JP3188236B2 - 造血前駆細胞の検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、造血前駆細胞(HP
C: hematopoietic progenitor cell)の検出方法に関
し、末梢血幹細胞移植(PBSCT: peripheral blood stem
cell tranplantation)において、移植する末梢血幹細胞
(PBSC: peripheral blood stem cell)数を簡単に測定
し、PBSCを採取する時期を判定する指標として有用であ
る。なお、本明細書では、後述するように、造血前駆細
胞という語を末梢血幹細胞よりも広い範囲の同義語とし
て用いている。

【０００２】

【従来の技術】骨髄移植(BMT)は、白血病等の不治の病
の最終的な唯一の治療法として過去30年にわたり発達し
てきた。しかしながら、骨髄移植は注目をあびていた治
療法であったにもかかわらず、ドナー側の負担として全
身麻酔をして胸骨、腸骨に穴をあけて幹細胞を採取しな
ければならず、また移植を受ける側にはＧＶＨＤの危険
性が伴うことが問題となっていた。そのため大学病院ク
ラスでの実施に限られ、骨髄移植を行っていない病院も
多くあった。

【０００３】近年の造血幹細胞研究の急速な進歩、造血
因子製剤の登場で造血幹細胞を末梢血中に動員すること
が可能になったこと、血液成分分離装置のめざましい技
術改良等によって末梢血幹細胞移植(PBSCT)が急速に普
及してきている。

【０００４】BMTもPBSCTも、移植するのはどちらも幹細
胞であるが、PBSCTはBMTと比較して以下の点において有
利である： 幹細胞採取に全身麻酔を必要とせず、ただの成分採血
で採取できるため、極めて安全である。 移植後の速やかな造血回復が得られ、感染症の危険や
輸血の必要性を低下させる。 入院期間の短縮が図れる。 移植される幹細胞が極めて多く含まれる。 骨髄移植に比べて腫瘍細胞の混入が少ない。 移植関連死が少ない。 無菌室などの設備が簡易で済む。

【０００５】PBSCTの施行方法は以下のようにして行
う。まず患者に通常量の化学薬剤等を投与する。そうす
ると、まず末梢血中の白血球が減少し、その後５〜７日
目から白血球数が上昇しはじめる。この時期に末梢血中
に造血幹細胞が増加する。このときに、顆粒球コロニー
刺激因子(G-CSF: granulocyte colony stimulating fac
tor)などの造血因子を投与すると造血幹細胞はさらに増
加する。

【０００６】末梢血に大量に造血幹細胞が動員された時
点（５〜20日前後）で、血液成分分離装置により幹細胞
を採取（アフェレーシス）し、凍結保存する。ここで、
末梢血の幹細胞の増加を正確に知る必要がある。造血幹
細胞が動員されたタイミングと幹細胞採取のタイミング
は、早くなっても遅くなっても十分な量の幹細胞が確保
できなくなる。

【０００７】次に、骨髄破壊的な超大量の化学・放射線
療法を施行し、癌細胞をTotal killする。そして、採取
しておいた幹細胞を移植することにより、造血機能の速
やかな回復を図る。

【０００８】上述したように、PBSCTのためには効率良
く造血幹細胞を採取する必要があり、そのために末梢血
幹細胞の動員を正確にモニターする必要がある。現在一
般に行われている幹細胞数測定法としては、主としてコ
ロニーアッセイ法とFCM(フローサイトメトリ)を用いたC
D34陽性細胞測定法がある。コロニーアッセイ法は、IMD
M等の培地で適当に採取細胞数を調整した後、CO₂インキ
ュベータにて、血液幹細胞アッセイ用培地上で14日間培
養し、位相差顕微鏡を用いて算定する。一方、FCM法に
よるCD34陽性細胞の測定では、single color分析では、
例えば、全血と蛍光標識された抗CD34モノクローナル抗
体とを反応させた後、溶血を行い、フローサイトメータ
で測定し、側方散乱光と蛍光のスキャッタグラムあるい
は蛍光のヒストグラムからCD34陽性細胞を求める。ま
た、two color分析では、例えば、抗CD34モノクローナ
ル抗体と抗CD45モノクローナル抗体を用いてフローサイ
トメータで測定し、まずCD45陽性細胞のみをデータとし
て取り込み、さらに側方散乱光−CD34蛍光のパラメータ
を用いてそのデータを解析し、側方散乱光が低値でCD34
を発現している細胞を求める。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】コロニーアッセイ法
は、正確にPBSC数を求めるには最良の方法であるので、
アフェレーシスした検体を正確に測定するにはこの方法
が用いられている。しかしながら、測定に2週間かかる
ので、PBSC採取時期の決定には使えない。また、算定に
は一定レベルの手技が必要であり、再現性、普遍性に乏
しい欠点を有している。さらに、コストも高い。

