JP4489978B2 - 損傷細胞分類計数方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はフローサイトメトリによる損傷細胞の分類計数に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、白血球の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上できわめて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５つの正常白血球が一定の比率で存在する。疾患の存在により、これらの白血球の比率は変動されることがあり、これらの正常白血球を分類計数することにより、各白血球の比率を測定することは有用である。
【０００３】
近年、医療費の削減により、一般病院では血液検査を検査センターなどに依頼することが多くなっている。従って、検査センターなどでは、採血後時間が経過した検体や保存状態が悪い検体が送られてくる場合がある。採血後時間が経過したり、保存状態が悪いと、白血球細胞は損傷を受けて、非常に細胞膜が壊れやすい状態になっている。
【０００４】
従来、全自動白血球分類計数装置では、このような検体の白血球を正確に分類計数することができず、何らかの疾患の存在を認めるフラッグを出力していた。この場合、目視による再検を行う必要性が生じることになる。このようなことが頻繁に発生すると、検査の非効率化やコスト高を招く恐れがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、採血後時間が経過した検体や保存状態が悪い検体でも、正確に白血球の分類計数が行うことができる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の工程：
（１）試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、白血球および損傷細胞を測定に好適な状態にする溶血剤と混合する工程
（２）（１）で調製した試料をフローサイトメーターで測定し、少なくとも２つの散乱光を測定する工程
（３）（２）で測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を２軸として、２次元分布を得る工程、
（４）２次元分布から、正常な白血球を少なくとも４つに分類計数する工程
（５）２次元分布から、損傷リンパ球の領域を設定し、損傷リンパ球を分類計数する工程
（６）２次元分布から、損傷単球の領域を設定し、損傷単球を分類計数する工程
（７）２次元分布から、損傷好中球の領域を設定し、損傷好中球を分類計数する工程
（８）２次元分布から、損傷好酸球の領域を設定し、損傷好酸球を分類計数する工程
（９）（４）で測定したリンパ球数と（５）で測定した損傷リンパ球数を用いて、リンパ球数を補正する工程
（１０）（４）で測定した単球数と（６）で測定した損傷単球数を用いて、単球数を補正する工程
（１１）（４）で測定した好中球数と（７）で測定した損傷好中球数を用いて、好中球数を補正する工程
（１２）（４）で測定した好酸球数と（８）で測定した損傷好酸球数を用いて、好酸球数を補正する工程。
からなる損傷細胞分類計数方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明でいう血液試料とは、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血液試料など、白血球を含む体液試料をいう。
【０００８】
本発明でいう損傷細胞とは、採血後時間が経過したり、保存状態が悪いために、細胞膜が壊れやすくなっている白血球のことをいう。
【０００９】
本発明でいう、血液試料中の赤血球を測定の障害とならないように溶解し、白血球及び損傷細胞を測定に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、血液試料を適当な溶血剤と混合する工程である。
【００１０】
本工程の目的は、赤血球を測定の障害とならないように溶解するだけである。この目的に使用する溶血剤は、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ４．５〜１１．０の水溶液である。
【００１１】
カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウム塩型およびピリジニウム塩型界面活性剤は、
【００１２】
【化１】
【００１３】
〔Ｒ1は炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基、Ｒ2およびＲ3は炭素数１〜４のアルキル又はアルケニル基、Ｒ4は炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。〕で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。Ｒ1の炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基としてはへキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ2およびＲ3の炭素数１〜４のアルキル、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ4の炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。
【００１４】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい：Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２５のアルキル、アルケニル又はアルキニル基；Ｒ2はＯ、
【００１５】
【化２】
またはＣＯＯ；ｎは１０〜５０の整数を表す。〕
【００１６】
溶血剤の組成は特に限定されるものではないが、例えば、特開平６−２０７９２号、特開平７−１８１１７７号に記載の溶血剤などが好適に使用される。
【００１７】
さらに、少なくとも１つの、分子内に１つの芳香環を有する有機酸を含有することは、白血球および損傷細胞の散乱光強度分布を、分類に好適なように調整するために好適である。
【００１８】
例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ヘンゼンスルホン酸などが好適に使用できる。好ましくは0.1〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１０〜３０ｍＭの濃度範囲で使用できる。
【００１９】
これらの有機酸を含有することにより、特に好酸球の散乱光強度が増加し、結果として、好中球と好酸球の分離が改善される。
【００２０】
