CN101881778A - 网织红细胞模拟物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一方面提供了一种制备网织红细胞模拟物的方法。本发明另一方面提供了一种网织红细胞模拟物,所述网织红细胞模拟物通过上述方法制备得到。本发明还一方面提供了一种全血质控物,所述全血质控物包含本发明所提供的网织红细胞模拟物。
Description
技术领域
本发明涉及血液质控物。更具体地讲,本发明涉及网织红细胞模拟物的制备方法,由所述方法得到的网织红细胞模拟物,以及包含所述网织红细胞模拟物的全血质控物。
背景技术
血液质控物是一种含有单一或多组分血细胞或血细胞模拟物的液体,具备如同血液一样的可检测特性,用于日常监控血液分析仪的准确性和精确性。
网织红细胞相关参数是中、高端血细胞分析仪所提供的一项重要信息。网织红细胞是刚脱去核尚残留有少量RNA的未完全成熟的红细胞。网织红细胞的总数或百分比对贫血的临床诊断及疗效观察非常有价值。是血液学诊断常做的项目之一。使用质控物对网织红细胞的计数进行质量控制则是保证血细胞分析仪给出网织红细胞准确计数信息的前提。
美国专利5736402、5858789、5945340、6444471公开了一种包含网织红细胞模拟物的质控物制备方法,通过离心沉降等方式富集并纯化猪血液中的网织红细胞,采取成熟停止(maturation-arrest)的方法对网织红细胞进行保护,然后用特定的保存液对网织红细胞进行保存。但是,由于猪血液中网织红细胞所占比例较低,使得采用该方法的原料处理量很大;另外,由于白细胞与网织红细胞具有近似的沉降性质,所以两者很难通过离心等常规手段分离,如果使用白细胞过滤器,由于网织红细胞在细胞中的比例低,就要用到大量白细胞过滤器,这会大大增加制备成本;再者,猪网织红细胞体积明显小于人网织红细胞,仿真性不高。
美国专利7195919提出了一种模拟网织红细胞质控物的方法,该方法主要是通过核酸、肽核酸或粘多糖等生物高聚物与哺乳动物红细胞表面相连接,从而使所连接的高聚物结合染料,模拟网织红细胞的仪器检测形态。由于该方法的原理是在细胞表面连接核酸,连接强度(特别是在长期的储存期中)难以保证;并且需要对核酸进行活化,及对活化试剂进行去除,操作步骤繁琐不可控。
美国专利6399388、6406915、5432089通过渗透压的变化使红细胞的胞膜膨胀,产生小孔,然后将RNA等核酸物质或者所谓聚阴离子注入胞内,从而模拟网织红细胞的形态。其存在的问题是,由于有效注入核酸的细胞比例不高,导致网织红细胞产率低,制备产物为红细胞与类网织红细胞的混合物,且由于细胞经过了涨缩打孔,其膜强度降低,另外操作步骤繁琐,使得此方案难以用于质控物产品的生产。
因此,本领域存在通过采用简单、经济的方法获得网织红细胞模拟物的需要。
发明内容
本发明一方面提供了一种制备网织红细胞模拟物的方法,所述方法包含以下步骤:
洗涤与分离抗凝含无核红细胞的血液,得到纯化的无核红细胞;
加入细胞处理液和固定剂,所述细胞处理液中含有蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂,对所述无核红细胞表面和/或胞内的物质进行处理和固定;
对所得的产物进行洗涤。
本发明另一方面提供了一种网织红细胞模拟物,所述网织红细胞模拟物通过上述方法制备得到。
本发明还一方面提供了一种全血质控物,所述全血质控物包含本发明所提供的网织红细胞模拟物。
再一方面涉及一种用于制备网织红细胞模拟物的组合物,所述组合物包含细胞处理液和固定剂,所述细胞处理液含有蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂。所述组合物可用于的制备网织红细胞模拟物的方法。
本发明所公开的方法采用无核细胞经试剂处理后模拟网织红细胞,不必使用核酸或类似生物多聚物,步骤简单,成本低廉,可方便地实现血液质控物的工业化生产。
附图说明
图1显示的是通过本发明说明书所公开的方法制备的网织红细胞模拟物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供网织红细胞,简称RET通道),图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度,黑色散点表示的是网织红细胞模拟物。
图2显示的是实施例1所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的全血质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图3显示的是实施例2所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的全血质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图4显示的是实施例3所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的全血质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图5显示的是实施例4所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图6显示的是实施例5所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图7显示的是实施例6所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图8显示的是实施例7所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
