JP4484375B2 - 異常細胞検出方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明はフローサイトメトリによる異常細胞の検出に関する。
【0002】
【従来の技術】
一般に白血病などの血液における腫瘍化の診断は、細胞表面に出現する抗原(表面マーカー)の測定や腫瘍化を特定する遺伝子の同定、顕微鏡観察による形態学的判定などを組み合わせて行われる。例えば、ATL(成人T細胞白血病)症例において血液中の腫瘍化細胞を検出するには、色素で標識したモノクローナル抗体を使用して疾患特異的に出現する表面抗原を検出する方法や特定の原因遺伝子(HTLV−I遺伝子)を検出する方法などがある。
【0003】
近年、フローサイトメータの普及により、色素で標識したモノクローナル抗体を用いて、リンパ球などの細胞表面マーカーの測定が頻繁に行われている。この方法は、測定結果が得られるまでに時間を要する、種々の抗体を使用するためコストがかかるという欠点がある。また、顕微鏡による形態学的観察では、種々の染色法と細胞形態とを組み合わせて判定するが、一部の腫瘍細胞は、正常細胞と区別ができない、観察者によって結果が異なるなどの欠点が挙げられる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、短時間、低コストで、精度良く腫瘍細胞を検出する方法を提供することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の工程:
(1)試料を、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解し、白血球および異常細胞を測定に好適な状態にする溶血剤と混合する工程
(2)(1)で調製した試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも2つの散乱光を測定する工程
(3)(2)で測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を2軸として、2次元分布を得る工程、
(4)2次元分布から、正常な白血球を少なくとも4つに分類計数する工程
(5)2次元分布から、リンパ球系腫瘍細胞の分布領域を設定し、リンパ球系腫瘍細胞を検出する工程
(6)2次元分布から、血小板凝集または大型血小板の分布領域を設定し、血小板凝集または大型血小板を検出する工程
(7)2次元分布から、芽球の分布領域を設定し、芽球を検出する工程
からなる異常細胞検出方法を提供する。
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明でいう血液試料とは、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシスで採取した血液試料など、白血球を含む体液試料をいう。
【0007】
本発明でいうリンパ球系腫瘍細胞とは、白血病によって腫瘍化したリンパ球のことをいう。
【0008】
本発明でいう、血液試料中の赤血球を測定の障害とならないように溶解し、白血球及び異常細胞を測定に好適な状態にする溶血剤と混合する工程とは、血液試料を適当な溶血剤と混合する工程である。
【0009】
本工程の目的は、赤血球を測定の障害とならないように溶解するだけである。この目的に使用する溶血剤は、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのノニオン性界面活性剤、pHを一定に保つための緩衝剤を含むpH4.5〜11.0の水溶液である。
【0010】
カチオン性界面活性剤としては、4級アンモニウム塩型界面活性剤又はピリジニウム塩型界面活性剤が好ましい。4級アンモニウム塩型およびピリジニウム塩型界面活性剤は、
【0011】
【化1】
【0012】
〔R1は炭素数6〜18のアルキル又はアルケニル基、R2およびR3は炭素数1〜4のアルキル又はアルケニル基、R4は炭素数1〜4のアルキルおよびアルケニル基又はベンジル基、Xはハロゲン原子である。〕で表される全炭素数9〜30の界面活性剤が挙げられる。R1の炭素数6〜18のアルキル又はアルケニル基としてはへキシル、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル等を挙げることができるが、とりわけオクチル、デシル、ドデシル等の直鎖のアルキル基が好ましい。また、R2およびR3の炭素数1〜4のアルキル、アルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数1〜3のアルキル基が好ましい。さらに、R4の炭素数1〜4のアルキルおよびアルケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル等を挙げることができるが、とりわけ、メチル、エチル、プロピル等の炭素数1〜3のアルキル基が好ましい。
【0013】
ノニオン性界面活性剤としては以下の式のポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい:R1−R2−(CH2CH2O)n−H〔式中、R1は炭素数8〜25のアルキル、アルケニル又はアルキニル基;R2はO、
【0014】
【化2】
またはCOO;nは10〜50の整数を表す。〕
【0015】
溶血剤の組成は特に限定されるものではないが、例えば、特開平6−20792号、特開平7−181177号に記載の溶血剤などが好適に使用される。
【0016】
さらに、少なくとも1つの、分子内に1つの芳香環を有する有機酸を含有することは、白血球および異常細胞を分類に好適なように調整するために好適である。例えば、安息香酸、フタル酸、馬尿酸、サリチル酸、p−アミノベンゼンスルホン酸、ヘンゼンスルホン酸などが好適に使用できる。好ましくは0.1〜100mM、より好ましくは1〜50mM、さらに好ましくは10〜30mMの濃度範囲で使用できる。
【0017】
これらの有機酸を含有することにより、特に好酸球の散乱光強度が増加し、結果として、好中球と好酸球の分離が改善される。
【0018】
pHが4.5よりも低い場合、好酸球の分離が悪くなり、正常白血球を分画することが困難になる。pH11.0よりも高い場合は、白血球が損傷を受けやすくなり、好ましくない。
【0019】
本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメーターで測定できる散乱光であり、側方散乱光、前方低角散乱光(受光角度0〜5度付近)、前方高角散乱光(5〜20度付近)等をいい、白血球の大きさもしくは内部構造情報を反映する散乱角度が選ばれる。
【0020】
異なる2つの散乱光の1つに前方散乱光(低角でも高角でもどちらでも良い)を使用すると、細胞の大きさに関する情報が得られる。
【0021】
