所制成;提供适合于测量血样中具核红细胞的血液分析仪;在血液分析仪上分析该基准对照组合物,并且测量具核红细胞成分;以及报告在基准对照组合物中的具核红细胞成分。在此,具核红细胞成分的测量可以通过下述测量法进行:测量DC阻抗信号;测量两个角度的光散射信号;测量DC阻抗和光散射信号;测量轴向光损失和DC阻抗信号;或者测量轴向光损失和光散射信号。两个角度的光散射信号可以皆为在小于10°下检测的低角度光散射信号,或者一个是低角度光散射信号而一个是中等角度光散射信号或直角光散射信号。另外,具核红细胞成分的测量可以通过下述 测量法而进行:测量第一等分血样的第一DC阻抗信号,并测量第二等分血样的第二DC阻抗信号、射频阻抗信号、以及光散射信号。
附图说明
图1A显示了根据实施例3中描述的程序分析的正常血样的DC直方图。
图1B显示了根据实施例3中描述的程序分析的与图1A中所示相同的血样的DC对RLS分布图。
图2A显示了根据实施例3中描述的程序分析的含有27NRBC/100WBC的临床样品DC直方图。
图2B显示了根据实施例3中描述的程序分析的图2A中所示临床样品的DC对RLS分布图。
图3A显示了根据实施例3中描述的程序分析的实施例3基准对照组合物的DC直方图。
图3B显示了根据实施例3中描述的程序分析的与图3A中所示相同的基准对照组合物的DC对RLS分布图。
具体实施方式
本发明的一个方面在于提供一种含有具核红细胞(NRBC)成分的基准对照组合物,并且提供一种制备具核红细胞成分和该基准对照组合物的方法。
更具体地说,在本发明的一种实施方式中,基准对照组合物包括:由用于模拟血样中具核红细胞的被固定的无核血细胞所制成的具核红细胞成分;以及一种适合将该成分递送至血液分析仪用于测量该具核红细胞的悬浮介质。为本发明的目的,该具核红细胞成分、以及其他细胞类型成分,也被称作类似物,例如,NRBC类似物。
合适的无核血细胞应具有与待模拟的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸。一旦经过在下文中描述的方法处理,可以进一步调节无核血细胞的尺寸以模拟具核红细胞。适合模拟具核红细胞的无核红细胞包括来自不同动物的无核红细胞,包括但不限于来自马、羊、牛、猫、犬、猪的红细胞或其组合物。
在血液分析仪上,血样中具核红细胞通常与白细胞在分解条件下一起被测量。将血液样品与分解试剂混合,以分解足够的成熟红细胞。在分解条件下,该成熟红细胞被完全分解;同时具核红细胞的细胞膜被破坏,并且细胞质基本上被释放。通过多种已知的检测方法测量 具核红细胞的剩余部分,其主要是细胞核和取决于所使用的分解试剂而可能被破坏的细胞膜。在该阶段,具核红细胞的尺寸基本上是细胞核的尺寸。
通过在等渗血液稀释剂中悬浮细胞,并且通过直流(DC)阻抗测量细胞、或低角度光散射测量细胞,可以在血液分析仪上测定无核血细胞的天然细胞尺寸。在此使用的术语“天然细胞尺寸”,指的是除了在血液采集期间与抗凝血剂接触、以及在测量期间与等渗稀释剂接触之外没有经过体外处理的基本上呈自然状态的细胞尺寸。
由无核血细胞制成的具核红细胞成分可以通过下述步骤制备:
(1)收集一定量的全血,其含有具有与待模拟的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸的无核红细胞;
(2)通过离心,将无核红细胞与其他的细胞成分(包括白细胞、血小板和血浆)分离开来;
(3)用洗涤溶液洗涤叠集的细胞;
(4)用固定介质固定无核血细胞;
(5)用洗液洗涤被固定的无核血细胞;以及
(6)在合适的悬浮介质中悬浮被固定的无核血细胞,从而形成用于在血液分析仪上进行分析的基准对照组合物。
