JP2996513B2 - 出生前遺伝子解析における使用のための母体循環における胎児幹細胞の相違する拡大 - Google Patents
出生前遺伝子解析における使用のための母体循環における胎児幹細胞の相違する拡大Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、遺伝子病の出生前診断を目的とする胎児細
胞の非侵襲性サンプリングに関する。他により提案され
た候補細胞は、白血球、赤血球様細胞、およびトロホブ
ラストを含む。第１または第２のトリメスターに母体の
循環中に入り込む胎児血液量は、中期トリメスター（mi
dtrimester）までは１日当たり２μｌまたは合計で50〜
200μｌと見積もられる（Parksら）。他の見積りでは、
約1/50,000の細胞が胎児性であると示唆される（Schrod
erら）。最近の研究により、この比は妊娠15週で1/144,
000から妊娠後期の1/4.000まで増加することが決定され
た（Hamadaら）。
胞の非侵襲性サンプリングに関する。他により提案され
た候補細胞は、白血球、赤血球様細胞、およびトロホブ
ラストを含む。第１または第２のトリメスターに母体の
循環中に入り込む胎児血液量は、中期トリメスター（mi
dtrimester）までは１日当たり２μｌまたは合計で50〜
200μｌと見積もられる（Parksら）。他の見積りでは、
約1/50,000の細胞が胎児性であると示唆される（Schrod
erら）。最近の研究により、この比は妊娠15週で1/144,
000から妊娠後期の1/4.000まで増加することが決定され
た（Hamadaら）。
本明細書で使用する略号を以下に示す： BFU−Ｅ バースト形成単位−赤血球様 BPA バースト促進活性 BSA ウシ血清アルブミン CFU−Ｅ コロニー形成単位−赤血球様 Ep エリスロポエチン FACS 蛍光活性化細胞選択 FCS ウシ胎児血清 FISH 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション GM−CSF 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 GPA グリコホリンＡ Hb ヘモグロビン IL−3 インターロイキン−３ IL−6 インターロイキン−６ MACS 磁気活性化細胞選択 MNC 単核細胞 mRNA メッセンジャーリボ核酸 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 RT−PCR 逆転写PCR SCF 幹細胞因子（stem cell factor） TFR トランスフェリンレセプター TSPR トロンボスポンジンレセプター Zipurskyらは、胎児ヘモグロビンに対するKleihauer
−Betke染色を用いて、母体の循環中の胎児赤血球（送
達の直後ではあるが）を最初に示した（Zipurskyら）。
Schrderは、1975年にこのことを再検討し、第２トリ
メスターの妊娠の５〜10％において50,000個の母体細胞
あたり１個より多い胎児細胞が存在することを示唆した
（Schrderら）。ParksおよびHerzenbergは、蛍光活性
化細胞選択（FACS）を用いて、すべてのRh D- ABO適合
母親の血液中に1:4,000から1:80,000の範囲の頻度（200
μｌの胎児血液に対応）でRh D+赤血球を発見した（Par
ksら）。母体の血液中の胎児赤芽球（および網状赤血
球）は、Bianchiら（1990）により、トランスフェリン
レセプター（TFR）に対するモノクローナル抗体を用い
た蛍光活性化細胞選択（FACS）を使用して妊娠16週程度
の初期に同定された。Priceらは、グリコホリンＡ（GP
A）に対する抗体の添加ならびに細胞のサイズ（前方光
散乱）および粒度（側方散乱）に従う選別によりその富
化を増強した。彼らは、ＸおよびＹ染色体に対するマー
カーを用いたインサイチュハイブリダイゼーショを使用
し、107個の母体細胞当たり１個の胎児有核赤血球から1
0〜20細胞当たり１個に富化したと結論した。Ｇnshir
t−Ahlertらは、微小ビーズ用いた磁気活性化細胞選択
（MACS）はFACSより迅速であることを示唆したが、TFR
に対する抗体は、有核胎児細胞の富化に対して効率的で
ないことを発見した。なぜなら、多くの赤芽球は反応性
がなく、多くの網状赤血球（胎児性および母体性）はTF
R−陽性であったからである。Bianchiら（1993）は、次
いでTFR、GPA、およびトロンボスポンジレセプター（TS
PR）に対する抗体を組み合わせて、GPAが胎児有核細胞
の回収に最も重要なマーカーであることを発見した。TF
RおよびGPAを用いた多くの分析は、胎児／母体細胞の最
終的な比率を決定しなかった；それらは、サザンブロッ
トに対するDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅ある
いは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）
のいずれかを使用して雄性細胞または胎児異数性を検出
した。
−Betke染色を用いて、母体の循環中の胎児赤血球（送
達の直後ではあるが）を最初に示した（Zipurskyら）。
Schrderは、1975年にこのことを再検討し、第２トリ
メスターの妊娠の５〜10％において50,000個の母体細胞
あたり１個より多い胎児細胞が存在することを示唆した
（Schrderら）。ParksおよびHerzenbergは、蛍光活性
化細胞選択（FACS）を用いて、すべてのRh D- ABO適合
母親の血液中に1:4,000から1:80,000の範囲の頻度（200
μｌの胎児血液に対応）でRh D+赤血球を発見した（Par
ksら）。母体の血液中の胎児赤芽球（および網状赤血
球）は、Bianchiら（1990）により、トランスフェリン
レセプター（TFR）に対するモノクローナル抗体を用い
た蛍光活性化細胞選択（FACS）を使用して妊娠16週程度
の初期に同定された。Priceらは、グリコホリンＡ（GP
A）に対する抗体の添加ならびに細胞のサイズ（前方光
散乱）および粒度（側方散乱）に従う選別によりその富
化を増強した。彼らは、ＸおよびＹ染色体に対するマー
カーを用いたインサイチュハイブリダイゼーショを使用
し、107個の母体細胞当たり１個の胎児有核赤血球から1
0〜20細胞当たり１個に富化したと結論した。Ｇnshir
t−Ahlertらは、微小ビーズ用いた磁気活性化細胞選択
（MACS）はFACSより迅速であることを示唆したが、TFR
に対する抗体は、有核胎児細胞の富化に対して効率的で
ないことを発見した。なぜなら、多くの赤芽球は反応性
がなく、多くの網状赤血球（胎児性および母体性）はTF
R−陽性であったからである。Bianchiら（1993）は、次
いでTFR、GPA、およびトロンボスポンジレセプター（TS
PR）に対する抗体を組み合わせて、GPAが胎児有核細胞
の回収に最も重要なマーカーであることを発見した。TF
RおよびGPAを用いた多くの分析は、胎児／母体細胞の最
終的な比率を決定しなかった；それらは、サザンブロッ
トに対するDNAのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅ある
いは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）
のいずれかを使用して雄性細胞または胎児異数性を検出
した。
妊娠母親血液中の胎児白血球の存在は、リンパ球の0.
