JP4338206B2

JP4338206B2 - 赤芽球の分類計数方法

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Publication number: JP4338206B2
Application number: JP2006118603A
Authority: JP
Inventors: 智悠辻; 孝坂田
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2006-04-23
Filing date: 2006-04-23
Publication date: 2009-10-07
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: JP2006208401A

Description

本発明はフローサイトメトリによる赤芽球の分類計数に関する。

臨床検査の分野において、赤芽球の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。

通常、赤芽球は骨髄中に存在し末梢血液中には存在しない。末梢血への赤芽球の出現は、急性骨髄性白血病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血等の疾患が存在する可能性を示しており、赤芽球の分類計数を行うことは、これらの疾患を診断する上で非常に有用である。

従来、赤芽球の分類計数を行うには、血液の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。

一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、赤芽球が出現した場合に、アブノーマルフラッグなどによって、赤芽球の存在する可能性があることを示唆するのみで、赤芽球を正確に分類計数する事はできなかった。

また、これとは別に特許文献１及び２に、赤芽球を分類計数する方法が開示されている。

これらの方法はいずれも、適当な溶血剤で赤血球系細胞の細胞膜のみを傷害し（色素の細胞膜透過性を付与する）、白血球系細胞の細胞膜を傷害しない（色素の細胞膜透過性を付与しない）溶解剤で処理した後に（あるいは同時に）、蛍光色素で細胞膜を傷害された赤芽球のみを染色し、その蛍光強度を測定することによって、赤芽球と白血球を弁別し、赤芽球を測定する方法である。

これらの方法は、採血直後の新鮮血液を用いる場合は正確な測定が可能であるが、採血後時間の経過とともに、赤芽球のみならず、白血球の細胞膜が傷害され易くなり、あるいは、溶血剤と混合する以前に細胞膜が傷害されるために、白血球の一部が蛍光色素によって染色されてしまう。特にリンパ球系細胞が傷害された場合、傷害されたリンパ球と赤芽球を明瞭に弁別することは困難であり、赤芽球を正確に分類計数することができなくなるという問題がある。また、一部のリンパ芽球出現検体、あるいは化学療法などによって、白血球系細胞の細胞膜が溶血剤による障害を受けやすくなった検体では採血直後でも正確に赤芽球を分類計数する事は困難である。

特開平４−２６８４５３号米国特許第５，５５９，０３７号

本発明は、採血後時間の経過した検体、あるいはダメージを受けやすい白血球が存在する場合でも、高精度で赤芽球を正確に分類計数する方法を提供することを目的とする。

本発明の赤芽球の分類計数方法は、以下の工程からなる：
１）試料を、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩を含有し、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下でｐＨ２．０〜５．０の水溶液である溶血剤と混合する工程、
２）１）で調製した試料と特定の蛍光色素を混合することにより、白血球と赤芽球を染色する工程、
３）２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する工程、及び
４）３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程。

本発明でいう試料とは、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシス等で採取した試料など、白血球、赤芽球を含む体液試料をいう。

本発明でいう、試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、白血球並びに赤芽球を染色に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、試料と適当な溶血剤を混合する工程である。適当な溶血剤は、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、ｐＨ２．０〜５．０の水溶液である。

本工程の目的は、通常白血球細胞の１０００倍の濃度で存在し、白血球、赤芽球を測定する上で障害となる赤血球を溶血することである。そして、これにより、赤芽球と白血球の間に蛍光強度の差異を生じさせることである。

赤血球は、若干の個体差はあるが通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明となる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、測定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。本発明で使用する溶血剤では、個体差を考慮して１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧を使用する。この浸透圧を達成するためには、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類又は後述の緩衝剤濃度などにより浸透圧を調整することができる。

ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球にも過度の傷害を与える為、後述する蛍光強度の差異が得にくくなる。

溶液のｐＨは、赤血球の溶血が効率よく行われるため、酸性側にすることが好適である。したがって、２．０〜５．０のｐＨが使用される。さらに好適には２．５〜４．５のｐＨが選ばれる。

