JPH07500499A

JPH07500499A - 母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法

Info

Publication number: JPH07500499A
Application number: JP5507911A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムス　シェリル; ベレンソン　ロナルド　ジェイ; ハイムフェルド　シェリー
Original assignee: セルプロ　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-10-23
Filing date: 1992-10-22
Publication date: 1995-01-19
Also published as: CA2122138A1; EP0610359A1; WO1993008269A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、また母親の血液由来の胎児のＷｔＸエリスロイド（ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ）細胞を濃厚化する方法をも意図する。本発明の一局面によれば、このような方法は（ａ）母親の血液サンプルと、胎児の有核エリスロイド細胞と特異的に結合し得る固定化リガンドとを、該リガンドと該細胞とを特異的に結合させるのに十分な条件下で、かつ十分な時間インキュベートする工程と、（ｂ）未結合血液物質を除去する工程と、（Ｃ）該胎児細胞が選択的に濃厚化されるように、エリスロボエチンの存在下で該結合細胞をインキュベートする工程とを含む。本発明のこの局面の一態様によれば、該固定化リガンドは固定化抗体である。

本発明のもう一つの局面においては、母親血液由来の胎児の有核エリスロイド細胞をａ厚化する方法が提供され、該方法は母親の血液サンプルと、胎児の有核エリスロイド細胞に特異的に結合し得るリガンドと化学的に結合する第一の構成要素とを、該リガンドと該細胞との特異的な結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、該細胞を固定化された第二の構成要素に吸着させる工程と（ここで該第二の構成要素は約１０’Ｕ−’よりも大きな親和定数にて該第−の構成要素と結合できる）、未結合の血液物質を除去する工程と、エリスロポエチンの存在下で、該胎児細胞が選択的に濃厚化されるように、該結合細胞をインキュベートする工程とを含む。適当な第一１ス成要素−第二構成要素結合対はビオチン−アビジン、ビオチンーストレブタビジン（ｓｔｒｅｐｌａｖｉｄｉｎ）、ビオシチン−アビジン、ビオシチンーストレブタビジン、メトトレキセート−ジヒドロフオレートリダクターゼ、５−フルオロウラシルーチミジレート（ｔｈｉｍｙｄｙｌａｔｅ）シンセターゼ、およびリボフラビンーリボフラビノ結合プロティンを包含する。本発明のこの局面の一怒様においては、リガンドに化学的に結合する該第−の構成要素はビオチンと結合した抗体であり、かつ該第二の構成要素は固定化されたアビジンである。

本発明のもう一つの局面においては、本発明の方法は母親の血液サンプルと、胎児の有探エリスロイド細胞と特異的に結合し得る第一のリガンドとを、該第−のリガンドと該細胞とを特異的に結合させるのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、該第−のリガンドに特異的に結合し得る第二のリガンドに化学的に結合する第一の構成要素と該サンプルとを、訪第二のリガンドと該第−のリガンドとを結合するのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、該細胞を固定化された第二の構成要素に吸着させる工程と（但し、該第二の構成要素は約１０″＆Ｉ−１よりも大きな親和定数にて該第−の構成要素と結合できる）、未結合の血液物質を除去する工程と、エリスロボエチンの存在下で、該胎児細胞が選択的に濃厚化されるように、該結合細胞をインキュベートする工程とを含む。−態様においては、該第−のリガンドは、胎児の有核エリスロイド細胞と特異的に結合する抗体である。好ましい態様においては、該第二のリガンドと化学的に結合する該第−の構成要素は、ビオチンと結合した抗体である。このようなｔ１１様において、該固定化された該第二の構成要素は固定化アビジンである。

エリスロボエチンの存在下で結合細胞をインキュベートする工程に代わるものとして、本発明の他の局面では（ａ’）該結合細胞をアンモニア、塩素イオンおよびカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤と共に、該結合細胞内へのアンモニウムイオ　。

ンの蓄積を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートし、（ｂ）蓄積されたアンモニウムイオンを含有する酸結合細胞を、アンモニアおよび二酸化炭素の存在下で、母親の血液細胞の選択的な溶血が起こるようにインキュベートする工程を含む。更に、本発明はエリスロボエチンの濃厚化と、該細胞をアンモニア、塩素イオンおよびカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤と共に該結合細胞内へのアンモニウムイオンの蓄積を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートし、次いて蓄積されたアンモニウムイオンを含有する該結合細胞を、アンモニアおよび二酸化炭素の存在下で、母親の血液細胞の選択的な溶血が起こるようにインキュベートする上記方法との組み合わせを利用して実施することもできる。これら２つの濃厚化法を連続的に、また何れかの順序で実施できる。

本発明のもう一つの局面においては、母親の血液由来の胎児の有核エリスロイド細胞を濃厚化する方法が提供され、該方法はエリスロポエチンの存在下で母親の血液サンプルを、該胎児細胞が濃厚化されるようにインキュベートする工程と。