2〜１％におけるXY核型の検出に基づいて、Walknowska
らによって1969年ころには示唆されていた。分裂間期の
細胞におけるＹ染色体またはＹ蛍光について試験した同
様の研究において、胎児リンパ球は約0.1〜１％含まれ
た（Schrderら、1972;De Grouchyら;Schroderら、1975;
Grossetら;Siebersら；およびKirsch−Voldersら）。He
rzenbergらはFACSを用いて、父系のHLA型について選別
し、1,000個の選別された細胞当たり３個の出現率でＹ
−陽性細胞を見出した；同グループによるより大規模な
研究により、1/800〜1/60,000の出現率を見出した（Ive
rsonら）。１つのグループは、α−フェトプロテインに
ついて母体の単核細胞（MNC）を染色し、1/1,000の陽性
細胞を発見した（Kulozikら）。Nakagomeらは、未分離
の母体細胞由来のY DNAのPCR増幅を用いて、陽性のもの
がないことを見出した、このことは、胎児細胞は、1/2
5.000母体細胞より少ないことを示した。しかし、Kaoら
は、このアプローチにより男性胎児を正しく同定でき、
そして２個の胎児細胞で充分であることを示した。Loら
は、２組のＹ−特異的プライマーを用いたネステッドPC
Rを用いて、300,000雌性細胞中の１個の雄性細胞を発見
できた。より初期の雄性妊娠（male pregnacies）由来
の残りリンパ球の可能性を避けるために、Wessmanら
は、抗My7を用いて、母体単核細胞のサイトスピンスラ
イド（cytospin slide）の顆粒球を同定し、インサイチ
ュハイブリダイゼーションを用いて約0.1がY+であるこ
とを発見した。従って、母体血液中の胎児白血球の検出
感度は広く変化し、恐らくアッセイ方法、富化方法、お
よび妊娠年齢に依存する；特異性もまた変化し、ほとん
どの報告には、偽陰性および偽陽性が含まれている。
2〜１％におけるXY核型の検出に基づいて、Walknowska
らによって1969年ころには示唆されていた。分裂間期の
細胞におけるＹ染色体またはＹ蛍光について試験した同
様の研究において、胎児リンパ球は約0.1〜１％含まれ
た（Schrderら、1972;De Grouchyら;Schroderら、1975;
Grossetら;Siebersら；およびKirsch−Voldersら）。He
rzenbergらはFACSを用いて、父系のHLA型について選別
し、1,000個の選別された細胞当たり３個の出現率でＹ
−陽性細胞を見出した；同グループによるより大規模な
研究により、1/800〜1/60,000の出現率を見出した（Ive
rsonら）。１つのグループは、α−フェトプロテインに
ついて母体の単核細胞（MNC）を染色し、1/1,000の陽性
細胞を発見した（Kulozikら）。Nakagomeらは、未分離
の母体細胞由来のY DNAのPCR増幅を用いて、陽性のもの
がないことを見出した、このことは、胎児細胞は、1/2
5.000母体細胞より少ないことを示した。しかし、Kaoら
は、このアプローチにより男性胎児を正しく同定でき、
そして２個の胎児細胞で充分であることを示した。Loら
は、２組のＹ−特異的プライマーを用いたネステッドPC
Rを用いて、300,000雌性細胞中の１個の雄性細胞を発見
できた。より初期の雄性妊娠（male pregnacies）由来
の残りリンパ球の可能性を避けるために、Wessmanら
は、抗My7を用いて、母体単核細胞のサイトスピンスラ
イド（cytospin slide）の顆粒球を同定し、インサイチ
ュハイブリダイゼーションを用いて約0.1がY+であるこ
とを発見した。従って、母体血液中の胎児白血球の検出
感度は広く変化し、恐らくアッセイ方法、富化方法、お
よび妊娠年齢に依存する；特異性もまた変化し、ほとん
どの報告には、偽陰性および偽陽性が含まれている。
探された別の細胞タイプはトロホブラストで、これは
モノクローナル抗体H315で識別され得る（Covoneら、19
84、およびMuellerら）。しかし、H315−陽性細胞は、
非妊娠女性で見出され（Poolら）、そして非トロホブラ
スト細胞がこの抗原を吸収し得る（Covoneら、1988）こ
とが一致した見解である。確かに、Bruchらは、トロホ
ブラストに対する３つのモノクローナル抗体で選別され
る陽性細胞は白血球の形態を有することを報告した。Ca
cheuxらは、モノクローナル抗体および磁気ビーズを用
いて母体のリンパ球を涸渇させ、次いでトロホブラスト
抗体およびFACSを用いた;1,000個の回収された細胞の４
％がFISHでＹ−陽性であった。
モノクローナル抗体H315で識別され得る（Covoneら、19
84、およびMuellerら）。しかし、H315−陽性細胞は、
非妊娠女性で見出され（Poolら）、そして非トロホブラ
スト細胞がこの抗原を吸収し得る（Covoneら、1988）こ
とが一致した見解である。確かに、Bruchらは、トロホ
ブラストに対する３つのモノクローナル抗体で選別され
る陽性細胞は白血球の形態を有することを報告した。Ca
cheuxらは、モノクローナル抗体および磁気ビーズを用
いて母体のリンパ球を涸渇させ、次いでトロホブラスト
抗体およびFACSを用いた;1,000個の回収された細胞の４
％がFISHでＹ−陽性であった。
細胞分離の主要な方法は、モノクローナル抗体を用い
る標識、およびFACS、ダイナール（Dynal）磁気ビーズ
または微小磁気ビーズ（MACS）を用いる分離を含んでい
る。分離後、得られた半精製細胞を、次いで特定の遺伝
子または染色体のPCR増幅またはインサイチュハイブリ
ダイゼーション用いて、または分裂中期の標準核型判定
により試験する。
る標識、およびFACS、ダイナール（Dynal）磁気ビーズ
または微小磁気ビーズ（MACS）を用いる分離を含んでい
る。分離後、得られた半精製細胞を、次いで特定の遺伝
子または染色体のPCR増幅またはインサイチュハイブリ
ダイゼーション用いて、または分裂中期の標準核型判定
により試験する。
発明の要旨 本発明の方法は、妊娠した女性の血液および胎児細胞
増幅を用いて、胎児のスペースを侵襲することなく出生
前の診断を容易にする。本方法は、羊水穿刺または絨毛
膜の絨芽サンプリングより、侵襲性が少なく簡便であ
る。なぜなら、母親から血液を抜き取り、胎児細胞サン
プルを得ることのみを含むからである。既知の分子変異
を伴う特定の疾病を探す場合、サンプルからの細胞は、
胎児物質を富化したDNAの供給源である。疾患が、赤血
球の関与する疾患である場合、本方法は分析のための胎
児赤血球を提供する。疾患に白血球が関与する場合、異
なるサイトカインを用いて、胎児白血球を選択的に産生
し得る。特定の診断上の危険（例えば母体の高齢）を伴
わない異常な染色体パターンを探す場合、培養方法は、
胎児起源の分割中の細胞を提供する。
増幅を用いて、胎児のスペースを侵襲することなく出生
前の診断を容易にする。本方法は、羊水穿刺または絨毛
膜の絨芽サンプリングより、侵襲性が少なく簡便であ
る。なぜなら、母親から血液を抜き取り、胎児細胞サン
プルを得ることのみを含むからである。既知の分子変異
を伴う特定の疾病を探す場合、サンプルからの細胞は、
胎児物質を富化したDNAの供給源である。疾患が、赤血
球の関与する疾患である場合、本方法は分析のための胎
児赤血球を提供する。疾患に白血球が関与する場合、異
なるサイトカインを用いて、胎児白血球を選択的に産生
し得る。特定の診断上の危険（例えば母体の高齢）を伴
わない異常な染色体パターンを探す場合、培養方法は、
胎児起源の分割中の細胞を提供する。
目的は胎児の性決定と単純であるが、本発明の最適に
効果的に使用する際には幾つかの問題が生じる。現在の