一种合适的洗液是磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)。也可以使用已为本领域技术人员所熟知的其他洗液。另外,在固定之前,可以在该洗液中添加球形化试剂,用于使无核血细胞球形化。作为另一种选择,在固定之前,可以用单独的球形化试剂处理洗涤后的血细胞。合适的球形化试剂的例子包括但不限于:阴离子表面活性剂,其包括:全氟烷基羧酸铵(可在市场上买到的例如FluoradTM FC-143,3M公司,St Paul,美国明尼苏达州)、月桂酰十四酰乳酸钠(可在市场上买到的例如PationicTM138C,RITA公司,Woodstock,伊利诺斯州);非离子型表面活性剂,其包括:十二烷基-β-D-麦芽糖苷、N,N-二(3-D-葡糖酰氨基丙基)胆酰胺、聚氧化丙烯-聚氧化乙烯嵌段共聚物、N-十四烷基-β-D-麦芽糖苷、癸酰基-N-甲基-葡糖酰胺、N-十二烷基-β-D-吡喃型葡糖苷、N-癸基-β-D-吡喃型葡糖苷、硬脂酸聚乙二醇酯、乙氧基化椰油单甘油酯、辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇、乙氧基化辛基苯酚、以及直链醇;或者阳离子表面活性剂,其包括:椰油羟乙基咪唑啉、十二烷基三甲基氯化铵、癸基三甲基溴化铵、辛基三甲基溴化铵;或者两性离子表面活性剂,其包括:十二酰胺丙基甜菜碱、N-十四烷基-N,N-二甲基3-氨合-1-丙烷磺酸盐、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨合-1-丙烷磺酸盐、 椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺磺化甜菜碱、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-氨合-1-丙烷磺酸盐以及N-十四烷基-N,N-二甲基-3-氨合-1-丙烷磺酸盐。
该固定介质包括固定剂和用于为固定介质提供适当渗透性的渗透性调节剂。基于所用的特定无核血细胞和类似物的所需性能,测定固定介质的渗透性。渗透性调节剂合适的例子包括但不限于碱金属磷酸盐、碱金属氯化物和碱金属硫酸盐。固定剂包括但不限于醛类、恶唑烷、醇类、环状脲或其组合物。合适的例子包括但不限于:甲醛,多聚甲醛,戊二醛,二偶氮烷基脲(DU),咪唑烷基脲(IDU),二羟甲基脲,二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲,2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇,5-羟甲基-1-氮杂-3,7-二氧杂双环(3.3.0)辛烷,5-羟基多亚甲基氧基-甲基-1-氮杂-3,7-二氧杂双环(3.3.0)辛烷,羟甲基氨基乙酸钠,及其混合物。在一种优选实施方式中,使用醛类固定剂比如多聚甲醛、甲醛、戊二醛、或其组合物。在固定介质中,该醛类固定剂的浓度可以约0.1%~2.0%。
如果该无核红细胞的天然细胞尺寸大于待模拟的具核红细胞细胞核的尺寸,则该固定介质具有比等渗的天然细胞环境更高的渗透性,从而在固定处理期间缩小细胞尺寸,并且得到尺寸极类似待模拟的具核红细胞的细胞核尺寸的NRBC类似物。相反,如果无核红细胞的天然细胞尺寸小于待模拟的具核红细胞细胞核的尺寸,该固定介质具有比等渗天然细胞环境更低的渗透性,从而在固定处理期间细胞尺寸会增大,并且得到尺寸极类似待模拟的具核红细胞的细胞核尺寸的NRBC类似物。
该固定处理可以进行约4~24小时。典型地,该无核红细胞在该固定介质中轻轻搅拌下培育约10~16小时。
悬浮介质的一个合适例子包括磷酸盐缓冲盐水溶液和血浆物质的水溶液。按照此处的限定,血浆物质的水溶液包括血清物质、血清物质与血浆蛋白质的组合、及其混合物的水溶液。按照此处的进一步限定,血浆蛋白质包括血浆中所含的一种或多种蛋白质。优选这样的血浆蛋白包括:白蛋白、脂蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、及其混合物。这些介质可以含有其他已为本领域技术人员所熟知的成分,以使其具有长期稳定性。实施例1提供了该悬浮介质的两种示例性配方。其他合适的介质例子大多在美国专利No.4,213,876、4,299,726、4,358,394、3,873,467、4,704,364、5,320,964、5,512,485和6,569,682中进行了描述,在此将其全部内容引入本文以供参考。