图9显示的是实施例8所制备的网织红细胞模拟物,与其他血液细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪用的质控物,在以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪上测试图片(仅提供RET通道)。图中横轴表示荧光强度,纵轴表示前向散射光强度。
具体实施方式
本发明的其它方面和优点在阅读以下描述和具体实施方案后将变得显而易见。
本发明一个实施方案提供了一种用无核红细胞制备网织红细胞模拟物的方法。所述网织红细胞模拟物采用人或动物的无核红细胞,通过特定试剂对细胞表面及胞内物质的处理和固定,使细胞能够产生对核酸染料,特别是荧光检测染料产生吸附作用,从而达到模拟网织红细胞的目的。
所述制备方法包括以下步骤:洗涤与分离抗凝含无核红细胞的血液,得到纯化的无核红细胞;
加入细胞处理液和固定剂,所述细胞处理液中含有蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂,对所述无核红细胞表面和/或胞内的物质进行处理和固定;
对所得的产物进行洗涤。
本发明一个实施方案通过离心或静置等方式去除血液中的血浆及血小板等,并用白细胞滤器或其他等同手段去除白细胞,得到纯化的无核红细胞。
用于本发明实施方案中的血液可以选用任何含有无核细胞的人或动物血液,只要和人红细胞平均红细胞体积(MCV)近似的动物的无核红细胞都可以通过本方法制备网织红细胞模拟物。常用人或哺乳动物血液,使用新鲜血液制备的效果较好。
然后往所得的经纯化的无核红细胞中加入包含蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂等的细胞处理液对细胞组分进行化学处理,并且加入适宜的固定剂,使性质已发生变化的细胞的细胞膜进行固定,以增强其稳定性。
众所周知,对于一些同时含有极性基团(亲水性基团)和非极性基团(疏水性基团)的大分子化合物(例如蛋白质分子)来说,在极性溶剂(例如水)中,其所携带的极性基团(亲水基团)露于分子空间结构的外部,而非极性基团(疏水基团)缩卷在分子空间结构的内部。
虽然不希望受理论约束,但是,用于本发明实施方案的蛋白质变性剂的作用是使得红细胞细胞膜或细胞内中所含的大分子化合物(如蛋白质分子)的空间结构发生变化,使得原来位于分子结构内部的疏水基团外露,从而能够与核酸染料,特别是荧光检测染料结合,达到模拟网织红细胞的目的。
因此,本领域技术人员可以理解,只要是能够使蛋白质分子结构发生如上所述变性作用的变性剂均能用作本发明实施方案的变性剂。例如,可用于本发明实施方案的变性剂可为盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素或硫酸铵,也可以是所述试剂的任意组合。
蛋白质变性剂在使用中的终浓度可为0.01-10%(w/v)。例如,蛋白质变性剂可采用终浓度为0.05%-10%(w/v)的盐酸胍、终浓度为0.01%-5%(w/v)的异硫氰酸胍、终浓度为0.01%-10%(w/v)的尿素或其任意组合。
虽然不希望受理论约束,但是认为用于本发明实施方案的固定剂在固定细胞结构的同时,也使发生结构变性的蛋白质分子空间结构稳定,从而使得制得的网织红细胞模拟物在一定的时间范围内保持稳定,进行准确测试。
因此,本领域技术人员可以理解,常用的细胞固定剂均可用作本发明实施方案的固定剂,例如丙酮、乙二醛、丙酮醛、丁二醛、戊二醛、多聚甲醛、甲醛或乙醇,也可以是所述试剂的任意组合。
固定剂的使用浓度可由本领域技术人员根据具体的条件,例如试剂、作用时间等来确定。例如,在使用中固定剂的终浓度可为0.005-8%(v/v)或0.005-5%(w/v)。例如,固定剂可为终浓度为0.005%-3%(v/v)的丙酮、终浓度为0.005%-2%(v/v)的冰醋酸、终浓度为0.005%-3%(w/v)的苦味酸、终浓度为0.005%-5%(v/v)的乙二醛、终浓度为0.01%-3%(v/v)的丙酮醛、终浓度为0.005%-5%(v/v)的丁二醛、终浓度为0.005%-8%(v/v)的戊二醛、终浓度为0.005%-3%(w/v)的多聚甲醛、终浓度为0.01%-5%(v/v)的甲醛、终浓度为0.005%-5%(v/v)的乙醇或其任意组合。