技術において公知であるように、分子マーカーが利用可
能である場合、DNA分析は最も容易に行われる。胎児幹
細胞は母体の循環中へ不十分ながら漏れ得る。胎児は循
環中の幹細胞数の減少を生じる内因性の造血性疾患を有
し得る。母親は、鎌状赤血球症のような血液学的疾患を
有し得、それによって母親自身の幹細胞が拡大し、そし
て胎児幹細胞の選択的増殖優位が阻害される。
効果的に使用する際には幾つかの問題が生じる。現在の
技術において公知であるように、分子マーカーが利用可
能である場合、DNA分析は最も容易に行われる。胎児幹
細胞は母体の循環中へ不十分ながら漏れ得る。胎児は循
環中の幹細胞数の減少を生じる内因性の造血性疾患を有
し得る。母親は、鎌状赤血球症のような血液学的疾患を
有し得、それによって母親自身の幹細胞が拡大し、そし
て胎児幹細胞の選択的増殖優位が阻害される。
図面の簡単な説明 図１は、赤血球形成のスキームである；始原細胞は、
インビトロアッセイにより定義され、一方、前駆体およ
び子孫は、骨髄および血液において形態学的に同定可能
である。
インビトロアッセイにより定義され、一方、前駆体およ
び子孫は、骨髄および血液において形態学的に同定可能
である。
図2Aは、CFU−Ｅ由来のコロニーを示す。
図2Bは、１つのBFU−Ｅ由来のバースト（burst）を示
す。
す。
図3A、図3B、および図3Cは、胎児、新生乳児、および
成人由来の血液BFU−Ｅ由来コロニーのエリスロポエチ
ン用量反応曲線を示す。データを、最大成育のパーセン
テージとして規格化した。白ヌキの符号の各々の曲線
は、異なるドナーを表し、そして各々の点は、３連の培
養（triplicate cultures）の平均値である。黒ヌリの
符号の曲線は、全ての曲線の平均値を表す。図3A、胎
児。図3B、新生児。図3C、成人。（Weinbergら、199
2）。
成人由来の血液BFU−Ｅ由来コロニーのエリスロポエチ
ン用量反応曲線を示す。データを、最大成育のパーセン
テージとして規格化した。白ヌキの符号の各々の曲線
は、異なるドナーを表し、そして各々の点は、３連の培
養（triplicate cultures）の平均値である。黒ヌリの
符号の曲線は、全ての曲線の平均値を表す。図3A、胎
児。図3B、新生児。図3C、成人。（Weinbergら、199
2）。
図4A、図4B、図4C、および図4Dは、胎児、新生乳児、
および成人由来の血液赤血球様始原細胞の成育ポテンシ
ャルを示す。図4Aおよび図4Cは、13日目のデータであ
る；図4Bおよび図4Dは、成育がピークである日のデータ
である。図4Aおよび図4Bにおいて、データは、コロニー
／（プレートした100,000細胞）として表されている。
図4Cおよび図4Dにおいて、データは、BFU−E/mL血液と
して表されている。白ヌキの符号は、個々の実験を表
す；黒ヌリの符号は、平均±1SDを表す。（Weinberg
ら、1992）。
および成人由来の血液赤血球様始原細胞の成育ポテンシ
ャルを示す。図4Aおよび図4Cは、13日目のデータであ
る；図4Bおよび図4Dは、成育がピークである日のデータ
である。図4Aおよび図4Bにおいて、データは、コロニー
／（プレートした100,000細胞）として表されている。
図4Cおよび図4Dにおいて、データは、BFU−E/mL血液と
して表されている。白ヌキの符号は、個々の実験を表
す；黒ヌリの符号は、平均±1SDを表す。（Weinberg
ら、1992）。
図5A、図5B、図5C、および図5Dは、液体培養における
赤血球様分化の形態学を示す。全てのスライドを、ベン
ジジンWright−Giemsaで染色した（本来の拡大率の1,00
0倍）。図5A、培養前０日目の単核細胞。図5B、７日後
の培養物の第一相から回収した細胞。図5C、ヘモグロビ
ン化赤芽球は、Epを有する第二相において７日後に現れ
る。図5D、Epを有する第二相において14日後に回収した
成熟赤芽球および赤血球。Weinbergら、1993より。
赤血球様分化の形態学を示す。全てのスライドを、ベン
ジジンWright−Giemsaで染色した（本来の拡大率の1,00
0倍）。図5A、培養前０日目の単核細胞。図5B、７日後
の培養物の第一相から回収した細胞。図5C、ヘモグロビ
ン化赤芽球は、Epを有する第二相において７日後に現れ
る。図5D、Epを有する第二相において14日後に回収した
成熟赤芽球および赤血球。Weinbergら、1993より。
図６は、液体培養物中に100,00個の血液単核細胞をプ
レートした後に回収された細胞数を示す。最初の７日間
は、サイトカインなしで、一方、第２の14日間は、Ep、
SCF、IL−３、およびIL−６を有した。左は新生児であ
る。右は成人である。斜線が引かれている棒は、ヘモグ
ロビン化（多染性および性染性）赤芽球である。２重斜
線が引かれている棒は、赤血球である。白ヌキ棒は、他
の有核細胞（白血球および非ヘモグロビン化赤芽球）で
ある。成人実験における２倍未満と比較して、新生児培
養における細胞数の80倍以上の増幅に留意のこと。
レートした後に回収された細胞数を示す。最初の７日間
は、サイトカインなしで、一方、第２の14日間は、Ep、
SCF、IL−３、およびIL−６を有した。左は新生児であ
る。右は成人である。斜線が引かれている棒は、ヘモグ
ロビン化（多染性および性染性）赤芽球である。２重斜
線が引かれている棒は、赤血球である。白ヌキ棒は、他
の有核細胞（白血球および非ヘモグロビン化赤芽球）で
ある。成人実験における２倍未満と比較して、新生児培
養における細胞数の80倍以上の増幅に留意のこと。
好適な実施態様の詳細な説明 本発明は、胎児の造血性始原細胞細胞を富化させる新
規のアプローチに関する。いくつかの研究は、胎児が始
原細胞が、成人の始原細胞と異なることを示している
（Weinbergら、1992;Forestierら）。母体の血液から得
られた単核細胞の培養物は、培養の条件の操作により、
成人子孫に対する胎児子孫の比率を改善するために用い
られる。本発明者の以前の研究は、胎児、新生児、およ
び成人赤血球様始原細胞細胞間に有益な差異が存在し得
ることを示している。母体の血液における胎児幹細胞の
存在は、本発明の重要な局面である。
規のアプローチに関する。いくつかの研究は、胎児が始
原細胞が、成人の始原細胞と異なることを示している
（Weinbergら、1992;Forestierら）。母体の血液から得
られた単核細胞の培養物は、培養の条件の操作により、
成人子孫に対する胎児子孫の比率を改善するために用い
られる。本発明者の以前の研究は、胎児、新生児、およ
び成人赤血球様始原細胞細胞間に有益な差異が存在し得
ることを示している。母体の血液における胎児幹細胞の
存在は、本発明の重要な局面である。
Genetics Institute,Inc.（87 Cambridge Park Driv
e,Cambridge MA 02140）によりIL−６が提供された。Am
gen,Inc.（Amgen Center,1840 Dehavilland Drive,Thou
sand Oaks CA 91320−1789）によりSCFが提供された。I
mmunex（51 University Street,Seattle WA 98101）に
よりIL−３が提供された。
e,Cambridge MA 02140）によりIL−６が提供された。Am
gen,Inc.（Amgen Center,1840 Dehavilland Drive,Thou
sand Oaks CA 91320−1789）によりSCFが提供された。I
mmunex（51 University Street,Seattle WA 98101）に
よりIL−３が提供された。
多能性幹細胞は、循環において存在する場合、成人に