实施例1示意了使用马红细胞制备NRBC类似物的示例性工艺。实施例2示意了使用羊红细胞制备NRBC类似物的示例性工艺。通过使用在此描述的工艺而生产的NRBC类似物在悬浮介质中的稳定期超过6个月。
研究发现,通过使用所述工艺固定无核动物红细胞而产生的NRBC类似物可以抗分解试剂,所述分解试剂用来制备用于在自动血液分析仪上测量白细胞和具核红细胞的血样混合物。该NRBC类似物在分解条件下基本上保持其尺寸或体积。当在样品混合物中测量时,该NRBC类似物在分解条件下会类似于血样中的具核红细胞,基本上为它们的细胞核体积。因此,应当理解,虽然NRBC类似物由无核血细胞制成,但它在测量条件下具有类似于血样中具核红细胞的某些性能。与本技术领域已知的NRBC类似物不同,本发明的NRBC类似物基本上不含核酸。一方面,由无核血细胞制成的该NRBC类似物不包含细胞核。另一方面,该NRBC类似物不包含覆盖在细胞膜表面上、或以化学方法联接细胞膜表面上、或注入细胞膜内的天然或合成的核酸。因此,优选能够通过简单的生产工艺使用足够的无核动物红细胞可以生产本发明的NRBC类似物。
在另一种实施方式中,基准对照组合物进一步包括可以模拟白细胞(WBC)的白细胞成分。在存在白细胞成分时,在NRBC成分和白细胞成分之间的比率可以用于报告每100个白细胞的NRBC数量,该数量是与在临床实验中报告血样中具核红细胞所用单位相同的单位。优选白细胞成分或其类似物具有类似于一个主要的白细胞亚群(比如粒性白细胞或淋巴细胞)的性能。
此外,该白细胞成分可以包含一种以上白细胞亚群成分或者类似物,例如,两种、三种、四种或五种白细胞亚群类似物,以便模拟白细胞亚群而用于示差分析。白细胞类似物的合适例子包括被稳定化并固定的哺乳动物白细胞、以及经处理的和/或固定的人类和动物红细胞,这已为本技术领域所熟知。在一种实施方式中,该白细胞类似物可以由经处理的鹅和鳄鱼红细胞制成,用于使用阻抗测量和光散射测量组合的示差分析,如同在美国专利No.5,320,964和5,512,485所公开的那样,在此将其全部内容引入本文以供参考。在另一个实施方式中,该白细胞类似物可以由经处理的鸟类和人红细胞制成,用于使用阻抗测量的示差分析,这在美国专利No.4,704,364中被公开,在此将其全部内容引入本文以供参考。在另一种实施方式中,该白细胞类似物可以由被固定的哺乳动物白细胞制成。在白细胞类似物的制备期间,在分解全血中的红细胞之前固定哺乳动物的白细胞。
任选地,可以通过在制备白细胞类似物的处理期间与脂蛋白相接触而进一步地处理哺乳动物白细胞和红细胞。与脂蛋白的接触可以发生在固定白细胞或红细胞之前;还可以发生在固定后以及在悬浮介质中保存期间,这在美国专利No.5,320,964、5,512,485、6,406,915、6,403,377、6,399,388、6,221,668和6,200,500中被公开,现将其全部内容引入本文作为参考。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种基准对照组合物,其包括上述具核红细胞成分、白细胞成分、以及在悬浮介质中的附加红细胞成分和血小板成分。
该红细胞成分可以是固定化的人或动物红细胞,优选固定化的人红细胞。制备红细胞成分的工艺已经在美国专利No.4,299,726和4,358,394中进行了详细描述,现将其全部内容并入本文以引为参考。血小板成分可以是固定化的人或动物血小板、或从其他细胞类型制得的血小板类似物。一个合适的例子是使用经处理的山羊红细胞作为血小板类似物,如同在美国专利No.4,264,470、4,389,490和4,405,719中公开的那样,现将其全部内容并入本文以引为参考。
