CN116754527A - 一种荧光原理的白细胞质控物制备方法 - Google Patents

一种荧光原理的白细胞质控物制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及血细胞分析检测技术领域，具体涉及一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，包括：利用抗凝剂获取动物血液并过滤，得到过滤血液；将过滤血液离心，得到离心液，去除离心液中的上清，取离心液中的白细胞层，得到纯化细胞；采用含有荧光增强剂的固定剂重悬固化纯白细胞，得到适用于荧光原理的全固化细胞；采用含有细胞膜保护剂的细胞保存液离心洗涤全固化细胞，直至去除全固化细胞中的固定剂，得到半成品细胞，将半成品细胞保存在细胞保存液中，得到荧光原理的白细胞模拟物；本发明利用哺乳类动物白细胞模拟荧光原理的白细胞，白细胞原料来源易得，制备方法简单，生产成本低廉，稳定性和重复性好。

Description

一种荧光原理的白细胞质控物制备方法
技术领域
本发明涉及血细胞分析检测技术领域，尤其涉及一种荧光原理的白细胞质控物制备方法。
背景技术
目前，荧光法原理的血细胞分析仪已发展成主流趋势，其中白细胞五种常见类型，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞等相关参数是中、高端血细胞分析仪所提供的重要信息，可以为某些疾病的诊断提供依据，因此研发血细胞分析仪用质控物(荧光原理)对于进一步开拓血细胞分析仪领域市场具有重要意义。
现有的同类质控物，适用的检测原理主要有电阻抗法、光散射法和荧光-散射法检测法，其中电阻抗法根据在电解质液中悬浮的细胞穿过计数小孔时所引起的电阻变化进行血细胞计数和体积的测定，根据体积大小对血细胞进行分类，其只能体现体积大小，没有细胞核信息，准确性较差；光散射法通过激发光照射细胞，得到前向散射光(FSC)、侧向散射光(SSC)反映细胞大小、表面构造、颗粒形状、核形、折射率和反射率等，随后将细胞进行分类，重复性较差；核酸荧光检测法在光散射法的基础上引入荧光染料，通过荧光染色后的侧向荧光(SFL)反映细胞内核酸和细胞器的种类和多少，三者相结合对细胞进行分类计数，其准确度高，重复性好，更适于仪器质量监控。
现有技术中有利用哺乳动物牛的中性粒细胞模拟嗜酸性粒细胞，有利用哺乳动物红细胞模拟制备五分类白细胞，有利用人类白细胞模拟制备五分类白细胞质控物，其都是适用于光散射原理检测的血细胞分析仪，且使用到人源性原料，存在潜在的生物风险，成本高；而荧光-散射法的血细胞分析仪也需要适配的质控物，目前的同类产品有希森美康质控品，其虽然是通过荧光-散射法的血细胞分析仪进行检测分析，但是质控品原料是人源性的，同样存在潜在的生物风险，而且成本高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，旨在解决现有的采用荧光原理的白细胞质控物在制备时需要采用人源性原料，导致存在生物风险，且成本高的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，包括：
利用抗凝剂获取动物血液并过滤，得到过滤血液；
将所述过滤血液离心，得到离心液，去除所述离心液中的上清，取所述离心液中的白细胞层，得到纯化细胞；
采用含有荧光增强剂的固定剂重悬固化所述纯白细胞，得到适用于荧光原理的全固化细胞；
采用含有细胞膜保护剂的细胞保存液离心洗涤所述全固化细胞，直至去除所述全固化细胞中的固定剂，得到半成品细胞，将所述半成品细胞保存在细胞保存液中，得到荧光原理的白细胞模拟物；
对所述荧光原理的白细胞模拟物进行分析，得到分析结果。
其中，所述动物血液采用哺乳动物血液制备，所述哺乳动物为猪、牛、羊、狗中的一种或几种。
其中，所述抗凝剂为Na2EDTA、K2EDTA、K3EDTA、柠檬酸、柠檬酸三钠、枸缘酸钠、草酸钠、NaCl中的一种或几种，所述抗凝剂浓度分别为0.1～30g/LNa2EDTA、0.1～30g/LK2EDTA、0.1～30g/LK3EDTA、0.1～30g/L柠檬酸、0.1～30g/L柠檬酸三钠、0.1～30g/L枸缘酸钠、0.1～25g/L草酸钠、0.1～25g/LNaCl。
其中，所述固定剂为醛类固定剂，选自甲醛、乙二醛、戊二醛、多聚甲醛中的一种或几种，所述醛类固定剂的浓度优选为0.01％～8％(W/V)。
其中，所述醛类固定剂中的所述荧光增强剂为乙酸、草酸、碳酸、磷酸、异硫酸氰胍、苯磺酸钠中的一种或几种；所述醛类固定剂中的所述荧光增强剂组分浓度分别为0.01～10％乙酸、0.01～10％草酸、0.01～10％碳酸、0.01～10％磷酸、0.01g/L～10g/L异硫酸氰胍、0.01g/L～10g/L苯磺酸钠中。
其中，所述醛类固定剂中缓冲组分为柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸、乙酸钠、碳酸、氨水、氯化铵中的一种或几种。
其中，所述醛类固定剂中糖类为蔗糖、五水棉子糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖中的一种或几种。
其中，所述细胞保存液包括柠檬酸、NaCl、KCl、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白中的一种或几种，所述细胞保存液pH为6.0～8.0，所述细胞保存液渗透压为200-600mOsm/(kg·H2O)。
其中，所述细胞保存液中细胞膜保护剂为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、二硫苏糖醇中的一种或几种；所述细胞膜保护剂浓度为0.01g/L～30g/L海藻糖、0.01g/L～20g/L葡萄糖、0.01g/L～20g/L蔗糖、0.01g/L～30g/L山梨糖醇、0.01g/L～30g/L二硫苏糖醇。
本发明的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，本发明利用哺乳类动物白细胞模拟荧光原理的白细胞，优选抗凝剂及其渗透压，调整了细胞体积，更有益于后续白细胞固定化以及白细胞分类，得到适用于荧光原理的细胞，优选固化剂以及固定剂组分中的荧光增强剂处理白细胞后可显著提高白细胞与检测时荧光染色试剂的结合能力，有益于检测时白细胞的分类，可用于模拟荧光原理的白细胞，对荧光原理的白细胞的分析测定进行准确的质量控制，通过在细胞保存液中添加细胞膜保护剂，增强了细胞稳定性，延长了质控物有效期，本发明中的白细胞原料来源易得，制备方法简单，生产成本低廉，稳定性和重复性好，便于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是未经过任何处理的人类血液检测结果图。
