CN101887059A - 嗜酸性粒细胞模拟物、制备方法及全血质控物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嗜酸性粒细胞模拟物、该模拟物的制备方法以及含有所述嗜酸性粒细胞模拟物的全血质控物，所述嗜酸性粒细胞模拟物由中性粒细胞制备得到。本发明模拟物可准确模拟嗜酸性粒细胞的特性，从而可用于嗜酸性粒细胞分析测定的质量控制，本发明采用中性粒细胞，特别是哺乳动物的中性粒细胞为原料，原料来源易得，生产过程简单，生产成本低廉，生产批次间的稳定性、重现性好。

Description

嗜酸性粒细胞模拟物、制备方法及全血质控物

技术领域

本发明涉及临床检测试剂，特别是涉及一种嗜酸性粒细胞的模拟物、该模拟物的制备方法以及含有该模拟物的全血质控物。

背景技术

血细胞分析仪作为细胞生物学重要的检测工具在临床医疗、教学、科研等工作中都发挥着重要的作用。血细胞分析仪检测结果的稳定性和准确性是其应用的前提，这使得质量控制在血细胞分析应用过程中必不可少。目前，中、高端的血细胞分析仪已成为血细胞分析仪发展的主流趋势。嗜酸性粒细胞相关的参数是中、高端血细胞分析仪所提供的一项重要信息，嗜酸性粒细胞的数量与寄生虫病、荨麻疹、枯草热、湿疹、银屑病、嗜酸性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、肺癌、猩红热、过敏性间质肾炎等疾病相关，所以准确的对嗜酸细胞的计数进行质量控制是保证血细胞分析仪给出嗜酸性粒细胞准确计数信息的前提。

美国专利5512485公开了一种包含白细胞亚类模拟物的质控物，该专利描述了通过低渗透压处理红细胞，使红细胞体积膨胀大约2倍，并改变红细胞中血红蛋白含量，从而改变细胞的性质使之适合嗜酸细胞的模拟物，然而该方法的缺点在于：(1)低渗处理很容易导致红细胞的裂解；(2)红细胞的固定后的稳定性比白细胞差；(3)红细胞本身体积就有一定的分布宽度；通过低渗处理很难保证白细胞模拟物体积的均一性；(4)用红细胞制备的白细胞模拟物有被溶血剂破坏的风险。

美国专利4704364、5380664选择具有一定体积红细胞的物种，利用红细胞来制备嗜酸性粒细胞模拟物的方法，然而这种方法与专利5512485一样具有红细胞的稳定性问题，并且要选择体积合适于模拟嗜酸性粒细胞的红细胞的物种也很困难，这会给质控物生产带来一定难度。

美国专利5270208、5858790、6187590通过哺乳动物的白细胞经固定剂固定，用于模拟白细胞的分类。虽然通过与人白细胞性质相似的哺乳动物的白细胞作为人白细胞的模拟物避免了美国专利5512485、4704364、5380664中所述方法的不稳定性和原料的复杂性，但是嗜酸性粒细胞在正常哺乳动物白细胞中所占比例只有1％左右，利用5270208、5858790、6187590所描述的方法所获得的白细胞模拟物中的嗜酸性粒细胞的含量较低，并且在检测时嗜酸性粒细胞很容易被划分为中性粒细胞，这使得本来含量就很少的嗜酸性粒细胞的质量控制很难实现。

制备具有嗜酸性粒细胞准确质控能力的嗜酸性粒细胞模拟物，将对血细胞分析仪的质量控制有很大意义。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够准确模拟哺乳动物尤其是人嗜酸性粒细胞，从而能够在嗜酸性粒细胞检测过程中进行准确质量控制的嗜酸性粒细胞模拟物。本发明的又一目的在于提供制备上述嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法。本发明的再一目的在于提供含有上述嗜酸性粒细胞模拟物的全血质控物。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明公开了一种嗜酸性粒细胞模拟物，所述嗜酸性粒细胞模拟物由中性粒细胞制备得到。