固定剂的作用时间根据具体所用的固定剂以及固定剂浓度而变化,通常可为1-8个小时。但是,本领域技术人员能够理解,固定剂的作用浓度与时间相关,在较高的浓度下,可以采用较短的作用时间。总之,本领域技术人员仍能根据具体的作用条件而采用合适的固定剂的浓度和时间。这在本领域技术人员公知的技术范围内。
所公开的细胞处理液中任选包含有渗入性试剂。虽然不希望受理论约束,但是认为用于本发明实施方案的渗入性试剂有助于本发明实施方案所用的其他试剂(例如变性剂和固定剂等)进入细胞与细胞内相关物质作用。因此,本领域技术人员可以理解用于本发明实施方案的渗入性试剂可以为任何具有膜渗透作用的试剂,例如二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、甲酰胺或乙酰胺,也可以是所述试剂的任意组合。
渗入性试剂在使用中的终浓度可为0.1-30%(v/v)。例如,渗入性试剂可以采用终浓度为0.1%-20%(v/v)的二甲基亚砜、终浓度为0.5%-25%(v/v)的甘油、终浓度为1%-30%(v/v)的乙二醇、终浓度为1%-30%(v/v)的丙二醇、终浓度为0.1%-20%(v/v)的甲酰胺、终浓度为0.1%-20%(v/v)的乙酰胺或其任意组合。
所公开的细胞处理液中还任选包含有表面活性剂。可用于本发明实施方案的表面活性剂可以是本领域常用的任何阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂以及非离子表面活性剂。
可用于本发明实施方案的阳离子表面活性剂例如可为具有以下通式的季铵盐性阳离子表面活性剂:
其中R1、R2和R3各自独立选自氢原子,C1-C8烷基和C6-C20芳烷基;R4选自C8-C18烷基,C8-18链烯基,C6-C18芳烷基;X为选自卤素、硫酸根、磺酸根的阴离子。
例如,可用于本发明实施方案的阳离子表面活性剂可为十六烷基三甲基氯化铵或十二烷基三甲基氯化铵。
可用于本发明实施方案的阴离子表面活性剂例如可为具有以下通式的磺酸盐:R-SO3Na,R为C8-C20烷基。例如,可用于本发明实施方案的阴离子表面活性剂可为十二烷基磺酸钠。
可用于本发明实施方案的非离子表面活性剂例如可为具有以下通式的聚氧乙烯类非离子表面活性剂:
R1-A-(CH2CH2O)n-H
R1选自H、C1-22烷基或C2-22烷基链烯基,A选自-O-、-COO-和ph-O-,n是10-1000的整数。具体化合物是聚乙二醇,优选分子量为6000-20000的聚乙二醇。
也可以采用各种表面活性剂的任意组合。
表面活性剂在使用中的终浓度可为0.005-5%(w/v)。例如,表面活性剂的终浓度为0.005%-5%(w/v)的聚乙二醇、终浓度为0.005%-5%(w/v)的十二烷基磺酸钠、终浓度为0.005%-3%(w/v)的十六烷基三甲基氯化铵或其任意组合。
本领域技术人员常用的中性等渗缓冲液均可用于本发明实施方案的洗涤过程。例如,可采用的洗涤液有中性等渗磷酸盐缓冲液、中性等渗硼酸盐缓冲液,中性等渗柠檬酸盐缓冲液、中性等渗NaCl溶液,
可用于本发明实施方案的抗凝剂为临床上常用的抗凝剂。例如,可采用1.5%(W/V)EDTA-2NA或EDTA-2K中性等渗抗凝剂,1%(W/V)柠檬酸钠中性等渗抗凝剂。
可用于本发明实施方案的保存液为本领域常用的细胞保存液。
添加细胞处理液和固定剂的顺序可作变化。一般来说,细胞处理液与红细胞膜或细胞内所含物质作用应该在固定剂使得蛋白质分子结构稳定之前完成。因此,通常是先加入细胞处理液,处理一定时间后再加固定剂。但是,也可以同时加入细胞处理液和固定剂;或者先加入固定剂,反应较短时间后再加入细胞处理液(或者降低固定剂浓度,将其先加入反应若干时间后,再加入细胞处理液)。本领域技术人员可以理解,这些方案均落入本发明所保护的范围。优选先加入细胞处理液处理一段时间后,再加入固定剂。
通过适宜的洗涤液将所得产物进行洗涤。
在本发明的实施方案中任选将制备好的网织红细胞模拟物保存于保存液中。
本方法中的保存液是能够长期保存细胞的溶液,本领域技术人员熟知的细胞保存液都可以使用。
本发明一个实施方案还提供了通过所公开的方法所制得的网织红细胞模拟物。
成熟红细胞胞内不含核酸,所以在仪器检测过程中不能结合特异的网织红细胞荧光检测染料。而在本发明公开所提供的方法中,通过对无核红细胞表面及胞内物质进行修饰,使细胞能够对荧光染料产生某种吸附作用,在仪器检测运行中有效吸附结合荧光染料,从而在激光光源激发下产生可检测的荧光信号,最终得到一个明显有别于成熟红细胞的、落在网织红细胞显示区域的细胞聚群,见图1。如果将制备产物按照一定比例掺入到成熟红细胞中,经以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪检测,可以显示出两个有明显界限的细胞群,一个位于成熟红细胞区,一个位于网织红细胞区,从而实现对网织红细胞计数的质量控制。
本发明再一个实施方案提供了包含所公开的网织红细胞模拟物的血液质控物。所公开的方法制得的网织红细胞模拟物可以与红细胞、白细胞、血小板等其他细胞模拟物相混合,组成以核酸荧光染色为检测原理的多参数血液细胞分析仪的质控物。其中网织红细胞相对与红细胞的比例可进行有效的调整。