图2是未经过任何处理的猪血液检测结果图。
图3是本发明实施例1的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图4是本发明实施例1的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图5是本发明实施例2的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图6是本发明实施例2的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图7是本发明实施例3的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图8是本发明实施例3的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图9是本发明实施例4的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图10是本发明实施例4的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图11是本发明实施例5的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图12是本发明实施例5的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图13是本发明实施例6的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图14是本发明实施例6的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图15是本发明实施例7的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图16是本发明实施例7的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图17是本发明实施例8的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图18是本发明实施例8的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图19是本发明实施例9的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图20是本发明实施例9的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图21是本发明实施例10的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图22是本发明实施例10的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图23是本发明实施例11的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图24是本发明实施例11的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图25是本发明实施例12的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图26是本发明实施例12的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图27是本发明实施例13的荧光原理白细胞在血细胞分析仪上的检测结果图。
图28是本发明实施例13的荧光原理白细胞稳定性观察数据图。
图29是本发明的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法的流程图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
请参阅图1～图29，本发明提供一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，包括：
S1利用抗凝剂获取动物血液并过滤，得到过滤血液；
所述动物血液采用哺乳动物血液制备，所述哺乳动物为猪、牛、羊、狗中的一种或几种。所述抗凝剂为Na2EDTA、K2EDTA、K3EDTA、柠檬酸、柠檬酸三钠、枸缘酸钠、草酸钠、NaCl中的一种或几种，所述抗凝剂浓度分别为0.1～30g/LNa2EDTA、0.1～30g/LK2EDTA、0.1～30g/LK3EDTA、0.1～30g/L柠檬酸、0.1～30g/L柠檬酸三钠、0.1～30g/L枸缘酸钠、0.1～25g/L草酸钠、0.1～25g/LNaCl。
S2将所述过滤血液离心，得到离心液，去除所述离心液中的上清，取所述离心液中的白细胞层，得到纯化细胞；
S3采用含有荧光增强剂的固定剂重悬固化所述纯白细胞，得到适用于荧光原理的全固化细胞；
所述固定剂为醛类固定剂，选自甲醛、乙二醛、戊二醛、多聚甲醛中的一种或几种，所述醛类固定剂的浓度优选为0.01％～8％(W/V)。所述醛类固定剂中的所述荧光增强剂为乙酸、草酸、碳酸、磷酸、异硫酸氰胍、苯磺酸钠中的一种或几种；所述醛类固定剂中的所述荧光增强剂组分浓度分别为0.01～10％乙酸、0.01～10％草酸、0.01～10％碳酸、0.01～10％磷酸、0.01g/L～10g/L异硫酸氰胍、0.01g/L～10g/L苯磺酸钠中。所述醛类固定剂中缓冲组分为柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸、乙酸钠、碳酸、氨水、氯化铵中的一种或几种。所述醛类固定剂中糖类为蔗糖、五水棉子糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖中的一种或几种。
S4采用含有细胞膜保护剂的细胞保存液离心洗涤所述全固化细胞，直至去除所述全固化细胞中的固定剂，得到半成品细胞，将所述半成品细胞保存在细胞保存液中，得到荧光原理的白细胞模拟物；