フローサイトメーターの光源は、特に限定されず、例えば、アルゴンイオンレーザー、He/Neレーザー、赤色半導体レーザー、水銀アークランプなどが使用される。特に半導体レーザーは気体レーザーに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができるため、好適である。
【0022】
「測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を2軸として2次元分布を得る工程」とは、例えば、X軸に側方散乱光、Y軸に前方散乱光をとって2次元分布を描くことである。
【0023】
「2次元分布から、正常な白血球を少なくとも4つに分類計数する工程」とは、例えば、X軸に側方散乱光、Y軸に前方散乱光をとって、2次元分布を描くと、図1に示すように、各白血球細胞は細胞毎に集団を形成する。この集団を適当な解析ソフトで解析することにより、各白血球集団の数と割合を算出する。
【0024】
「2次元分布から、リンパ球系腫瘍細胞集団、血小板凝集または大型血小板の集団、または芽球集団の分布領域を設定し、リンパ球系腫瘍細胞、血小板凝集または大型血小板、または芽球を検出する工程」とは、例えば、X軸に側方散乱光、Y軸に前方散乱光をとって、2次元分布を描くと、図1に示すように、リンパ球系腫瘍細胞は集団を形成する。この集団を適当な解析ソフトで解析することにより、リンパ球系腫瘍細胞集団の数を算出する。血小板凝集、大型血小板、芽球も同様にして、各集団の数を算出する。各集団の数にはそれぞれ閾値を設定しておき、その設定値を超えたらメッセージを表示する。
【0025】
【実施例】
実施例1 リンパ球腫瘍細胞出現例
以下の組成の試薬を調製した。
HEPES(市販品) 10mM
フタル酸2Na(市販品) 20mM
BC30TX(ポリオキシエチレン(30)セチルエーテル) 1500ppm
(日光ケミカルズ(株))
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド(市販品) 550ppm
NaOHでpHを7.0に調整。
【0026】
上記試薬1.0mlに抗凝固剤処理した健常者およびATL患者の血液をそれぞれ30μlずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、フローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【0027】
図2にX軸に側方散乱光、Y軸に前方低角散乱光をとった健常人のスキャッタグラムを示す。
【0028】
図3にX軸に側方散乱光、Y軸に前方低角散乱光をとったATL患者のスキャッタグラムを示す。リンパ球領域(Lymph)よりも前方散乱光強度の低い位置に集団が認められ、本法によりリンパ球系腫瘍細胞であるATL細胞が検出できることが確認された。
【0029】
実施例2 血小板凝集出現例
実施例1の試薬1.0mlに抗凝固剤処理した血小板凝集が出現した血液をそれぞれ30μlずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、フローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【0030】
図4にX軸に側方散乱光、Y軸に前方低角散乱光をとった血小板凝集のスキャッタグラムを示す。リンパ球領域(Lymph)とゴースト領域(Ghost)の間に集団が認められ(PLT Clumps)、本法により血小板凝集が検出できることが確認された。
【0031】
実施例3 大型血小板出現例
実施例1の試薬1.0mlに抗凝固剤処理した大型血小板が出現した血液をそれぞれ30μlずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、フローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【0032】
図5にX軸に側方散乱光、Y軸に前方低角散乱光をとった大型血小板のスキャッタグラムを示す。リンパ球領域(Lymph)とゴースト領域の間に集団(Ghost)が認められ(Large PLT)、本法により大型血小板が検出できることが確認された。
【0033】
実施例4 芽球出現例
実施例1の試薬1.0mlに抗凝固剤処理した芽球が出現した血液をそれぞれ30μlずつ加え、35℃で40秒間反応させた後、フローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光を測定した。光源は633nmの赤色半導体レーザを使用した。
【0034】
図6にX軸に側方散乱光、Y軸に前方低角散乱光をとった芽球のスキャッタグラムを示す。単球領域(Mono)の左上方に集団が認められ(Blast)、本法により芽球が検出できることが確認された。
【0035】
【発明の効果】
本発明によれば、短時間、低コストで、精度良く腫瘍細胞などの異常細胞を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】白血球及び異常細胞のスキャッタグラムの模式図である。
【図2】本発明の実施例1における健常人のスキャッタグラムである。
【図3】本発明の実施例1におけるATL患者のスキャッタグラムである。
【図4】本発明の実施例2における血小板凝集のスキャッタグラムである。
【図5】本発明の実施例3における大型血小板のスキャッタグラムである。
【図6】本発明の実施例4における芽球のスキャッタグラムである。
Claims (3)
- 以下の工程からなる異常細胞検出方法;
(1)試料を、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤、少なくとも一つのカチオン性界面活性剤及びpHを一定に保つための緩衝液を含むpH4.5〜11.0の水溶液である溶血剤と混合する工程
(2)(1)で調製した試料をフローサイトメーターで測定し、少なくとも2つの散乱光を測定する工程
(3)(2)で測定した個々の細胞の散乱光信号から異なる散乱光を2軸として、2次元分布を得る工程、
(4)2次元分布から、正常な白血球を少なくとも4つに分類計数する工程
(5)2次元分布から、リンパ球系腫瘍細胞集団、血小板凝集または大型血小板の集団、または芽球集団の分布領域を設定し、リンパ球系腫瘍細胞、血小板凝集または大型血小板、または芽球を検出する工程。 - 溶血剤が、少なくとも1つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有する請求項1に記載の異常細胞検出方法。
- 散乱光の受光角度が、前方低角散乱光、前方高角散乱光、側方散乱光から選ばれる少なくとも2つである請求項1または2記載の異常細胞検出方法。
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