JPH06505099A - 偏光光散乱手法を用いて微視的細胞をスクリーニングする方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 偏光光散乱手法を用いて微視的細胞をスクリーニングする方法および装置 技術分野 本発明は一般に、偏光散乱手法を用いて、選択された特性を示す微視的細胞をス クリーニングする方法および装置に関する。

さらに特に、本発明は、モノクローナル抗体か結合したミクロスフイアを用いる ことにより細胞集団中の不明確な関連する１つ以上の細胞群を分析して各々の特 定した細胞の検出された特性を変化させて関連する細胞群の細胞を細胞集団と区 別することを目的とする。

背景技術 本発明は一般に、研究、診断、医学または工業的目的で、選択された特性を示す 集団の計数のために生物細胞または形成体をスクリーニングする自動分析装置お よびこれを用いる方法に関する。さらに特に、本発明を実施する自動分析装置お よび方法により、細胞および形成体の多部分分類、細胞および形成体の機能的表 現型、白血病性、リンパ腫および固体腫瘍細胞の分類を、とりわけ光学的または 光学的および電子的手法の独特な組み合わせ並びに選択的生物分子、例えば抗体 の特異性を用いて、細胞および形成体をこのようにスクリーニングし、選択的に 計数することが可能になる。

自動血液細胞カウンターによるヒト末梢性血液の慣例的な完全血液細胞（ＣＢＣ ）分析の自動化は、アメリカ合衆国フロリダ州バイアレア所在のクールター・エ レクトロニクス（ＣｏｕｌｔｅｒＥｌｅｃｅｒｏｎｉｃｓ）製のクールター・カ ウンター（ＣＯυＬＴＥＲＣＯ［ＪＮＴＥＲ）（登録商標）モデルＡにより好首 尾に達成された。この器機の電子的粒子検出システム原理は、Ｗａｌｌａｃｅ　 Ｈ，Ｃｏｕｌｔｅｒの米国特許第２，６５６，５０８号明細書（１９５３年ｌＯ 月２０日刊行）に開示されている。このクールター検出原理は、より精巧な機器 類、例えばクールター・カウンター（登録商標）モデルＳタイプの器機に開発お よび拡張され、これにより特定のコンピュータプログラムによるＣＢＣパラメー タ、絶対的細胞カウント、血小板カウントおよび形態、赤血球細胞（ＲＢＣ）の 形態、正常および異常の血液試料の解決が可能となった。

クールター電子粒子検出原理は、直流（ＤＣ）アパーチャ電力供給を用いるアパ ーチャ検出回路を備える。このような粒子センサは構造が単純であり、アメリカ 合衆国の臨床実験においておよび世界の他の国を通じてクールター・カウンター （登録商標）自動分析装置のほぼ全体的な受容により証明されたように極めて耐 久性があり信頼できる。この基本的なアパーチャ検出回路の改良はＷａｌｌａｃ ｅ　ＣｏｕｌｔｅｒおよびＷａｌｔｅｒ　Ｈｏｇｇの米国特許第３．５０２，９ ７４号明細書（１９７０年刊行）に開示されている。標準の直流アパーチャ電力 供給に加えて、分類目的の付加的なパラメータの検出を可能にする高周波数アパ ーチャ電流が用いられた。高周波数アパーチャ電流は、血液細胞の内部導電率お よびこの容積の関数である信号を発生した。直流アパーチャ回路により同時に発 生した信号は、主に細胞の容積を示す従来のＤＣ振幅信号である。無線周波振幅 を直流パルス振幅により高速ディバイダ回路を用いて除して細胞の容積および内 部導電率の関数である商を得、これは好都合に「不透明度」と呼ばれる。この原 理はさらにＷａｌｌａｃｅ　ＣｏｕｌｔｅｒおよびＷａｌｔｅｒＨｏｇｇにより １９７０年に刊行された米国特許第３，５０２゜９７３号明細書に記載されてい る。不透明度パラメータは細胞分類システムにおいて適用性を存する。単一のま たは一対のいずれかの別個のアパーチャをこの目的に用いることができる。

異なる集団の分類は、生じた信号対のデータを対照することにより達成される； 一方は粒子の容積の測定値であり、他方は細胞の内部抵抗率または不透明度の測 定である。このデータを与える好都合の形態は、散布プロット（ｓｃａｔｔｅｒ ｐｌｏｔ）または散布図と呼ばれる２次元プロットによる。このようなプロット は、ｒＦｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ、　３７１頁； 　Ｍｅｌａｍｅｄ　ＭｅｌａｎｅｙおよびＭｅｄｅｌｓｏｈｎ編、１９７９年、 アメリカ合衆国ニューヨーク州ニューヨーク所在のＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏ 口Ｓ」に十分に記載されている。

クールター電子粒子検出原理の最初の適用は、赤血球細胞カウントを実施するこ とであり、次に他の赤血球細胞パラメータのより精巧な決定であった。赤血球細 胞を全体の末梢性血液から除去することにより、白血球細胞（ＷＢＣ）集団の分 析を、赤血球細胞の除去が請求めて測定した残りの白血球細胞集団の性質を顕著 に損傷しない限り実施することができる。有用であり広範囲に用いることができ るか、後の白血球細胞測定のすへての観点において完全には満足できない赤血球 溶解試薬かこのために開発された。

種々の角度においてＤＣ容積単独または光散乱を用いた白血球のフロー分析の以 前の方法は、好中球、好塩基球および好酸球集団を含むリンパ球、単球および顆 粒球に対応する白血球の３つのクラスターを示した。おおよそであるが有用な好 酸球濃度の評価を、若干の試料において実施することかできる。第５の主要な集 団、好塩基球はこの方法では比較的過小である。好酸球もまた、特別の蛍光手法 を用いて別個のクラスターとして観察された。

免疫学的研究もまた、異形か末梢性血液塗抹標本において見出された際に重要で ある。白血病の特定の亜類壓を決定して病気に対する治療法をより良好に選択し 、患者に可能な限り特定的な予後を与えることか必要である。例えば、急性白血 病の形態において、末梢性血液にブラストの優性が存在する。これらの未成熟の 細胞は、区別がないために、リンパ球または顆粒球のいずれかとして分類するこ とが困難な場合がある。急速に増殖するブラスト副次集団がＴｌｌ受容体を含む ことが見出された場合には、白血病を急性リンパ球ブラスト白血病、Ｔ細胞型と して分類することができる。一般に、ＴリネッジＡＬＬはＢリネッジＡＬＬより 乏しい予後を存する。これらの白血病をこれらの区別のレベルによってさらにサ ブグループ分類することもまた習慣的である。グループ■およびＩＩは、初期の 胸腺前駆細胞において見られる抗原を示すニ一方グループＩＩＩにおいて示され たものは、成熟したＴ細胞において見出される表面抗原に類似している。白血病 細胞において示された表面抗原に関するこのような情報は、患者の予後および治 療に有用である。

免疫学的実験は第１に、リンパ球サブセットの測定のために光学顕微鏡を用いて 開発された。ヒトリンパ球とヒツジ赤血球細胞との間のロゼツト形成か、Ｃｏｏ ｍｂｓ等によって１９７０年に観察された。後の研究により、適切な条件下での 少なくとも大部分の胸腺誘導リンパ球（Ｔ細胞）かロゼツト形成現象を示すこと か見出された。これらの研究ではフィコール単離リンパ球か用いられ、一定期間 光学ｊ！ｊＩ微鏡を用いて単離されたリンパ球のサブセット分類に慣例的に用い られた。

ここで、慣例的には２、リンパ球サブセットを細胞を試料中で蛍光標識したモノ クローナル抗体で蛍光標識することにより測定する。蛍光標識したモノクローナ ル抗体は、関連する抗原の、抗原を表現する細胞の表面に結合する。次に細胞試 料を、蛍光顕微鏡を用いるかまたは高度に精巧なフローサイトメトリー装置を用 いることにより分析する。フローサイトメトリー装置を用いる際には、細胞試料 調製、データ採集およびデータ分析を特別に訓練された技術者により実施しなけ ればならない。

フローサイトメトリー装置はレーザーおよび複雑な光学装置、強力コンピュータ 並びに電気的および流体装置を含む。フローサイトメトリー装置の構成装置を適 切に維持し、規則的および頻繁な基準で校正しなければならない。フローサイト メトリー装置が現在参照リンパ球サブセット測定方法であるが、この方法は若干 の欠点を有し、これには装置か高価であることおよびこのような装置を正確に操 作する専門技術が必要であることが含まれる。

リンパ球サブセットはまた、本発明の継承人であるクールター・エレクトロニク ス・インコーホレーテッドにより開発された自動装置および方法を用いて測定す ることかできる。改良された単純な自動装置およびこれを用いる方法は、米国特 許通番第３月１３日出願、題名同一の継続出願）に開示されている。

この出願は電子的検出原理、決定された集団の細胞または形成体および微視的粒 子手法を同定および／または計数するための選択された生物学的分子の特異性の 出願を組み合わせる。自動分析装置を、微視的ミクロスフイアまたは組成を変化 させる支持体と組み合わせる特定の溶解剤および／または抗体と共に用いること かできる。

第２の出願である米国特許通番第２８５，８５６号、１９８８８年１２月１６日 出願、題名ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲＳＣＲＥＥＮ ［ＮＧ　ＣＥＬＬＳ　ＯＲＦＯＲＭＥＤ　ＢＯＤ［ＥＳ　ＷＩＴＨＰＯＰＵＬＡ Ｔ［ＯＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ　５ＥＬＥＴＥＤ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ［５ ＴｆＣＳ）には、全血試料またはこの一部からの直接のサブセットのスクリーニ ングが開示されている。

第３の出願である米国特許通番第３３９，１５６号、１９８９年４月１４日出願 、題名ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮ［Ｎ Ｇ　ＣＥＬＬＳ　ＯＲＦＯＲＭＥＤ　ＢＯ旧ＥＳ　ＷＩＴＨＰＯＰＵＬＡＴＩＯ ＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳ［ＮＧＳＥＬＥＴＥＤ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴ［ＣＳ 　ＵＴ［Ｌ［Ｚ［ＮＧ　ＡＴ　ＬＥＡＳＴ　ＯＮＥ　５ＥＮＳ［ＮＧＰＡＲＡＭ ＥＴＥＲＪには、１種以上の光または電子的パラメータを用いて全血試料あるい は集団および／またはこのサブセットを消去することにより除去された赤血球細 胞および／または白血球細胞の集団を存する試料から実施した多部または５部白 血球細胞区別、リンパ球サブセットおよび重複測定が開示されている。

第４の出願である米国特許通番第０７１５２５．２３１号、１９９０年５月１７ 日出願、題名ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲＳＣＲＥＥ Ｎ［ＮＧ　０ＢＳＣ［ＪＲＥＤ　ＯＲＰＡＲＴＩＡＬＬＹ　０ＢＳＣＵＲＥＤ　 ＣＥＬＬＳ　Ｊには特定のモノクローナル抗体か結合したミクロスフイアを用い て、不明確な細胞の検出された特性を散布図上の１つの細胞集団領域から他の領 域へ移動させることによる不明確な細胞の分析か開示されている。上記の４つの 参照出願をここに参照として包含する。

