CN107686859B - 一种适用于鱼类血细胞快速分类计数的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于鲫鱼、鲤鱼等常见鱼类的血细胞高通量快速分类分析方法。针对无法去除的有核红细胞在数量和形态两方面干扰白细胞分类计数的问题，利用荧光染料与多通道图像相结合的自动化测量和分析策略，依据细胞内颗粒、细胞核形态及位置等差异，将干扰的红细胞样点与白细胞分开，并划分出淋巴细胞、单核细胞和颗粒细胞等承担重要免疫功能的不同白细胞类群范围，完成自动分析。无法有效去除有核红细胞的难点长期困扰很多种类动物的血象自动化分析，本发明把荧光染料与图像分析相结合，利用多维全景分析仪高通量，高灵敏的测量模块，准确识别出红细胞类群，排除其干扰，为聚焦分析白细胞类群提供了重要的技术支持，有广阔应用前景。

Description

一种适用于鱼类血细胞快速分类计数的方法及应用

技术领域

本发明属于检测技术领域，涉及利用荧光染料与多通道图像相结合的新型自动化细胞检测技术，分析鲫鱼全血中各类血细胞种类和数量和比例的方法。本方法能简便、快速、准确、高通量检测鲫鱼血细胞种类和数量比例，可对尚无有效裂红试剂的鲫鱼血细胞进行更为精准的高效的自动化分析，避免了繁重的人工分类计数，以及人工辨识差异导致“因人而异的”结果偏差，解决了由无法去除的数量百倍于白细胞的大量红细胞对白细胞分类计数干扰的主要问题，实现了给鱼快速“验血”。

背景技术

血象是指血液一般检验结果的总称。例如，医学血常规检查就是一种血象分析，包括对血液细胞数量和质量的化验检查等，白细胞数目增高，常见于细菌感染、应激等；白细胞减低则多见于病毒感染、自身免疫性疾病等；嗜酸细胞比例上调，往往提示寄生虫感染、过敏等。血细胞是生物体免疫系统的重要组成部分，任培丽等（2008）发现鱼类外周血细胞数量及比例可以反映宿主健康状况。当鱼类处于某些非健康状况时，其外周血中红细胞数目会显著减少，白细胞数量则显著增加。Claver等（2009）提出鱼等非哺乳类脊椎动物的不同的类型的血细胞中的各个类群的白细胞细胞直接参与了众多免疫应答及相关的过程，对自身生理状态变化和外界环境因子的刺激十分敏感。生理及病理状态往往都能在血细胞的组成和丰度等方面有明确的反应，可以据此了解鱼类的健康状况。

多维全景检测仪是一种新型的图像辅助分析设备，它可以借助类似流式的上样模块，将待分析颗粒均匀分配于流动液滴中，再通过多维全景检测器采集相关数据，可对包括细胞在内的多种样品进行大小、颗粒度、长宽比，散射等几十种特征的分析；更为重要的是，该仪器能够对每个样点进行各个检测通道的图像采集，实现多维而且全景的分析。相较于常规流式细胞仪需要分选模块来收集待测细胞进行后续的繁琐的鉴定的分析不同，多维全景可以实时呈现并记录结果，便于随时调用分析，类似于传照相与数码照相的差别。Samsel等（2015）提出在医学领域可以利用该类图像辅助的仪器根据细胞数量及形态测量的偏移和变化诊断相关疾病，有很好的应用前景。图像辅助不但极大的节约时间和成本，而且对于没有特定筛选抗体的低等动物而言，这种实时、实景的分析能力是之前各项技术都无法比拟的。边界细胞以及低丰度类群细胞的分类关乎鉴定结果的准确性，但常规流式检测方法需要先回收再鉴定，而低丰度以及边界类群的少量细胞难以逐一回收鉴定，因此在水生动物血细胞分类方面尚未有成熟的高通量、自动化的方法。多维全景检测仪具有多通道同步采集图像的功能，实现一劳永逸的数据测量和保存，仅需一次上样即可，随时选择任何位置的任何一群甚至一个细胞进行精确比较，确保分群和统计结果的准确性；另一方面，多维全景分析仪的上样模块可以提供理想的检测速度，每分钟数万样本的通量是检测结果可靠性和重现性的重要保证。由此可见，常规流式不能采集样品图像，而一旦把细胞收集后就不能再放回原样品进行调整分群处理；而本发明使用多维全景分析仪，其采集的图像可以随时调用、匹配，根据图像特征精准调整分群，实现各类细胞的准确区分和分析。