【００１０】CD34陽性細胞測定法は、コロニーアッセイ
法に比べれば短時間で測定が行えるとは言え、この方法
も、測定に１〜2時間を要する。末梢血への幹細胞の動
員をモニターするためには、３〜５日間連続して測定す
ることが理想ではあるが、フローサントメータでCD34陽
性細胞を測定するこの方法は装置や試薬にかかる費用、
人員確保の問題により一般化が困難である。またこの方
法では、スキャッタグラムあるいはヒストグラム上の特
定の細胞領域を決定するのにゲーティングの作業を必要
とするため、施設間差も大きい。

【００１１】以上のような事情から、現実的には、血球
計数装置を用い、白血球数と血小板の増加パターンを見
て幹細胞の動員状況を間接的に把握し、採取時期を決定
している。この方法で臨床上は十分とする意見もある
が、確実性に欠ける。つまり、この方法では、白血球数
と血小板数とが同期して上昇する場合にはPBSCの採取時
期を決定するのは容易であるが、両者の上昇度合が乖離
する場合には決定が困難である。

【００１２】最近になって、幼若白血球を検出できるチ
ャンネル(IMIチャンネル：immatureleulocyte informat
ion channel)を備えた自動血球分析装置(SE-9000,東亞
医用電子株式会社)が市販され、これを用いてPBSCを測
定した事例が報告されている（例えば、Lebeck, L.K. e
t al., International Society for Laboratory Hemato
logy, Vol.1, No.1, p.62, 1995; Takekawa, K. et a
l., The Japanese Journal of Clinical Hematology, V
ol.36, No.9, 1995; Yamada, H. et al., Japanese Jou
rnal of Medical Technology, Vol.145, No.3, p.501,
1996; Mougi, H.et al., Med. J. Kagoshima Univ., Vo
l.48, No.2, p.139-146, 1996; Houwen,B. et al., Int
ernational Society for Laboratory Hematology, Vol.
2, No.2,p.51, 1996; Takekawa, K. et al., Journal o
f the American Society of Hematology, Vol.88, No.1
0, Supplement 1, 250b, 1996）。これらの報告による
と、幼若白血球の総数（IMI total）とフローサイトメ
ータによるCD34陽性細胞数との間に有意な相関関係が認
められている。

【００１３】しかしながら、IMI totalは、芽球(Blas
t)、幼若顆粒球(Immature granulocyte)、左方移動(Lef
t shift)の各領域に出現する細胞を含む総数であり、PB
SC数のみを反映しているわけではない。従って、IMI to
talには、上記のようなより成熟した幼若白血球も含ま
れているため、PBSCTに有用なPBSCの出現をモニターす
るには誤差が大きい。

【００１４】本発明は、簡便でより確実にPBSCの出現を
検知することのできる方法を提供することを目的とす
る。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は、免疫学的な手
法を用いることなく幼若細胞を検出できる試薬と血液試
料を混合し、前記工程で処理された血液試料を粒子分析
装置を用いて細胞情報を測定して細胞分布図を作成し、
前記細胞分布図上に設定された、造血前駆細胞の少なく
とも１つのサブクラスが出現する領域を設定し、その領
域内の細胞数を計数する、ことによって造血前駆細胞の
出現を検出及び／又は計数することを特徴とする。

【００１６】本発明において、造血前駆細胞(HPC)と
は、多能性幹細胞から各系統の血液細胞へと分化してい
く血液細胞分化の過程で、芽球以前の分化段階の細胞の
総称であり、末梢血幹細胞(PBSC)より広範囲の同義語と
して使用する。