优选地，所述中性粒细胞为哺乳动物的中性粒细胞，更优选为牛或猪的中性粒细胞。

进一步地，所述嗜酸性粒细胞模拟物通过减小所述中性粒细胞的体积或/和提高所述中性粒细胞的复杂程度制备。

优选地，所述嗜酸性粒细胞模拟物制备方法包括将所述中性粒细胞于200～2000mOsm/kgH₂O的渗透压条件下经固定剂固定处理。其中所述的固定剂优选为醛类固定剂。

本发明还公开了上述嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法，所述方法包括减小中性粒细胞的体积或/和提高中性粒细胞的复杂程度。

优选地，所述方法包括将所述中性粒细胞于200～2000mOsm/kgH₂O的渗透压条件下经固定剂固定处理。

所述中性粒细胞优选为哺乳动物的中性粒细胞。

所述的固定剂优选为醛类固定剂。

更优选地，所述醛类固定剂选自甲醛、乙醛、多聚甲醛及戊二醛。所述醛类固定剂的浓度优选为0.1％～10％，所述浓度为质量体积百分比浓度。

本发明还进一步公开了所述嗜酸性粒细胞模拟物可以用于模拟嗜酸性粒细胞特征。

所述嗜酸性粒细胞特征包括光散射特征、光学透性特征、电阻抗特征和射频特征；优选光散射特征。

本发明还公开了含有上述嗜酸性粒细胞模拟物的全血质控物。

由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

本发明利用中性粒细胞，特别是哺乳动物，例如牛科或猪科动物的中性粒细胞模拟嗜酸性粒细胞，优选经固定剂和适当渗透压处理后可准确模拟嗜酸性粒细胞的特性，特别是光散射特性，容易与其它细胞类型区分开，从而可作为嗜酸性粒细胞的模拟物，对嗜酸性粒细胞的分析测定进行准确的质量控制；由于中性粒细胞在白细胞中所占比例最大，远高于嗜酸性粒细胞，本发明采用哺乳动物中性粒细胞，例如牛科或猪科动物的中性粒细胞为原料制备嗜酸性粒细胞模拟物，原料来源易得；本发明制备方法简单，生产成本低廉，生产批次间的稳定性、重现性好，便于大规模生产。

附图说明

图1生理状态下人白细胞经低角度和高角度散射光检测结果，虚线标志区域分别为淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞的分布区域。

图2采用本发明纯化方法纯化的牛中性粒细胞经低角度和高角度散射光检测结果，虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图3是利用本发明实施例一制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图4是利用本发明实施例二制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图5是利用本发明实施例三制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图6是利用本发明实施例四制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图7是利用本发明实施例五制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图8是利用本发明实施例六制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图9.是利用本发明实施例七制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

图10.是利用本发明实施例八制备的嗜酸性粒细胞模拟物经低角度散射光及高角度散射光的检测结果，图中的虚线标志区域为人嗜酸性粒细胞分布区域。

具体实施方式

本发明公开了一种嗜酸性粒细胞模拟物及其制备方法，所述的嗜酸性粒细胞模拟物由中性粒细胞制备得到，在一定的渗透压条件下经固定剂固定处理，从而改变所述中性粒细胞的性质，使之特征向适合于模拟嗜酸性粒细胞方向变化，从而适于模拟嗜酸性粒细胞。本发明的嗜酸性粒细胞模拟物能够模拟嗜酸性粒细胞的光散射特性、光学透性特征、电阻抗特征或射频特征，特别是能够较准确地模拟嗜酸性粒细胞的光散射特性。

本发明中，所述中性粒细胞可以来自哺乳动物，例如牛、猪、马、羊、狗、兔、猫、猴等，优选牛科或猪科动物的中性粒细胞。通常可以从这些动物的血液中获得中性粒细胞。其获得方法可以采取本领域熟知的方式或者根据本发明所描述的以下方法制取：

步骤一、获取动物的血液；

步骤二、通过红细胞裂解液裂解所述动物血液中的红细胞；

步骤三、收获白细胞；

步骤四、取步骤三中所述的白细胞，纯化、获得较纯的中性粒细胞。

其中，中性粒细胞可以通过将所述去除红细胞的动物白细胞经低速离心、或使用分离介质损失白细胞中的淋巴细胞，从而获得较纯的中性粒细胞。

在获得纯化的中性粒细胞后，经过合适的渗透压条件下固定剂处理，使之特征向适合于模拟哺乳动物尤其人的嗜酸性粒细胞方向变化，所述的溶液渗透压范围为200-2000mOsm/kgH₂O，所述固定剂采用醛类固定剂。