改良された血液学的分析器機およびこれを用いる方法は、米国特許通番第０２５ ，４４２号、１９８７年３月１３日出願および継続出願である米国特許通番第１ ２９．９５４号、１９８７年１２月４日出願、共に題名ｒＭＵＬＴＩ−ＰＡＲＴ 　Ｄ［ＦＦＥＲＥＮＴ［ＡＬ　ＡＮＡＬＹＺ［ＮＧ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＵＴ ［ＬＩＺＩＮＧ　ＬＩＧＨＴ　５ＣＡＴＴＥＲＴＥＣＨＮ［ＱｔｌＥＳ」に開示 されており、これをここに参照として包含する。このいわゆるＶＣ８血液学的器 機は光散乱および電子検出手法を用いて白血球（Ｌ）ＷＢＣ集団の多部区別を得 る。しかし、この血液学的器機はＬサブセットの区別を実施せず、これはこのよ うなサブセットか集団中で不明確になるためである。

他の関連する出願である米国特許通番第６１７．０７５号、１９９０年１１月２ ３日出願、題名ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳＦＯＲ５ＣＲＥＥ ＮＩＮＧ　Ｍ［ＣＲＯＳＣＯＰｔＣＣＥＬＬＳ　ＵＴＩＬＩＺＩＮＧ　ＬＩＧＨ Ｔ　５ＣＡＴＴＥＲＴＥＣＨＮ［ＱＵＥＳ　Ｊにおいては、光散乱手法を用いて サブセットと重複サブセットとの両方の測定を得ており、これもまたここに参照 として包含する。

微視的粒子の細胞集団の各細胞への選択的結合により少なくとも１つの集団の初 期の位置の原因であるパラメータの変性が可能になる。添加が測定された容量お よび／または不透明度に影響を与える、選択された標的集団の各々の細胞への複 数の微視的粒子の添加の結果、集団を表す散布図の点の位置がシフトする。

既知の特異性を存する抗体を、微視的粒子の覆いに用いる。

この覆いは粒子に、抗体が特異的である抗体を表現するある細胞に選択的に結合 する能力を与える。これらの覆われたまたは標識された細胞は、新たな存在物と 同様に挙動する粒子と細胞との組み合わせである。これらの不透明度、容積また は不透明度と容積との両方のパラメータを、得られた信号における細胞と粒子と の両方への影響の合計を表すと考えることができる。

成分の特性が異なる場合には、新たな存在物は最終的な影響に従って散布図上の 新たな位置に移動する。新たな位置は、細胞単独の以前の位置と対照的に、この ような新たな存在物または新たな存在物の群の分類を可能にする。細胞に結合し た粒子が磁性である場合には、当然現在の実際に従って、新たな存在物を磁石を 用いることにより捕集することができる。急速に混合した場合には、研究下での 細胞の特性に悪影響を与えることなく集団の完全な捕集を含む予期されない結果 が生じる。

３つの別個の細胞の集団のみを、以上に述べたＤＣ容積および不透明度パラメー タの固有のおよび独特の特性を用いることにより血液試料から容易に同定および 計数することができる。

付加的な工程、例えば改良された溶解システムを実施してより多くの集団の検出 および計数を可能にしなければならない。当然、これらの付加的な集団は、リン パ球、単球および顆粒球と呼ばれる３つの基本的なもののサブ集団を表す。上記 に述べた応用に従う工程は、これらの基本的な３つの集団の副次集団をいかにし て得るかを例示する。

このような単純なアパーチャ検出手法を２種類以上の生物学的粒子と組み合わせ て用いて、所与の集団を示す点クラスターの独特であり新たな場所を生じさせる ことができる。点プロットまたは散乱図における集団のこの選択的な動きは再現 可能であり、基本的な３つの集団と別個の集団を分類するのに用いることができ る。

ＤＣ容積および不透明度検出手法の最初のおよび固有の組み合わせを、微視的粒 子を選択された別個の細胞に結合させることにより変性させることかできる。選 択性は、生物学的分子、とりわけ粒子表面上の覆いとして用いられる抗体の本質 または特異性により粒子に与えられる。表面に粒子を全く存しない細胞のみの集 団は、他の集団または副次集団と同一の点プロット位置および従って互いに識別 不能な位置を占める請求めて同定され、計数され、研究される特定の集団の細胞 への選択的吸着を存する粒子の付加はこの方法を用いて可能である。十分な質量 の選択的粒子の関連する別個の集団への選択的付加の結果、この集団の点プロッ ト位置の、各細胞の質量、容積および不透明度の新たな独特の組み合わせの結果 としてのシフトが発生する。

本発明を実施する方法および装置を種々の免疫学的反応、例えば反応体と形成体 または細胞との免疫学的反応と共に用いることかできる。本発明はまた、形成体 浮遊物、例えばとりわけ若干の細菌およびウィルスに適用される。ここで用いら れる細胞は、個別にまたは集合体として同定可能である細胞状細菌、菌類を含む 動物または植物細胞であると定義する。細胞は、独立単位として機能することか できる生物体の最小構造集合体である。例えば細胞は、ヒトＲＢＣおよびＷＢＣ 集団、組織または血液試料からのガンまたは他の異常な細胞とすることかできる 。形成体は若干の細菌およびウィルスであると定義する。適切に標識された細胞 または形成体は、本発明の方法および装置により、ヒト血液細胞の例と同様にし て光学的に同定することができると合理的に予想される。

「反応体」か上記出願において溶解剤およびモノクローナル抗体を定義するのに 用いられたか、反応体は、細胞または形成体の表面上に存在す、る１種以上の特 定的な分子を検出し、これと反応する種々の薬剤を含むことができる。若干の例 を以下に抗体　抗原 薬物　薬物受容体 ホルモン　ホルモン受容体 成長因子　成長因子受容体 反応体は細胞上の特定的な分子に結合する。これらの反応体は事実化学反応の一 部を形成する：しかし反応体は必ずしも化学的に変化するとは限らない。

発明の開示 細胞集団例えばＷＢＣ集団の関連する１種以上のサブセットにより不明確な関連 する１種以上の細胞群のスクリーニングを実施する方法および装置の関連する細 胞群を、モノクローナル抗体が結合したミクロスフイアを用いることにより計数 して特定の細胞の検出された特性を変えて関連する細胞群を不明確な細胞集団か ら区別する。

全血試料またはこの一部をスクリーニングして関連するＷＢＣサブセットの所望 の分析を提供することができる。試料部を関連するＷＢＣサブセット特異性モノ クローナル抗体を有するミクロスフイアと混合し、このミクロスフイアは関連す る細胞と結合して細胞の検出された特性をシフトさせる。次に、関連するＷＢＣ サブセットを有する試料部を少なくとも２種の検出パラメータにより検出し、こ のうちの１つは偏光検出パラメータであり、関連するＷＢＣサブセットの特性を 関連するサブセットを直接測定するのに十分にシフトさせる。重複する細胞集団 もまた分析することかできる。２種の関連する細胞群を同時にシフトさせること かできる。

また、試料部を第１に測定し、次に特定の細胞をここから除去して関連する細胞 群を、さもないと除去された細胞により不明確になる領域において検出すること かできるようにする。試料部を再び測定し、第１の測定値と比較して関連する細 胞群を区別する。全血試料において、関連する細胞群は、さもないとＷＢＣ細胞 集団により不明確になる関連するＷＢＣサブセットである。

図面の簡単な説明 本発明の好適例を以下に実施例により、本明細書に添付した図面を参照して説明 する： 図１は本発明の一例の細胞スクリーニング分析装置のブロック図式図である： 図２は本発明の第２の例の細胞スクリーニング分析装置のブロック図式図である ： 図３は本発明の一例の特定的な分析装置である；図４は本発明の一例の偏光検出 器装置である：図５Ａ〜６Ｄは関連するＷＢＣサブセットを得るための本発明の 手法を例示する散乱図である。

図７Ａ〜７Ｃは種々の検出パラメータを用いた関連するＷＢＣサブセットの結果 の散乱図である； 図８Ａ〜９Ｄは本発明に従った同一の大きさの２種のミクロスフイアの使用を例 示する散乱図である；図１Ｏは重複サブセットを測定するための本発明の一例の 細胞スクリーニング分析装置の他のブロック図式図である：図１１は不明確な細 胞を測定する本発明の一例の細胞スクリーニング分析装置のブロック図式図であ る：図１２は不明確な細胞を測定する本発明の他の例の細胞スクリーニング分析 装置のブロック図式図である：図１３は関連する２つの細胞群を同時に分析する 本発明の一例の細胞スクリーニング分析装置のブロック図式図である：図１４は 関連する２つの細胞群を同時に分析する本発明の第２の例の細胞スクリーニング 分析装置のブロック図式図である。

本発明を実施する態様 図１において、本発明の第１の例の細胞スクリーニング分析装置を参照符号１０ により一般的に示す。分析装置１０は試料１２を含み、これは少なくとも細胞の 第１のセットまたは集団（図示せず）を含む。この細胞集団は、以下に示すよう に分析した際に、関連する細胞群、例えば細胞のサブセットまたは第２のセット を不明確にする。試料１２は、細胞が加えられる緩衝液を含むことができる。

試料１２またはこの一部をライン１４を介して、ライン１８を介した少なくとも １種の反応体１６と混合することができる。

関連する細胞群の細胞は、シフト細胞群ステーション２０において変性またはシ フトした少なくとも１つの検出された細胞特性を存する。関連する細胞群の細胞 の検出された特性を、細胞特性を不明確にする細胞集団の検出された細胞特性か ら除去するのに十分に変性またはシフトさせる。

反応体１６は、関連する細胞群に特異的である抗体が結合した複数のミクロスフ イアであるかまたはこれを含むことかできる。反応体１６と試料部１２とを混合 してミクロスフイアの関連する細胞群への結合性を増強させるのか好ましい。複 数のミクロスフイアを関連する細胞群の各細胞に結合させて一般に各細胞をミク ロスフイアで覆い、これにより関連する細胞群の各細胞の結果的な検出された特 性か変性またはソフトする。次に試料部１２をアナライザ２２にライン２４を介 して供給する。

アナライザは試料部Ｉ２中の細胞の数を少なくとも検出および計数する。アナラ イザ２２は少なくとも１種、好ましくは２種の検出パラメータを有し、このうち の少なくとも１種は以下にさらに記載する偏光光学パラメータである。

図２において、本発明の第２の例の細胞スクリーニング分析装置を参照符号３０ により一般的に示す。分析装置３０は例えば全血試料中またはこれからの少なく とも第１のセットの生物学的試料（図示せず）を含む生物学的試料３２を含む。

