CN117347146A - 一种用于血细胞分析仪的白细胞五分类质控品制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于血细胞分析仪的白细胞五分类质控品制备方法。本发明方法是用人工培养增殖的人肾小管上皮细胞，进行细胞形态、细胞内容物调整和固化处理，添加适量含有稳定剂的细胞保存液，制备正常水平及异常水平质控品，使混合液体中WBC、Neu#、Lym#、Mon#、Eos#、Bas#检测结果满足临床正常及异常质控使用需求。本发明制得的白细胞分类质控品重复性好、适用性广、对检测试剂变化敏感性好，且具有较好的稳定性，满足血球项目检验的质量控制要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于血细胞分析仪的白细胞五分类质控品制备方法。
背景技术
全血细胞计数，是用于检测细胞的特征性变量，包括细胞大小、细胞数量、细胞形态和结构等的常规检查之一。血细胞计数在临床检验工作中具有非常重要的作用；例如贫血、白血病的诊断，各种感染性疾病的诊断等等不胜枚举。而白细胞是人体血液中非常重要的一类血细胞。白细胞(WBC)在人体中担负许多重任，它具有吞噬异物并产生抗体的作用、机体损伤的治愈能力、抵御病原体入侵的能力、对疾病的免疫抵抗力等。人体不适时，经常会通过白细胞数量的显著变化而表现出来。因此到医院看病很多情况下需要化验血常规，现在医院血常规化验多采用仪器，常有20多项指标，很多时候医生首先关注白细胞(WBC)数是否改变。白细胞是一种非常特殊且重要的细胞，因此了解它的相关情况非常重要。
白细胞不是一个均一的细胞群，根据其形态、功能和来源部位可以分为三大类：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中粒细胞又可根据胞质中颗粒的染色性质不同，分为中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒细胞三种，因此血液中的白细胞一共可以分为五种，按照体积从小到大是：淋巴细胞(Lym)、嗜碱性粒细胞(Bas)、中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eos)和单核细胞(Mon)。白细胞的主要功能是防卫作用。不同种类的白细胞以不同的方式参与机体的防御反应。中性粒细胞在血液的非特异性免疫中起着十分重要的作用，它处于机体抵御微生物病原体，特别是在化脓性细菌入侵的第一线，具有很强的吞噬活性，可吞噬细菌、衰老的红细胞、抗原一抗体复合物和坏死的细胞等。嗜碱粒细胞的胞质中存在碱性染色很深的大颗粒，颗粒内含有肝素、组胺、嗜酸粒细胞趋化因子A和过敏性慢反应物质等多种生物活性物质。嗜酸粒细胞在体内的主要作用是：限制嗜碱粒细胞和肥大细胞在速发型过敏反应中的作用和参与对蠕虫的免疫反应。单核细胞内含有更多的非特异性脂酶，可以消化某些细菌(如结核杆菌)的脂膜，并且具有更强的吞噬能力，可吞噬更多、更大的细菌和颗粒。淋巴细胞是免疫细胞中的一大类，主要参与机体的特异性免疫应答反应。根据细胞成长发育的过程和功能的不同，淋巴细胞分成T细胞和B细胞两类。在功能上T细胞主要与细胞免疫有关，B细胞则主要与体液免疫有关。
随着血常规项目不断拓展到疾病诊断和治疗中的各个领域，第三方血细胞分析仪用质控品对血液检验进行室内质量控制也显得尤为重要。目前市场上主要的血细胞分析仪用质控商品多为进口产品，价格昂贵，水平设计单一，并且大多数质控品效期较短、供货周期长，使用过程中容易断货。
由于细胞结构的差异，目前市场上的质控品为了能满足性能需求，往往使用真实的白细胞或多种动物红细胞作为原材料，细胞获取渠道少，获取难度大、成本高。目前市场上现有的血细胞分析仪用质控品多为配套使用，由于不同血细胞分析仪在检测白细胞五分类的光散射性方面存在差异，一款质控品无法同时适用多种主流检测仪器。
因此，提供一种用人肾小管上皮细胞制备可同时用于WBC和Lym、Bas、Neu、Eos、Mon白细胞五分类项目检验的涵盖正常人范围及病理范围的多水平质控品的制备方法具有现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供的一种用于血细胞分析仪的白细胞五分类质控品制备方法，制得的白细胞分类质控品重复性好、适用性广、对检测试剂变化敏感性好，且具有较好的稳定性，满足血球项目检验的质量控制要求。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了白细胞模拟粒子的制备方法，包括基于人肾小管上皮细胞制备。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.35～0.75g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.8％～1.2％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.0～1.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为1.4％～1.8％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.6～1.0g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.5～2.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.4％～0.6％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
本发明还提供了上述制备方法制得的白细胞模拟粒子。
本发明还提供了上述白细胞模拟粒子在制备五分类白细胞质控品中的应用。
本发明还提供了五分类白细胞质控品的制备方法，包括将单核细胞模拟粒子、中性粒细胞模拟粒子、嗜酸性细胞模拟粒子、嗜碱性细胞模拟粒子、淋巴细胞模拟粒子以及可接受的辅料或助剂混合，获得所述五分类白细胞质控品；