おいてこの胎児成分を見出すことが非常に難しい、低い
比率で存在する。用語「始原細胞」は、特定の系統に決
定づけられており、そして形態学的に識別可能でない
が、それらの子孫により同定される細胞に用いる（図
１）。最も初期の赤血球様細胞は、BFU−Ｅ（バースト
形成単位−赤血球様）と呼ばれる（Axelrad）。血液ま
たは骨髄単核細胞を、Ficoll−hypaqueでの遠心分離後
の低密度画分を回収することにより単離し、そしてエリ
スロポエチン（Ep）＋ウシ胎児血清を含むメチルセルロ
ースまたは血漿血塊、またはバースト促進活性（BPA）
（例えば、インターロイキン−３（IL−３）または顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF））を含
む、規定無血清培地中で培養する。現在用いられる方法
は、Weinbergら（1983）に詳細に記載されている。約14
日後、ヘモグロビン化赤芽球のいくつかのサブコロニー
を有する大きなコロニーを、容易に同定し得る。より成
熟した始原細胞CFU−Ｅ（コロニー形成単位−赤血球
様）はEpを必要とし、そして８〜132の赤芽球を含有す
る小さなコロニーに７〜８日間内に発達する（図２）。
「前駆体」は始原細胞よりも成熟しており、そして培養
することなく形態学期に同定可能である。赤血球系列に
おいて、これらは、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性
赤芽球、および正染性赤芽球を包含する。次いでこれら
は、脱核する。従って、もはやDNAを含有しない。しか
し、網状赤血球はグロビンRNAを含有し、異常血色素症
の診断に用いられ得る。
おいてこの胎児成分を見出すことが非常に難しい、低い
比率で存在する。用語「始原細胞」は、特定の系統に決
定づけられており、そして形態学的に識別可能でない
が、それらの子孫により同定される細胞に用いる（図
１）。最も初期の赤血球様細胞は、BFU−Ｅ（バースト
形成単位−赤血球様）と呼ばれる（Axelrad）。血液ま
たは骨髄単核細胞を、Ficoll−hypaqueでの遠心分離後
の低密度画分を回収することにより単離し、そしてエリ
スロポエチン（Ep）＋ウシ胎児血清を含むメチルセルロ
ースまたは血漿血塊、またはバースト促進活性（BPA）
（例えば、インターロイキン−３（IL−３）または顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSF））を含
む、規定無血清培地中で培養する。現在用いられる方法
は、Weinbergら（1983）に詳細に記載されている。約14
日後、ヘモグロビン化赤芽球のいくつかのサブコロニー
を有する大きなコロニーを、容易に同定し得る。より成
熟した始原細胞CFU−Ｅ（コロニー形成単位−赤血球
様）はEpを必要とし、そして８〜132の赤芽球を含有す
る小さなコロニーに７〜８日間内に発達する（図２）。
「前駆体」は始原細胞よりも成熟しており、そして培養
することなく形態学期に同定可能である。赤血球系列に
おいて、これらは、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性
赤芽球、および正染性赤芽球を包含する。次いでこれら
は、脱核する。従って、もはやDNAを含有しない。しか
し、網状赤血球はグロビンRNAを含有し、異常血色素症
の診断に用いられ得る。
表１は、赤血球形成の種々の段階に対するいくつかの
特定マーカー（通常、表面抗原;Sieffら;Lokenら;Okumu
raら;Papayannopoulouら）を概説する。
特定マーカー（通常、表面抗原;Sieffら;Lokenら;Okumu
raら;Papayannopoulouら）を概説する。
マーカーは、表面膜抗原である。Kit＝ｃ−kit。TFR
−トランスフェリンレセプター。TSPR＝トロンボスポン
ジンレセプター。GPA＝グリコホリンＡ。Hb＝ヘモグロ
ビン。
−トランスフェリンレセプター。TSPR＝トロンボスポン
ジンレセプター。GPA＝グリコホリンＡ。Hb＝ヘモグロ
ビン。
これらの抗原は、通常胎児細胞を成人細胞と区別しな
い。そしてそれ故これらの抗原に対するモノクローナル
抗体の母体の単核細胞との使用は、特定のカテゴリーの
みを規定するために役立つ；この区画への胎児の寄与が
相対的に過剰である場合は（例えば、赤芽球）、胎児細
胞についての部分的な選択が達成され得る。CD34は、最
も初期の幹細胞および始原細胞を同定するが、CD34は始
原細胞が成熟するときに失われる。CD33は幹細胞段階の
後に出現するが、CFU−Ｅのレベルにより消失する。ｃ
−kitチロシンキナーゼレセプターは初期に存在し、そ
してまたBFU−Ｅの後に減少する。BFU−Ｅ後期に出現す
るマーカー（CFU−Ｅおよび赤芽球を特徴付け、そして
網状赤血球上に持続する）は、トランスフェリンレセプ
ターおよびトロンボスポンジンレセプターを包含する。
分化した赤血球形成のマーカーは、血液型抗原、グリコ
ホリンＡ、グロビンRNAおよびグロビンタンパク質であ
る。
い。そしてそれ故これらの抗原に対するモノクローナル
抗体の母体の単核細胞との使用は、特定のカテゴリーの
みを規定するために役立つ；この区画への胎児の寄与が
相対的に過剰である場合は（例えば、赤芽球）、胎児細
胞についての部分的な選択が達成され得る。CD34は、最
も初期の幹細胞および始原細胞を同定するが、CD34は始
原細胞が成熟するときに失われる。CD33は幹細胞段階の
後に出現するが、CFU−Ｅのレベルにより消失する。ｃ
−kitチロシンキナーゼレセプターは初期に存在し、そ
してまたBFU−Ｅの後に減少する。BFU−Ｅ後期に出現す
るマーカー（CFU−Ｅおよび赤芽球を特徴付け、そして
網状赤血球上に持続する）は、トランスフェリンレセプ
ターおよびトロンボスポンジンレセプターを包含する。
分化した赤血球形成のマーカーは、血液型抗原、グリコ
ホリンＡ、グロビンRNAおよびグロビンタンパク質であ
る。
本発明は赤血球様始原細胞のレベルにおける差異（We
inbergら、1992;Frestierら）および刺激感受性を利用
する。１つのパラメータはEp用量応答曲線により規定さ
れた（図３）。Epは胎児BFU−Ｅまたは成人BFU−Ｅの増
殖に必要である。胎児BFU−Ｅは成人BFU−ＥよりもEpに
感受性であり、Ep1/2max（最大増殖の50％のために要求
されるEp）は0.4U/mLに比較して0.3U/mLである（表
２）。
inbergら、1992;Frestierら）および刺激感受性を利用
する。１つのパラメータはEp用量応答曲線により規定さ
れた（図３）。Epは胎児BFU−Ｅまたは成人BFU−Ｅの増
殖に必要である。胎児BFU−Ｅは成人BFU−ＥよりもEpに
感受性であり、Ep1/2max（最大増殖の50％のために要求
されるEp）は0.4U/mLに比較して0.3U/mLである（表
２）。
より無視できない観察は、胎児コロニーの20〜40％が
0.01U/mLのEp濃度で出現したが、成人コロニーの＜５％
がこの低いEp濃度で増殖したことである。大部分の胎児
培養物はEp＜2U/mLで最大増殖に達したが、大部分の成
人培養物は≧2U/mLを必要とした。従って、培養とため
に使用されるEp濃度の選択は、胎児赤血球様子孫の選択
的な濃縮のために重要であり得る。
0.01U/mLのEp濃度で出現したが、成人コロニーの＜５％
がこの低いEp濃度で増殖したことである。大部分の胎児
培養物はEp＜2U/mLで最大増殖に達したが、大部分の成
人培養物は≧2U/mLを必要とした。従って、培養とため
に使用されるEp濃度の選択は、胎児赤血球様子孫の選択
的な濃縮のために重要であり得る。
胎児BFU−Ｅ由来のコロニーは、成人BFU−Ｅ由来のコ