生物学的試料３２の細胞は、定量的および／または定性的測定または分析におけ る生物学的反応に含まれる。生物学的試料３２は少なくとも１つのＷＢＣ集団を 含み、このＷＢＣ集団は関連するＷＢＣサブセット集団を不明確にする。試料３ ２もまた細胞が加えられる緩衝液を含むことができる。

ここで用いるＷＢＣサブセット集団は、特定のモノクローナル抗体を結合するこ とができるＷＢＣ集団のサブセットである。

現在、名称は世界保健機構および国際免疫学協会によりモノクローナル抗体に定 義されている。モノクローナル抗体は、特定の特異性を細胞または細胞群および ＣＤ群特異性モノクローナル抗体に対する特定の特異性を与えるクラスター表示 （ＣＤ）名称により与えられる。例示のみの目的で、３種のＣＤ群、ＣＤ２、Ｃ Ｄ４およびＣＤ８か以下の例において用いられる。ＣＤ名称、特異性およびモノ クローナル抗体の若干の商業的給源を表Ｉに例示する。

ＣＤ２（ｇｐ５０）“　Ｔｌ１（クールター）　εロゼツト０ＫＴＩＩ　（オル ト）；　受容体 Ｌｅｕ　５　ａ　（ＢＤ） ＣＤ４（ｇｐ５６）　Ｔ４　（クールター）　ヘルパー１０ＫＴ４．　（オルト ）；　インデューサーＴＬｅｕ　３　ａ　（ＢＤ） ＣＤ８（ｇｐ３２〜３３）　Ｔ８（クールター）　細胞毒性１０ＫＴ８（オルト ）；　サプレッサーＴＬｅｕ　２　ａ　（ＢＤ） １ｇｐ−糖タンパク質、分子量（キロダルトン）ゝクールターークールター　コ ーポレーションのクールターイムノロジー　ディビジョン（アメリカ合衆国フロ リダ州バイアレア所在） ＢＤ−ベクトンーディキンソン　イムノサイトメトリー　システム オルト−オルト　ダイアグノスティック　システムズ（アメリカ合衆国ニューシ ャーシー州　ラリタン所在）試料３２またはこの一部をライン３４を介して、ラ イン３８を介した少なくとも１種の反応体３６と混合する。次に、赤血球細胞（ ＲＢ　Ｃ）を混合物から機能的に示されたＲＢＣ除去ステーション４０により除 去する。ＲＢＣは多くの方法でステーション４０により混合物から除去すること ができる。ＲＢＣを溶解剤により反応体３６中で溶解することができる。これに 用いることかできる１種の選択的溶解剤およびクエンチ剤は通番第１３０，９１ １号、１９８７年１２月１０日出願、題名（これは通番第０２５，３０３号、１ ９８７年３月１３日出願、題名同一のＣＩＦ’である）に開示されており、これ をここに参照として包含する。反応体３６は、ＲＢＣ特異性抗体がミクロスフイ ア（図示せず）に結合した複数の磁性ミクロスフイアであるかまたはこれを含む ことができる。この例において、用いられる特定の赤血球細胞特異性抗体は米国 特許第４．７５２゜５６３号明細書、題名ｒＭＯＮＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢ ＯＤＹ　ＦＯＲＲＥＣＯＶＥＲＹＯＦ　ＬＥＵＫＯＣＹＴＥＳ　ＩＮ　ＨＵＭＡ Ｎ　ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬ　ＢＬＯＯＤ　ＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤ　０ＦＲＥＣＯ ＶＥＲＹ　ＥＭＰＬＯＹＩＮＧ　５ＡＩＤ　ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢ ＯＤＹ　Ｊ　ニ開示されており、これをここに参照として包含する。また反応体 １６は、試料緩衝液に加えてまたはこの代わりに緩衝液を含むことができる。さ らに反応体３６は選択的ＲＢＣ溶解剤およびＲＢＣ特異性ミクロスフイアの組み 合わせとすることができる。

ＲＢＣかはとんと試料部３２中から除去された後に、混合物の一部をサブセット シフトステーション４２に供給する。分析装置１０におけると同様に、関連する ＷＢＣサブセット集団はステーション４２において変性またはシフトした少なく とも１つの検出された細胞特性を存して、関連するＷＢＣサブセット集団の検出 された特性を、不明確にするＷＢＣ集団の検出された細胞特性から除去する。

再び、反応体３６は、関連するＷＢＣサブセット集団特異性抗体か結合した複数 のミクロスフイアであるかまたはこれを含むことかできる。反応体３６と試料部 ３２とを混合してミクロスフイアの関連するＷＢＣサブセット集団への結合性を 増強するのか好ましい。複数のミクロスフイアは関連するＷＢＣサブセット集団 の各細胞に結合して各細胞をミクロスフイアで覆い、これにより関連するＷＢＣ サブセット集団の各細胞の結果的に検出された細胞特性が変性またはシフトする 。

次に試料部をアナライザ２２と同一であることかできるアナライザ４４に導入し 、再び偏光パラメータを用いて試料部３２中の細胞の数を少なくとも検出し、計 数する。

本発明を実施し、第１および第２の分析装置１０および３０の分析方法を達成す ることができる分析器機の１つの特定的な例を図３において参照符号５０により 一般的に示した。

器機５０において、１つのみを特定的に挙げ、これは本発明の原理に従ってほと んど終わりのない群細において変化させることができる。さらに、器機５０は一 般的な機能的詳細において示し、特定例を多くの既知方法により構造的に実施す ることかできる。

器機５０は、関連する細胞試料例えば試料１２または３２を器機５０中に吸引す るのに用いられる吸引ポンプ機構を含む。

アスピレータ５２をライン５３を介してサンプリング弁５４に接続し、これを試 料プローブ５５に接続することができる。希釈剤ポンプ５６は希釈剤または緩衝 溶液を含むことができ、弁５４にライン５８を介して接続される。弁５４および ポンプ５２は細胞試料１２または３２を希釈剤と共にポンプ５６を介して適切な 際に吸引することができる。

反応体混合物または細胞試料自体を次に排出管６ｏを介して混合装置６６中に供 給する。ミキサ６６は、試料または反応体が供給される混合チャンバ６８を有す る。次にＲＢＣをライン６４を介してチャンバロ８に供給された溶解剤ポンプ６ ２からの溶解剤により溶解する。反応か完了した際にクエンチ剤または固定剤を ステーション７０からライン７２を介して供給する。

反応を７４で機能的に示したように、溶解剤および／またはクエンチ剤と試料と をチャンバ６８内で混合することにより補助することかできる。

ここで用いることかできる適切な混合装置６６の特定的詳細は、通番第０２５， ３３７号、１９８７年３月１３日出願および通番第５１７，３０９号、１９９０ 年５月１日出願（通番第０２５．３３７号の継続出願）、共に題名ｒＭＥＴＨＯ Ｄ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲＲＡＰｒＤ　Ｍ（ＸＩＮＧ　ＯＦ　Ｓ ＭＡＬＬ　ＶＯＬＵＭＥＳ　ＦＯＲＥＮＨＡＮＣＩＮＧ　ＢＩＯＬＯＧ［ＣＡＬ 　Ｉ？ＥＡＣＴｒＯＮＳ　Ｊ　＋：ｒＪＲ示されており、これらをココニ参照と して包含する。ミキサ６６を用いることにより、関連する細胞の特性を損傷する ことなく反応温度の上昇により発生させることかできるように、反応速度を上げ ることかできる。さらに、反応を、一般に２分以内の程度の顕著に減少した時間 内に完了させることができる。このために自動高容積分析器機５０の迅速な分析 が可能になる。

溶解剤によりＲＢＣが除去されたクエンチされた試料部をライン７６を介してＷ ＢＣアナライザ７８（すなわちアナライザ２２または４４）に直接供給すること ができる。試料部を、参照のまたはシフトしていない結果が後の参照または比較 目的のための試料から第１に得られるアナライザ７８に直接供給することかでき る。アナライザ７８はＷａｌｌａｃｅ　Ｈ，Ｃｏｕｌｔｅｒにより米国特許第２ ．６５６，５０８号明細書に記載され、多くの市販の血液細胞カウンタにおいて 継承人であるクールター　エレクトロニクス　インコーホレーテッドにより実施 された計数および計測手法に従った多くの物理的型とすることができる。

アナライザ７８は一般に、フローセル型の検出チャンバ８゜を存する。フローセ ル８０は少なくとも偏光光学的および好ましくは電子的検出装置を存する。フロ ーセル８０は任意の光学的に透明な材料、例えば融解シリカ、または石英から形 成することかできる。フローセル８０は、試料部か十分知られた方法で流体力学 的に形成された流れとして流れる狭い首下降アパーチャ８２を有する。フローセ ル８０は偏光した電磁的光エネルギーの光線８４を集光するための光学的に平坦 な表面を有し、これはアパーチャ８２のスポットにレンズ装置８８を介して集光 されるレーザ源８６からであると好ましい。アパーチャ８２を介して通過するよ うに個々の細胞により散乱した光および光線８４は図４に示した通り偏光検出装 置９ｏにより検出される。

フローセル８０はまた、電子的検出回路を有することができる。フローセル８０ は、この内部の流体と接触する第１電極９２を有する第１の部分９Ｉを有する。

フローセルチャンバ部９Ｉおよび電極９２は、内部に第２を極９８を存する第２ のチャンバ部９６と、アパーチャ８２を介して連通ずる。電極９２および９８は 反応リード１００および１０２を介してＲＦ／ＤＣ源および検出回路１０４に接 続される。回路１０４はＤＣまたは低周波電流または信号と、電極９、２と９８ との管の高周波信号との両者と結合する。

低周波信号を用いて、アパーチャ８２を介して通過する細胞により発生した信号 パルスの振幅を検出する。高周波信号を用いて、アパーチャ８２を介して通過す る同一の細胞の電気的不透明度を得る。

細胞の電気的不透明度の測定は、Ｗａｌｌａｃｅ　Ｈ，ＣｏｕｌｔｅｒおよびＷ ａｌ、ｔｅｒ　Ｒ，ｔ（ｏｇｇにより米国特許第３．５０２，９７４号明細書に 、またこの特許以降の、継承人であるクールター　エレクトロニクス　インコー ホレーテッドの若干の特許および出願に記載された。ここで用いることかできる １１ｍの特定的な回路は、米国特許第４．７９１，３５５号明細書、題名ｒＰＡ ＲＴ［ｃＬＥ　ＡＮＡＬＹＺＥＲＦＯＲＭＥＡＳＵＲ［ＮＧ　ＴＨＥ　ＲＥＳ［ ５ＴＡＮＣＥ　ＡＮＤ　ＲＥＡＣＴＡＮＣＥ　ＯＦ　Ａ　ＰＡＲＴ［ＣＬε」に 開示されており、これをここに参照として包含する。

検出された細胞から回路１０４により発生された信号をＤＣ信号リード１０６お よびＲＦ信号リード１０８を介してコンパレータ１１０に結合する。コンパレー タ１１０は試料部から発生した信号を、すなわち記載する他の試料部から生じた 結果と比較するために保持することかできる。また、コンパレータ１１０は光学 的検出器装置９０からリード１１２を介しての光学的検出インプットを含むこと かできる。