本发明再一个实施方案涉及一种用于制备网织红细胞模拟物的组合物,所述组合物包含细胞处理液和固定剂,所述细胞处理液含有蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂。所公开的组合物可用于公开的制备网织红细胞模拟物的方法中。
实施例
以下将通过具体实施例对本发明作出进一步的描述。所述实施例仅对本发明作出示例性说明,并非对本发明作出任何意义上的限定。
实施例中所用到的试剂:
以下配制中所用的化学试剂,除非特殊说明,均为分析纯
抗凝剂:每升蒸馏水中含EDTA-Na215g。用HCl或NaOH调节pH至7.0±0.2,用NaCl调节渗透压至300±20mOsm/kgH2O。
洗涤液:每升蒸馏水中含NaCl 8.5g,Na2HPO42.2g,NaH2PO40.4g。用HCl或NaOH调节pH至7.0±0.2,用NaCl调节渗透压至300±20mOsm/kgH2O。
细胞处理液A:每升蒸馏水中含去离子甲酰胺5ml,尿素5g,十二烷基磺酸钠0.5g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
细胞处理液B:每升蒸馏水中含二甲基亚砜5ml,丙二醇20ml,盐酸胍5g,十二烷基三甲基氯化铵0.5g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
细胞处理液C:每升蒸馏水中含甘油10ml,异硫氰酸胍5g,聚乙二醇200000.5g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
细胞处理液D:每升蒸馏水中含丙二醇20ml,盐酸胍5g,十六烷基三甲基氯化铵0.1g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
细胞处理液E:每升蒸馏水中含二甲基亚砜5ml,盐酸胍5g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
细胞处理液F:每升蒸馏水中含尿素5g,聚乙二醇200000.5g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
细胞处理液G:每升蒸馏水中含尿素5g,NaCl 9g。混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,
固定剂A:戊二醛(25%)100ml,冰醋酸20ml,苦味酸30ml,室温混匀后补蒸馏水至1L。
固定剂B:甲醛(37%)300ml,戊二醛(25%)40ml,乙醇10ml,丙酮5ml,室温混匀后补蒸馏水至1L。
保存液:每升蒸馏水中含葡萄糖9.0g,甘露醇5.0g,氯化铵1.3g,甘氨酸10.0g,腺嘌呤0.14g,磷酸氢二钠2.2g,磷酸二氢钠0.4g,硫酸链霉素1.0g,青霉素20万单位,混匀后用HCl或NaOH调节pH值至7.0±0.1,用NaCl调节渗透压至300±10mOsm/kgH2O。
全组分质控物的配制
将以下实施例1-8中所制备的网织红细胞模拟物按照下表配制方法,与红细胞模拟物、血小板模拟物、白细胞模拟物用适量的保存液进行混合,配制成不同水平的全组份质控物,即可用于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司所生产的检测波长635nm的BC系列流式细胞分析仪的日常质量控制。
参数项目 | 低值质控物 | 中值质控物 | 高值质控物 |
WBC(109/L) | 3.35-4.40 | 6.60-8.20 | 17.00-23.00 |
RBC(1012/L) | 2.20-2.80 | 4.00-5.00 | 5.23-5.83 |
RET% | 5.90-11.90 | 2.20-6.20 | 0.30-1.30 |
PLT(109/L) | 60-90 | 150-300 | 420-560 |
实施例1
取新鲜抗凝牛全血,每800ml牛血中含抗凝剂200ml。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液A将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为2%(固定剂体积占总反应液的体积比,下同),室温下作用5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图2(仅提供RET通道图像)。
实施例2
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液B将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为2%,室温下反应5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图3(仅提供RET通道图像)。
实施例3