ロニーよりも大きく、サブコロニーがより多くそして総
細胞がより多い。標準的な培養条件下では（Ep2U/mL、1
4日）、平均で10倍多いBFU−Ｅが胎児血液中に存在し、
これはプレートされた105単核細胞あたりのBFU−Ｅ、ま
たは特に血液1mLあたりのBFU−Ｅ（なぜならMNC/mL血液
は胎児血液において成人血液よりも高いので）のいずれ
かで表される（表２および図）。胎児コロニーはまたよ
り大きいので、全体の相対的な増幅は実質的に10倍以上
となる。成人培養物の大部分は最大増殖に達するために
14日より多く要したが、胎児培養物の大部分はそれまで
にプラトーに達していた。従って、母体の循環由来のMN
Cの培養は、成人子孫に比較して胎児子孫についての相
対的な濃縮に導き得るようである。胎児始原細胞と成人
始原細胞との間の別の明白な差異は、胎児コロニー中の
赤芽球が優勢に胎児ヘモグロビンを合成することであ
る；これは異常ヘモグロビン症の出生前診断および胎児
子孫の同定のための潜在的な適用を有する。
ロニーよりも大きく、サブコロニーがより多くそして総
細胞がより多い。標準的な培養条件下では（Ep2U/mL、1
4日）、平均で10倍多いBFU−Ｅが胎児血液中に存在し、
これはプレートされた105単核細胞あたりのBFU−Ｅ、ま
たは特に血液1mLあたりのBFU−Ｅ（なぜならMNC/mL血液
は胎児血液において成人血液よりも高いので）のいずれ
かで表される（表２および図）。胎児コロニーはまたよ
り大きいので、全体の相対的な増幅は実質的に10倍以上
となる。成人培養物の大部分は最大増殖に達するために
14日より多く要したが、胎児培養物の大部分はそれまで
にプラトーに達していた。従って、母体の循環由来のMN
Cの培養は、成人子孫に比較して胎児子孫についての相
対的な濃縮に導き得るようである。胎児始原細胞と成人
始原細胞との間の別の明白な差異は、胎児コロニー中の
赤芽球が優勢に胎児ヘモグロビンを合成することであ
る；これは異常ヘモグロビン症の出生前診断および胎児
子孫の同定のための潜在的な適用を有する。
本発明はまた、個体発生の種々の段階でのBFU−Ｅ間
のさらなる差異に関する。この目的のために、最初にFi
bachらによって記載された液体培養系を改変した（Wein
bergら、1993）。単核細胞を第１期において約７日間幹
細胞因子（SCF）（赤血球形成の初期およびその後の段
階で作用する近年記載されたサイトカイン（McNiece
ら））の存在下で培養する。次いで、生じる核形成した
細胞を第２期においてEp単独またはEpとSCFを用いてさ
らに７〜14日間（合計14〜21日間）再培養する。図５
は、成人血液培養物由来の、第０日目の単核細胞、第７
日目の細胞、および第14日目および第21日目の最終産物
を示す。開始時および第７日目の細胞は主にリンパ球お
よび単球であるが、終了結果は核形成赤血球様細胞およ
び無核赤血球様細胞を含む。新生児由来の培養物を、成
人血液由来の培養物と比較する。新生児細胞の最大最終
増幅は８〜45倍であり、この50〜100％は赤血球様であ
った（表３）。
のさらなる差異に関する。この目的のために、最初にFi
bachらによって記載された液体培養系を改変した（Wein
bergら、1993）。単核細胞を第１期において約７日間幹
細胞因子（SCF）（赤血球形成の初期およびその後の段
階で作用する近年記載されたサイトカイン（McNiece
ら））の存在下で培養する。次いで、生じる核形成した
細胞を第２期においてEp単独またはEpとSCFを用いてさ
らに７〜14日間（合計14〜21日間）再培養する。図５
は、成人血液培養物由来の、第０日目の単核細胞、第７
日目の細胞、および第14日目および第21日目の最終産物
を示す。開始時および第７日目の細胞は主にリンパ球お
よび単球であるが、終了結果は核形成赤血球様細胞およ
び無核赤血球様細胞を含む。新生児由来の培養物を、成
人血液由来の培養物と比較する。新生児細胞の最大最終
増幅は８〜45倍であり、この50〜100％は赤血球様であ
った（表３）。
成人培養物において、増幅は３〜５倍であり、60〜90
％の赤血球様細胞を含有していた。メチルセルロースア
ッセイにおける新生児についての５〜10倍と胎児につい
ての10倍を比較すると、この系において成人細胞より新
生児の約10倍の相対的な有利性が存在する（表３）。
％の赤血球様細胞を含有していた。メチルセルロースア
ッセイにおける新生児についての５〜10倍と胎児につい
ての10倍を比較すると、この系において成人細胞より新
生児の約10倍の相対的な有利性が存在する（表３）。
複数の供給源の帯および成人細胞をSCFを含むおよび
含まないまたはSCF、IL3およびIL6の組み合わせを含む
液体培地中で培養した（表４の結果を参照のこと）。20
〜40mLの血液を、正常成人または正常小児の分娩後の臍
帯から採集し、そしてNaヘパリンを含有する減圧式注射
管（vacutainer tube）中に入れた。これを室温に置い
てそして１時間以内に処理した。血液をα培地（Gibc
o）で1:1に希釈し、そしてFicoll−hypaque（Pharmaci
a）中に20mlのFicollあたり20〜25mlの希釈した血液の
割合で重層した。単核細胞（MNC）をFicoll−hypaque上
の18℃、30分間、450×ｇでの遠心分離により単離し
た。血漿および培地を除去し、そしてMNCを含有する境
界面層を20mlの２％のウシ胎児血清（FCS）を含むα培
地中に採集した。細胞を同じ条件で２回洗浄し、そして
２％FCSを含むα培地中に再懸濁した。次いでMNCを５×
106/mlで７日間、10％FCS単独、または＋SCF 100ng/m
l、または＋SCF（AMGEN）100ng/ml＋IL−３（Immunex）
100ng/ml＋IL−６（Genestics Institute）100u/mlを含
むα培地（ペニシリン0.1u/mlおよびストレプトマイシ
ン0.1μg/1を含む）中で培養した。下内空気インキュベ
ーター（room air incubator）は、高い湿度および５％
CO2を有した。次いで、非接着細胞をフラスコの緩やか
な振盪の後、細胞を含有する培地の吸引および上記のよ
うな遠心分離により回収した。細胞を３×105/mlで、30
％FCS、１％ウシ血清アルブミン（BSA）、10-4Mβ−メ
ルカプトエアノール、ペニシリン0.1u/mlおよびストレ
プトマイシン0.1μg/mlならびにSCF 100ng/ml、IL−3 1
00ng/ml、およびIL−6 100u/mlを含むα培地中で再プレ
ートした。インキュベーション物は、５％CO2および室
内空気または５％酸素のいずれかを有する加湿したイン
キュベーター中にあった。21日後、細胞を、フラスコの
振盪および細胞を含有する培地の吸引により回収した。
細胞をCoulter ZBI中で計数し、そして細胞遠心分離ス
ライド（cytocentrifuge slide）を作製してベンジジン
−Wright's−Giemsaで染色した。
含まないまたはSCF、IL3およびIL6の組み合わせを含む
液体培地中で培養した（表４の結果を参照のこと）。20
〜40mLの血液を、正常成人または正常小児の分娩後の臍
帯から採集し、そしてNaヘパリンを含有する減圧式注射
管（vacutainer tube）中に入れた。これを室温に置い
てそして１時間以内に処理した。血液をα培地（Gibc
o）で1:1に希釈し、そしてFicoll−hypaque（Pharmaci
a）中に20mlのFicollあたり20〜25mlの希釈した血液の
割合で重層した。単核細胞（MNC）をFicoll−hypaque上
の18℃、30分間、450×ｇでの遠心分離により単離し
た。血漿および培地を除去し、そしてMNCを含有する境