アナライザ７８は、既知の方法により、フローセル８０内の細胞に集光するシー スフローを有する。シースフローは、フローセル８０に既知の方法で一対のライ ン１１６および１１８により接続された流体システム１１４を備えることかでき る。試料反応混合物をフローセル８０に導入チューブ１２０を介して供給し、フ ローセル８０から出口チューブ１２２を介して廃棄物容器１２４に供給すること ができる。

混合物の第１の部分をアナライザ７８において分析する間に、ミキサ５６を洗浄 ライン１２６により洗浄し、洗浄液を廃棄物ライン１２８を介して排出すること かできる。ここで、第２の試料部をチャンバ６８に導入してこの検出された細胞 特性を変性またはシフトさせることかできる。あるいはまた、変性する試料部を 、第１の変化していない、または標準の試料部結果を第１に得ることなくチャン バ６８に導入することかできる。ここで、関連するＷＢＣまたは他の細胞群を、 ＷＢＣミクロスフイアをステーション１３０からライン１３２、弁１３４および チャンバライン１３６を介してチャンバ６８に導入して試料部と混合することに よりシフトさせることかできる。

ＷＢＣミクロスフイアを第２の部分と、混合機構７４により混合する。シフトさ せるために、ＷＢＣミクロスフイアおよび結合したＷＢＣミクロスフイアを有す る反応混合物をライン７Ｇを介してアナライザ７８（すなわちアナライザ２２ま たは４４）に導入し、ここで第２の部分を第１の部分と同様に分析し、次に結果 をコンパレータ１１０において比較することかできる。

細胞特性を検出された少なくとも１つのＷＢＣサブセッ）へ細胞を第２の部分に おいて、次に分析することができる変化した結果を与えるようにＷＢＣサブセッ ト結合ミクロスフイアによる細胞不透明度のように変える。

ＷＢＣミクロスフイアか以下に記載する理由により磁性である場合には、これに 結合したＷＢＣサブセット集団を、磁場または磁石１３８による混合工程の間お よび／または後に磁場により除去することかできる。磁場を電磁的方法またはチ ャンバ６８に関して物理的に移動される磁石１３８により供給して磁気的に結合 したＷＢＣサブセットを捕集する。次に、ＷＢＣサブセットが結合していない第 ２の部分をライン７６を介してアナライザ８６に前記した方法により供給して分 析結果を得ることかできる。

次に器機６６を準備して、次の試料または試料部分を次の分析のために取り入れ る。プローブ５８をプローブ洗浄機構１４０により洗浄し、ラインおよびチャン バ６８を従来の方法により洗浄することかできる。連続する試料混合物の各分析 を迅速および自動方式で得る。連続する試料混合物の分析の間の周期を分収下の 程度とすることかできる。

分析器機６６の操作にあたり、ＲＢＣ溶解剤／反応体と試料部との反応混合物を チャンバ６８内で、ＷＢＣサブセットの１つと結合するステーション１３０から の非磁性ＷＢＣミクロスフイアと共に混合する。クエンチ剤７０を反応混合物に 加え、これを次にライン７６を介してＷＢＣアナライザ７８に導入して分析する 。

溶解剤を用いる代わりに、試料１２または３２をミキサ６６に弁５６を介して溶 解剤なしに供給することができる。この場合には、ＲＢＣを、ＲＢＣ特異性抗体 か結合したミクロスフイアを用いることによりＲＢＣミクロスフイアステーショ ン１４２から磁気的に除去し、弁１３４にライン１３６を介して供給することが できる。溶解剤を用いない場合には、結合したＲＢＣを、上記した磁気的に結合 したＷＢＣの場合とほぼ同一の方法により混合後に磁石１４０により磁気的に除 去する。

さらに、反応速度を上昇させる第２の場合において、ＲＢＣ溶解剤とＲＢＣ磁性 ビーズとの両方を含む試料の反応混合物を用いることかできる。反応混合物を混 合し、溶解剤をクエンチし、結合したＲＢＣを磁気的に除去し、次にＷＢＣを前 記したように分析する。

本発明の手法をこの本来の状態、例えば器機６６に直接供給された全血試料にお ける試料を用いて記載したか、試料を所要に応してオフライン調製するかまたは 部分的に予備調製することができる。試料からＲＢＣを予め除去することかでき る。このシステムではミクロスフイアをオフラインでまたは調製モードにおいて 加えることかでき、すてにシフトした検出細胞特性を存する試料部を残りの分析 のためにシステムに加えることかできる。若干の特定的な例を以下に記載する。

多次元光散乱を用いた白血球またはＷＢＣ集団区別は、アメリカ合衆国カリフォ ルニア用　マウンテンビュー所在のセコイア−ターナ−（Ｓｅｑｕｏｉａ−Ｔｕ ｒｎｅｒ）により発売されているＣＥＬＬ−ＤＹＮ３０００器機に開示されてい る。この器機は偏光した光源を用い、１０°及び９０°　（直交）方向の偏光お よび復極光散乱を測定する。この器機はまた試薬配合物を用いてＲＢＣをレーサ ー光線に対して「透明」にする。しかし、これらの多段階パラメータによってさ えも、器機はＷＢＣサブセット集団区別を全く与えない。

図４において、偏光光学検出器装置９０の一例を示す。装置９０は偏光光線１５ ２をフローセル８０に向ける偏光レーザ光源１５０を有する。光線１５２は細胞 流（図示せず）と作用し、細胞に関する情報を含む反射光１５４を形成する。反 射光１５４はビームスプリッタ１５６に向けられる。

光線の第１の部分１５８はビームスプリッタ１５６および偏光フィルタ１６０を 介して通過し、増倍型光電管（ＰＭＴ）１６２により９０°偏光光散乱信号また は出力として向けられる。

光線の第２の部分１６４をビームスプリッタ１５６から反射させ、第２のＰＭＴ 　１６６により非偏光光散乱信号として向け、検出する。他の光検出パラメータ もまた上記のｖＣ８およびケース３５６０８器機に開示されているように用いる ことかできる。

図５Ａ〜６Ｂにおいて、散乱図を提供し、図５に示したＤＣ／偏光光散乱プロッ トにおいて、３種のＷＢＣ集団グルーピング即ち１６８単球（Ｍ）、１７０Ｌ並 びに１７２を組み合わせた好中球（Ｎ）および好酸球（Ｅ）を示した。この散乱 図において、ミクロスフイアは存在しない。

ミクロスフイアを加える際には、ミクロスフイアにより散乱した光は、検出され た特性を図５Ｂの１７０Ｌおよび組み合わされた１７４Ｍ、Ｎ、Ｅに示したよう に２つのＷＢＣ集団グルービングのみが個別に計数されるように混成する。この 細胞グルーピングの混成は最小数のミクロスフイアを用いることにより最小にす ることができる。さらに、直径０．６μ以下の程度の極めて小さいミクロスフイ アは、４８８ｎｍの波長を有する光源を用いて顕著な混成を全く発生しない。

図５Ａを標準または対照として用いて、Ｌサブセット特異性モノクローナル抗体 が結合した非磁性ミクロスフイア、例えばＣＤ４を、同一の試料または試料の第 ２の部分中で混合し、図５Ｂに示す直接サブセットグルービング（１７ｃ）のシ フト形成を生じた。

この方法はオフラインまたはオンラインを用いることかできる。方法の手順１〜 ３はオフラインで達成することができる。

これによりミクロスフイアを加え、これらを試料と混合するのに必要な装置は不 要になる。完全自動器機５０はすべての手順を自動でオンラインで達成すること ができる。手順は一般に以下の通りである。： １．１５０μｌ　（またはこれ以上）の全血を供給する。

２．１５μｌの、Ｌサブセット特異性モノクローナル抗体か結合した２μミクロ スフイア（Ｔ４．Ｔ８またはＴｌｌ、各々個別の混合容器中）を加えるかまたは ｌＯμＩのＭＳｒＧ対照ミクロスフイアを加えて対照／背景標準を形成する。

３．２分間混合する（後に少なくとも１時間まで放置することができる）。

４、システムにおいて実施する（自動）。

５、システムでオンラインで溶解およびクエンチする。

図６Ａにおいて、再び、対照またはシフトしていない散乱図結果を示す。Ｌはグ ルービング１７８に見出され、一方Ｍはグルービング１８０に見出され、Ｎおよ びＥはグルービング１８２に見出される。前記したように、図５Ｂおよび６Ｂに おいて明らかであるように、関連するＷＢＣサブセットを直接位置決めし、従っ て参照結果と比較する必要がないため、対照を供給する必要はない。ＭＳＩＧ対 照ミクロスフイアのみを用いて、散乱パターンに干渉が存在しないことを確認す る。ＭＳＩＧは、ＷＢＣまたはＷＢＣサブセット集団に特異的でないマウスモノ クローナルイムノグロビンである。

第１の関連するＷＢＣサブセット、ＣＤ４細胞を、図６Ｂに示すように、Ｔ４ミ クロスフイアを結合させることによりシフトさせる。シフトしたサブセットがな い残りのＬはグルービング１７８に示され、一方ここでＭ、ＮおよびＥは群１８ ４に見出される。ＣＤ４細胞のシフトした検出された細胞特性は新たなグルービ ング１８６を形成し、これをｌ１ｉｌＵ６Ａの結果と比較するかまたはＣＤ４細 胞の全りに対する割合として直接分析することができる。この例において、ＣＤ ４細胞の寄与百分率は５３．２％であることか見出された。同一の試料を、従来 のＥＰＩＣ３（登録商標）フローサイトメトリー器機において比較のために分析 し、この結果寄与百分率は５３．３％であった。

図７Ａ〜７Ｃは、種々の検出パラメータを用いて散乱図を形成したＣＤ４変化を 示す。これらの結果は最適化されていないか、他の検出パラメーター、例えばＭ ＡＳ（中心角散乱−図３および４に図示せず）を用いる原理を示すために例示す る。図７Ａは、すへてのＷＢＣ集団に関する対照の細胞グルービング１８８を示 す。９０°光散乱を、この散乱図において、９０゜偏光光散乱に対してプロット した。

図７Ｂは、すべてのＷＢＣ集団に関する単一の細胞グルーピング１９０および同 一の試料混合物からのシフトしたＣＤ４細胞に関する散乱したＣＤ４グルービン グ１９１を示す。再び、この散乱図において、９０°復極光散乱を９０’偏光光 散乱に対してプロットした。