ｐＨが４．５よりも低い場合、好酸球の分離が悪くなり、正常白血球を分画することが困難になる。ｐＨ１１．０よりも高い場合は、白血球が損傷を受けやすくなり、好ましくない。
【００２１】
本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメーターで測定できる散乱光であり、側方散乱光、前方低角散乱光（受光角度０〜５度付近）、前方高角散乱光（５〜２０度付近）等をいい、白血球の大きさもしくは内部構造情報を反映する散乱角度が選ばれる。
【００２２】
異なる２つの散乱光の１つに前方散乱光（低角でも高角でもどちらでも良い）を使用すると、細胞の大きさに関する情報が得られる。
【００２３】
フローサイトメーターの光源は、特に限定されず、例えば、アルゴンイオンレーザー、Ｈｅ／Ｎｅレーザー、赤色半導体レーザー、水銀アークランプなどが使用される。
【００２４】
特に半導体レーザーは気体レーザーに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができるため、好適である。
【００２５】
「測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を２軸として２次元分布を得る工程」とは、例えば、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方散乱光をとって２次元分布を描くことである。
【００２６】
「２次元分布から、正常な白血球を少なくとも４つに分類計数する工程」とは、例えば、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方散乱光をとって、２次元分布を描くと、図１に示すように、各白血球細胞は細胞毎に集団を形成する。この集団を適当な解析ソフトで解析することにより、各白血球集団の数と割合を算出する。
【００２７】
「２次元分布から、損傷白血球の領域を設定し、損傷白血球を分類計数する工程」とは、例えば、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方散乱光をとって、２次元分布を描くと、図２に示すように、損傷リンパ球(Damaged Lymph)は集団を形成する。この集団を適当な解析ソフトで解析することにより、損傷リンパ球集団の数と割合を算出する。損傷単球(Damaged Mono)、損傷好中球(Damaged Neut)、損傷好酸球(Damaged Eo)も同様にして、各集団の数と割合を算出する。
【００２８】
【実施例】
実施例１ 採血後時間が経過した場合
以下の組成の試薬を調製した。
HEPES（市販品） 10mM
フタル酸2Na（市販品） 20ｍＭ
BC30TX（ポリオキシエチレン(30)セチルエーテル） 1500ppm
（日光ケミカルズ（株））
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（市販品） 550ppm
NaOHでpHを7.0に調整。
【００２９】
上記試薬1.0mlに抗凝固剤処理した健常人の採血直後および採血後4℃で72時間経過した血液をそれぞれ30μｌずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、FCMで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【００３０】
図３にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった採血直後のスキャッタグラムを示す。
【００３１】
図４にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった72時間後のスキャッタグラムを示す。
【００３２】
図５に採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率を示す。本法による補正により採血後時間が経過した場合でも、採血直後と同様の結果が得られた。
【００３３】
実施例２ 保存状態が悪い場合
実施例１の試薬1.0mlに抗凝固剤処理した健常人の採血直後および室温で48時間保存した血液をそれぞれ30μｌずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、FCMで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【００３４】
図６にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった採血直後のスキャッタグラムを示す。
【００３５】
図７にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった室温で保存した場合のスキャッタグラムを示す。
【００３６】
図８に採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率を示す。本法による補正により保存状態が悪い場合でも、採血直後と同様の結果が得られた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、採血後時間が経過した検体や保存状態が悪い検体でも、正確に白血球の分類計数が行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各白血球細胞の２次元分布図の模式図である。
【図２】損傷細胞が出現した場合の各白血球細胞の２次元分布図である。
【図３】本発明の実施例１における採血直後のスキャッタグラムである。
【図４】本発明の実施例１における4℃で72時間保存後のスキャッタグラムである。
【図５】本発明の実施例１における採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率である。
【図６】本発明の実施例２における採血直後のスキャッタグラムである。
【図７】本発明の実施例２における室温で48時間保存した場合のスキャッタグラムである。
【図８】本発明の実施例２における採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率である。
【発明の属する技術分野】
本発明はフローサイトメトリによる損傷細胞の分類計数に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、白血球の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上できわめて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球の５つの正常白血球が一定の比率で存在する。疾患の存在により、これらの白血球の比率は変動されることがあり、これらの正常白血球を分類計数することにより、各白血球の比率を測定することは有用である。
【０００３】