【００１７】造血前駆細胞には、多能性幹細胞（plurip
otent stem cell）、リンパ系幹細胞（lymphoid stem c
ell）、骨髄系幹細胞（CFU-GEMM）、赤芽球コロニー群
形成細胞（BFU-E）、赤芽球コロニー形成細胞（CFU-
E）、巨核球コロニー形成細胞（CFU-Meg）、好中球・マ
クロファージコロニー形成細胞（CFU-GM）、好酸球形成
細胞（CFU-E_OS）、Ｂ細胞前駆細胞（progenitor B）、
ならびにＴ細胞前駆細胞（progenitor T）等のサブクラ
スがある（図９参照）。

【００１８】また、「幼若細胞を検出できる試薬」とい
う語を用いるときの幼若細胞とは、例えば顆粒球（好中
球、好酸球、好塩基球）の場合であれば、造血前駆細胞
から（骨髄芽球→前骨髄球→骨髄球→後骨髄球）→（杆
状核球→分葉核球）というように幼若な血球から成熟な
血球へと分化していく過程における成熟血球以前の細胞
を総称していう。なお、図９には、好中球の分化過程を
示し、好酸球と好塩基球については省略した。

【００１９】本発明において「免疫学的な手法を用いる
ことなく幼若細胞を検出できる試薬」とは、図９に示す
ような各サブクラスに特有な細胞表面抗原とこれを認識
する抗体（例えば抗ＣＤ３４抗体）との免疫学的反応を
利用することなく幼若細胞を検出できる試薬をいう。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明で用いられる、免疫学的な
手法を用いることなく幼若細胞を検出できる試薬は、赤
血球を溶解できる水溶性界面活性剤を含む水溶液であ
る。中でも好適なのは、ノニオン性界面活性剤であり、
ポリオキシエチレン(POE)系ノニオン性界面活性剤であ
る。さらに好ましくは、以下の式:

【化１】

【００２１】このうち、R₁が、炭素数10〜25のアルキ
ル、アルケニル又はアルキニル基であり、R₂が O であ
り、nが10〜30の整数のものが特に好適であり、具体例
を挙げれば、POE(20)ラウリルエーテル、POE(15)オレイ
ルエーテル、POE(16)オレイルエーテルが特に好適に使
用される。

【００２２】ノニオン性界面活性剤の濃度については、
使用するものによって異なるが、前述のPOE(20)ラウリ
ルエーテルでは、0.1〜2.0g/l（好ましくは0.5〜1.5g/
l）の範囲で使用でき、POE(15)オレイルエーテルでは、
1〜9g/l（好ましくは3〜7g/l）の範囲で使用でき、POE
(16)オレイルエーテルでは、5〜50g/l（好ましくは15〜
35g/l）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノ
ニオン性界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれ
ば、nの数が小さくなるほど、細胞を損傷する力が強
く、nが大きくなるほど弱くなる。また、nの数が同じで
あれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて、細胞
を損傷する力は強くなる。その点を考慮し、上記の値を
目安にして、必要な界面活性剤濃度は、実験により簡単
に求めることができる。

【００２３】また、この試薬には、可溶化剤を含有する
ことができる。この可溶化剤を使用することによって、
赤血球ゴーストと成熟白血球を収縮させ、造血前駆細胞
を含む幼若細胞をより明瞭に弁別できるようになる。好
ましい可溶化剤を以下に例示する:

【化２】

【００２４】可溶化剤の好ましい濃度は、サルコシン酸
誘導体あるいはその塩では、0.2〜2.0g/l、コール酸誘
導体では、0.1〜0.5g/l、メチルグルカンアミドでは、
1.0〜8.0g/lである。具体的には、Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナ
トリウム、ラウロイルサルコシン、CHAPS（３−［（３
−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−
プロパンスルホネート）、CHAPSO（３−［（３−コール
アミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキ
シ−１−プロパンスルホネート）、MEGA8（オクタノイ
ル−N−メチルグルカミド）、MEGA9（ノナノイル−N−
メチルグルカミド）、MEGA10（デカノイル−N−メチル
グルカミド）等が好適に使用できる。その他にも、n−
オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレー
トやN−ホルミルメチルロイシルアラニン等が使用で
き、好ましい濃度は、0.01〜50.0g/lである。

【００２５】また、この試薬にアミノ酸を含有させる
と、造血前駆細胞を含む幼若細胞の同定ならびに分類の
ために好都合である。アミノ酸としては、タンパク質を
構成するアミノ酸であれば何でも使用でき、グルタミン
酸、バリン、メチオニンやシスチン、システインのよう
な含硫アミノ酸等が特に好適である。使用量は、1〜50g
/lの範囲で使用でき、グルタミン酸の場合は8〜12g/lが
好適であり、メチオニンの場合は、16〜24g/lが好適で
ある。