図７０は、ＤＣに対してＭＡＬＳをプロットすることにより形成した散乱図によ り図７Ｂと同一のデータを示すものである。

Ｌはグルービング１９２に示され、一方シフトしたＣＤ４細胞はグルービング１ ９４に示される。

図８Ａ−Ｄは、同一の直径を存する２種のミクロスフイアを同時に用いて２つの 関連する異なる細胞群、例えば関連する２つのＷＢＣサブセット集団をスクリー ニングする潜在的可能性を示す。１種は５．７４μであり他の１種は５．１１μ である２種の異なる型のミクロスフイアおよび非偏光光散乱の対数対不透明度を 用いて、図８Ａに示すように、単一のミクロスフイアのグルービング１９６のみ が得られた。しかし、偏光した検出されたパラメータ対数９０°偏光光散乱を用 いて、図８Ｂに示すように、２つの別個のグルービング１９８および２００が得 られた。これらのパラメータを用いて、２つの別個のＷＢＣサブセット集団を潜 在的にシフトさせ、結果が１つの試料部において得られる。示した結果は何の組 胞をも含まず、ミクロスフイア自体のみを含む。さらに、図８Ｃおよび８Ｄに示 すように、単一偏光光パラメータ対数９０’偏光光散乱を用いた結果、２つのミ クロスフイアグルーピングの間に１次元分離が生じた（図８Ｄ）。規則的な非偏 光光散乱はグルービング間に区別を全く示さなかった（図８Ｃ）。

１種は１０μであり、他の１種は１０．３５μである他の２種の異なる童のミク ロスフイアもまた、図９Ａ〜９Ｄに示すように、偏光を用いて潜在的な分離を示 した。１Ｎ９Ａは、９０’散乱対不透明度を用いた単一のグルービング２０２の みを示す一方、図９Ｂは、偏光光散乱を用いた２種の別個のグルービング２０４ および２０６を示す。再び、これらは、［Ｍ９Ｄに示すように単一の偏光検出パ ラメータを用いて得ることができる。

［１Ｈ９Ｃにおける非偏光データは２つのグルービングを示さない。

図１０において、本発明の第３の例の組胞スクリーニング分析装置を、参照符号 １９０により一般的に示す。分析装置１９０を用いて、関連する細胞群の重複割 合を測定し、全血試料またはこの一部から関連するＷＢＣ集団サブセットに関し て記載する。

分析装ｆｌ１９０は生物学的試料１９２を含み、再び、これは少なくとも第１の ＷＢＣ集団を含み、これは関連する少なくとも２つのＷＢＣ集団サブセットを含 む。生物学的試料１９２またはこの一部をライン１９４を介して、ライン１９８ を介した少なくとも１種の反応体１９６と混合する。次に、ＲＢＣを試料部から 、機能的に示したＲＢＣ除去ステーション２００により除去する。ＲＢＣを、前 記した手法の１種により除去する。

ＲＢＣを除去した後、混合物の部分を異なるラインに供給することかできる。第 １のライン２０２を用いて、第１の試料部を直接アナライザ２０４にライン２０ ６を介して送達することができる。上記のアナライザ２２および４４と同様に、 細胞の特性を少なくとも２種の検出パラメータ、このうち１種は光検出パラメー タにより検出する。

第２のライン２０８は、第２の試料部を「Ｘ」細胞シフティングステーション２ １０に送達する。前記の通り、「Ｘ」細胞は、ステーション２１０において変性 またはシフトした少なくとも１種の検出された細胞特性を有して、関連するＷＢ Ｃ集団サブセットの検出された特性を、不明確にするＷＢＣ集団の検出された細 胞特性から除去する、関連する第１のＷＢＣ集団サブセットである。検出された 細胞特性は、前記の通り、複数の非磁性ミクロスフイアと、関連するＷＢＣ集団 サブセット特異性抗体とを結合させることによりシフトする。次に、試料部をア ナライザ２０４に導入する。アナライザ２０４により得られた各セットのデータ を蓄積して後にコンパレータ２１２にライン２１４を介して比較することができ る。

同様の方法により、第３の試料部をｒＹＪ細胞シフティングステーション２１６ にライン２１８を介して供給する。「Ｙ」細胞の検出された細胞特性をステーシ ョン２１６によりシフトまたは変性させ、次に試料部をアナライザ２０４および コンパレータ２１２に供給する。これにより、「Ｘ」細胞およびｒＹＪ細胞の割 合を、直接またはライン２０２からのシフトしていない結果との比較のいずれか により得ることかできる。しかし、これにより、所要に応じて重複する「Ｘ」お よび「Ｙ」細胞の数を得ることはできない。

重複割合を測定するために、第４の試料部を「Ｘ」および「Ｙ」シフティングス テーション２２０にライン２２２を介して供給する。ここで重複は、ある細胞、 細胞の集団、細胞の副次集団または形成体か少なくとも２つの関連する受容体ま たは抗原を存することを意味するために用いる。この試料部において、「Ｘ」細 胞または第１の関連するＷＢＣ集団サブセット特異性抗体を有するミクロスフイ アと、「Ｙ」細胞または第２の関連するＷＢＣ集団サブセット特異性抗体を有す るミクロスフイアとの両者を混合する。次に試料部をアナライザ２０４に供給し 、データをコンパレータ２１２に供給する。

重複割合を、ライン２０８および２１８からの個別の「Ｘ」および「Ｙ」割合結 果を合計することにより見出す。この和から、ライン２２２からの結合された「 Ｘ」および「Ｙ」の割合の結果を減する。２つの合計の割合がほとんど等しい場 合には、「ＸＪおよびｒＹＪ細胞は顕著には重複していない。差異かある場合に は、差異は、「ＸＪおよびＦＹＪの両者に特異的なミクロスフイアが結合する細 胞の重複割合である。アナライザ２９０が、複数のラインを有すると記載したが 、アナライザ２９０はまた分析装置５０に関して記載したような単一のラインを 用いた連続アナライザとすることかできる。また、複数のラインに、分析装置５ ０に従って、平行に配置された各ライン２０８．２１８および２２２に個別のミ キサ６６を用いて提供することができる。この方法の特定の結果を図９Ａ〜９Ｆ に示す。

図１１に、本発明の別の不明確な細胞スクリーニング分析装置の実施態様を参照 符号２５０により一般的に示す。分析装置２５０は試料２５２を含み、これは細 胞（図示せず）の少なくとも第１セツト又は集団を含む。この細胞集団は後述す るように分析に際し、細胞のサブセット又は第２セツトのような問題の細胞群を 不明確にする。試料２５２は細胞か添加される緩衝液を含み得る。

試料２５２又はその部分をライン２５４を介してライン２５８を介した少なくと も１の反応体２５６と結合する。この混合物の第１部分をライン２６２を介して アナライザ２６０に直接供給する。アナライザ２６０はアナライザ２２と同様に 少なくとも試料部分中の細胞の数を検出し計数し得る。その結果をライン２６６ を介してコンパレータ２６４に送る。

第２試料部分をライン２７０を介して細胞取出ステーション２６８に送る。細胞 を上述のように変えることにより又は減少させること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）に より取り出す。変えることについては、非磁性ミクロスフイアを十分に検出した 細胞特性を変える不明確な細胞集団に結合し問題の不明確な細胞集団の検出細胞 特性からこれらを取り出す。減少については、磁性ミクロスフイアを不明Ｗｉ細 胞集団に結合しその後試料部分から磁気的に取り出す。

その後第２試料部分をライン２７２を介してアナライザ２６０に送り得られたデ ータをコンパレータ２６４に送る。その後第２試料部分からのデータを比較して 問題の不明確な細胞群の寄与百分率を決定する。

図１２に、本発明の別の細胞スクリーニング分析装置の実施態様を参照符号２８ ０により一般的に示す。分析装置２８０は分析装置２５０に似ているが、例えば 全血試料中又はこれからの生育できる生物学細胞の少なくとも第１セツト（図示 せず）を含む生物学的試料２８２を含む。生物学的試料２８２の細胞は定量的お よび／又は定性的決定又は分析における生物学的反応に含まれ得る。

生物学的試料２８２は少なくともｌのＷＢＣ集団を含み、このＷＢＣ集団は問題 のＷＢＣ集団を不明確にする。試料２８２は細胞か添加される緩衝液をも含み得 る。

試料２８２又はその部分をライン２８４を介してライン２８８を介する反応体２ ８６と結合する。ＲＢＣをＲＢＣ除去ステーション２９０における試料部分２８ ２から取り出す。ＲＢＣを前述の多数の方法のうちのＩの方法で取り出す。ＲＢ Ｃ除去試料の一部分をライン２９２を介してアナライザ２９４に送り、再び少な くともＷＢＣ集団を検出し計数する。アナライザ２５０におけるようにアナライ ザ２９４からのデータをライン２９６を介してコンパレータ２９８に送る。

第２試料部分をライン３０２を介して機能的に示した除去ステーション３００の 好中球（Ｎ）に送る。Ｎを前述した不透明度のようなｌのパラメータをシフトし たり変えたりすることにより又は磁気的に取り出すことにより混合物から取り出 すことができる。この例では、用いた特別のＮの特異的抗体は米国特許第４９３ １３９５号明細書ｒＭＯＮＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮＴ［ＢＯＤＹ　５ＰＥＣｒＦｒ ＣＴＯＮＥｊｌＴＲＯ１？）ＩＩＬＳ　Ｊに開示されている。

その後取り出された又は変えられたＮを有する混合物をライン３０４を介してＷ ＢＣアナライザ２９４に送る。アナライザ２９４の結果をコンパレータ２９８に 送る。その後第２試料部分の結果を第１試料部分と比較し前にＮにより不明確に されたＮ領域に細胞か残っている場合には決定をする。

図１３に、本発明の同時発生的な細胞群スクリーニング分析装置の実施態様を参 照符号３４０により一般的に示す。分析装置３４０は試料３４２を含み、試料３ ４２は細胞の少なくとも第１セツト又は集団（図示せず）を含む。この細胞集団 は後述する分析に際し、細胞のサブセット又は他のセットのような問題の少なく とも２ｍ胞群を不明確にする。試料３４２は細胞を添加する緩衝液を含み得る。

試料３４２又はその部分をライン３４４を介してライン３４８を介した少なくと もｌの反応体３４６と結合する。問題の各細胞群は細胞群シフトステーション３ ５０にて変性又はシフトされる少なくとも１の検出細胞特性を有する。検出細胞 特性の各群を十分に変性し又はシフトし検出細胞特性を不明確細胞集団の検出細 胞特性および他のものから取り出す。

反応体３４６は問題の細胞群の１に特異的な結合抗体を各々存する種々の非磁性 ミクロスフイアの多数のセットであり又はこのセットを含みつる。反応体３４６ および試料部分３４２を共に混合し問題の細胞群へのミクロスフイアの結合を高 める。多数のミクロスフイアを問題の各細胞群中の各細胞に結合し、一般に各細 胞をミクロスフイアで覆い、問題の細胞群の各細胞の得られる検出特性を変性し 又はシフトする。

その後試料部分又は混合物３４２をライン３５４を介してアナライザ３５２に送 る。アナライザは試料部分３４２中の細胞の数を少なくとも検出し計数する。ア ナライザ３５２は少なくとも２の検出パラメータを含み、前述のようにそのうち の少な（とも１は光学的パラメータである。分析装置３４０はミクロスフイアの 少なくとも２の異なるセットの添加を伴う分析装ｆｌｌｏおよび５０と本質的に 同様であり得る。