所述单核细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得单核细胞模拟粒子；
所述中性粒细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(a)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液a；
步骤(b)：取步骤(a)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(a)所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液b；
步骤(c)：取步骤(b)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得中性粒细胞模拟粒子；
所述嗜酸性细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(A)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液A；
步骤(B)：取步骤(A)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.35～0.75g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(A)所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液B；
步骤(C)：取步骤(B)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.8％～1.2％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得嗜酸性细胞模拟粒子；
所述嗜碱性细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(i)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液i；
步骤(ii)：取步骤(i)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.0～1.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(i)所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液ii；
步骤(iii)：取步骤(iii)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为1.4％～1.8％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得嗜碱性细胞模拟粒子；
所述淋巴细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(I)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.6～1.0g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液I；
步骤(II)：取步骤(I)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.5～2.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(I)所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液II；
步骤(III)：取步骤(II)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.4％～0.6％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得淋巴细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
本发明还提供了上述制备方法制得的五分类白细胞质控品。
本发明的制备方法有如下效果：
(1)本质控品可同时用于白细胞(WBC)及淋巴细胞(Lym)、嗜碱性粒细胞(Bas)、中性粒细胞(Neu)、嗜酸性粒细胞(Eos)和单核细胞(Mon)五种白细胞分类项目的质量控制。
(2)原材料仅使用一种细胞：本发明针仅使用人肾小管上皮细胞一种细胞来模拟五种白细胞粒子，原材料简单易获取。
(3)分开制备的五种白细胞模拟粒子可以以任意比例混合，可根据使用需求选择包含不同正常或异常浓度值的Lym、Bas、Neu、Eos、Mon五种白细胞粒子。
(4)本发明使用人肾小管上皮细胞，为人源性细胞，与白细胞相似程度高，光学表现相似，白细胞五分类检测散点图相似度高，临床差异小，适用机型广泛，且可通过细胞体外培养技术大量制备。
(5)本发明使用人肾小管上皮细胞，相对于真实白细胞，更易获取；可通过细胞体外培养技术制备，获取量大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示1号瓶；
图2示2号瓶；
图3示3号瓶；
图4示4号瓶；
图5示5号瓶；
图6示五种细胞一定比例混合；
图7示临床样本。
具体实施方式
本发明公开了一种用于血细胞分析仪的白细胞五分类质控品制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
基于背景技术所述的问题，发明一种同时适用于多种主流机型，且细胞获取容易、获取体量大，成本低，同时能实现WBC和Lym、Bas、Neu、Eos、Mon五种白细胞粒子检测的质控品既有很好的临床实用性，也非常利于在临床上推广和发展。