水生动物，特别是水产动物是重要食物来源，因此大规模、高密度养殖已成为常态。我国养殖产量占到全世界的近一半，但随着养殖规模扩大，一些伴随高密度养殖的病害问题越来越突出。由于水产动物的生活环境不便于获取每只个体并进行针对治疗，因此定期抽检，提前发现，建立预警机制等监控体系就成为当务之急。这套系统的完善需要多方面的技术配合，常规技术方法主要包括，目测，手触，等浅表检查，虽然可以通过个体生长差异，摄食变化，运动，体色以及常规设备检测评价水生动物健康状况，但这些表征往往是在个体严重异常时才能探查到，这些不能满足预警监测所需的快速，高效，准确的要求。虽然可以加入镜检等微观分析，但染色，分类，计数等人工操作环节十分繁琐，且由于人工计数总量所限，只能提供基于数百样点的分析结果，对于一些低丰度的重要免疫细胞的比例和数量的细微变化尚无高效分析方法可用。

与哺乳动物的红细胞不同，鱼类的红细胞具有完整的细胞核，常规裂红试剂对于鱼类的红细胞无效；即便少量溶破，占血细胞绝大多数的红细胞释放出来的核DNA也会导致溶液十分粘稠，这些无法去除的大量丝状松散DNA使得样品失去了可操作性。白细胞有多个类群，承担重要免疫功能，但总量仅占全部血细胞的约1%，因此对鱼类白细胞进行分类分析时会受到大量红细胞的干扰，给常规的人工计数带来极大困难，统计结果也因人而异，可行性较差。虽然有研究尝试用流式细胞仪对鱼类血细胞进行自动化分类，但是由于红细胞与一些类群的白细胞在流式细胞仪的检测项目上特征接近，导致难以确定类群边界，而且流式细胞仪需要对边界细胞和散在的低丰度细胞回收后才能分析鉴定，因此目前尚无有效的通量高，可靠性高，重复性高的方法，这也严重阻碍了基于鱼类血细胞分类统计等血象分析需求的诸多研究和应用。

本发明针对水生动物血细胞缺乏特异性检测抗体的现状，以及鱼类的有核红细胞在数量和形态两方面干扰白细胞分类计数的主要问题，建立了一种适用于鲫鱼的荧光染料定位与图像辅助相结合的自动化分析法。本方法既有类似流式的高通量能力，又有超越流式细胞仪的图像辅助功能，结合荧光图像能通过细胞核大小、形态及位置清晰区分细胞类群。细胞经DAPI染色后，通过自动采集的图像可以清晰分辨每个类群细胞核的形态和位置并据此划定类群边界，将红细胞以及淋巴细胞，单核细胞粒和颗粒细胞等白细胞类群准确区分开，进行统计分析，获得准确的检测结果。

与人类的验血检查一样，鱼类的血象分析也是一项极其重要的和关键的检测手段，但一直受限于有核红细胞的干扰和人工分类计数的繁冗操作，尚无普遍适用的方法。本发明建立的操作简便、准确性高、可靠性好、通量大的方法避免了上述问题，利用图像辅助解决了清晰分群的问题，利用高通量自动检测仪既省却了大量分类计数的繁重劳动又避免了常规观察计数面临的“因人而异”的问题，因此在科学分析，养殖监测以及抗体开发等领域具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。

发明内容

本发明的目的在于，以荧光染料与图像分析相结合的策略，分析鲫鱼各类血细胞在大小、形态、胞质颗粒、细胞核等物理特性方面的差异，对其加以准确区分。本方法简便、高效、准确、可靠、成本极低，可以用于科研分析、养殖监测，以及环境监控等诸多领域。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种适用于鱼类血细胞快速分类计数的方法，其特征在于：针对无法去除的有核红细胞在数量和形态方面干扰白细胞分类计数的两个主要问题，建立了一种利用荧光染料与自动图像分析相结合的测量和分析策略，引入DAPI染料，将图像辅助的自动化分析用于细胞核的形态和位置差异对比，进一步通过明场和荧光视场的融合图像，准确甄别划定细胞类群边界。按如下步骤进行：