近年、医療費の削減により、一般病院では血液検査を検査センターなどに依頼することが多くなっている。従って、検査センターなどでは、採血後時間が経過した検体や保存状態が悪い検体が送られてくる場合がある。採血後時間が経過したり、保存状態が悪いと、白血球細胞は損傷を受けて、非常に細胞膜が壊れやすい状態になっている。
【０００４】
従来、全自動白血球分類計数装置では、このような検体の白血球を正確に分類計数することができず、何らかの疾患の存在を認めるフラッグを出力していた。この場合、目視による再検を行う必要性が生じることになる。このようなことが頻繁に発生すると、検査の非効率化やコスト高を招く恐れがある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、採血後時間が経過した検体や保存状態が悪い検体でも、正確に白血球の分類計数が行うことができる方法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の工程：
（１）試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、白血球および損傷細胞を測定に好適な状態にする溶血剤と混合する工程
（２）（１）で調製した試料をフローサイトメーターで測定し、少なくとも２つの散乱光を測定する工程
（３）（２）で測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を２軸として、２次元分布を得る工程、
（４）２次元分布から、正常な白血球を少なくとも４つに分類計数する工程
（５）２次元分布から、損傷リンパ球の領域を設定し、損傷リンパ球を分類計数する工程
（６）２次元分布から、損傷単球の領域を設定し、損傷単球を分類計数する工程
（７）２次元分布から、損傷好中球の領域を設定し、損傷好中球を分類計数する工程
（８）２次元分布から、損傷好酸球の領域を設定し、損傷好酸球を分類計数する工程
（９）（４）で測定したリンパ球数と（５）で測定した損傷リンパ球数を用いて、リンパ球数を補正する工程
（１０）（４）で測定した単球数と（６）で測定した損傷単球数を用いて、単球数を補正する工程
（１１）（４）で測定した好中球数と（７）で測定した損傷好中球数を用いて、好中球数を補正する工程
（１２）（４）で測定した好酸球数と（８）で測定した損傷好酸球数を用いて、好酸球数を補正する工程。
からなる損傷細胞分類計数方法を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明でいう血液試料とは、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血液試料など、白血球を含む体液試料をいう。
【０００８】
本発明でいう損傷細胞とは、採血後時間が経過したり、保存状態が悪いために、細胞膜が壊れやすくなっている白血球のことをいう。
【０００９】
本発明でいう、血液試料中の赤血球を測定の障害とならないように溶解し、白血球及び損傷細胞を測定に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、血液試料を適当な溶血剤と混合する工程である。
【００１０】
本工程の目的は、赤血球を測定の障害とならないように溶解するだけである。この目的に使用する溶血剤は、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、ｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ４．５〜１１．０の水溶液である。
【００１１】
カチオン性界面活性剤としては、４級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。４級アンモニウム塩型およびピリジニウム塩型界面活性剤は、
【００１２】
【化１】
〔Ｒ1は炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基、Ｒ2およびＲ3は炭素数１〜４のアルキル又はアルケニル基、Ｒ4は炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基又はベンジル基、Ｘはハロゲン原子である。〕で表される全炭素数９〜３０の界面活性剤が挙げられる。Ｒ1の炭素数６〜１８のアルキル又はアルケニル基としてはへキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、Ｒ2およびＲ3の炭素数１〜４のアルキル、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。さらに、Ｒ4の炭素数１〜４のアルキルおよびアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数１〜３のアルキル基が好ましい。
【００１４】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい：Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ〔式中、Ｒ1は炭素数８〜２５のアルキル、アルケニル又はアルキニル基；Ｒ2はＯ、
【００１５】
【化２】
【００１６】
溶血剤の組成は特に限定されるものではないが、例えば、特開平６−２０７９２号、特開平７−１８１１７７号に記載の溶血剤などが好適に使用される。
【００１７】
さらに、少なくとも１つの、分子内に１つの芳香環を有する有機酸を含有することは、白血球および損傷細胞の散乱光強度分布を、分類に好適なように調整するために好適である。
【００１８】
例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ヘンゼンスルホン酸などが好適に使用できる。好ましくは0.1〜１００ｍＭ、より好ましくは１〜５０ｍＭ、さらに好ましくは１０〜３０ｍＭの濃度範囲で使用できる。
【００１９】
これらの有機酸を含有することにより、特に好酸球の散乱光強度が増加し、結果として、好中球と好酸球の分離が改善される。
【００２０】
ｐＨが４．５よりも低い場合、好酸球の分離が悪くなり、正常白血球を分画することが困難になる。ｐＨ１１．０よりも高い場合は、白血球が損傷を受けやすくなり、好ましくない。
【００２１】
本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメーターで測定できる散乱光であり、側方散乱光、前方低角散乱光（受光角度０〜５度付近）、前方高角散乱光（５〜２０度付近）等をいい、白血球の大きさもしくは内部構造情報を反映する散乱角度が選ばれる。
【００２２】
異なる２つの散乱光の１つに前方散乱光（低角でも高角でもどちらでも良い）を使用すると、細胞の大きさに関する情報が得られる。
【００２３】
フローサイトメーターの光源は、特に限定されず、例えば、アルゴンイオンレーザー、Ｈｅ／Ｎｅレーザー、赤色半導体レーザー、水銀アークランプなどが使用される。