また、ｐＨを一定に保つためには、緩衝剤を使用することが好適であり、設定するｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤が使用できる。例えば、クエン酸、リンゴ酸、ジグリコール酸、マロン酸などの緩衝剤を含むことができる。

さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有することにより、より効果的に（短時間に）赤血球を溶血することができる。好ましい有機酸としては、例えばサリチル酸、フタル酸などが挙げられる。

本条件下では赤芽球の細胞膜も赤血球と同様に細孔を生じ溶血するが、赤芽球細胞核の性状は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。

一方、白血球細胞の細胞膜への傷害は明確ではないが、光学的顕微鏡による観察では、生細胞と顕著な差異は認められない。

本発明で使用される溶血剤は、低張浸透圧で赤血球系細胞を溶血するもので、他の溶血剤で使用されるような各種界面活性剤、サポニン、アルコール類などの溶解剤、溶解補助剤は本質的に不要である。

しかしながら、難溶性の色素の可溶化剤や、赤血球ゴーストの凝集防止、ゴースト収縮、赤血球溶血促進などの目的で添加する界面活性剤、アルコール、サポニンなどを、含有しても良い。

しかしながら、多量の界面活性剤の存在は、特に赤芽球の核の性状を変化させ、後述する赤芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくするという問題があり好ましくない。

したがって、本発明に使用する溶血剤は、従来の溶血剤とは異なり、本質的に細胞成分を溶解する界面活性剤などの成分を含まない方が好ましい。

この結果、予期せぬことに、従来不可能であると考えられていた赤芽球と白血球間の明瞭な蛍光強度の差異を生じさせることができた。

少なくとも白血球と赤芽球を弁別可能に染色する特定の蛍光色素とは、以下の群からなる色素のうち少なくとも１種類が使用される。

（式中，Ｒ₁，Ｒ₂，は水素原子又は炭素数１−６のアルキル基又は水酸基で置換された炭素数１−６のアルキル基；Ｙ，Ｚは硫黄又は酸素又は窒素又はメチル及びエチルより選択される低級アルキル基を有する炭素；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである。）

（式中，Ｒ₁は水素原子又は炭素数１−６のアルキル基；Ｒ₂およびＲ₃は水素原子，メチル及びエチルより選択される低級アルキル基又はメトキシ及びエトキシより選択される低級アルコキシ基；Ｒ₄は水素原子又は炭素数１−１０のアルキル基；Ｚは硫黄，酸素，あるいはメチル及びエチルより選択される低級アルキル基を有する炭素；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである。）

（式中，Ｒ₁は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ₂は炭素数１−６のアルキル基，Ｒ₃は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである。）

式中、ヘテロ環の窒素原子に結合するアルキル基は、炭素数１−１０、好ましくは１−６のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルを挙げることができる。低級アルキル基又は低級アルコキシ基とは、メチル、エチル、メトキシ、エトキシである。好ましいアニオンには、Ｆ^-、Ｃｌ^-、Ｂｒ^-、Ｉ^-などのハロゲンイオン、及びＣＦ₃ＳＯ₃ ^-、ＢＦ₄ ^-、ＣｌＯ₄ ^-などを含む。

上記に記載した色素のうちＮＫシリーズは日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ７３０、ＬＤ７００はＥｘｃｉｔｏｎ社より、その他のものは市販品を購入することができる。

蛍光色素は、溶血剤に溶解させ、溶血剤と同時に血液に作用させても（混合させても）良いし、溶解処理（工程の）後、適当な溶媒（水、低級アルコール、エチレングリコール, ＤＭＳＯ、等）に溶解したものを添加しても良い。

色素の濃度は使用する色素により異なるが、一般に０．０１−１００ｍｇ／Ｌ、好ましくは０．１−１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３−３．０ｍｇ／Ｌである。なお、この濃度は溶血剤と色素溶液とを混合した状態での濃度である。