其中，所述的渗透压范围优选为250～1500mOsm/kgH₂O。固定剂可以选用本领域中用于固定细胞的常用固定剂，其中，醛类固定剂效果较好，其中，更优选甲醛、乙醛、多聚甲醛及戊二醛中的至少一种。所用固定剂的浓度优选为0.1～10％(W/V)，该浓度是醛类固定剂用于固定细胞时的常用浓度，在该浓度范围内通常都能达到较优的固定效果。

固定剂的作用时间根据具体所用的固定剂以及固定剂浓度而变化，通常可为20分钟至24小时。但是，本领域技术人员能够理解固定剂浓度的增加、固定时间的延长都可以使固定反应体系达到反应完全的稳定状态，而在这种反应完全的稳定状态下，继续延长固定时间不会对固定结果产生很大的影响，所以本发明中所所述的固定时间优选，但不限于20分钟至24小时。

将含有嗜酸性粒细胞的人血液样本放置1小时自然沉降后，将上清液通过血细胞分析仪，经高角度和低角度散射光检测(低角度：1-7度，高角度：6-30度)，结果如图1所示，图中显示嗜酸性粒细胞在光散射所体现的特征上，其体积要小于中性粒细胞，复杂度要高于中性粒细胞，所以要将中性粒细胞的光散射特征改变到适合于哺乳动物尤其人的模拟嗜酸性粒细胞的程度，需要使中性粒细胞的体积变小和/或复杂度相对变大。

可以采用不同渗透压条件下采用固定剂处理动物的中性粒细胞实现这种变化，图2显示为采用本发明纯化方法获取的牛中性粒细胞低角度和高角度散射光检测结果(低角度：1-7度，高角度：6-30度)，图3-6为采用牛中性粒细胞在不同渗透压条件下固定剂处理牛中性粒细胞所获得的嗜酸性粒细胞模拟物，对比图2和图3-6的结果说明，采用本发明所述不同渗透压条件下固定剂处理中性粒细胞方法制备嗜酸性粒细胞模拟物时，不同渗透压条件下固定剂处理使中性粒细胞的体积和/或复杂度发生变化，其细胞性质也相应发生了变化，可以来模拟嗜酸性粒细胞的特性，这些特性可以是光散射特征、光学透性特征、电阻抗特征或射频特征，使之在散点图上分布于适合模拟哺乳动物尤其人嗜酸性粒细胞的区域。

本发明公开的嗜酸性粒细胞模拟物可以添加入其它细胞的模拟物作为血细胞分析仪的质控物，即全血质控物，其配制方法为本领域技术人员熟知。

采用本发明的嗜酸性粒细胞模拟物和制备方法，可以对嗜酸性粒细胞进行准确的质量控制，所述嗜酸细胞模拟物采用中性粒细胞为原料，原料来源易得，生产成本低廉，生产批次间的稳定性、重现性好。

下面通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。

实施例所用到的试剂：

除非特殊说明，配制中所用试剂为分析纯。

溶血剂：将2g Tris和7.5g NH₄Cl溶解于1L蒸馏水，调节pH至7.0±0.5，用NaCl调节渗透压至100±20mOsm/kgH₂O。

PBS缓冲液：8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄，用盐酸调节pH到7.0±0.5定容到1L，用NaCl调节渗透压至300±20mOsm/kgH₂O。

固定缓冲液：0.1g KCl，0.34g Na₂HPO₄，0.14g KH₂PO₄，用盐酸或NaOH调节pH到7.0±0.5，用NaCl调节渗透压至200-2000mOsm/kgH₂O。

下面实施例使用的血细胞分析仪是深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的BC5500血液细胞分析仪，其光学检测系统在申请号为200610062982.2中国专利申请中公开，在此通过引用将其全文结合于此。