本发明涉及临床血常规检验项目质量控制领域，具体提供了一种包含正常及异常水平血细胞分析仪用质控品的制备方法，可同时用于WBC、Neu#、Lym#、Mon#、Eos#、Bas#血常规项目检验的质控品的方法。本发明方法是用人工培养增殖的人肾小管上皮细胞，进行细胞形态、细胞内容物调整和固化处理，添加适量含有稳定剂的细胞保存液，制备正常水平及异常水平质控品，使混合液体中WBC、Neu#、Lym#、Mon#、Eos#、Bas#检测结果满足临床正常及异常质控使用需求。本发明方法制备的白细胞分类质控品重复性好、适用性广、对检测试剂变化敏感性好，且具有较好的稳定性，满足血球项目检验的质量控制要求。为临床疾病的诊断提供准确的依据，且均一性好，既方便了临床操作减少操作失误的可能又节约成本，为临床检验结果的准确性提供了可靠保障。本质控品优势点在于3水平设计，包括正常水平及异常水平质控，监控机体能同时检测WBC和Lym、Bas、Neu、Eos、Mon白细胞五分类项目，国内及国外市场上未有此种用人肾小管上皮细胞，进行细胞形态、细胞内容物调整和固化处理，添加适量含有稳定剂的细胞保存液的质控品及其制备方法的报道。
具体地，本发明由人肾小管上皮细胞制备白细胞五分类模拟粒子，提供了一种包含正常及异常水平血细胞分析仪用质控品的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：人肾小管上皮细胞的获取，使用少量商品化的人肾小管上皮细胞(人肾小管上皮细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司；货号：CP-H193)，进行悬浮培养增殖，使之达到制备质控品的使用量。离心富集后，使用等渗PBS缓冲液重复洗涤人肾小管上皮细胞3～5次，获得纯净的人肾小管上皮细胞。
步骤2：将步骤1获得的人肾小管上皮细胞，使用不同渗透压的PBS缓冲液稀释至细胞浓度为10×109个/L至20×109个/L，并在5分钟内将稀释后并混匀的细胞等体积分成5份至瓶中，分别编号1号瓶、2号瓶、3号瓶、4号瓶、5号瓶，并维持10～15分钟，使细胞体积进行调整，改变细胞膜通透性。PBS渗透压如表1所示。
表1
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| PBS渗透压(mOsm/kg) | 50～100 | 125～175 | 200～250 | 270～370 | 400～500 |
步骤3：作用结束后，分别向1～5号瓶加入不同浓度的丙二醇进行细胞内容物释放和结合处理，作用60min。加入浓度如表2所示。
表2
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 丙二醇(g/L) | 0.15～0.25 | 0.15～0.25 | 1.5～2.5 | 1.5～2.5 | 0.6～1.0 |
步骤4：作用结束后，将步骤3中的1～5号瓶分别进行离心，并用步骤2中与瓶号相对应的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤过程不能超过5min。最后再次使用表1中对应的PBS重悬细胞至10×109个/L至20×109个/L。
步骤5：向步骤4中的细胞悬液中分别加入不同浓度的溴酸钠，作用15min，调整细胞内部的蛋白质光学特性及核酸光学特性。加入浓度如表3。
表3
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 溴酸钠(g/L) | 0.20～0.30 | 0.20～0.30 | 0.35～0.75 | 1.0～1.5 | 1.5～2.5 |
步骤6：步骤5中的细胞光学特性处理结束后，将1～5号瓶分别进行离心，用对应渗透压的PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将1～5号瓶均稀释至浓度约100×109个/L。
步骤7：在稀释后的1～5号瓶细胞悬液中分别加入如表4所示浓度的戊二醛溶液，作用2h。作用结束后，使用渗透压为300mOsm/kg的等渗PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将洗涤后的细胞分别使用细胞保存液稀释至浓度约100×109个/L。
表4
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 戊二醛(v/v) | 0.15％～0.25％ | 0.15％～0.25％ | 0.8％～1.2％ | 1.4％～1.8％ | 0.4％～0.6％ |
步骤8：将步骤7中的细胞按照所需比例进行混合，并使用细胞保存液稀释成异常低浓度值、浓度值、异常高浓度值，即得三水平白细胞五分类质控品。
将其与固化后的红细胞和血小板类似物按照一定浓度进行混合也可获得全血细胞质控品。质控品均于2℃～8℃条件下保存。
本发明提供的血细胞分析仪用质控品的制备方法中，人肾小管上皮细胞的获取方式为悬浮培养，细胞洗涤过程中的离心速度为3000rpm，10min，洗涤时洗涤液添加量为细胞体积的10倍。
本发明中使用不同浓渗透压的PBS缓冲液，目的一是为使细胞膨胀或皱缩，改变细胞的体积；目的二是改变细胞通透性，控制细胞内容物从细胞中流出的速度不同及外部成分进入细胞的速度，从而影响处理程度。
本发明中使用的丙二醇可以增大细胞通透性，并使部分胞内蛋白和核酸自身或二者之间进行结合，影响细胞中颗粒分布。
本发明中使用溴酸钠的作用为氧化细胞中的蛋白、核酸及其他还原性物质，调整细胞内容物结构，影响检测时检测试剂中的荧光染色液与细胞内的结合程度。
本发明中使用不同浓度的戊二醛，目的一为固化细胞膜，加强细胞膜的牢固程度，延长细胞保存时间；目的二为使不同处理浓度的细胞的固化程度不同——在细胞检测阶段，检测试剂中的溶血剂会作用于细胞膜，使细胞膜部分破裂，染色剂从而进入细胞与核酸进行结合，而不同浓度戊二醛处理后的细胞因为固化程度不同，所以细胞破裂程度存在差异，导致染色剂进入细胞的量不同，发光特性也就不一样。