所述细胞保存液包括柠檬酸、NaCl、KCl、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白中的一种或几种，所述pH为6.0～8.0，所述渗透压为200-600mOsm/(kg·H2O)。所述细胞保存液中细胞膜保护剂为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、二硫苏糖醇中的一种或几种；所述细胞膜保护剂浓度为0.01g/L～30g/L海藻糖、0.01g/L～20g/L葡萄糖、0.01g/L～20g/L蔗糖、0.01g/L～30g/L山梨糖醇、0.01g/L～30g/L二硫苏糖醇。
S5对所述荧光原理的白细胞模拟物进行分析，得到分析结果；
通过荧光-散射原理的血细胞分析仪对所述荧光原理的白细胞模拟物进行分析，得到分析结果。
为更好的理解本发明，下面通过几种具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。
实施例所用到的试剂：除非特殊说明，配制中所用试剂均为分析纯。
抗凝剂一：10g/L柠檬酸、10g/L柠檬酸三钠、无水葡萄糖，用无水葡萄糖调节渗透压至400mOsm/(kg·H2O)。
抗凝剂二：10g/LNa2EDTA、NaCl，用NaCl调节渗透压至500mOsm/(kg·H2O)。
抗凝剂三：10g/LNa2EDTA、NaCl，用NaCl调节渗透压至700mOsm/(kg·H2O)。
抗凝剂四：10g/LNa2EDTA、NaCl，用NaCl调节渗透压至900mOsm/(kg·H2O)。
固定剂一：0.8％甲醛、0.8g/L异硫酸氰胍、1g/L柠檬酸，1g/L柠檬酸三钠，NaCl，0.8g/L五水棉子糖。
固定剂二：0.8％甲醛、1g/L柠檬酸，1g/L柠檬酸三钠，NaCl，0.8g/L五水棉子糖。
固定剂三：0.4％甲醛、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠，NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
固定剂四：0.04％戊二醛、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠，NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
固定剂五：0.8％甲醛、0.8g/L异硫酸氰胍、0.5％乙酸、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠、NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
固定剂六：0.04％多聚甲醛、0.8％甲醛、0.5％乙酸、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠、NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
固定剂七：0.04％多聚甲醛、0.8％甲醛、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠、NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
固定剂八：0.05％多聚甲醛、0.8％甲醛、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠、NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
固定剂九：0.05％多聚甲醛、0.8％甲醛、0.6％乙酸、1g/L柠檬酸、1g/L柠檬酸三钠、NaCl、0.8g/L五水棉子糖。
细胞保存液一：0.25g/L海藻糖、0.3g/L山梨糖醇、10g/L柠檬酸、9g/LNaCl、10g/LKCl、15g/L柠檬酸三钠、15g/L牛血清白蛋白中的一种或几种，所述pH为6.0～8.0，所述渗透压为200-600mOsm/(kg·H2O)。
细胞保存液二：10g/L柠檬酸、9g/LNaCl、10g/LKCl、15g/L柠檬酸三钠、15g/L牛血清白蛋白中的一种或几种，所述pH为6.0～8.0，所述渗透压为200-600mOsm/(kg·H2O)。
下面实施例所使用的血细胞分析仪是希森美康生产的XN-1000血细胞分析仪，采用荧光核酸染色原理进行识别计数。
实施例1：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂一，渗透压为400mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血离心2000r/min，10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂一(0.8％甲醛，0.8g/L异硫酸氰胍)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图3所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图4所示，三个月的测试过程中数值波动较大。
实施例2：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压为500mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血离心2000r/min，10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂一(0.8％甲醛，0.8g/L异硫酸氰胍)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图5所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图6所示，三个月的测试过程中数值波动较大。
实施例3：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂三，渗透压为700mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血离心2000r/min，10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂一(0.8％甲醛，0.8g/L异硫酸氰胍)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图7所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图8所示，在三个月的测试中数值相对较稳定。