实施例一

1.取新鲜的抗凝牛血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝牛血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞，用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含戊二醛5％的固定缓冲液重悬(渗透压260±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图3所示。

实施例二

1.取新鲜的抗凝牛血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝牛血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含戊二醛1％的固定缓冲液重悬(渗透压1400±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图4所示。

实施例三

1.取新鲜的抗凝牛血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝牛血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含甲醛5％的固定缓冲液重悬(渗透压400±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图5所示。

实施例四

1.取新鲜的抗凝牛血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝牛血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞，用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含甲醛2％的固定缓冲液重悬(渗透压800±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪测定步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图6所示。

实施例五

1.取新鲜的抗凝牛血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝牛血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞，用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含甲醛3％的固定缓冲液重悬(渗透压1200±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图7所示。

实施例六

1.取新鲜的抗凝牛血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝牛血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含多聚甲醛5％的固定缓冲液重悬(渗透压600±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图8所示。

实施例七

1.取新鲜的抗凝猪血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝猪血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含戊二醛2％的固定缓冲液重悬(渗透压400±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图9所示。

实施例八

1.取新鲜的抗凝猪血100ml，含抗凝剂2g/L；

2.将抗凝猪血100ml与400ml溶血剂混合，搅拌反应10分钟，2000g离心5分钟后收获白细胞；

3.用PBS缓冲液离心洗涤白细胞一至两次；

4.取步骤3中白细胞用PBS调整至白细胞计数50×10⁹个/L，离心力200g，离心10分钟，收获沉淀；

5.取步骤4中的沉淀，用含甲醛0.8％的固定缓冲液重悬(渗透压600±20mOsm/kgH₂O)，室温固定5小时后，用PBS缓冲液离心洗涤去除固定剂。

采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测步骤5制备的嗜酸性粒细胞模拟物，结果如图10所示。

本发明经过实验验证，验证结果如图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9和图10所示，采用同时检测低角度散射光和高角度散射光的血细胞分析仪检测本发明所述方法制备的嗜酸性粒细胞模拟物时，不同渗透压条件下固定剂处理使中性粒细胞的光散射性质发生了变化，使之在散点图上分布于适合模拟嗜酸性粒细胞的区域。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种嗜酸性粒细胞模拟物，其特征在于：所述嗜酸性粒细胞模拟物由中性粒细胞制备得到。

2.根据权利要求1所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物，其特征在于：所述中性粒细胞为哺乳动物的中性粒细胞。

3.根据权利要求2所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物，其特征在于：所述哺乳动物为牛或猪。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物，其特征在于：通过减小所述中性粒细胞的体积或/和提高所述中性粒细胞的复杂程度制备。

5.根据权利要求4所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物，其特征在于：所述嗜酸性粒细胞模拟物制备方法包括将所述中性粒细胞于200～2000mOsm/kgH₂O的渗透压条件下经固定剂固定处理。

6.根据权利要求5所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物，其特征在于：所述的固定剂为醛类固定剂。

7.一种嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法，其特征在于：所述方法包括减小中性粒细胞的体积或/和提高中性粒细胞的复杂程度。

8.根据权利要求7所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括将所述中性粒细胞于200～2000mOsm/kgH₂O的渗透压条件下经固定剂固定处理。

9.根据权利要求7所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法，其特征在于：所述中性粒细胞为哺乳动物的中性粒细胞。

10.根据权利要求8所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法，其特征在于：所述的固定剂为醛类固定剂。

11.根据权利要求10所述的一种嗜酸性粒细胞模拟物的制备方法，其特征在于：所述醛类固定剂选自甲醛、乙醛、多聚甲醛及戊二醛。

12.根据权利要求1至6中任一项所述的嗜酸性粒细胞模拟物用于模拟嗜酸性粒细胞特征的用途，其特征在于：所述嗜酸性粒细胞特征选自光散射特征、光学透性特征、电阻抗特征及射频特征。

13.根据权利要求12所述的嗜酸性粒细胞模拟物用于模拟嗜酸性粒细胞特征的用途，其特征在于：所述嗜酸性粒细胞特征为光散射特征。

14.一种含有权利要求1至6中任一项所述的嗜酸性粒细胞模拟物的全血质控物。

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