（1）采血和制样

微创抽取10-100微升鲫鱼全血，用含4%多聚甲醛的固定液室温固定5分钟，用DAPI染液重悬细胞，染色5分钟，用PBS重悬细胞；

(2)测试和分析

1）用70微米细胞筛过滤上述处理后的细胞样品，去除黏连细胞，中速上机检测，收集1-3万个样点的测量数据；

2）将单细胞样点以Area对Intensity作图，根据分区位置及图像提示的细胞形态特征将鲫鱼血细胞清晰地划分为红细胞类群和淋巴细胞，单核细胞以及粒细胞三个白细胞类群（图1）。由图像分析可见，R1类群的细胞核椭圆形，形态规整，由于缺乏内膜系统支撑，因此细胞膜塌缩，是有核的红细胞；R2类群长宽比接近，细胞核占比很大，属于淋巴细胞；R3类群细胞体积巨大，形态多样，细胞核边集，且无显著胞内颗粒，属于单核细胞；R4类群细胞较大，长宽比接近，细胞核形态及位置多变，而且具有明显的胞内颗粒，属于颗粒细胞。所述的鱼类指的是鲫鱼、鲤鱼等具有有核红细胞的鱼类。

本发明进一步公开了适用于鲫鱼血细胞快速分类计数的方法在用于鱼类血细胞自动化、高通量分类分析方面的应用。实验结果显示：本发明利用荧光染料与图像分析辅助相结合的策略，有效去除了有核红细胞的干扰，同时凭借高通量的检测能力可快速获得足量低丰度细胞类群样点数据，使得检测过程的可操作性和检测结果的可靠性相较于以往人工计数的“费时费力”和“因人而异”的有了显著改善。

本发明更加详细的描述如下

1、采血及制样

采用尾静脉微创取血法，所用试剂为：肝素钠抗凝剂100U/mL，多聚甲醛固定液4%（w/v），1xPBS，DAPI染液（100ng/mL）；抽取10-100μL全血，迅速转移到固定液中，室温固定5分钟；离心收集细胞，DAPI避光染色5分钟，离心收集细胞，重悬于1xPBS。

2、检测和分析

1）细胞样品经70μm细胞筛过滤去除多黏连细胞后上机，以中速度采集1-3万个样点测量结果用于分析；

2）将单细胞样点以Area对Intensity作图，根据分区位置及图像提示的细胞形态等特征可将鲫鱼血细胞清晰地划分为红细胞类群，以及淋巴细胞，单核细胞和粒细胞三个白细胞类群（图1）。由图像分析可见，R1类群细胞的质膜因缺乏内膜系统支撑而塌缩，胞质不含颗粒，核近椭圆形，形态规整，为有核的红细胞；R2类群长宽比接近，整体近圆形，胞质少，细胞核占比很大，属于淋巴细胞； R3类群细胞体积巨大，形态多样，细胞核偏离中心位置，且无明显胞内颗粒，属于单核细胞；R4类群细胞较大，长宽比接近，细胞核边集而且具有明显的胞内颗粒，属于颗粒细胞。各类细胞占比可由软件自动计算。

本发明公开的适用于鱼类血细胞快速分类计数的方法所具有的积极效果在于：

（1）从技术上来说，本发明建立了一种适用于鲫鱼等鱼类血细胞的高通量、自动化的分类分析方法。用多通道、高精度测量模块代替人工镜检，准确、快速，测量结果不会因人而异，批次重复性好；图像通道的辅助，确保结果的准确性和可靠性。上述综合特点是以往各类单一方法不具备的，因此有望从根本上改变目前鱼类血象自动化分析方法的短板，具有广阔的应用前景。

（2）从成本上来说，本方法所需的血量仅需微创采血即可满足，不影响动物生长；所需试剂耗材为肝素钠，多聚甲醛，PBS，普通离心管和吸头等常规市售产品，易获得，成本低，且检测用量很少，每个样品检测成本不足1元，具有很强的竞争优势。

附图说明

图1为鲫鱼血细胞分类分析示例；其中 a. 鲫鱼血细胞分群散点图；b. R1类群细胞图像，（左侧为明场图像，编号为样点序号，右侧图像中的高亮部分为相应细胞的细胞核区域。下同）；c. R2类群细胞图像；d. R3类群细胞图像；e. R4类群细胞图像；