図１４に、本発明の第２同時発生的細胞スクリーニング分析装置の実施態様を参 照符号３６０により一般的に示す。分析装置３６０は例えば全血試料中又はこれ からの生育できる生物学的細胞の少な（とも第１セツト（図示せず）を含む生物 学的試料３６２を含む。生物学的試料３６２の細胞は定量的および／又は定性的 決定又は分析における生物学的反応において含まれ得る。

生物学的試料３６２は少なくともｌのＷＢＣ１ｌ団を含み、このＷＢＣ集団は問 題の少なくとも２のＷＢＣサブセット集団を不明確にする。試料３６２は細胞を 添加する緩衝液をも含む。

試料３６２又はその部分をライン３６４を介してライン３６８を介した少なくと もｌの反応体３６６と結合する。その後ＲＢＣを混合物から機能的に図示したＲ ＢＣ除去ステーション３７０により取り出す。ＲＢＣを混合物から前述した溶解 （ｌｙｓｅ）、磁性ミクロスフイア又はその結合のような多数の方法にてステー ション３７０により取り出す。

ＲＢＣを試料部分混合物３６２から実質的に取り出し、混合物の一部分をサブセ ット変化ステーション３７２に送る。分析装置ＩＯにおけるように、問題の各Ｗ ＢＣサブセット集団はステーション４２にて変性又はシフトされる少なくとも１ の検出細胞特性を有し、不明確ＷＢＣ集団の検出細胞特性およびそれらから問題 のＷＢＣサブセット集団の検出細胞特性を取り出す。

再び反応体３６６は異なるミクロスフイアの２セツトであり又はこのセットを含 むことができ、問題のＷＢＣサブセット集団の１に特異的な結合抗体を有する多 数の非磁性ミクロスフイアを各々含む。反応体３６６および試料部分３６２を好 ましくは共に混合し問題のＷＢＣサブセット集団へのミクロスフイアの結合を高 める。前のように、セットからの多数のミクロスフイアを問題の各ＷＢＣサブセ ット集団の各細胞に結合し、各細胞をミクロスフイアで覆い、問題のＷＢＣサブ セット集団の各細胞の得られた検出細胞特性を変位又はシフトする。

その後、試料部分３６２をアナライザ２２と同じであり得るアナライザ３７４に 送り、再び試料部分３２の細胞の数を少なくとも検出および計数する。分析装置 器機５０は分析装置３６０の分析方法を達成できる。

分析装置は好ましくはＷＢＣの絶対数をも計算でき、これよりＷＢＣサブセット 集団の絶対数をも計算できる。このことは特にＡＩＤＳを有するヒトの治療に役 立つ、というのは特異的なＣＤ４集団数はＡＩＤＳ患者の薬剤治療の仕方を決め るのに使われるからである。絶対数は従来法では特異的な体積中のＷＢＣの数を 計数することにより見い出されるが、これは出願人、クールターエレクトロニク ス　インコーポレイテ・ソドの多数の市販の細胞計数器によってなされる。

用いられた磁性ミクロスフイアは好適な型のいずれかをとり得、例えば直径０． ７ミクロン、１０重量／容量％の固体のポリスチレン磁性ミクロスフイアであり 、インディアナ州のカルメルのバングズ研究所から販売されている。非磁性ミク ロスフイアは同様にいずれかの好適な型をとり得、例えば直径２．１７ミクロン 、８重量／容量％の固体の界面活性剤フリー硫酸化ポリスチレンラテックスミク ロスフイアであり、オレゴン州のボートランドのインターフエイシャルダイナミ クスのＩＤＣミクロスフイアとして販売されている。これらの特異的なミクロス フイアは例示の目的に対して使用されるが、その他の従来の出所からの他の型お よび大きさのミクロスフイアも使用できる。

一般に、シフトに対しては、細胞の直径より実質的に小さい直径のミクロスフイ アを使用することか好ましい、というのは多数のミクロスフイアが各細胞に結合 するからである。典型的に０．６５〜３．０ミクロンの直径のミクロスフイアを 用いると器機により示された細胞として遊離ミクロスフイアそれ自体を検出し計 数しないように確実にてきる。更に、とても大きいミクロスフイアは検出アパー チャを詰まられたり閉鎖したりし得る、というのは多数の細胞がミクロスフイア に結合するからであり、結果として大きなミクロスフイアと細胞の塊となる。典 型的に、非磁性ミクロスフイアは高価でなく、これによりシフト目的のために使 用されるが、磁性ミクロスフイアも検出細胞変化を引きおこすのに使用できる。

又、使用されるミクロスフイアの大きさの幅は用いられる光の波長に依存する。

磁性的に細胞を除くためには、磁性ミクロスフイアのみ使用できる。この適用で は、ミクロスフイアの大きさはあまり問題とならない、というのは細胞は検出の 前に試料から排除されるからである。ミクロスフイアは磁界にて迅速に容易に除 去するのに十分な手段である。二の場合は０．６５〜４．５ミクロンの直径が良 好に機能する。更に、細胞のみ除去されるので、１０ミクロン又はそれ以上の直 径が使用できる。多くの細胞が各ミクロスフイアに結合できるが、計数しないの で、器機の操作に支障ない。

ＦＩＧ、　３ ９０°　偏光 ＦＩＧ、５Ｂ ０．０　＋０００．０　２０００．０　３０００．０　４００００９０’　偏光 ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、６Ｂ ０．０　＋０００．０　２０００．０　３０００．０　４００ｏ、０９０’　福 光 Ｆ　Ｉ　Ｇ、７Ａ ０．０　＋００Ｑ○　２０００．０　３０００．０　４００００９００　儂光 ＦＩＧ、７Ｂ ０．０　＋０００．０　２０００．０　３０００．０　４０００．０＾＾ｏ１ａ 　ｊ４ ＦＩＧ、７Ｃ ＦＩＧ、８Ａ ○５００Ｑ　不透明度　１．５０００ Ｆ　Ｉ　Ｇ、８Ｃ ９０’ ９０°　イ塙光 ＦＩＧ、９Ａ ＦＩＧ、９Ｂ ＦＩＧ、９Ｃ ９０’ ＦＩＧ、９Ｄ ９０’　イ扁光 ＦＩＧ、ＩＱ ＦＩＧ、ＩＩ ＦＩＧ、１２ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／ＧＯＩＮ　２１／２ １　Ｚ　７３７０−２Ｊ（７２）発明者　ロドリゲス　カルロス　エムアメリカ 合衆国　フロリダ州　３３１６５　マイアミ　ニスダブリュー　サーチイーサー ド　ストリート１００１０ Ｉ （７２）発明者　ラッセル　トーマス アメリカ合衆国　フロリダ州　３３１８６　マイアミ　ニスダブリュー　ワンハ ンドレッドイレブンス　ストリート　１４０００