前述の溶血剤で処理した血球を上述の色素で染色した場合、白血球細胞は強く染色され、フローサイトメータで測定した場合強い蛍光を発する。一方赤芽球は弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球と赤芽球の蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく赤芽球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられる。

通常の溶血剤では、界面活性剤等が使用されているために、赤芽球の細胞核の凝集構造がゆるみ、白血球細胞と同程度の染色性を示してしまい、赤芽球と白血球を弁別することが困難になると考えられる。

本発明の好ましい態様では、サリチル酸などの有機酸、色素、及び所望によりポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤などの界面活性剤を精製水に溶解し、ＮａＯＨなどを用いてｐＨを調整して得られる簡単な組成の試薬を用いることができる。試薬を試料と混合し、１５−５０℃、好ましくは２０−４０℃で、５−１２０秒間、好ましくは１０−４０秒間反応させる。

このようにして調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する。

本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低角散乱光（受光角度０〜５度付近）、前方高角散乱光（受光角度５〜２０度付近）等をいい、白血球の大きさ情報を反映する散乱角度が選ばれる。このうち低角前方散乱光がより好適である。

蛍光とは、前述の細胞成分と結合した色素から発せられるもので、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。

フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。

次いで、測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する。「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に前方低角散乱光、Ｙ軸に蛍光をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、各細胞は集団（クラスター）を形成して分布する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトで解析することにより、赤芽球の数と割合を算出する、工程をいう。

本発明の方法を用いると、採血後時間の経過した検体、あるいはダメージを受けやすい白血球が存在する場合でも、高精度で赤芽球を正確に分類計数することができる。また、本発明の方法はフローサイトメータを用いることにより短時間で効率よく赤芽球の分類計数を行うことができ、各種疾患の診断に有用な情報を提供することができる。

本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、したがって、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。

実施例１
以下の組成の試薬を調製した。
サリチル酸１０ｍＭ市販品
ＮＫ−２８２５０．３ｍｇ／Ｌ日本感光色素研究所（株）
ＢＣ−２０ＴＸ３ｇ／Ｌ日光ケミカルズ（株)
精製水１Ｌ
なお、この水溶液試薬は、ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧３０ｍＯｓｍ／ｋｇ）した。また、上記ＢＣ−２０ＴＸとは、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルのである。

上記試薬１．０ｍｌに抗凝固剤処理した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液３０μｌを加え、３５℃で１０秒間反応させたのちフローサイトメータで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。

図２にＸ軸に前方低角散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラムを示す。血球は単核球（リンパ球, 単球）、顆粒球（好中球, 好酸球, 好塩基球）、赤芽球の３つの集団を形成する。

実施例２
以下の組成の試薬を調製した。
サリチル酸１０ｍＭ市販品
ＮＫ−３２１０．３ｍｇ／Ｌ日本感光色素研究所（株）
ＢＯ−１６３ｇ／Ｌ日光ケミカルズ（株)
精製水１Ｌ
なお、この水溶液試薬は、ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧３２ｍＯｓｍ／ｋｇ）した。また、上記ＮＫ−３２１とは、日本感光色素研究所（株）から提供されている請求項１記載の化２の化学式を持つ色素であり、上記ＢＯ−１６とは、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルである。

図３にＸ軸に前方低角散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラムを示す。血球は単核球（リンパ球, 単球）、顆粒球（好中球, 好酸球, 好塩基球）、赤芽球の３つの集団を形成する。

実施例３
以下の組成の試薬を調製した。
サリチル酸１０ｍＭ市販品
ＮＫ−１８３６３ｍｇ／Ｌ日本感光色素研究所（株）
精製水１Ｌ
なお、この水溶液試薬は、ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）した。

図４にＸ軸に前方低角散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラムを示す。血球は単核球（リンパ球, 単球）、顆粒球（好中球, 好酸球, 好塩基球）、赤芽球の３つの集団を形成する。