【００２４】
特に半導体レーザーは気体レーザーに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができるため、好適である。
【００２５】
「測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を２軸として２次元分布を得る工程」とは、例えば、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方散乱光をとって２次元分布を描くことである。
【００２６】
「２次元分布から、正常な白血球を少なくとも４つに分類計数する工程」とは、例えば、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方散乱光をとって、２次元分布を描くと、図１に示すように、各白血球細胞は細胞毎に集団を形成する。この集団を適当な解析ソフトで解析することにより、各白血球集団の数と割合を算出する。
【００２７】
「２次元分布から、損傷白血球の領域を設定し、損傷白血球を分類計数する工程」とは、例えば、Ｘ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方散乱光をとって、２次元分布を描くと、図２に示すように、損傷リンパ球(Damaged Lymph)は集団を形成する。この集団を適当な解析ソフトで解析することにより、損傷リンパ球集団の数と割合を算出する。損傷単球(Damaged Mono)、損傷好中球(Damaged Neut)、損傷好酸球(Damaged Eo)も同様にして、各集団の数と割合を算出する。
【００２８】
【実施例】
実施例１ 採血後時間が経過した場合
以下の組成の試薬を調製した。
HEPES（市販品） 10mM
フタル酸2Na（市販品） 20ｍＭ
BC30TX（ポリオキシエチレン(30)セチルエーテル） 1500ppm
（日光ケミカルズ（株））
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド（市販品） 550ppm
NaOHでpHを7.0に調整。
【００２９】
上記試薬1.0mlに抗凝固剤処理した健常人の採血直後および採血後4℃で72時間経過した血液をそれぞれ30μｌずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、FCMで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【００３０】
図３にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった採血直後のスキャッタグラムを示す。
【００３１】
図４にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった72時間後のスキャッタグラムを示す。
【００３２】
図５に採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率を示す。本法による補正により採血後時間が経過した場合でも、採血直後と同様の結果が得られた。
【００３３】
実施例２ 保存状態が悪い場合
実施例１の試薬1.0mlに抗凝固剤処理した健常人の採血直後および室温で48時間保存した血液をそれぞれ30μｌずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、FCMで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【００３４】
図６にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった採血直後のスキャッタグラムを示す。
【００３５】
図７にＸ軸に側方散乱光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとった室温で保存した場合のスキャッタグラムを示す。
【００３６】
図８に採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率を示す。本法による補正により保存状態が悪い場合でも、採血直後と同様の結果が得られた。
【００３７】
【発明の効果】
本発明によれば、採血後時間が経過した検体や保存状態が悪い検体でも、正確に白血球の分類計数が行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】各白血球細胞の２次元分布図の模式図である。
【図２】損傷細胞が出現した場合の各白血球細胞の２次元分布図である。
【図３】本発明の実施例１における採血直後のスキャッタグラムである。
【図４】本発明の実施例１における4℃で72時間保存後のスキャッタグラムである。
【図５】本発明の実施例１における採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率である。
【図６】本発明の実施例２における採血直後のスキャッタグラムである。
【図７】本発明の実施例２における室温で48時間保存した場合のスキャッタグラムである。
【図８】本発明の実施例２における採血直後、本法による補正前、本法による補正後の各細胞比率である。
Claims (4)
- 以下の工程からなる損傷細胞分類計数方法。
（１）少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、及びｐＨを一定に保つための緩衝剤を含むｐＨ４．５〜１１．０の水溶液である溶血剤と試料とを混合する工程
（２）（１）で調製した試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも２つの散乱光を測定する工程
（３）（２）で測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を２軸として、２次元分布を得る工程、
（４）２次元分布から、正常な白血球を少なくとも４つに分類計数する工程
（５）２次元分布から、損傷細胞の領域を設定し、損傷細胞を分類計数する工程
（６）（４）で測定した白血球数と（５）で測定した損傷細胞数を用いて、白血球数を補正する工程。 - 白血球が、リンパ球、単球、好中球または好酸球であり、損傷細胞が、損傷リンパ球、損傷単球、損傷好中球または損傷好酸球である請求項１記載の損傷細胞分類計数方法。
- 溶血剤が、少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有する請求項１又は２に記載の損傷細胞分類計数方法。
- 散乱光の受光角度が、前方低角散乱光、前方高角散乱光、側方散乱光から選ばれる少なくとも２つである請求項１〜３のいずれか一項に記載の損傷細胞分類計数方法。
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