类似于血样中的红细胞,基准对照组合物中固定化的人红细胞在通常用于制备测量具核红细胞和白细胞所用的血样的分解条件下被分解,并且如果适当地操作分析仪则在测量期间将不会被检测到。在分解条件下血液样品中的血小板的尺寸会减小;并且它们或者在用于具核红细胞测量的检测阈下面,或者与具核红细胞相分离。如上所述的血小板类似物在分解条件下可以模拟血液样品中血小板的效应。因此,在基准对照组合物中红细胞成分和血小板成分进一步反映了对照物组合物对于分解试剂的效应、以及在仪器上的反应条件。从而,含有红细胞和血小板成分的基准对照组合物可以进一步提供与仪器工作条件有关的信息。
此外,含有红细胞和血小板类似物的基准对照组合物还可以用于红细胞测量和血小板测量,其通常在自动血液分析仪上与白细胞和具核红细胞的测量一起进行。
任选地,基准对照组合物可以进一步包括用于网织红细胞分析的网织红细胞成分。该网织红细胞成分可以通过使用本技术领域已知的方法,例如,在美国专利No.6,399,388、6,403,377和6,406,915中所述的方法来制备,在此将其全部内容引入本文以供参考。
实施例3示意了一种基准对照组合物的制备方法,该基准对照组合物含有通过使用实施例1中所述工艺由马红细胞制成的NRBC类似物、单一群体白细胞成分、红细胞成分和血小板成分。实施例4进一步示意了一种基准对照组合物的制备方法,该基准对照组合物含有本发明的具核红细胞成分、多个白细胞亚群的类似物、红细胞成分和血小板成分。
可以利用含有本发明具核红细胞成分的基准对照组合物,用于采用多种测量方法的具核红细胞测量。实施例3示意了使用含有具核红细胞成分的基准对照组合物以用于采用DC阻抗测量法、或DC和VCS组合测量法的具核红细胞的测量的方法。在此使用的术语的“VCS测量法或者检测方法”,指的是一种三维测定技术,其测量直流(DC)和射频(RF)阻抗、以及当血细胞经过流动池时的光散射信号。该VCS检测方法已经在美国专利No.5,125,737中进行了详细描述,在此将其全部内容并入本文以作为参考。该方法通过使用DC和VCS的 组合测量法来测量具核红细胞,这已经在美国专利No.6,472,215中进行了全面描述,在此将其全部内容并入本文以作为参考。
典型地,在自动血液分析仪上,几个等分血样分别地进行处理,用于测量不同的血细胞亚群。在Coulter GEN*S或LH750血液分析仪(贝克曼考尔特公司,Fullerton,加利福尼亚),以不同的分析模式并行地分析几个等分血样。用血液稀释剂稀释第一等分血样,以形成第一样品混合物,并且通过DC阻抗测量法来测量红细胞和血小板,以得到红细胞和血小板参数。同时,将第二等分血样与血液稀释剂和第一分解试剂混合,以形成第二样品混合物,并且通过DC阻抗测量法来测量第二样品混合物,以得到白细胞数,同时将白细胞区分为三个亚群,并且分析具核红细胞。将第三等分血样与第二分解试剂混合,随后再与固定化试剂混合,从而形成第三样品混合物。将第三样品混合物输送至流动池,并且通过VCS检测方法进行测量,以将白细胞示差异分析为五个亚群,并且分析具核红细胞。
图1A和2A分别显示了从含有约27NRBC/100白细胞的第二等分正常全血样品和临床全血样品中得到的DC直方图,这在实施例3中进行了更全面的描述。如图1A和2A所示,临床血液样品中的具核红细胞在直方图的左边大部分显示出不同的峰,同时正常的血液样品在相同的区域没有细胞群。
图1B和2B显示了从在图1A和2A中所示第三等分正常血样和临床血样得到的DC对RLS分布图。如图所示,临床血样中的具核红细胞位于分布图的底部左侧,同时正常血样中在相同的区域没有明显的细胞数量。应注意,RLS是术语“旋转光散射”的缩写,其定义为中等角度光散射信号和DC阻抗信号的函数。