本发明处理过程中使用的PBS可用同样渗透压的盐溶液替代；溴酸钠可使用溴酸钾、高碘酸钠、高碘酸钾等替代；戊二醛可使用甲醛、多聚甲醛等固定剂替代。
本发明中使用的细胞保存液的配制方法为：按照20.5g/L葡萄糖、14.6g/L甘露醇、7.8g/L磷酸二氢钠、0.4g/L磷酸氢二钾、2g/L EDTA、1g/L抗坏血酸、0.4g/L腺嘌呤、4g/L氯化钠的浓度配制成溶液后，使用0.22μm过滤装置过滤除菌，即所需细胞保存液。
本发明中不同步骤使用的试剂浓度不同，使处理后的人肾小管上皮细胞在细胞大小、细胞内容物复杂程度、细胞胞内蛋白和核酸成分有差异，从而分别模拟Lym、Bas、Neu、Eos、Mon五种白细胞粒子。其中1号瓶处理方式模拟单核细胞、2号瓶模拟中性粒细胞、3号瓶模拟嗜酸性细胞、4号瓶模拟嗜碱性细胞、5号瓶模拟淋巴细胞；使用迈瑞BC-6900型号仪器进行检测其散点图分别对应图1～图5，混合后与临床样本对比，散点图基本一致。
使用单种细胞分别通过分步骤添加不同浓度的处理试剂，可获得五种不同的白细胞模拟粒子，为其他专利所不能实现，且原料单一易获取、制备过程操作简便。
分开制备的五种白细胞模拟粒子可已任意比例混合，可根据使用需求选择包含不同正常或异常浓度值的Lym、Bas、Neu、Eos、Mon五种白细胞粒子，不必局限用使用真实白细胞时的五分类白细胞粒子的固定比例。
本发明使用人肾小管上皮细胞，为人源性细胞，与白细胞相似程度高，临床差异小，适用机型广泛，且可通过细胞体外培养技术大量制备。
本发明中所用细胞为人源性，与白细胞结构相似，白细胞检测散点图一致程度高；适用性广，满足目前市场中大部分血细胞检测机型的需求。
术语解释：
WBC：白细胞；
Neu#：中性粒细胞绝对值；
Lym#：淋巴细胞绝对值；
Mon#：单核细胞绝对值；
Eos#：嗜酸性细胞绝对值；
Bas#：嗜碱性细胞绝对值；
PBS：磷酸盐缓冲液；
等渗：与细胞内液的渗透压相等；
低渗：低体于细胞内液的渗透压；
高渗：高于细胞内液体的渗透压。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一种包含正常及异常水平血细胞分析仪用质控品的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：人肾小管上皮细胞的获取，使用少量商品化的人肾小管上皮细胞(人肾小管上皮细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司；货号：CP-H193)，进行悬浮培养增殖，使之达到制备质控品的使用量。离心富集后，使用等渗PBS缓冲液重复洗涤人肾小管上皮细胞3～5次，获得纯净的人肾小管上皮细胞。
步骤2：将步骤1获得的人肾小管上皮细胞，使用不同渗透压的PBS缓冲液稀释至细胞浓度为10×109个/L至20×109个/L，并在5分钟内将稀释后并混匀的细胞等体积分成5份至瓶中，分别编号1号瓶、2号瓶、3号瓶、4号瓶、5号瓶，并维持10～15分钟，使细胞体积进行调整，改变细胞膜通透性。PBS渗透压如表5所示。
表5
步骤3：作用结束后，分别向1～5号瓶加入不同浓度的丙二醇进行细胞内容物释放和结合处理，作用60min。加入浓度如表6所示。
表6
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 丙二醇(g/L) | 0.2 | 0.2 | 2 | 2 | 0.8 |
步骤4：作用结束后，将步骤3中的1～5号瓶分别进行离心，并用步骤2中与瓶号相对应的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤过程不能超过5min。最后再次使用表5中对应的PBS重悬细胞至10×109个/L至20×109个/L。
步骤5：向步骤4中的细胞悬液中分别加入不同浓度的溴酸钠，作用15min，调整细胞内部的蛋白质光学特性及核酸光学特性。加入浓度如表7。
表7
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 溴酸钠(g/L) | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 1.25 | 2 |
步骤6：步骤5中的细胞光学特性处理结束后，将1～5号瓶分别进行离心，用对应渗透压的PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将1～5号瓶均稀释至浓度约100×109个/L。
步骤7：在稀释后的1～5号瓶细胞悬液中分别加入如表8所示浓度的戊二醛溶液，作用2h。作用结束后，使用渗透压为300mOsm/kg的等渗PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将洗涤后的细胞分别使用细胞保存液稀释至浓度约100×109个/L。
表8
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 戊二醛(v/v) | 0.2％ | 0.2％ | 1％ | 1.6％ | 0.5％ |
步骤8：将步骤7中的细胞按照所需比例进行混合，并使用细胞保存液稀释成异常低浓度值、浓度值、异常高浓度值，即得三水平白细胞五分类质控品。
其中1号瓶处理方式模拟单核细胞、2号瓶模拟中性粒细胞、3号瓶模拟嗜酸性细胞、4号瓶模拟嗜碱性细胞、5号瓶模拟淋巴细胞；使用迈瑞BC-6900型号仪器进行检测其散点图分别对应图1～图5，混合后(图6)与临床样本(图7)对比，散点图基本一致。
按上述制备步骤生产得到的产品，水平数多，稳定性优异，且适用于多种检测机型的质控要求。
(一)本实施例制备的质控品与现有质控品适用性的比较结果
表9：本实施例制备的质控品适用性表现