实施例4：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂一(0.8％甲醛，0.8g/L异硫酸氰胍)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂三(0.4％甲醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图9所示；
将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图10所示，三个月后的测试数值比较稳定。
实施例5：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂一(0.8％甲醛，0.8g/L异硫酸氰胍)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图11所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图12所示，三个月后的测试数值仍然稳定。
实施例6：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂二(0.8％甲醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图13所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图14所示，在三个月的测试中，白细胞分类数值波动较大。
实施施7：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂五(0.8％甲醛、0.8g/L异硫酸氰胍、0.5％乙酸)重悬白细胞，25℃恒温下固化40h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化24h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图15所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图16所示，三个月后的测试数值仍然稳定。
实施例8：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂六(0.04％多聚甲醛，0.8％甲醛，0.5％乙酸)重悬白细胞，25℃恒温下固化40h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化24h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图17所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图18所示，三个月后的测试数值仍然稳定。
实施例9：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂七(0.04％多聚甲醛、0.8％甲醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化48h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化24h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图19所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图20所示，三个月后的测试数值仍然稳定。
实施例10：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂八(0.05％多聚甲醛、0.8％甲醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化40h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化6h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图21所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图22所示，三个月后的测试数值仍然稳定。
实施例11：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂九(0.05％多聚甲醛，0.8％甲醛，0.6％乙酸)重悬白细胞，25℃恒温下固化40h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化6h；
6.用细胞保存液一离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液一中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图23所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图24所示，三个月后的测试数值仍然稳定。
实施例12：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂九(0.05％多聚甲醛，0.8％甲醛，0.6％乙酸)重悬白细胞，25℃恒温下固化40h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化6h；
6.用细胞保存液二离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液二中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图25所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图26所示，在三个月的测试中数值波动较大。