图3A和3B分别显示了从第二等分血样得到的DC直方图和从实施例3的第三等分的基准对照组合物得到的DC对RLS分布图。如图3A所示,由被固定的马红细胞制成的NRBC类似物位于直方图的左侧大部分,其极类似人类具核红细胞。如图3B所示,位于分布图底部左侧的NRBC类似物与人类具核红细胞处于相同区域;并且在DC直方图和DC对RLS分布图中,被固定的鹅红细胞极类似人类淋巴细胞。如图所示,实施例3的基准对照组合物可以用于单独的DC测量,也可以用于DC和VCS的组合测量。
虽然实施例3示意了采用DC和VCS测量法的基准对照组合物的应用,但因为本发明的具核红细胞成分具有极类似具核红细胞的细胞核尺寸的类似尺寸,故该基准对照组合物可以基于细胞尺寸的测量而与多种检测方法一起使用。这些测量方法包括但不限于阻抗、光散射和轴向光损失测量法。
低角度光散射和轴向光损失测量法已经用于测量具核红细胞。术语“低角度光散射”指的是在自入射光起小于10°的角度检测的光散射信号,其还通常称作正向光散射。
轴向光损失(ALL,亦称正向消光),通常由于穿过入射光束并且可通过光电探测器检测的颗粒而在光能量方面下降。当入射光光束撞击颗粒时,光或者被散射或者被吸附,两者都会从入射光中移出能量,并且入射光束被衰减。该衰减称为消光。当沿着入射光光束的轴观察时,它被称为轴向光损失。一般来讲,以从入射光起约0°~1°的角度来检测ALL信号。在本发明的一种优选实施方式中,在从入射光轴起小于约0.5°的环形区域内收集ALL信号。该ALL信号会受到细胞尺寸的强烈影响。由于轴向光损失测量法可以测量入射光光束的能量损失,而低角度光散射测量法可以测量光的增强,因此需要不同的电路用于测量这两个不同的光学特性。
在测量方法和测试设备的一个合适例子中,可以利用本发明的基准对照组合物作为用于测量具核红细胞的基准对照物,这已经在美国专利No.5,874,310和5,917,584中进行了详细描述,在此将其全部内容引入本文以供参考。更具体地讲,具核红细胞的测量是通过测量两个角度的光散射信号而进行的。在一种实施方式中,该两个角度的光散射信号都是低角度光散射信号,其检测角度是从入射光起小于10°,优选约0°至约4°。在另一个实施方式中,第一光散射信号是低角度光散射信号;而第二光散射信号是介质光散射信号或直角光散射信号。另外,具核红细胞的测量还可以通过测量光散射和DC阻抗信号来进行。
在测量方法和测试设备的另一个合适例子中,可以利用本发明的基准对照组合物作为用于测量具核红细胞的基准对照物,这已经在待审的专利申请序列号No.11/048,086和11/338,229中进行了详细描述,在此将其全部内容引入本文以供参考。更具体地讲,专利申请序列号11/048,086所述的方法可通过下述测量方法来测量具核红细胞:测量轴向光损失和低角度光散射信号;轴向光损失和DC阻抗信号;或者轴向光损失、DC阻抗和低角度光散射信号。专利申请序列号11/338,229所述的方法可通过下述测量方法来测量具核红细胞:测量轴向光损失、DC阻抗、中等角度光散射信号;轴向光损失、低角度光散射信号和中等角度光散射信号;或者轴向光损失、DC阻抗、低角度光散射信号和中等角度光散射信号。低角度光散射信号优选以约1°~7°的角度测量,而中等角度光散射信号优选以约20°~45°的角度测量。
所有已有的基准对照物都需要使用具核的血细胞来制备NRBC成分。不同于已有的用于NRBC测量的基准对照物,本发明的基准对照组合物不必使用具核血细胞。取而代之的是,可以利用那些易得到的并且充足的无核红细胞来制备NRBC成分。
实施例4显示了一种基准对照组合物,其含有NRBC成分、多个白细胞亚群类似物、红细胞成分和血小板成分。除了红细胞、血小板和NRBC测量之外,该基准对照组合物可以进一步用于白细胞的示差分析,这是通过使用VCS测量法对其五个亚群来进行的。