总结：本实施例制备的在市面上主流仪器上检测，各个浓度值适用性表现均良好，可满足医学实验室质量控制使用，而现有其他厂商质控品适用性如表10所示。
表10：现有其他厂商质控品适用性表现
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注：“****”为没有测定值。
总结：目前市场中现有的大部分质控品在主流厂家仪器上细胞五分类无法检测出测定值，或测定值无法实现异常低值、正常值、异常高值的三水平梯度浓度值设置，适用机型少，适用性较差，临床适用性差。
(二)本实施例制备的质控品稳定性结果
按本实施例制备步骤生产得到的产品的稳定性数据如表11、表12所示。
表11：开瓶稳定性表现
表12：实时稳定性表现
总结：本发明各个水平浓度值开瓶14天后和实时放置4个月后，稳定性均良好，满足各实验室质量控制使用要求。
实施例2
步骤1：人肾小管上皮细胞的获取，使用少量商品化的人肾小管上皮细胞(人肾小管上皮细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司；货号：CP-H193)，进行悬浮培养增殖，使之达到制备质控品的使用量。离心富集后，使用等渗PBS缓冲液重复洗涤人肾小管上皮细胞3～5次，获得纯净的人肾小管上皮细胞。
步骤2：将步骤1获得的人肾小管上皮细胞，使用不同渗透压的PBS缓冲液稀释至细胞浓度为10×109个/L至20×109个/L，并在5分钟内将稀释后并混匀的细胞等体积分成5份至瓶中，分别编号1号瓶、2号瓶、3号瓶、4号瓶、5号瓶，并维持10～15分钟，使细胞体积进行调整，改变细胞膜通透性。PBS渗透压如表13所示。
表13
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| PBS渗透压(mOsm/kg) | 50 | 125 | 200 | 270 | 400 |
步骤3：作用结束后，分别向1～5号瓶加入不同浓度的丙二醇进行细胞内容物释放和结合处理，作用60min。加入浓度如表14所示。
表14
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 丙二醇(g/L) | 0.15 | 0.15 | 1.5 | 1.5 | 0.6 |
步骤4：作用结束后，将步骤3中的1～5号瓶分别进行离心，并用步骤2中与瓶号相对应的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤过程不能超过5min。最后再次使用步骤1中对应的PBS重悬细胞至10×109个/L至20×109个/L。
步骤5：向步骤4中的细胞悬液中分别加入不同浓度的溴酸钠，作用15min，调整细胞内部的蛋白质光学特性及核酸光学特性。加入浓度如表15所示。
表15
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 溴酸钠(g/L) | 0.20 | 0.20 | 0.35 | 1.0 | 1.5 |
步骤6：步骤5中的细胞光学特性处理结束后，将1～5号瓶分别进行离心，用对应渗透压的PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将1～5号瓶均稀释至浓度约100×109个/L。
步骤7：在稀释后的1～5号瓶细胞悬液中分别加入如表16所示浓度的戊二醛溶液，作用2h。作用结束后，使用渗透压为300mOsm/kg的等渗PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将洗涤后的细胞分别使用细胞保存液稀释至浓度约100×109个/L。
表16
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 戊二醛(v/v) | 0.15％ | 0.15％ | 0.8％ | 1.4％ | 0.4％ |
步骤8：将步骤7中的细胞按照所需比例进行混合，并使用细胞保存液稀释成异常低浓度值、浓度值、异常高浓度值，即得三水平白细胞五分类质控品。
性能数据如下：
质控品适用性表现如表17所示。
表17
开瓶稳定性表现如表18所示。
表18
实时稳定性表现如表19所示。
表19
结论：对所示试剂配比进行实验验证，结果表明适用性、开瓶稳定性和实时稳定性均良好。
实施例3
步骤1：人肾小管上皮细胞的获取，使用少量商品化的人肾小管上皮细胞(人肾小管上皮细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司；货号：CP-H193)，进行悬浮培养增殖，使之达到制备质控品的使用量。离心富集后，使用等渗PBS缓冲液重复洗涤人肾小管上皮细胞3～5次，获得纯净的人肾小管上皮细胞。
步骤2：将步骤1获得的人肾小管上皮细胞，使用不同渗透压的PBS缓冲液稀释至细胞浓度为10×109个/L至20×109个/L，并在5分钟内将稀释后并混匀的细胞等体积分成5份至瓶中，分别编号1号瓶、2号瓶、3号瓶、4号瓶、5号瓶，并维持10～15分钟，使细胞体积进行调整，改变细胞膜通透性。PBS渗透压如表20所示。
表20
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| PBS渗透压(mOsm/kg) | 100 | 175 | 250 | 370 | 500 |
步骤3：作用结束后，分别向1～5号瓶加入不同浓度的丙二醇进行细胞内容物释放和结合处理，作用60min。加入浓度如表21所示。
表21
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 丙二醇(g/L) | 0.25 | 0.25 | 2.5 | 2.5 | 1.0 |
步骤4：作用结束后，将步骤3中的1～5号瓶分别进行离心，并用步骤2中与瓶号相对应的PBS洗涤细胞2次，每次洗涤过程不能超过5min。最后再次使用步骤1中对应的PBS重悬细胞至10×109个/L至20×109个/L。