【００２６】また、pHを一定に保つための緩衝剤を含有
させることができる。好ましいpHの範囲は、5.0〜9.0で
ある。この範囲に調整できるものであれば、種類はとく
に制限されず、公知のものが使用できる。

【００２７】必要であれば、浸透圧を150〜600mOsm/k
g、好ましくは250〜380mOsm/kgに調整するために、浸透
圧調整剤を添加することができる。

【００２８】さらに、数MHzの高周波信号を供給し血球
の誘電率の違いに基づく信号を検出（RF法）して細胞情
報を検出する場合には、水溶液の電気伝導度を3.0〜12.
0mS/cm、好ましくは6.0〜9.0mS/cmに調整して使用する
ことができる。この場合、使用に適しているのは、電解
質であり、塩化ナトリウムや塩化カリウムのようなアル
カリ金属やアルカリ土類金属のハロゲン化物、硫酸塩、
硝酸塩等を使用することができる。なお、散乱光のよう
に光学的な手段のみを用いて細胞情報の測定を行なう場
合には、電気伝導度については考慮する必要はない。

【００２９】本発明を実施するには、まず上述した幼若
細胞を検出できる試薬と血液試料を混合し、反応させ
る。混合に際して、血液試料を100〜500倍、好ましくは
200〜300倍に幼若細胞を検出できる試薬で希釈する。反
応温度は、25.0〜40.0℃、好ましくは30〜34℃、反応時
間は、5 〜60秒、好ましくは10〜20秒間である。

【００３０】次に、粒子分析装置を用いて、1つの細胞
に対し、1つ以上の細胞情報を測定する。好ましくは、
２つ以上の細胞情報が望ましく、細胞の大きさ情報と内
部情報の組み合わせ、又は内部情報同士の組み合わせが
考えられる。細胞の大きさ情報としては、直流電流をア
パーチャ（微細孔）に流しておき、細胞がそのアパーチ
ャを通過する際に生じる細胞の電気抵抗の違いに基づく
信号（DC信号）や、低角度（例えば、光軸に対して1〜6
度）散乱光が挙げられる。また、内部情報としては、高
周波電流をアパーチャ（微細孔）に流しておき、細胞が
そのアパーチャを通過する際に生じる細胞の誘電率の違
いに基づく信号（RF信号）や、高角度（例えば、光軸に
対して8〜20度）前方散乱光、側方（光軸に対して70〜1
10度）散乱光、後方散乱光（光軸に対して120〜180
度）、偏光解消度等が挙げられる。

【００３１】複数の細胞情報を測定できる粒子分析装置
としては、光学式の装置では、公知のフローサイトメー
タがあり、電気抵抗式の装置では、RF/DC検出方式を採
用したNEシリーズ、SEシリーズ（いずれも東亞医用電子
株式会社）がある。RF/DC方式では、直流電流に高周波
電流を重畳することによって、細胞の大きさと細胞内部
の情報を同時に検出することが可能である。

【００３２】次に得られたデータに基づいて細胞分布図
を作成する。細胞分布図は、1次元ヒストグラム、ある
いは2次元又は3次元スキャッタグラムである。好ましく
は2次元スキャッタグラムを作成する。

【００３３】なお、造血前駆細胞数を測定するには、上
記の細胞分布図上で造血前駆細胞の出現領域を設定して
おく必要がある。そのためには、造血前駆細胞がCD34陽
性である性質を利用して、免疫磁気ビーズ法によるセル
セパレーションにより造血前駆細胞のみを分離し、粒子
分析装置で測定して、出現位置を確認し、これを造血前
駆細胞の測定領域と設定することができる。

【００３４】セルセパレーションを行うには、例えば血
液成分分離装置により単核球に富む試料を調製する。次
にこれを抗CD34モノクローナル抗体を結合させた磁気ビ
ーズ（例えば、Dynabeads^TM; DYNALとして市販されてい
る）と反応させ、次いで磁気細胞分離器（例えば、Isol
ex^TM: Baxter Co. Ltd.）を用いてCD34陽性の造血前駆
細胞を分離する。次に、酵素処理を行ってCD34陽性細胞
を磁気ビーズから分離する。