界面層を20mlの２％のウシ胎児血清（FCS）を含むα培
地中に採集した。細胞を同じ条件で２回洗浄し、そして
２％FCSを含むα培地中に再懸濁した。次いでMNCを５×
106/mlで７日間、10％FCS単独、または＋SCF 100ng/m
l、または＋SCF（AMGEN）100ng/ml＋IL−３（Immunex）
100ng/ml＋IL−６（Genestics Institute）100u/mlを含
むα培地（ペニシリン0.1u/mlおよびストレプトマイシ
ン0.1μg/1を含む）中で培養した。下内空気インキュベ
ーター（room air incubator）は、高い湿度および５％
CO2を有した。次いで、非接着細胞をフラスコの緩やか
な振盪の後、細胞を含有する培地の吸引および上記のよ
うな遠心分離により回収した。細胞を３×105/mlで、30
％FCS、１％ウシ血清アルブミン（BSA）、10-4Mβ−メ
ルカプトエアノール、ペニシリン0.1u/mlおよびストレ
プトマイシン0.1μg/mlならびにSCF 100ng/ml、IL−3 1
00ng/ml、およびIL−6 100u/mlを含むα培地中で再プレ
ートした。インキュベーション物は、５％CO2および室
内空気または５％酸素のいずれかを有する加湿したイン
キュベーター中にあった。21日後、細胞を、フラスコの
振盪および細胞を含有する培地の吸引により回収した。
細胞をCoulter ZBI中で計数し、そして細胞遠心分離ス
ライド（cytocentrifuge slide）を作製してベンジジン
−Wright's−Giemsaで染色した。
液体培養アッセイについては、さらに最適化を行って
いる。サイトカイン（Ep、SCF、IL−３、IL−６）の組
合せを用いると、新生児細胞は80倍より多く増幅し、そ
して成人細胞の２倍未満であり、これは赤血球様系列の
細胞の50％を超える（図６）。従って、成人細胞に対す
る新生児細胞の相対的な富化は、40倍を超える；より良
好な増殖が胎児始原細胞から得られるべきである。条件
は表４について記載したとおりであった。
いる。サイトカイン（Ep、SCF、IL−３、IL−６）の組
合せを用いると、新生児細胞は80倍より多く増幅し、そ
して成人細胞の２倍未満であり、これは赤血球様系列の
細胞の50％を超える（図６）。従って、成人細胞に対す
る新生児細胞の相対的な富化は、40倍を超える；より良
好な増殖が胎児始原細胞から得られるべきである。条件
は表４について記載したとおりであった。
メチルセルロースまたは液体培養の可能な使用を表５
に示す。培養および他の条件は表４について記載したと
おりであった。
に示す。培養および他の条件は表４について記載したと
おりであった。
50mLの母体液体は、通常には少なくとも５×107単核
細胞を生じる。50,000母体細胞当たり１個の胎児細胞
（赤血球またはリンパ球の検査から得た上記で概略した
概算値に基づく）と仮定すると、1,000胎児単核細胞が
存在する。105成人MNC当たり20成人BFU−Ｅおよび105胎
児MNC当たり200胎児BFU−Ｅと仮定すると、10,000成人
バーストおよび２胎児バーストが存在する。バーストが
平均して1,000細胞を有する場合（しかし胎児バースト
はそれより多くを有する）、メチルセルロース培養物に
おいて、107成人細胞当たり2,000胎児細胞より多くが存
在する。すなわち、1/5,000より多い。しかし、液体培
養系がより有用である。ここに記載の数は最少数であ
る。５×107成人MNCは最大４倍増幅され、２×108成人
細胞を生じ、一方、その中の1,000胎児MNCは、少なくと
も100倍増幅され、105胎児細胞を生じる。成人に対する
胎児の割合は現在少なくとも1/2,000である。この場合
の出発物質1/50,000胎児／成人細胞であった。同じ容積
の母体血液から、このように液体系はより多い数の胎児
細胞を提供する。
細胞を生じる。50,000母体細胞当たり１個の胎児細胞
（赤血球またはリンパ球の検査から得た上記で概略した
概算値に基づく）と仮定すると、1,000胎児単核細胞が
存在する。105成人MNC当たり20成人BFU−Ｅおよび105胎
児MNC当たり200胎児BFU−Ｅと仮定すると、10,000成人
バーストおよび２胎児バーストが存在する。バーストが
平均して1,000細胞を有する場合（しかし胎児バースト
はそれより多くを有する）、メチルセルロース培養物に
おいて、107成人細胞当たり2,000胎児細胞より多くが存
在する。すなわち、1/5,000より多い。しかし、液体培
養系がより有用である。ここに記載の数は最少数であ
る。５×107成人MNCは最大４倍増幅され、２×108成人
細胞を生じ、一方、その中の1,000胎児MNCは、少なくと
も100倍増幅され、105胎児細胞を生じる。成人に対する
胎児の割合は現在少なくとも1/2,000である。この場合
の出発物質1/50,000胎児／成人細胞であった。同じ容積
の母体血液から、このように液体系はより多い数の胎児
細胞を提供する。
いくつかのタイプの操作が、表１に示したマーカーに
基づいて、細胞を培養する前または後で用いられ得る。
幹細胞および／または始原細胞は、CD34、CD33、17F1
1、DR、またはCD71を用いて富化され得る。分離方法
は、パンニング、磁気ビーズ、MACS、またはFACSであり
得る。富化は、０日目、または培養初期の間のある時点
でなされ得る。次のEp依存期の間に、細胞は回収され
得、そしてCD71、CD36、血液群抗原、またはGPAを用い
て赤血球様系統について富化され得る。これらの分離手
段のいずれもが胎児細胞／母体細胞の比を必ずしも変え
るわけではないが、赤血球様細胞の総収率を増加させ
る。胎児起源の細胞についての選択的富化は、適切な父
性血液群抗原、または胎児赤血球特徴に対する抗体を用
いて行われ得る（例えば、胎児ヘモグロビンまたはｉ抗
原、胎児赤血球に特異的な膜抗原）。
基づいて、細胞を培養する前または後で用いられ得る。
幹細胞および／または始原細胞は、CD34、CD33、17F1
1、DR、またはCD71を用いて富化され得る。分離方法
は、パンニング、磁気ビーズ、MACS、またはFACSであり
得る。富化は、０日目、または培養初期の間のある時点
でなされ得る。次のEp依存期の間に、細胞は回収され
得、そしてCD71、CD36、血液群抗原、またはGPAを用い
て赤血球様系統について富化され得る。これらの分離手
段のいずれもが胎児細胞／母体細胞の比を必ずしも変え
るわけではないが、赤血球様細胞の総収率を増加させ
る。胎児起源の細胞についての選択的富化は、適切な父
性血液群抗原、または胎児赤血球特徴に対する抗体を用
いて行われ得る（例えば、胎児ヘモグロビンまたはｉ抗
原、胎児赤血球に特異的な膜抗原）。
培養物はまた、サイトカイン操作を用いて破裂され得
る。これは、成人成育よりむしろ胎児成育に好都合であ
る。このような条件は、低濃度のEp（Weinbergら、199
2）、IL−６の添加（Gardnerら）、またはEp、SCF、IL
−３、およびIL−６を包含する因子の組合せを包含す
る。
る。これは、成人成育よりむしろ胎児成育に好都合であ
る。このような条件は、低濃度のEp（Weinbergら、199
2）、IL−６の添加（Gardnerら）、またはEp、SCF、IL
−３、およびIL−６を包含する因子の組合せを包含す
る。
母体循環中の胎児細胞を用いる出生前診断は、以下の
ようにして行われる： 血液（50ml）を妊娠８〜20週の妊娠中の女性から採取
する。MNCをFicoll−hypaque上の遠心分離により単離
し、SCF 100ng/ml、IL−3 100ng/ml、およびIL−6 100u
/mlを用いて、10％FCSを添加したα培地において７日間