步骤5：向步骤4中的细胞悬液中分别加入不同浓度的溴酸钠，作用15min，调整细胞内部的蛋白质光学特性及核酸光学特性。加入浓度如表22所示。
表22
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 溴酸钠(g/L) | 0.30 | 0.30 | 0.75 | 1.5 | 2.5 |
步骤6：步骤5中的细胞光学特性处理结束后，将1～5号瓶分别进行离心，用对应渗透压的PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将1～5号瓶均稀释至浓度约100×109个/L。
步骤7：在稀释后的1～5号瓶细胞悬液中分别加入如表23所示浓度的戊二醛溶液，作用2h。作用结束后，使用渗透压为300mOsm/kg的等渗PBS缓冲液洗涤细胞3次，并将洗涤后的细胞分别使用细胞保存液稀释至浓度约100×109个/L。
表23
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| 戊二醛(v/v) | 0.25％ | 0.25％ | 1.2％ | 1.8％ | 0.6％ |
步骤8：将步骤7中的细胞按照所需比例进行混合，并使用细胞保存液稀释成异常低浓度值、浓度值、异常高浓度值，即得三水平白细胞五分类质控品。
结果：
质控品适用性表现如表24所示。
表24
开瓶稳定性表现如表25所示。
表25
实时稳定性表现如表26所示。
表26
结论：对所示试剂配比进行实验验证，结果表明适用性、开瓶稳定性和实时稳定性均良好。
对比例1
使用鸡红细胞按照实施例1相同步骤添加表27中相应浓度的试剂进行处理。
表27
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| PBS渗透压(mOsm/kg) | 75 | 150 | 230 | 320 | 450 |
| 丙二醇(g/L) | 0.2 | 0.2 | 2 | 2 | 0.8 |
| 溴酸钠(g/L) | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 1.20 | 2 |
| 戊二醛(v/v) | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 1.20 | 2 |
结果：
使用鸡红细胞处理后适用性数据如表28所示。
表28
总结：使用鸡红细胞处理后在不同厂家仪器上进行检测，迈瑞BC-5800、SysmexXS-500i等机型可检测出WBC测定值，但五分类白细胞粒子只有部分出现检测值；而SysmexXN-1000和XN-2800仪器上所有项目均无检测值。
对比例2
使用牛白细胞按照实施例1相同步骤添加表29中相应浓度的试剂进行处理。
表29
| 试剂成分 | 1号瓶 | 2号瓶 | 3号瓶 | 4号瓶 | 5号瓶 |
| PBS渗透压(mOsm/kg) | 75 | 150 | 230 | 320 | 450 |
| 丙二醇(g/L) | 0.2 | 0.2 | 2 | 2 | 0.8 |
| 溴酸钠(g/L) | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 1.20 | 2 |
| 戊二醛(v/v) | 0.25 | 0.25 | 0.50 | 1.20 | 2 |
结果：
使用牛白细胞处理后适用性数据如表30所示。
表30
总结：使用牛白细胞处理后在不同厂家仪器上进行检测，各厂家机型均可检测出WBC测定值，但五分类白细胞粒子只有部分出现检测值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.白细胞模拟粒子的制备方法，其特征在于，基于人肾小管上皮细胞制备。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.35～0.75g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.8％～1.2％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.0～1.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为1.4％～1.8％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.6～1.0g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.5～2.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.4％～0.6％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得白细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
7.如权利要求1至6任一项所述的制备方法制得的白细胞模拟粒子。
8.如权利要求7所述的白细胞模拟粒子在制备五分类白细胞质控品中的应用。
9.五分类白细胞质控品的制备方法，其特征在于，包括将单核细胞模拟粒子、中性粒细胞模拟粒子、嗜酸性细胞模拟粒子、嗜碱性细胞模拟粒子、淋巴细胞模拟粒子以及可接受的辅料或助剂混合，获得所述五分类白细胞质控品；
所述单核细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(1)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液1；
步骤(2)：取步骤(1)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(1)所述渗透压为50～100mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液2；