【００３５】また、図９に示したように、造血前駆細胞
は、分化段階にしたがって、CD34の他に様々な抗原を有
する。これを利用して、さらに、それぞれの分化段階で
出現するCD34以外の抗原を認識する抗体を結合した磁気
ビーズを用い、上記と同様に免疫磁気ビーズ法によるセ
ルセパレーションを行うことによって、特定のサブクラ
スに富んだ試料を調製することができる。

【００３６】このようにして得られる試料に幼若細胞を
検出できる試薬を混合し、例えばRF/DC法を採用したSE-
9000（東亞医用電子株式会社）で測定する。複数の試料
を測定し、造血前駆細胞の出現パターンから、出現領域
をスキャッタグラム上に実験的に設定する。

【００３７】いったん造血前駆細胞の出現領域をこのよ
うにして設定すると、実際の血液試料の測定は極めて簡
単、迅速である。即ち、幼若細胞を検出できる試薬と血
液試料を混合して反応させ、粒子分析装置で細胞情報を
測定して細胞分布図を作成し、上述したようにして設定
した領域内の造血前駆細胞を計数する。SE-9000などの
装置ではこれらの工程を自動化されたIMIチャンネルに
よって行うことができるので、１つの血液試料の測定に
要する時間は約１〜２分である。

【００３８】本発明の方法で検出しようとする造血前駆
細胞は、造血前駆細胞の多能性幹細胞（pluripotent st
em cell）、リンパ系幹細胞（lymphoid stem cell）、
骨髄系幹細胞（CFU-GEMM）、赤芽球コロニー群形成細胞
（BFU-E）、赤芽球コロニー形成細胞（CFU-E）、巨核球
コロニー形成細胞（CFU-Meg）、好中球・マクロファー
ジコロニー形成細胞（CFU-GM）、好酸球好酸球形成細胞
（CFU-E_OS）、Ｂ細胞前駆細胞（progenitor B）、なら
びにＴ細胞前駆細胞（progenitor T）のサブクラスのう
ちの少なくとも１つであり、好ましくは、CFU-GM,CFU-G
EMMまたはCFU-E_OSである。これらは、すべてCD34陽性細
胞である。

【００３９】上述した、免疫学的手法を用いることなく
幼若細胞を検出できる試薬、例えばノニオン性界面活性
剤、可溶化剤及びアミノ酸及びpH5.0〜9.0、浸透圧150
〜600mOsm/kg、電気伝導度3.0〜12.0mS/cmの緩衝剤を含
む試薬では、造血前駆細胞だけでなく、芽球（リンパ芽
球、骨髄芽球）、幼若顆粒球（前骨髄球、骨髄球、後骨
髄球）、左方移動（左方移動とは核の分葉の少ない好中
球が、すなわち杆状核好中球が増加したことをいうが、
ここでは杆状核好中球を指す）等の、造血前駆細胞細胞
よりも成熟した細胞も検出される。造血前駆細胞を含む
試料では、同時にこれらの細胞も出現するので、従来の
ようにIMI totalを用いて造血前駆細胞の動態を把握す
るには余分な細胞が多い（図２参照）。しかしながら、
本発明の方法を用いて設定した領域の細胞数を計数する
と、これらの細胞の影響を少なくして、より特異性を高
めることが図３から明らかである。

【００４０】また、本発明の方法により測定した細胞数
はIMI totalよりもCD34陽性細胞との相関性が高い（図
４と図５を比較されたい）。さらに、CD34陽性細胞数は
PBSCT施行前の最初の化学薬剤の投与後５〜７日目から
増加し始め、１０〜１２日目で急激に増加した後、約１
７日目でいったん低下し、その後再度増加することが観
察された。本発明の方法により測定した細胞数はIMI to
talよりも、このようなCD34陽性細胞の挙動とよく一致
することが判明した（図６と図７を比較されたい）。従
って、本発明の方法は末梢血中の造血前駆細胞の経日的
変化をモニターするのに適している。

【００４１】本発明の方法によって測定した造血前駆細
胞数は造血前駆細胞の１つのサブクラスである好中球・
マクロファージコロニー形成細胞（CFU-GM）数ともよく
一致した（図８）。PBSCTの施行にあたっては、G-CSFな
どの造血剤を投与するが、そのとき優先的に出現すると
されているCFU-GM数を経日的にモニターできることも本
発明の大きな利点である。