Claims (82)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１の不明確な細胞集団を有する細胞試料の少なくとも１部分から 問題の少なくとも１の細胞群の分析を得る方法において、 第１試料部分中の問題の少なくとも第１選択細胞群の検出特性を変性し、特性を 検出された不明確な細胞集団から特性を検出された細胞群を取り出し、且つ 少なくとも偏光パラメータを有する前記第１試料部分を検出し且つ計数し、問題 の前記選択細胞群の寄与百分率を得ることを特徴とする方法。
2. ２．問題の前記選択細胞群における特異的な分子に特異的な結合反応体を有する ミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料部分に混合し問題 の前記選択細胞群に結合し問題の前記選択細胞群の少なくとも１の検出特性を変 えることにより前記検出特性を変性することを更に特徴とする請求項１記載の方 法。
3. ３．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的な分子を形成す る問題の前記細胞集団サブセットにおける抗原を調製することを更に特徴とする 請求項２記載の方法。
4. ４．ＷＢＣ集団である前記不明確な細胞集団および前記ＷＢＣ集団のサブセット 母集団である問題の前記選択細胞群を有する全血試料から前記細胞試料を形成す ることを更に特徴とする請求項１記載の方法。
5. ５．前記ＷＢＣ集団サブセットにおける特異的な分子に特異的な結合反応体を有 するミクロスフィアを調製し且つ前記ミクロスフィアを前記試料部分に混合し前 記ＷＢＣ集団サブセットに結合し前記ＷＢＣ集団サブセットの少なくとも１の検 出特性を変えることにより前記特性を変性することを更に特徴とする請求項４記 載の方法。
6. ６．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的分子を形成する 問題の前記ＷＢＣ集団サブセットにおける抗原を調製することを更に特徴とする 請求項５記載の方法。
7. ７．前記第１白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有する ミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記第１ サブセット集団に結合し前記第１サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシ フトすることにより第１白血球集団サブセットをシフトすることを更に特徴とす る請求項６記載の方法。
8. ８．第２白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有するミク ロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記第２サブ セット集団に結合し、前記第２サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフ トすることにより第２試料部分中の第２白血球集団サブセットをシフトすること を更に特徴とする請求項７記載の方法。
9. ９．ミクロスフィアの２セット即ち前記第１白血球集団サブセットに特異的な結 合モノクローナル抗体を有する第１セットおよび前記第２ＷＢＣ集団サブセット に特異的な結合モノクローナル抗体を有する第２セットを調製し、且つ前記ミク ロスフィアを前記試料と混合し前記第１および第２サブセット集団に結合し前記 第１および第２サブセット集団の各々の少なくとも１の検出特性をシフトするこ とにより、第３試料部分中の前記第１および第２白血球集団サブセットをシフト し、前記第１、第２および第３試料部分の結果を比較し第１および第２ＷＢＣ集 団サブセットの重なり百分率（ｐｅｖｃｅｎｔａｇｅｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ） を決定することを更に特徴とする請求項８記載の方法。
10. １０．前記ＣＤ４白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ４サブセット集団に結合し前記ＣＤ４サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトすることによりＣＤ４白血球集団サブセットをシフトすることを更 に特徴とする請求項６記載の方法。
11. １１．前記ＣＤ８白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ８サブセット集団に結合し前記ＣＤ８サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトすることにより第２試料部分中のＣＤ８白血球集団サブセットをシ フトすることを更に特徴とする請求項１０記載の方法。
12. １２．前記ＣＤ４およびＣＤ８白血球集団サブセットの１に特異的な結合モノク ローナル抗体を各々有するミクロスフィアの２セットを調製し、且つ前記ミクロ スフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ４およびＣＤ８サブセット集団に結合し前 記ＣＤ４およびＣＤ８サブセット集団の各々少なくとも１の検出特性をシフトす ることにより、第３試料部分中のＣＤ４およびＣＤ８白血球母集団サブセットを シフトする前記第１、第２および第３試料部分の結果を比較しＣＤ４およびＣＤ ８白血球集団サブセットの重なり百分率を決定することを更に特徴とする請求項 １１記載の方法。
13. １３．前記ＣＤ４白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ４サブセット集団に結合し前記ＣＤ４サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトすることによりＣＤ４白血球集団サブセットをシフトすることを更 に特徴とする請求項６記載の方法。
14. １４．前記ＣＤ２白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ２サブセット集団に結合し前記ＣＤ２サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトすることにより、第２試料部分中のＣＤ２白血球集団サブセットを シフトすることを更に特徴とする請求項１３記載の方法。
15. １５．前記ＣＤ２およびＣＤ４白血球集団サブセットの１に特異的な結合モノク ローナル抗体を各々有するミクロスフィアの２セットを調製し、前記ミクロスフ ィアを前記試料と混合し前記ＣＤ２およびＣＤ４サブセット集団に結合し前記Ｃ Ｄ２およびＣＤ４サブセット集団の各々の少なくとも１の検出特性をシフトする ことにより、第３試料部分中のＣＤ２およびＣＤ４白血球集団サブセットをシフ トし、前記第１、第２および第３試料部分の結果を比較しＣＤ２およびＣＤ４白 血球集団サブセットの重なり百分率を決定することを更に特徴とする請求項１４ 記載の方法。
16. １６．前記ＣＤ８白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ８サブセット集団に結合し前記ＣＤ８サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトすることにより、ＣＤ８白血球集団サブセットをシフトすることを 更に特徴とする請求項６記載の方法。
17. １７．前記ＣＤ２白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製し、且つ前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ２サブセット集団に結合し前記ＣＤ２サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトすることにより、第２試料部分中のＣＤ２白血球集団サブセットを シフトすることを更に特徴とする請求項１６記載の方法。
18. １８．前記ＣＤ２およびＣＤ８白血球集団サブセットの１に特異的な結合モノク ローナル抗体を各々有するミクロスフィアの２セットを調製し、且つ前記ミクロ スフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ２およびＣＤ８サブセット集団に結合し前 記ＣＤ２およびＣＤ８サブセット集団の各々少なくとも１の検出特性をシフトす ることにより、第３試料部分中のＣＤ２およびＣＤ８白血球母集団サブセットを シフトし、前記第１、第２および第３試料部分の結果を比較しＣＤ２およびＣＤ ８白血球集団サブセットの重なり百分率を決定することを更に特徴とする請求項 １７記載の方法。
19. １９．前記全血試料が赤血球集団を含み、前記白血球集団の関係する質および／ 又は量に重大な悪影響を与えることなく前記試料から前記赤血球集団を取り出す ことを更に特徴とする請求項４記載の方法。
20. ２０．前記第１試料を第１検出且つ計数した後前記検出特性を変性し前記計数値 を比較して寄与百分率を得ることを更に特徴とする請求項１記載の方法。
21. ２１．前記第１試料中で問題の前記第１細胞群と共存する問題の少なくとも第２ 選択細胞群の検出特性を変性し特性を検出された不明確な細胞集団および特性を 検出された問題の前記第１細胞群から特性を検出された第２細胞群を取り出すこ とを更に特徴とする請求項１記載の方法。
22. ２２．問題の前記第２細胞群における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製することにより且つ前記ミクロスフィアを前記試料部分 と混合し問題の前記第２細胞群に結合し問題の前記第２細胞群の少なくとも１の 検出特性をシフトすることにより特性を検出された問題の前記第２細胞群を変性 することを更に特徴とする請求項２１記載の方法。
23. ２３．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的な分子を形成 する問題の前記細胞集団サブセットにおける抗原を調製することを更に特徴とす る請求項２２記載の方法。
24. ２４．ＷＢＣ集団である前記不明確細胞集団および前記ＷＢＣ集団のサブセット 集団である問題の前記選択細胞群を有する全血試料から前記細胞試料を形成する ことを更に特徴とする請求項２１記載の方法。
25. ２５．ミクロスフィアのセット、即ち前記ＷＢＣ集団サブセットの１における特 異的な分子に特異的な結合反応体を有する各セットを調製し且つミクロスフィア の前記セットを前記試料部分と混合し各セットを前記ＷＢＣ集団サブセットの１ に結合し各前記ＷＢＣ集団サブセットの少なくとも１の検出特性をシフトするこ とにより前記検出特性を変性することを更に特徴とする請求項２４記載の方法。
26. ２６．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的な分子を形成 する問題の前記ＷＢＣ集団サブセットにおける抗原を調製することを更に特徴と する請求項２５記載の方法。
27. ２７．前記第１白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有す るミクロスフィアを調製して前記ミクロスフイアを前記試料に混合し前記第１サ ブセット集団に結合し前記第１サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフ トすることにより第１白血球集団サブセットをシフトし且つ前記第２白血球集団 サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを調製し て前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記第２サブセット集団に結合し前記 第２サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトすることにより前記試料 部分中の第２白血球集団サブセットをシフトすることを更に特徴とする請求項２ ６記載の方法。
28. ２８．前記ＣＤ４血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有す るミクロスフィアを調製して前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ４ サブセット集団に結合し前記ＣＤ４サブセット集団の少なくとも１の検出特性を シフトすることによりＣＤ４白血球集団サブセットをシフトし且つ前記ＣＤ８白 血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有するミクロスフィア を調製して前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ８サブセット集団に 結合し前記ＣＤ８サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトすることに より前記試料部分中のＣＤ８白血球集団サブセットをシフトすることを更に特徴 とする請求項２６記載の方法。
29. ２９．少なくとも１の不明確な細胞集団を有する細胞試料の少なくとも１部分か ら問題の少なくとも１の細胞群の分析を得る装置において、 第１試料部分中の問題の少なくとも第１選択細胞群の検出特性を変性し、特性を 検出された不明確な細胞集団から特性を検出された細胞群を取り出す装置、およ び少なくとも偏光パラメータを有する前記第１試料部分を検出して計数する装置 を有することを特徴とする装置。
30. ３０．前記検出特性を変性する前記装置が、問題の前記選択細胞群における特異 的な分子に特異的な結合反応体を有するミクロスフィアを調製する装置および前 記ミクロスフィアを前記試料部分と混合し問題の選択細胞群に結合し問題の前記 選択細胞群の少なくとも１の検出特性を変える装置 を含むことを更に特徴とする請求項２９記載の装置。
31. ３１．前記反応体を形成するためにモノクローナル抗体を、および前記特異的な 分子を形成するために問題の前記細胞集団サブセットにおける抗原を調製する装 置を有することを更に特徴とする請求項３０記載の装置。
32. ３２．ＷＢＣ集団である前記不明確細胞集団および前記ＷＢＣ集団のサブセット 集団である問題の前記選択細胞群を有する全血試料から前記細胞試料を形成する 装置を有することを更に特徴とする請求項２９記載の装置。
33. ３３．前記検出特性を変性する装置が、前記ＷＢＣ集団サブセットにおける特異 的な分子に特異的な結合反応体を有するミクロスフィアを調製する装置および前 記ミクロスフィアを前記試料部分と混合し前記ＷＢＣ集団サブセットに結合し前 記ＷＢＣ集団サブセットの少なくとも１の検出特性をシフトする装置を含むこと を更に特徴とする請求項３２記載の装置。
34. ３４．前記反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的な分子 を形成するための問題の前記ＷＢＣ集団サブセットにおける抗原を調製する装置 を有することを更に特徴とする請求項３３記載の装置。
35. ３５．前記第１白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有す るミクロスフィアを調製することにより第１白血球集団サブセットを変える装置 および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記第１サブセット集団に結合し 前記第１サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトする装置を有するこ とを更に特徴とする請求項３４記載の装置。
36. ３６．前記第２白血球集団サブセットに特異的な待合モンクローナル抗体を有す るミクロスフィアを調製することにより第２試料部分中の第２白血球集団サブセ ットを変える装置および前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記第２サブセ ット集団に結合し前記第２サブセット集団の少なくとも１の検出特性を変える装 置 を有することを更に特徴とする請求項３５記載の装置。
37. ３７．ミクロスフィアの２セット、即ち前記第１白血球集団サブセットに特異的 な結合前記モノクローナル抗体を有する第１セットおよび前記第２ＷＢＣ集団サ ブセットに特異的な結合前記モノクローナル抗体を有する第２セット を調製することにより第３試料部分中の前記第１および第２白血球集団サブセッ トをシフトする装置および前記ミクロスフィアを前記試料を混合し前記第１およ び第２サブセット集団に結合し前記第１および第２サブセット集団の各々の少な くとも１の検出特性をシフトする装置および前記第１，第２および第３試料部分 の結果を比較し第１および第２ＷＢＣ集団サブセットの重なり百分率を決定する 装置を有することを更に特徴とする請求項３６記載の装置。
38. ３８．前記ＣＤ４白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することによりＣＤ４白血球集団サブセットをシフト する装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ４サブセット集 団に結合し前記ＣＤ４サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトする装 置を有することを更に特徴とする請求項３４記載の装置。
39. ３９．前記ＣＤ８白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することにより前記試料部分中のＣＤ８白血球集団サ ブセットをシフトする装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記Ｃ Ｄ８サブセット集団に結合し前記ＣＤ８サブセット集団の少なくとも１の検出特 性をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項３８記載の装置。