步骤(3)：取步骤(2)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得单核细胞模拟粒子；
所述中性粒细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(a)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.15～0.25g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液a；
步骤(b)：取步骤(a)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.20～0.30g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(a)所述渗透压为125～175mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液b；
步骤(c)：取步骤(b)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.15％～0.25％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得中性粒细胞模拟粒子；
所述嗜酸性细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(A)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液A；
步骤(B)：取步骤(A)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为0.35～0.75g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(A)所述渗透压为200～250mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液B；
步骤(C)：取步骤(B)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.8％～1.2％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得嗜酸性细胞模拟粒子；
所述嗜碱性细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(i)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为1.5～2.5g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液i；
步骤(ii)：取步骤(i)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.0～1.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(i)所述渗透压为270～370mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液ii；
步骤(iii)：取步骤(iii)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为1.4％～1.8％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得嗜碱性细胞模拟粒子；
所述淋巴细胞模拟粒子的制备方法包括如下步骤：
步骤(I)：取人肾小管上皮细胞与渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液混合，维持10～15min，再与丙二醇混合，使丙二醇的终浓度为0.6～1.0g/L，维持50～70min，收集细胞，用所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液I；
步骤(II)：取步骤(I)所述的细胞液1与氧化剂混合，使氧化剂的终浓度为1.5～2.5g/L，维持10～20min，收集细胞，用步骤(I)所述渗透压为400～500mOsm/kg的缓冲液洗涤，获得细胞液II；
步骤(III)：取步骤(II)所述的细胞液2与固定剂混合，使固定剂的体积比为0.4％～0.6％，维持1～3h，收集细胞，用渗透压为250～350mOsm/kg的缓冲液洗涤，收集细胞，获得淋巴细胞模拟粒子；
所述缓冲液包括盐溶液；
所述盐溶液包括PBS；
所述氧化剂包括溴酸钾、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或两种或多种；
所述固定剂包括甲醛和/或多聚甲醛。
10.如权利要求9所述的制备方法制得的五分类白细胞质控品。
Priority Applications (1)
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| CN202311461412.0A CN117347146A (zh) | 2023-11-06 | 2023-11-06 | 一种用于血细胞分析仪的白细胞五分类质控品制备方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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- 2023-11-06 CN CN202311461412.0A patent/CN117347146A/zh active Pending
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