実施例４
以下の組成の試薬を調製した。
サリチル酸１０ｍＭ市販品
ＤｉＩＣ１（５）３ｍｇ／Ｌ日本感光色素研究所（株）
精製水１Ｌ
なお、この水溶液試薬は、ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）した。また、上記ＤｉＩＣ１（５）とは、日本感光色素研究所（株）から提供されている請求項１記載の化１の化学式を持つ色素である。

図５にＸ軸に前方低角散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラムを示す。血球は単核球（リンパ球, 単球）、顆粒球（好中球, 好酸球, 好塩基球）、赤芽球の３つの集団を形成する。

各々の集団にウインドウを設けウィンドウ内の細胞数の計数、細胞比率の算出を行う。

実施例５
以下の組成の試薬を調整した。
サリチル酸１０ｍＭ市販品
クエン酸１０ｍＭ市販品
ＮＫ−１８３６０．３ｍｇ／Ｌ日本感光色素研究所（株）
精製水１Ｌ
なお、この水溶液試薬は、ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧４０ｍＯｓｍ／ｋｇ）した。

上記試薬１．０ｍＬに抗凝固剤処理した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液３０μｌを加え、３５℃で１０秒間反応させたのちフローサイトメータで、前方低角酸乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍ赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。

図６にＸ軸に前方低角散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラムを示す。血球は単核球（リンパ球、単球）、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、赤芽球の３つの集団を形成する。

各々の集団にウインドウを設けウインドウ内の細胞数の計数、細胞比率の算出を行う。

図７に用手法（メイーグリュンワルド−ギムザ染色、５００カウント）と本法を用いた場合の測定結果の相関図を示す。

本発明の方法を用いて測定した血液試料の前方低角散乱強度−赤蛍光強度スキャッタグラムの一例である。実施例１の試薬で測定した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液試料の前方低角散乱強度−赤蛍光強度スキャッタグラムである。実施例２の試薬で測定した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液試料の前方低角散乱強度−赤蛍光強度スキャッタグラムである。実施例３の試薬で測定した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液試料の前方低角散乱強度−赤蛍光強度スキャッタグラムである。実施例４の試薬で測定した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液試料の前方低角散乱強度−赤蛍光強度スキャッタグラムである。実施例５の試薬で測定した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液試料の前方低角散乱強度−赤蛍光強度スキャッタグラムである。用手法と本発明の方法を用いて得られた測定結果の相関図を示す。

Claims

以下の工程からなる赤芽球分類計数方法：
１）試料を、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩を含有し、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下でｐＨ２．０〜５．０の水溶液である溶血剤と混合する工程、
２）１）で調製した試料と以下の化１乃至化１６の化合物よりなる群から選ばれる蛍光色素を混合することにより、白血球と赤芽球を染色する工程、
３）２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する工程、及び
４）３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程。

（式中，Ｒ₁，Ｒ₂，は水素原子又は炭素数１−６のアルキル基又は水酸基で置換された炭素数１−６のアルキル基；Ｙ，Ｚは硫黄又は酸素又は窒素又はメチル及びエチルより選択される低級アルキル基を有する炭素；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである。）

（式中，Ｒ₁は水素原子又は炭素数１−６のアルキル基；Ｒ₂およびＲ₃は水素原子，メチル及びエチルより選択される低級アルキル基又はメトキシ及びエトキシより選択される低級アルコキシ基；Ｒ₄は水素原子又は炭素数１−１０のアルキル基；Ｚは硫黄，酸素，あるいはメチル及びエチルより選択される低級アルキル基を有する炭素；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである。）

（式中，Ｒ₁は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ₂は炭素数１−６のアルキル基，Ｒ₃は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは１又は２；Ｘ^-はアニオンである。）
分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩が、サリチル酸又はその塩である請求項１記載の赤芽球分類計数方法。
散乱光の受光角度が、前方低角散乱光、前方高角散乱光、から選ばれる少なくとも一つである請求項１記載の赤芽球分類計数方法。