５×106/mlで培養する。次いで非接着細胞を回収し、そ
してSCF 100ng/ml、IL−3 100ng/ml、およびIL−6 100u
/mlに加えて、30％FCS、１％BSA、10-4Mβ−メルカプト
エタノール、ならびにペニシリンおよびストレプトマイ
シンを添加したα培地において３×105/mlで再プレート
する。全ての培養を５％CO2、および室内大気または５
％O2のいずれかの加湿インキュベーター中で行う。21日
後に、細胞を回収する。
ようにして行われる： 血液（50ml）を妊娠８〜20週の妊娠中の女性から採取
する。MNCをFicoll−hypaque上の遠心分離により単離
し、SCF 100ng/ml、IL−3 100ng/ml、およびIL−6 100u
/mlを用いて、10％FCSを添加したα培地において７日間
５×106/mlで培養する。次いで非接着細胞を回収し、そ
してSCF 100ng/ml、IL−3 100ng/ml、およびIL−6 100u
/mlに加えて、30％FCS、１％BSA、10-4Mβ−メルカプト
エタノール、ならびにペニシリンおよびストレプトマイ
シンを添加したα培地において３×105/mlで再プレート
する。全ての培養を５％CO2、および室内大気または５
％O2のいずれかの加湿インキュベーター中で行う。21日
後に、細胞を回収する。
（１）細胞遠心分離スライドを２×105細胞で作製し、
そして（胎児ヘモグロビンの）γグロビンに対する蛍光
抗体で染色し、次いで目的のDNA配列についてのプロー
ブを用いてFISH分析を行う。これらは、Ｘ、Ｙ、および
第13染色体、第18染色体、および第21染色体を包含す
る、これらはまた、ファミリーにおいて欠失または増幅
が生じている変異体であると知られる特定の遺伝子を包
含する。
そして（胎児ヘモグロビンの）γグロビンに対する蛍光
抗体で染色し、次いで目的のDNA配列についてのプロー
ブを用いてFISH分析を行う。これらは、Ｘ、Ｙ、および
第13染色体、第18染色体、および第21染色体を包含す
る、これらはまた、ファミリーにおいて欠失または増幅
が生じている変異体であると知られる特定の遺伝子を包
含する。
（２）細胞を遠心分離し、そして標準的な方法を用いて
DNAを抽出する。胎児が危険にさらされる変異遺伝子
（単数または複数）に特異的なプローブを用いるPCR増
幅を行うためである。
DNAを抽出する。胎児が危険にさらされる変異遺伝子
（単数または複数）に特異的なプローブを用いるPCR増
幅を行うためである。
（３）細胞をビンブラスチンで１時間処理して中期を阻
止し、そして標準的な方法を細胞遺伝解析のためのスラ
イドを調製するために用いる。
止し、そして標準的な方法を細胞遺伝解析のためのスラ
イドを調製するために用いる。
（４）RNAを細胞から抽出し、グロビンまたは他の赤血
球特異的タンパク質（例えば、スペクトリンまたは他の
膜タンパク質、または赤血球酵素）についてのRNAの逆
転写PCRのために用いる。
球特異的タンパク質（例えば、スペクトリンまたは他の
膜タンパク質、または赤血球酵素）についてのRNAの逆
転写PCRのために用いる。
分析（１）だけが、胎児赤血球様細胞についての独特
のマーカー、抗γグロビンを利用する。しかし、これは
非常に強力なマーカーである。なぜなら、全く正常であ
る胎児細胞の同定は、致命的な疾患を排除するに十分で
あり得るからである。胎児細胞が特に同定されない場合
は、変異の検出ができないことが常に疑われる。
のマーカー、抗γグロビンを利用する。しかし、これは
非常に強力なマーカーである。なぜなら、全く正常であ
る胎児細胞の同定は、致命的な疾患を排除するに十分で
あり得るからである。胎児細胞が特に同定されない場合
は、変異の検出ができないことが常に疑われる。
分析（４）は、大量の赤血球様細胞の増殖を利用す
る。
る。
分析（２）は、胎児細胞の相対的増幅を利用する;PCR
は、培養前の約1/50,000に比較して約1/2,000の胎児／
成人比でより確実である。
は、培養前の約1/50,000に比較して約1/2,000の胎児／
成人比でより確実である。
分析（３）はなお、非常に労力を要する方法を必要と
するが、自動化中期細胞検出器（automated metaphase
finder）によりこの分析を実行可能にする；多くの正常
細胞の中でわずかな異常細胞が認められること（すなわ
ち、1/2,000）を必要とする。
するが、自動化中期細胞検出器（automated metaphase
finder）によりこの分析を実行可能にする；多くの正常
細胞の中でわずかな異常細胞が認められること（すなわ
ち、1/2,000）を必要とする。
上記手順を増強するために、他の方法が利用可能であ
り、始原細胞または幹細胞について富化して、第一期に
おける培養に置く細胞数を減少させる。これは、ネガテ
ィブ選択（単球およびＴ細胞の除去）ならびにポジティ
ブ選択（例えば、CD34を要いる）により行われ得る。
り、始原細胞または幹細胞について富化して、第一期に
おける培養に置く細胞数を減少させる。これは、ネガテ
ィブ選択（単球およびＴ細胞の除去）ならびにポジティ
ブ選択（例えば、CD34を要いる）により行われ得る。
約７日目、初期赤血球様細胞の特徴を有する細胞が富
化され得る（例えば、CD71）。
化され得る（例えば、CD71）。
約14日目または約21日目、例えば、CD71、CD36、およ
び／またはGPAを用いて赤血球様細胞は富化され得る。
び／またはGPAを用いて赤血球様細胞は富化され得る。
これらの培養から生じる細胞は純粋な胎生ではない
が、出発材料よりは比較的胎生であり、そして主にPC
R、FISH、または核型分析のような非分離材料に対して
用いられてきたのと同じ分析技術に供し得る。さらに、
グロビンmRNAを回収し得、そして異常ヘモグロビン症の
診断のためのRT−PCRに使用され得る。胎児由来の赤血
球様細胞は胎児ヘモグロビンに対する蛍光抗体による染
色により同定され得る。
が、出発材料よりは比較的胎生であり、そして主にPC
R、FISH、または核型分析のような非分離材料に対して
用いられてきたのと同じ分析技術に供し得る。さらに、
グロビンmRNAを回収し得、そして異常ヘモグロビン症の
診断のためのRT−PCRに使用され得る。胎児由来の赤血
球様細胞は胎児ヘモグロビンに対する蛍光抗体による染
色により同定され得る。
以下の参考文献は、上記の本文に挙げる理由により、
本明細書において関連する部分で参考とし援用される。
本明細書において関連する部分で参考とし援用される。
本明細書に記載の内容を研究すれば、選択的増幅およ
び分析を達成するために、以下の請求項の範囲の手順お
よび刺激因子の等価な改変が同業者に公知であることは
いうまでもない。
び分析を達成するために、以下の請求項の範囲の手順お
よび刺激因子の等価な改変が同業者に公知であることは
いうまでもない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/68,33/80 C12N 5/06,5/08 C12Q 1/68
Claims (8)
- 【請求項１】以下の工程を包含する、胎児細胞に富む細
胞サンプルを母体の血液から得るためのプロセス： 母体の血液サンプルから細胞を得る工程； 少なくとも１つのサイトカインを母体の細胞よりも胎児
細胞においてより大きい刺激効果を有する量で含む培地
中で、該細胞をインキュベートすることにより、胎児細
胞増殖を選択的に刺激して胎児細胞に富む細胞サンプル
を生成する工程。 - 【請求項２】以下の工程を包含する、出生前遺伝子解析
のためのプロセス： 母体の血液サンプルから細胞を得る工程； 少なくとも１つのサイトカインを母体の細胞よりも胎児
細胞においてより大きい刺激効果を有する量で含む培地