【００４２】本発明を以下の実施例によってさらに詳し
く説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定す
るものではない。

【００４３】なお、以下の実施例では、幼若細胞を検出
できる試薬として次の組成の物を使用した。

【００４４】 （試薬組成） POE(15)オレイルエーテル 5g Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム 1.5g グルタミン酸 10g リン酸緩衝液(pH7.0, mM) 10g 塩化ナトリウム 適量（電気伝導度を13.0ms/cmに調整) 精製水 1Ｌ

【００４５】

【実施例】

実施例１：スキャッタグラム上における造血前駆細胞の
領域設定 血液成分分離装置により単核球に富む試料を調製した。
次にこれを抗CD34モノクローナル抗体（Becton Dickins
on Immunocytometry System Co. Ltd.社製）を結合させ
た磁気ビーズと反応させ、次いで磁気細胞分離器（Isol
ex^TM: Baxter Co. Ltd.）を用いてCD34陽性の造血前駆
細胞を分離した。次に、酵素（キモパパイン）処理を行
ってCD34陽性細胞を磁気ビーズから分離した。

【００４６】このようにして調製した試料に上述の幼若
細胞を検出できる試薬を加えて混合し、SE-9000（東亞
医用電子株式会社）で測定した。１０検体について測定
を行い、その造血前駆細胞の出現パターンから、出現領
域をスキャッタグラム上に設定した（図１）。

【００４７】実施例２：IMI totalと造血前駆細胞の比
較IMI totalの測定 Ｇ−ＣＳＦ投与後の末梢血検体を上述の幼若細胞を検出
できる試薬で２５０倍に希釈し、３３℃で１３秒反応さ
せた後、SE-9000（東亞医用電子株式会社）で測定した
細胞分布図を図２に示す。この検体には造血前駆細胞以
外の分化した幼若白血球も含まれ、分布図上においても
芽球から幼若球領域上に分布していることが伺える。こ
れらは従来幼若白血球数の総数（IMI total）として計
数されていた集団である。なお、IMI totalは、Blast,
Immature granulocyte及びLeft shiftの各領域内の計数
値の総数である。

【００４８】本発明の方法による造血前駆細胞の測定 IMI totalの測定に用いたのと同じ検体を、実施例１に
記載した方法で設定した領域内で測定した細胞分布図を
図３に示す。この領域を設定することにより芽球(Blas
t)、幼若顆粒球(Immature granulocyte)、左方移動細胞
(Left shift)の各領域に出現する細胞の影響を少なく
し、より特異性を高めることが図３の細胞分布図よりも
明らかである。

【００４９】実施例３：CD34陽性細胞との相関性 実施例２の方法で測定した幼若白血球数の総数（IMI to
tal）と造血前駆細胞数のそれぞれと、CD34陽性細胞数
との相関性を検討した。

【００５０】なお、CD34陽性細胞数はフローサイトメト
リ法を用いてFACScan(Becton Dickinson Immunocytomet
ry Systems Co. Ltd.)で測定した結果である。

【００５１】末梢血検体（９９検体）を用いて測定し
た、IMI totalとCD34陽性細胞との相関関係を図４に示
す。この図よりIMI totalとCD34陽性細胞の間に相関関
係があることが認められた（相関係数r=0.527）。

【００５２】また、造血前駆細胞数とCD34陽性細胞との
相関関係を図５に示す。設定した領域の出現細胞数を用
いることで高い相関係数が得られ（相関係数r=0.81
4）、本発明の方法の有効性が示された。

【００５３】実施例４：経日的変化における相関性 CD34陽性細胞数はPBSCT施行前の最初の化学薬剤の投与
後５〜７日目から増加し始め、１０〜１２日目で急激に
増加した後、約１７日目でいったん低下し、その後再度
増加することが観察された（なお、CD34陽性細胞数はフ
ローサイトメトリ法で測定した）。そこで、実施例２の
方法によりIMI totalと造血前駆細胞とを同様に経日的
に測定してCD34陽性細胞の挙動と比較した。

【００５４】図６にCD34陽性細胞数とIMI total、図７
にCD34陽性細胞数と設定した領域の造血前駆細胞数それ
ぞれの経日的な変化を示す。IMI totalよりも本発明の
方法により設定した領域の粒子数の方がよりCD34陽性細
胞数の変化と一致し、よりダイナミックなCD34陽性細胞
数の変化を表現していると言える。