下述实施例用于说明本发明,而决不应解释为限制本发明的保护范围,本发明的保护范围通过权利要求书予以限定。应当理解,根据本公开,可以使用多种其它组分和比例。
实施例1
由马红细胞制成的具核红细胞组分
磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)
类似物固定介质1
悬浮液介质1
悬浮介质2
使用马红细胞制备NRBC类似物的工艺步骤:
1.在含有抗凝血剂的容器中收集50mL马的全血。将马全血离心,并且除去包含白细胞、血小板和血浆的上层。
2.用磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)洗涤叠集的马红细胞三次,并且在剩余量的PBS中再悬浮洗涤后的叠集的细胞。细胞洗涤步骤是在1200rpm下15分钟的一系列离心,接着除去上清液,并且用PBS再悬浮叠集的细胞。
3.将1mL叠集的马红细胞加入含有49mL类似物固定介质1的试管中,并且通过倒置进行较好的混合,从而形成细胞处理悬浮液。
4.将试管放置在滚筒机上,并且在室温下低速混合过夜。
5.按步骤(2)中所述,用PBS洗涤经处理的细胞三次。
6.在悬浮介质1或2中再悬浮经处理的细胞,从而形成用于在血液分析仪上进行分析的NRBC基准对照组合物。
实施例2
由羊红细胞制成的具核红细胞成分
收集50mL羊全血,并且按照与实施例1中所述相同的工艺步骤进行处理,所不同的是,在步骤3中使用如下所示的类似物固定介质2。将经处理的羊红细胞再悬浮于悬浮介质1中,从而形成另一种NRBC基准对照组合物。
类似物固定介质2
实施例3
含有具核红细胞成分、白细胞成分、以及红细胞成分和血小板成分的基准对照组合物[063]制备工序:
1.提供预定量的实施例1中的悬浮介质1。
2.将预定量的固定化人红细胞加入该介质。按照美国专利No.4,299,726和4,358,394所述的方法处理固定化人红细胞。
3.在含有固定化人红细胞的悬浮介质中加入预定量的血小板成分。该血小板成分是按照美国专利No.4,264,470、4,389,490和4,405,719中所述的方法由被固定的山羊红细胞制成的。
4.将预定量的由被固定的鹅红细胞制成的白细胞成分加入该含有固定化人红细胞和血小板成分的悬浮介质中。
5.将预定量的实施例1中被固定的马红细胞加入到含有固定化人红细胞、血小板成分和白细胞成分的悬浮介质中。
6.轻轻混合所形成的基准对照组合物。
配制红细胞、白细胞和血小板成分的细胞浓度,以便模拟人全血样品的相应细胞浓度。配制具核红细胞成分的细胞浓度,以模拟含有特定水平具核红细胞的临床样品,优选具核红细胞水平的范围为1~50NRBC/100白细胞。
在Coulter LH750血液分析仪(贝克曼考尔特公司制造,Fullerton,加利福尼亚州)上分析了由上述方法得到的基准对照组合物。该Coulter LH750血液分析仪具有:RBC槽,其采用了三个非聚焦流动光圈(non-focused flow apertures)和DC阻抗检测器,用于测量红细胞;WBC槽,采用了三个非聚焦流动光圈和DC阻抗检测器,用于测量白细胞数,并且用于将白细胞区分为三个亚群和分析具核红细胞;以及流动池,其具有VCS检测系统,用于将白细胞区分为五个亚群。该VCS检测系统可以测量DC阻抗、射频阻抗和穿过流动池的细胞的中等角度光散射信号。
通过Coulter LH750血液分析仪吸出血液样品或基准对照组合物。以6250:1的稀释比,用等渗血液稀释剂LH700Series Diluent稀释第一等分的1.6μl样品,从而形成第一样品混合物。第一样品混合物经三个一组的光圈由真空源抽出。当血细胞穿过光圈时,通过DC阻抗检测器测量每个血细胞,以得到红细胞参数。用6mL的LH700Series Diluent稀释第二等分的28μl样品,然后与1mL的第一分解试剂Lyse SIII diff混合,从而形成第二样品混合物。第二样品混合物经三个一组的光圈由真空源抽出,并且进行测量,以得到白细胞数,将白细胞区分为三个亚群并分析具核红细胞。将第三等分的34μl样品与540μl的第二分解试剂ErythrolyseII混合,以分解红细胞,并且随后与218μl的固定化试剂Stabilyse混合,从而形成第三样品混合物。将第三样品混合物供至流动池,用于将白细胞示差分析为五个亚群,并且分析具核红细胞。在约18~28℃的温度下进行测量。分析了由测量第二等分试样和测量第三等分试样得到的数据,从而报告出具核红细胞。所有上述试剂皆为贝克曼考尔特公司的产品。