中で、該細胞をインキュベートすることにより、胎児細
胞増殖を選択的に刺激して胎児細胞に富む細胞サンプル
を生成する工程；および 遺伝子の内容または異常について胎児細胞を分析する工
程。 - 【請求項３】前記サイトカインが、エリスロポエチン、
幹細胞因子、インターロイキン−３、およびインターロ
イキン−６のうち少なくとも１つである、請求項１また
は２に記載のプロセス。 - 【請求項４】前記少なくとも１つのサイトカインが、幹
細胞因子、インターロイキン−３、およびインターロイ
キン−６の組み合わせである、請求項１または２に記載
のプロセス。 - 【請求項５】前記サイトカインの量が、約100ng/mlまた
はそれより低い、請求項４に記載のプロセス。 - 【請求項６】胎児細胞濃度が、胎児細胞抗原に特異的な
抗体を用いることによりモニターされる、請求項１また
は２に記載のプロセス。 - 【請求項７】前記胎児細胞抗原が、胎児ヘモグロビンま
たはｉ抗原である、請求項６に記載のプロセス。 - 【請求項８】前記胎児細胞が胎児造血始原細胞である、
請求項１または２に記載のプロセス。
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|---|---|---|---|
| US08/218,290 US5580724A (en) | 1994-03-25 | 1994-03-25 | Differential expansion of fetal stem cells in maternal circulation for use in prenatal genetic analysis |
| US08/218,290 | 1994-03-25 | ||
| US218,290 | 1994-03-25 | ||
| PCT/US1995/003659 WO1995026507A1 (en) | 1994-03-25 | 1995-03-24 | Differential expansion of fetal stem cells in the maternal circulation for use in prenatal genetic analysis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09509328A JPH09509328A (ja) | 1997-09-22 |
| JP2996513B2 true JP2996513B2 (ja) | 2000-01-11 |
Family
ID=22814517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7525227A Expired - Fee Related JP2996513B2 (ja) | 1994-03-25 | 1995-03-24 | 出生前遺伝子解析における使用のための母体循環における胎児幹細胞の相違する拡大 |
Country Status (9)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0752104B1 (ja) |
| JP (1) | JP2996513B2 (ja) |
| AU (1) | AU684935B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69501326T2 (ja) |
| ES (1) | ES2111401T3 (ja) |
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| US7666615B2 (en) * | 2001-01-29 | 2010-02-23 | Hemogenix, Inc. | High-throughput assay of hematopoietic stem and progenitor cell proliferation |
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| US8940535B2 (en) * | 2003-11-04 | 2015-01-27 | University Of Maryland, Baltimore | Stem cell culture medium and method of using said medium and the cells |
| WO2005123779A2 (en) * | 2004-06-14 | 2005-12-29 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Antibodies binding to cd34+/cd36+ fetal but not to adult cells |
| KR20180105266A (ko) | 2005-12-29 | 2018-09-27 | 안트로제네시스 코포레이션 | 태반 줄기 세포 집단 |
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| JPH07500499A (ja) * | 1991-10-23 | 1995-01-19 | セルプロ インコーポレイテッド | 母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法 |
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| WO1994016715A1 (en) * | 1993-01-27 | 1994-08-04 | Hemosol, Inc. | Selective cell proliferation |
-
1994
- 1994-03-25 US US08/218,290 patent/US5580724A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-03-24 DE DE69501326T patent/DE69501326T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-24 WO PCT/US1995/003659 patent/WO1995026507A1/en active IP Right Grant
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- 1995-03-24 JP JP7525227A patent/JP2996513B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-24 CA CA002186366A patent/CA2186366C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-03-24 MX MXPA96004278A patent/MXPA96004278A/es not_active IP Right Cessation
- 1995-03-24 AU AU22298/95A patent/AU684935B2/en not_active Ceased
- 1995-03-24 ES ES95915408T patent/ES2111401T3/es not_active Expired - Lifetime
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| ES2111401T3 (es) | 1998-03-01 |
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