40. ４０．前記ＣＤ４およびＣＤ８白血球集団サブセットの１に特異的な結合モノク ローナル抗体を各々有するミクロスフィアの２セットを調製することにより第３ 試料部分中のＣＤ４およびＣＤ８白血球集団サブセットをシフトする装置および 前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記ＣＤ４およびＣＤ８サブセット集団 に結合し前記ＣＤ４およびＣＤ８サブセット集団の各々の少なくとも１の検出特 性をシフトする装置および前記第１，第２および第３試料部分の結果を比較して ＣＤ４およびＣＤ８白血球集団サブセットの重なり百分率を決定する装置を有す ることを更に特徴とする請求項３９記載の装置。
41. ４１．前記ＣＤ４白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することによりＣ４白血球集団サブセットをシフトす る装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ４サブセット集団 に結合し前記ＣＤ４サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトする装置 を有することを更に特徴とする請求項３４記載の装置。
42. ４２．前記ＣＤ２白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することにより第２試料部分中のＣＤ２白血球集団サ ブセットをシフトする装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記Ｃ Ｄ２サブセット集団に結合し前記ＣＤ２サブセット集団の少なくとも１の検出特 性をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項４１記載の装置。
43. ４３．前記ＣＤ２およびＣＤ４白血球集団サブセットの１に特異的な結合モノク ローナル抗体を各々有するミクロスフィアの２セットを調製することにより第３ 試料部分中のＣＤ２およびＣＤ４白血球集団サブセットをシフトする装置および 前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ２およびＣＤ４サブセット集団 に結合し前記ＣＤ２およびＣＤ４サブセット集団の各々の少なくとも１の検出特 性をシフトする装置および前記第１，第２および第３試料部分の結果を比較しＣ Ｄ２およびＣＤ４白血球集団サブセットの重なり百分率を決定する装置を有する ことを更に特徴とする請求項４２記載の装置。
44. ４４．前記ＣＤ８白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することによりＣＤ８白血球集団サブセットをシフト する装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ８サブセット集 団に結合し前記ＣＤ８サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトする装 置を有することを更に特徴とする請求項３７記載の装置。
45. ４５．前記ＣＤ２白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することにより第２試料部分中のＣＤ２白血球集団サ ブセットをシフトする装置および前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記Ｃ Ｄ２サブセット集団に結合し前記ＣＤ２サブセット集団の少なくとも１の検出特 性をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項４４記載の装置。
46. ４６．前記ＣＤ２およびＣＤ８白血球集団サブセットの１に特異的な結合モノク ローナル抗体を各々有するミクロスフィアの２セットを調製することにより第３ 試料部分中のＣＤ２およびＣＤ８白血球集団サブセットを変える装置および前記 ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ２およびＣＤ８サブセット集団と結 合し前記ＣＤ２およびＣＤ８サブセット集団の各々の少なくとも１の検出特性を シフトする装置を有することを更に特徴とする請求項４５記載の装置。
47. ４７．前記全血試料が赤血球集団を含み、且つ前記白血球集団の関係ある質およ び／又は量に重大な悪影響を与えることなく前記試料から前記赤血球集団を取り 出す装置を有することを更に特徴とする請求項３２記載の装置。
48. ４８．前記第１試料部分を第１検出および計数した後前記検出特性を変性する装 置および前記計数値を比較し寄与百分率を得る装置を有することを更に特徴とす る請求項２９記載の装置。
49. ４９．前記第１試料部分中で問題の前記第１細胞群と共存する問題の少なくとも 第２選択細胞群の検出特性を変性し特性を検出された不明確な細胞集団および特 性を検出された問題の前記第１細胞群から特性を検出された第２細胞群を取り出 す装置を有することを更に特徴とする請求項２９記載の装置。
50. ５０．問題の前記第２細胞群における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製することにより特性を検出された問題の前記第２細胞群 を変性する装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し問題の前記第２細 胞群を結合し問題の前記第２細胞群の少なくとも１の検出特性をシフトする装置 を有することを更に特徴とする請求項４９記載の装置。
51. ５１．前記反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的な分子 を形成するための問題の前記細胞集団サブセットにおける抗原を調製する装置を 有することを更に特徴とする請求項５０記載の装置。
52. ５２．ＷＢＣ集団である前記不明確な細胞集団および前記ＷＢＣ集団のサブセッ ト集団である問題の前記選択細胞群を有する全血試料から前記細胞試料を形成す る装置を有することを更に特徴とする請求項４９記載の装置。
53. ５３．ミクロスフィアのセット、即ち前記ＷＢＣ集団サブセットの１における特 異的な分子に特異的な結合反応体を有する各セットを調製することにより前記検 出特性を変性する装置およびミクロスフィアのセットを前記試料部分と混合し前 記ＷＢＣ集団サブセットの１に各セットを結合し各前記ＷＢＣ集団サブセットの 少なくとも１の検出特性を変える装置を有することを更に特徴とする請求項５２ 記載の装置。
54. ５４．前記反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的な分子 を形成するための問題の前記ＷＢＣ集団サブセットにおける抗原を調製する装置 を有することを更に特徴とする請求項５３記載の装置。
55. ５５．前記第１白血球細胞集団サブセット集団に特異的な結合モノクローナル抗 体をミクロスフィアを調製することにより第１白血球集団サブセットをシフトす る装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記第１サブセット集団に 結合し前記第１サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトする装置およ び前記第２白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有するミ クロスフィアを調製することにより前記試料部分中の第２白血球集団サブセット をシフトする装置および前記ミクロスフィアを前記試料に混合し前記第２サブセ ット集団に結合し前記第２サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトす る装置を有することを更に特徴とする請求項５４記載の装置。
56. ５６．前記ＣＤ４白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を有 するミクロスフィアを調製することによりＣＤ４白血球集団サブセットをシフト する装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記ＣＤ４サブセット集 団に結合し前記ＣＤ４サブセット集団の少なくとも１の検出特性をシフトする装 置および前記ＣＤ８白血球集団サブセットに特異的な結合モノクローナル抗体を 有するミクロスフィアを調製することにより前記試料部分中のＣＤ８白血球集団 サブセットをシフトする装置および前記ミクロスフィアを前記試料と混合し前記 ＣＤ８サブセット集団に結合し前記ＣＤ８サブセット集団の少なくとも１の検出 特性をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項５４記載の装置。
57. ５７．少なくとも１の不明確な細胞集団を有する細胞試料の少なくとも１部分か ら問題の少なくとも１の細胞群の分析を得る方法において、 少なくとも１の偏光パラメータを有する第１試料部分を検出および計数し、 第２試料部分から不明確な細胞集団を取り出し、少なくとも１の偏光パラメータ を有する前記第２試料部分を検出および計数し、 前記２計数値を比較し問題の前記不明確な細胞群の寄与百分率を得る、 ことを特徴とする方法。
58. ５８．前記不明確な細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製し前記ミクロスフィアを前記第２試料部分を混合し前記 不明確な細胞集団に結合し前記不明確な細胞集団の少なくとも１の検出特性を変 えることを更に特徴とする請求項５７記載の方法。
59. ５９．反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的な分子を形成する 前記不明確な細胞集団における抗原を調製することを更に特徴とする請求項５８ 記載の方法。
60. ６０．前記不明確な細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製し前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混合し前記 不明確な細胞集団に結合し、前記試料から結合前記不明確細胞集団を有する前記 ミクロスフィアを取り出すことを更に特徴とする請求項５７記載の方法。
61. ６１．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的な分子を形成 する前記不明確な細胞集団における抗原を調製することを更に特徴とする請求項 ６０記載の方法。
62. ６２．ＷＢＣ集団である前記不明確細胞集団および前記ＷＢＣ集団により不明確 な集団である問題の前記不明確細胞群を有する全血試料から前記細胞試料を形成 することを更に特徴とする請求項５７記載の方法。
63. ６３．前記不明確な細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製し前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混合し前記 不明確な細胞集団に結合し前記不明確な細胞集団の少なくとも１の検出特性を変 えることを特徴とする請求項６２記載の方法。
64. ６４．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的な分子を形成 する前記不明確な細胞集団における抗原を調製することを更に特徴とする請求項 ６３記載の方法。
65. ６５．結合好中球特異的なモノクローナル抗体を有するミクロスフィアを調製し 前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混合し前記好中球集団に結合し前記好 中球集団の少なくとも１の検出特性、即ち未成熟白血球集団である問題の前記選 択細胞群を変えることを更に特徴とする請求項６４記載の方法。
66. ６６．前記不明確細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有する ミクロスフィアを調製し前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混合し前記不 明確細胞集団に結合し前記試料から結合前記不明確細胞集団と共に前記ミクロス フィアを取り出すことを更に特徴とする請求項６２記載の方法。
67. ６７．前記反応体を形成するモノクローナル抗体および前記特異的分子を形成す る前記不明確細胞集団における抗原を調製することを更に特徴とする請求項６６ 記載の方法。
68. ６８．結合好中球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを調製し、 前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混合し前記好中球集団に結合し前記試 料部分から結合前記好中球集団と共に前記ミクロスフィアを取り出すことを更に 特徴とする請求項６７記載の方法。
69. ６９．磁気ミクロスフィアおよび磁界を形成し前記磁界内にて前記磁気ミクロス フィアを引きつけっつ前記第２試料部分の残部を取り出すことによって前記第２ 試料部分から前記好中球集団を取り出すことを更に特徴とする請求項６８記載の 方法。
70. ７０．少なくとも１の不明確細胞集団を有する細胞試料の少なくとも１部分から 問題の少なくとも１の細胞群の分析を得る装置において、 少なくとも１の偏光パラメータを有する第１試料部分を検出および計数する装置 、 第２試料部分から不明確細胞集団を取り出す装置、少なくとも偏光パラメータを 有する前記第２試料部分を検出および計数する装置、 前記２計数値を比較し問題の前記不明確細胞群の寄与百分率を得る装置 を有することを特徴とする装置。
71. ７１．前記不明確細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有する ミクロスフィアを調製する装置および前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と 混合し前記不明確細胞集団に結合し前記不明確細胞集団の少なくとも１の検出特 性をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項７０記載の装置。
72. ７２．反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的分子形成の ための前記不明確細胞集団における抗原を調製する装置を有することを更に特徴 とする請求項７１記載の装置。
73. ７３．前記不明確細胞集団における特異的分子に特異的な結合反応体を有するミ クロスフィアを調製する装置および前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混 合し前記不明確細胞集団に結合し前記試料から結合前記不明確細胞集団と共に前 記ミクロスフィアを取り出す装置を有することを更に特徴とする請求項７０記載 の装置。
74. ７４．前記反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的な分子 を形成するための前記不明確な細胞集団における抗原を調製する装置を有するこ とを更に特徴とする請求項７３記載の装置。
75. ７５．ＷＢＣ集団である前記不明確な細胞集団および前記ＷＢＣ集団により不明 確な集団である問題の前記不明確な細胞群を有する全血試料から前記細胞試料を 形成するための装置を有することを更に特徴とする請求項７０記載の装置。
76. ７６．前記不明確な細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製するための装置および前記ミクロスフィアを前記第２試 料部分と混合し前記不明確な細胞集団に結合し前記不明確な細胞集団の少なくと も１の検出特性をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項７５記載 の装置。
77. ７７．前記反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的な分子 を形成するための前記不明確な細胞集団における抗原を調製する装置を有するこ とを更に特徴とする請求項７６記載の装置。
78. ７８．結合好中球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを調製する 装置および前記ミクロスフィアを前記第２試料部分に混合し前記好中球集団に結 合し前記好中球集団の少なくとも１の検出特性即ち未成熟な白血球細胞集団であ る問題の前記選択細胞群をシフトする装置を有することを更に特徴とする請求項 ７７記載の装置。
79. ７９．前記不明確な細胞集団における特異的な分子に特異的な結合反応体を有す るミクロスフィアを調製する装置および前記ミクロスフィアを前記第２試料部分 と混合し前記不明確な細胞集団に結合する装置および前記ミクロスフィアを結合 前記不明確な細胞集団と共に前記試料から取り出す装置を有することを更に特徴 とする請求項７５記載の装置。
80. ８０．前記反応体を形成するためのモノクローナル抗体および前記特異的な分子 を形成するための前記不明確な細胞集団における抗原を調製する装置を有するこ とを更に特徴とする請求項７９記載の装置。
81. ８１．結合好中球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを調製する 装置および前記ミクロスフィアを前記第２試料部分と混合し前記好中球集団に結 合する装置および前記ミクロスフィアを結合前記好中球集団と共に前記試料部分 から取り出す装置を有することを更に特徴とする請求項８０記載の装置。
82. ８２．磁性ミクロスフィアおよび磁界を形成する装置および前記磁界内で前記磁 性ミクロスフィアを引き付けつつ前記第２試料部分の残部を取り出すことにより 前記第２試料部分から前記好中球集団を取り出す装置を有することを更に特徴と する請求項８１記載の装置。