图1A显示了根据如上所述程序由分析第二等分正常全血样而得到的DC直方图。如图所示,分布在0~400fL范围内的三个白细胞亚群,并且在白细胞左侧未出现细胞群。图1B显示了由第三等分相同的血液样品得到的DC对RLS分布图。如图所示,在分布图底部没有出现明显量的细胞。
图2A显示了根据如上所述程序由分析第二等分临床全血样品而得到的DC直方图,该临床全血样品含有约27NRBC/100白细胞。如图所示,在该直方图的左侧大部分,具核红细胞显示为独特的峰。图2B显示了由第三等分相同的临床样品得到的DC对RLS分布图。如图所示,具核红细胞位于该分布图的底部左侧。
图3A和3B分别是由如上所述第二和第三等分基准对照组合物得到的DC直方图和DC对RLS分布图。如图所示,在DC直方图的左侧大部分,被固定的马红细胞显示为独特的峰,并且位于DC对RLS分布图的底部左侧;因此,它们在DC和DC对RLS测量方面极 类似人类具核红细胞。另一方面,被固定的鹅红细胞类似人类淋巴细胞。
实施例4
含有NRBC成分、多个白细胞亚群类似物、红细胞成分和血小板成分的血液基准对照组合物。
用于制备这种基准对照组合物的工序与如上所述实施例3的工序基本相同,所不同的是,在步骤4中将预定量的多个白细胞亚群类似物加入到含有固定化人红细胞、血小板成分和实施例1或2中所制NRBC成分的悬浮介质内。
按照美国专利No.5,320,964和5,512,485所述工序制备多个白细胞亚群类似物。基准对照组合物的储存周期可以超过45天。
该基准对照组合物可以用于采用DC阻抗测量和VCS测量的组合测量法的具核红细胞分析,这已在美国专利No.6,472,215中进行了详细描述。
以上对本发明进行了详细描述,并且在附图上进行了图示,但不应将这些内容看作是对本发明保护范围的限制,而应视为其优选实施方式的示例。然而,很明显在上述说明书中以及附后的权利要求中所述的本发明精神和保护范围内可以做出多种改进和变化,并且它们在法律意义上讲是等价的。在本文引用的所有专利及其他公开文献并入本文以供参考。
Claims (26)
1.一种含有具核红细胞成分的基准对照组合物,其包括:
(a)由用于模拟血样中具核红细胞的经固定的无核血细胞所制成的具核红细胞成分,所述具核红细胞成分不包含覆盖在细胞膜表面上、或以化学方法联接细胞膜表面上、或注入细胞膜内的天然或合成的核酸;以及
(b)适合于将所述成分输送至血液分析仪以用于测量所述具核红细胞的悬浮介质。
2.如权利要求1所述的基准对照组合物,其特征在于,所述无核血细胞具有与所述血液样品中所述具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸。
3.如权利要求2所述的基准对照组合物,其特征在于,所述无核血细胞包括马、羊、牛、猫、犬、猪的红细胞或其组合物。
4.如权利要求2所述的基准对照组合物,其特征在于,所述经固定的无核血细胞基本上不含核酸。
5.如权利要求1所述的基准对照组合物,其特征在于,还包含白细胞成分。
6.如权利要求1所述的基准对照组合物,其特征在于,还包含红细胞成分。
7.如权利要求1所述的基准对照组合物,其特征在于,还包含血小板成分。
8.如权利要求1所述的基准对照组合物,其特征在于,还包含网织红细胞成分。
9.一种制备如权利要求1所述的基准对照组合物的方法,包括如下步骤:
a)提供无核血细胞,其具有与待测量的具核红细胞的细胞核尺寸基本近似的天然细胞尺寸;
b)用固定介质固定所述无核血细胞,所述具核红细胞成分不包含覆盖在细胞膜表面上、或以化学方法联接细胞膜表面上、或注入细胞膜内的天然或合成的核酸;以及
c)使步骤(b)中得到的经固定的无核血细胞悬浮于悬浮介质中,从而形成基准对照组合物。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述无核血细胞包括马、羊、牛、猫、犬、猪的红细胞或其组合物。
11.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述经固定的无核血细胞基本上不含核酸。
12.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述固定介质包含固定剂和渗透性调节剂。
13.如权利要求9所述的方法,其特征在于,还包括:在步骤(b)之前,用球形化试剂接触所述无核血细胞使之球形化。
14.如权利要求9所述的方法,其特征在于,还包括在所述悬浮介质中加入白细胞成分、红细胞成分、血小板成分、网织红细胞成分或其组合物。
15.一种使用如权利要求1所述的基准对照组合物的方法,包括下述步骤:
a)提供如权利要求1所述的基准对照组合物;
b)提供适合于测量血样中具核红细胞的血液分析仪;
c)在所述血液分析仪上分析所述基准对照组合物,并且测量所述具核红细胞成分;以及
d)报告所述基准对照组合物中的所述具核红细胞成分。
16.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述测量所述具核红细胞成分是通过测量DC阻抗信号来进行的。
17.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述测量所述具核红细胞成分是通过测量两个角度的光散射信号来进行的。
18.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述两个角度的光散射信号都是在小于10°的角度下检测的低角度光散射信号。
19.如权利要求17所述的方法,其特征在于,所述两个角度的光散射信号是一个低角度光散射信号、和一个中等角度光散射信号或直角光散射信号。
20.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述测量所述具核红细胞成分是通过测量DC阻抗和光散射信号来进行的。
21.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述测量所述具核红细胞成分是通过测量轴向光损失和DC阻抗信号来进行的。
22.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述测量所述具核红细胞成分是通过测量轴向光损失和光散射信号来进行的。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述光散射信号是低角度光散射信号。
24.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述光散射信号是中等角度光散射信号。
25.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述测量所述具核红细胞成分是通过下述测量法而进行:测量所述血液样品的第一等分试样的第一DC阻抗信号,测量所述血液样品的第二等分试样的第二DC阻抗信号、射频阻抗信号和光散射信号。
26.如权利要求15所述的方法,其特征在于,所述无核血细胞包括马、羊、牛、猫、犬、猪的红细胞或其组合物。
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