图2为健康鲫鱼血细胞种类和数量的范围分析；其中R1红细胞，R2淋巴细胞，R3单核细胞，R4颗粒细胞；

图3为氨氮胁迫鲤鱼血的细胞分类分析；其中R1红细胞，R2淋巴细胞，R3单核细胞，R4颗粒细胞。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。

特别加以说明的是，本发明使用的试剂和材料：PBS、多聚甲醛，离心管等均购自生工生物工程（上海）有限公司；肝素钠抗凝剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；实验鲫鱼购自天津市王顶堤水产市场。

实施例1

鲫鱼血象健康范围分析

与医学血象检查类似，每种动物的血细胞种类和数量在一定程度上反映了其宿主的健康状况，通过规模测量可以获取健康鲫鱼血液中各类细胞的种类和比例范围。

检测流程：

（1）挑选体重300±30g的健康鲫鱼30尾，采用尾部取血法，抽取100μL全血，准确吸取20微升抗凝全血于4%多聚甲醛固定液中固定5分钟；离心弃上清，用DAPI染液重悬细胞团，室温染色5分钟，PBS重悬。

（2）用70μm规格细胞筛过滤去除黏连细胞，上机检测；中速率采集30000个细胞样点。

（3）用IDEAS Application v6.1软件分析数据，根据将单细胞样点图像辅助分析结果圈选特定细胞类群边界，自动计算各类细胞相对比例（图2）。其中R1红细胞类群占比最大为99.4%，R2淋巴细胞类群占比0.34%，R3单核细胞类群占比0.06%，R4颗粒细胞类群占比0.22%。

实施例2

急性氨氮胁迫鲤鱼的血象分析

本发明不但适用于鲫鱼，而且也适用于鲤鱼等含有完整细胞核的鱼类血细胞检测。残饵、粪便以及脱落碎屑等含氮有机物都是水体中的氨氮来源，氨氮浓度超过一定范围会对鱼类等水生动物造成严重健康威胁，这些健康损害通常在血象变化方面都有明显的指征。

（1）设置不含氨氮的对照组和含有200ppm氨氮的实验组；挑选体重500±50g的健康鲤鱼10尾，各取5尾，分别置于对照组和实验组水体中，3天后检测血液中各种血细胞含量变化

（2）采用尾部取血法，抽取100μL全血，准确吸取20微升抗凝全血于4%多聚甲醛固定液中固定5分钟；离心弃上清，用DAPI染液重悬细胞团，室温染色5分钟，PBS洗涤一遍。

（3）用70μm规格细胞筛过滤去除黏连细胞，上机检测；中速率采集30000个细胞样点。

（4）用IDEAS Application v6.1软件分析数据，根据将单细胞样点图像辅助分析结果圈选特定细胞类群边界，自动计算各类细胞相对比例（图3）。分析可见细胞密度有了显著下降，红细胞由于缺乏胞内膜系统，失去生产能力，所以易于受损。各类白细胞比例因此有所升高，总量仍显示为显著降低。另一方面，统计显示淋巴细胞占比0.77%，单核细胞占比0.15%，颗粒细胞占比0.23%白细胞类群之间对氨氮刺激亦有不同反应，其中颗粒细胞比例变化不大，但淋巴细胞与单核细胞数量有显著增加，可能与氨氮刺激导致固定化的单核细胞游离，从而刺激淋巴细胞增殖。

Claims (1)

1.一种适用于鱼类血细胞快速分类计数的方法，其特征在于，采用多维全景分析仪按如下的步骤进行：

微创抽取10-100微升鱼全血，用含4%多聚甲醛的固定液室温固定5分钟，用DAPI染液重悬细胞，染色5分钟，用PBS重悬细胞；用70微米细胞筛过滤上述处理后的细胞样品，去除黏连细胞，上机检测，收集1-3万个样点的测量数据；将单细胞样点以Area对Intensity作图，Area取值范围 0 — +237.5，Intensity的取值范围 -300 -+30000，根据分区位置及图像提示的细胞形态特征将鱼血细胞清晰地划分为红细胞类群和淋巴细胞，单核细胞以及粒细胞三个白细胞类群；所述的鱼类指的是具有有核红细胞的鱼类。

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