【００５５】実施例５：CFU-GMとの相関性 実施例２の方法により設定した領域内の造血前駆細胞数
と、造血前駆細胞の１つのサブクラスである好中球・マ
クロファージコロニー形成細胞（CFU-GM）数とを比較し
た（１０検体）。CFU-GM数は用手法を用いて顕微鏡でコ
ロニーを計数した。得られた結果を図８に示す。両者の
間に高い相関関係（相関係数r=0.950）。

【００５６】なお、この試験では、G-CSF投与後に末梢
血幹細胞採取した検体を使用した。

【００５７】

【発明の効果】本発明によれば、免疫学的な手法を用い
ることなく幼若細胞を検出できる試薬と細胞情報が得ら
れる粒子分析装置を用いることにより造血前駆細胞のサ
ブクラスの1つを検出することが可能であり、短時間、
低コスト、簡便に造血前駆細胞の動的変化をモニターを
することが出来る。特に、従来のコロニー培養法では検
査に２週間程度かかり、またフローサイトメトリ法でも
約２時間を要していたのに対して、本発明の検出法では
約１〜２分で結果を得ることができるのは大きな利点で
ある。また、高価な抗ＣＤ３４モノクローナル抗体を用
いる方法に比べると、費用が格段に安い（約１／５
０）。さらに、測定に特別な手技を必要とせず、手技に
よるバラツキを生じない。

【００５８】加えて造血前駆細胞の出現領域を設定する
ことで芽球、幼若顆粒球や桿状核球の影響を削減するこ
とが可能であり、より高度に造血前駆細胞を検出するこ
とができる。

【００５９】末梢血幹細胞移植では末梢血への幹細胞の
動員をモニターするには３〜５日間連続して測定を行う
ことが理想であるが、本発明の方法を用いることによ
り、これを簡単に達成することができる。骨髄移植に代
えて末梢血幹細胞移植が主流となりつつある状況におい
て、本発明の産業上の利用価値は極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の方法により調製された試料をSE-900
0（東亞医用電子株式会社）で測定した細胞分布図であ
る。

【図２】末梢血幹細胞の動員された末梢血検体をSE-900
0（東亞医用電子株式会社）で測定した細胞分布図であ
る。

【図３】末梢血幹細胞の動員された末梢血検体を本発明
の方法により設定した領域内でSE-9000（東亞医用電子
株式会社）で測定した細胞分布図である。

【図４】IMI totalとCD34陽性細胞との相関関係を示
す。

【図５】本発明の方法により測定した造血前駆細胞数と
CD34陽性細胞との相関関係を示す。

【図６】CD34陽性細胞数とIMI totalの経日的変化を示
す。

【図７】CD34陽性細胞数と本発明の方法により測定した
造血前駆細胞数の経日的な変化を示す。

【図８】本発明の方法で測定した造血前駆細胞数と用手
法で測定したCFU-GM細胞数との相関関係を示す。

【図９】血球の分化過程と表面抗原の関係を示す。

フロントページの続き (72)発明者 池内 喜郎 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番 地の１ 東亞医用電子株式会社内 (72)発明者 浜口 行雄 兵庫県神戸市中央区港島中町７丁目２番 地の１ 東亞医用電子株式会社内 (56)参考文献 特開 平６−273413（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 G01N 15/00 G01N 15/14 G01N 33/49 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫学的な手法を用いることなく幼若細胞
   を検出できる試薬と血液試料を混合し、 前記工程で処理された血液試料を粒子分析装置を用いて
   細胞情報を測定して細胞分布図を作成し、 前記細胞分布図上に設定された、造血前駆細胞の少なく
   とも１つのサブクラスが出現する領域を設定し、 その領域内の細胞数を計数する、ことからなる造血前駆
   細胞の出現を検出及び／又は計数する方法。
2. 【請求項２】細胞情報が、大きさ情報と細胞内部情報で
   ある請求項１の方法。
3. 【請求項３】サブクラスが、CFU-GM,CFU-GEMMまたはCFU
   -E_OSである請求項１の方法。
4. 【請求項４】免疫学的な手法を用いることなく幼若細胞
   を検出できる試薬がノニオン性界面活性剤を含む水溶液
   である請求項１の方法。