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液C将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为8%,4℃下反应2小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图4(仅提供RET通道图像)。
实施例4:
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液D将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为0.2%,37℃下反应5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图5(仅提供RET通道图像)。
实施例5:
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液E将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为2%,室温下反应5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图6(仅提供RET通道图像)
实施例6:
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液F将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为2%,室温下反应5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图7(仅提供RET通道图像)。
实施例7:
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液G将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂A至终浓度为2%,室温下反应5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图8(仅提供RET通道图像)。
实施例8:
取新鲜抗凝人全血。将抗凝全血离心2400rpm,5分钟。去掉上清液,洗涤液洗涤,再次离心2400rpm,5分钟。并重复洗涤一至二次。去掉上清液,用白细胞过滤器过滤除去白细胞。用细胞处理液A将上述滤液的红细胞浓度调整至1×1012个/L,搅拌混匀1-5分钟,加入固定剂B至终浓度为2%,室温下反应5小时,期间不断混匀搅拌。用洗涤液重复洗涤反应产物三至四次。用适量保存液对产物进行悬浮,即可如上全组分质控物的配制所述,与其他细胞模拟物按比例混合配制血液分析仪质控物。用以核酸荧光染色为检测原理的血液细胞分析仪对上述质控物检测,结果参见图9(仅提供RET通道图像)。
由附图可见,本发明各实施例制得的血液质控物在血液分析仪中检测分析,得到与成熟红细胞区具有明显界限的网织红细胞区。因此,本发明各实施例可以实现对网织红细胞计数的质量控制。
本文中的所有数据、图像、仪器、试剂和步骤应理解为说明性而非限制性的。虽然已结合上述具体实施方案描述了本发明,许多修改和其它变化对于本领域技术人员是显而易见的。所有这种修改和其它变化也落入本发明的精神和范围内。
Claims (9)
1.一种制备网织红细胞模拟物的方法,所述方法包含以下步骤:
洗涤与分离抗凝含无核红细胞的血液,得到纯化的无核红细胞;
加入细胞处理液和固定剂,所述细胞处理液中含有蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂,对所述无核红细胞表面和/或胞内的物质进行处理和固定;
对所得的产物进行洗涤。
2.权利要求1的方法,其中所述蛋白质变性剂选自盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、硫酸铵及其组合。
3.权利要求1-2中任一项的方法,其中所述固定剂选自丙酮、乙二醛、丙酮醛、丁二醛、戊二醛、多聚甲醛、甲醛、乙醇及其组合。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述渗入性试剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、甲酰胺、乙酰胺及其组合。
6.权利要求1-5中任一项的方法,其中所述阳离子表面活性剂选自十六烷基三甲基氯化铵和十二烷基三甲基氯化铵,所述阴离子表面活性剂选自十二烷基磺酸钠,并且所述非离子表面活性剂选自聚乙二醇。
7.一种网织红细胞模拟物,所述网织红细胞模拟物通过权利要求1-6中任一项的方法制备。
8.一种全血质控物,所述全血质控物包含权利要求7的网织红细胞模拟物。
9.一种用于制备网织红细胞模拟物的组合物,所述组合物包含细胞处理液和固定剂,所述细胞处理液含有蛋白质变性剂以及任选的渗入性试剂和/或表面活性剂。
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