实施例13：
1.取新鲜抗凝(抗凝剂四，渗透压900mOsm/(kg·H2O))猪血进行过滤；
2.将抗凝猪血2000r/min离心10min，去掉上清，取中间白细胞层；
3.用固定剂四五(0.8％甲醛、0.8g/L异硫酸氰胍、0.5％乙酸)重悬白细胞，25℃恒温下固化40h；
4.将半固化的细胞1500r/min离心5min，弃去上清液；
5.用固定剂四(0.04％戊二醛)重悬白细胞，25℃恒温下固化24h；
6.用细胞保存液二离心洗涤(2次)去除固定剂，将细胞保存在细胞保存液二中；
7.将制备的荧光原理的白细胞在血细胞分析仪上测试，结果如图27所示；
8.将上述白细胞配制成全项质控物进行观察，结果如图28所示，在三个月的测试中数值较大。
从上述实施例可知：
1.高渗透压抗凝剂采集的血液(实施例3～实施例5、实施例7～实施例11)经过固定化处理后的稳定性高于低渗透压抗凝剂采集的血液(实施例1～实施例2)经过固定化处理后的稳定性，且实施例3～实施例5、实施例7～实施例11白细胞分类比实施例1～实施例2更好。
2.通过实施例5和实施例6、实施例8和实施例9、实施例9和实施例10、实施例11分别增加异硫酸氰胍、乙酸、增强多聚甲醛浓度、增强多聚甲醛和乙酸浓度使细胞膜更稳定、白细胞分类更明显，同时缩短了细胞固定化时间，大大缩短了质控物生产和发货周期。
3.通过实施例7和实施例13、实施例11和实施例12分别增加细胞保存液中海藻糖、山梨糖醇细胞膜保护剂维持了细胞膜活性、延长了细胞稳定性。
本申请的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，收集动物血液使用高渗渗透压(700～900Osm/kgH2O)的抗凝剂比低渗透压抗凝剂采集血液经固定化处理后，白细胞以及白细胞分类稳定性效果更好；将白细胞在200～400mOsm/(kg·H2O)的渗透压条件下用不同的固化剂进行两步固定处理，通过在醛类固化剂中特别添加的乙酸、异硫酸氰胍组分，和两步固化的处理方式，能够起到增强白细胞与检测时荧光染色试剂结合能力的作用，使原本与人类样本差异较大的动物血的测试散点图得到优化，从而能够起到模拟作用，此外，缩短了质控物生产和发货周期；在细胞保存液中特别添加了海藻糖和山梨醇保护剂，延长了细胞膜稳定性，增强了质控物稳定性，延长了质控物的有效期。
以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

Claims (9)

1.一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，包括：
利用抗凝剂获取动物血液并过滤，得到过滤血液；
将所述过滤血液离心，得到离心液，去除所述离心液中的上清，取所述离心液中的白细胞层，得到纯化细胞；
采用含有荧光增强剂的固定剂重悬固化所述纯白细胞，得到适用于荧光原理的全固化细胞；
采用含有细胞膜保护剂的细胞保存液离心洗涤所述全固化细胞，直至去除所述全固化细胞中的固定剂，得到半成品细胞，将所述半成品细胞保存在细胞保存液中，得到荧光原理的白细胞模拟物；
对所述荧光原理的白细胞模拟物进行分析，得到分析结果。
2.如权利要求1所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述动物血液采用哺乳动物血液制备，所述哺乳动物为猪、牛、羊、狗中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述抗凝剂为Na2EDTA、K2EDTA、K3EDTA、柠檬酸、柠檬酸三钠、枸缘酸钠、草酸钠、NaCl中的一种或几种，所述抗凝剂浓度分别为0.1～30g/LNa2EDTA、0.1～30g/LK2EDTA、0.1～30g/LK3EDTA、0.1～30g/L柠檬酸、0.1～30g/L柠檬酸三钠、0.1～30g/L枸缘酸钠、0.1～25g/L草酸钠、0.1～25g/LNaCl。
4.如权利要求1所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述固定剂为醛类固定剂，选自甲醛、乙二醛、戊二醛、多聚甲醛中的一种或几种，所述醛类固定剂的浓度优选为0.01％～8％(W/V)。
5.如权利要求4所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述醛类固定剂中的所述荧光增强剂为乙酸、草酸、碳酸、磷酸、异硫酸氰胍、苯磺酸钠中的一种或几种；所述醛类固定剂中的所述荧光增强剂组分浓度分别为0.01～10％乙酸、0.01～10％草酸、0.01～10％碳酸、0.01～10％磷酸、0.01g/L～10g/L异硫酸氰胍、0.01g/L～10g/L苯磺酸钠中。
6.如权利要求4所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述醛类固定剂中缓冲组分为柠檬酸、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸、乙酸钠、碳酸、氨水、氯化铵中的一种或几种。
7.如权利要求4所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述醛类固定剂中糖类为蔗糖、五水棉子糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖中的一种或几种。
8.如权利要求1所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述细胞保存液包括柠檬酸、NaCl、KCl、柠檬酸三钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白中的一种或几种，所述细胞保存液pH为6.0～8.0，所述细胞保存液渗透压为200-600mOsm/(kg·H2O)。
9.如权利要求1所述的一种荧光原理的白细胞质控物制备方法，其特征在于，
所述细胞保存液中细胞膜保护剂为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、二硫苏糖醇中的一种或几种；所述细胞膜保护剂浓度为0.01g/L～30g/L海藻糖、0.01g/L～20g/L葡萄糖、0.01g/L～20g/L蔗糖、0.01g/L～30g/L山梨糖醇、0.01g/L～30g/L二硫苏糖醇。
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