該濃厚化した細胞と、１６児の有核エリスロイド細胞と特異的に結合できる固定化リガンドとを、酸リガンドと該細胞との特異的な結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、未結合の血液物質を除去する工程とを含むものである。また、本発明のもう一つの態様においては、駿濃厚化された細胞と特異的に結合し得るリガンドに化学的に結合する第一の構成要素と共に、該リガンドと該細胞とのｗ！４的な結合を可能とするのに十分な条件並びに時間、該細胞をインキュベートし、ａ細胞を固定化された第二の構成要素に吸着させることにより該濃厚化された細胞を固定化できる。ここで、該第二の構成要素は約１０１Ｍ−１よりも大きな親和定数にて該第−の構成要素と結合できる。更に別の本発明の態様においては、該濃厚化された細胞をこれにｆｆ！異的に結合し得る第一のリガンドと共に、該第−のリガンドとｋｉ細胞との特異的な結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートし、該サンプルと、該第−のリガンドに特異的に結合可能な第二のリガンドに化学的に結合する第一の構成要素とを、該第二のリガンドと該第−のリガンドとが結合するのに十分な条件並びに時間インキュベートシ、かつｂｍ胞を固定化されｌ；第二の構成要素に吸着させることにより該濃厚化された細胞を固定化できる。こ二で、該第二の構成要素は約１０’Ｍ”よりも大きな親和定数にて該第−の構成要素と結合できる。適当な第一および第二リガンドの組、み合わせは以下で詳細に議論する。

更に、上記の局面において、該方法は（未結合の血液物質の除去工程に引き続き）、更に以下の工程を含むことができる。即ち、該細胞をアンモニア、塩素イオンおよびカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤と共に該結合細胞内・＼のアンモニウムイオンの蓄積を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程、および蓄積されたアンモニウムイオンを含有する該結合細胞を、アンモニアおよび二酸化炭素の存在下で、母親の血液細胞の選択的な溶血が起こるようにインキュベートする工程を含むことができる。

本発明の他の局面においては、エリスロポエチンの存在下で母親の血液サンプルを先ずインキュベートする代わりに、該細胞を、アンモニア、塩素イオンおよびカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤と共に該結合細胞内へのアンモニウムイオンの蓄積を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートし、次いで蓄積されたアンモニウムイオンを含有するｗｉ結合細胞を、アンモニアおよび二酸化炭素の存在下で、母親の血液細胞の選択的な溶血が起こるようにインキュベートする。

本発明においては、種々のリガンドを使用することができ、例えば抗体、エリスロポエチンおよびトランスフェリンを包含する。このリガンドは種々の固体担体、例えば中空繊維、ビーズ、磁性ビーズ、プレート、皿、フラスコ、メツシュ、スクリーン、硬質ａｌ維、膜およびディツプスティックなどの上に固定化することができる。

他の本発明の局面においては、母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法が！ｌＫ供され、該方法は（ａ）母親の血液サンプルと、胎児始原細胞に特異的に結合できる固定化リガンドとを、該細胞と該リガンドとを特異的に結合するのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）未結合血液物質を除去して該胎児始原細胞を濃厚化する工程とを含む、−態様においては、該インキュベート工程前に、例えばフィコール密度勾配に対して該母親の血液を流動させることにより、誼＠親の血液から赤血球を除去する。他の！！様においては、該未結合血液物質の除去工程に引き続き、該結合細胞をエリスロボエチンの存在下でインキュベートする。

本発明の他の局面においては、母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法が提供され、該方法は（ａ）母親の血液サンプルと、胎児始り細胞に特異的に結合できるｔＩＡｗｔリガンドとを、該リガンドと該細胞とを＃Ｉ興的に結合させるのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）　１ｉｆｔリガンド結合細胞の存在を検出する工程と、（Ｃ）　＊リガンド結合細胞を未結合細胞から分離して、ＭＩＩ飴児胎児始原細胞厚化する工程を含む。−態様においては、該インキュベートエ！！前に、例えばフィコール密度勾配に対して該母親の血液を流動させることにより、該母親の置設から赤血球を除去する。もう一つの態様においては、皺未結合血液物質を除去する工程に引き続き、該結合細胞をエリスロポエチンの存在下でインキュベートする。これらの態様において、該標識はフルオレセイン−イソチオシアネート、フィコエリトリン、ローダミンインチオシアネートまたは他の蛍光性の高い分子からなる群から選ばれる０本発明の他の！！様においては、該リガンドは１２，８等の抗体である。

本発明のその他の局面によれば、母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法が提供され、該方法は、（ａ）母親の血液サンプルと、胎児始原細胞以外の細胞と特異的に結合できる固定化したリガンドとを、該他の細胞と該リガンドとの特異的結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）未結合の該胎児始原細胞を除去して、腋胎児始原細胞を濃厚化する工程とを含む。−態様においては、該インキュベート工程前に、例えばフィコール密度勾配に対して該母親の血液を流動させることにより、駿母親の血液から赤血球細胞を除去する。好ましい態様において、該リガンドは抗体である。

本発明のもう一つの局面によれば、胎児の有核エリスロイド細胞の染色体の型を決定する方法が提供され、該方法は（ａ）　ｔｋ胎児の有核エリスロイド細胞を、エリスロポエチン含有媒体中で、該細胞内に中期を誘発させるのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）診細胞のＤＮＡを固定する工程と、（Ｃ）該固定された［ｌＮＡを染色体が観察できるように染色する工程と、（ｄ）該染色されたＤＮＡを検査して、該染色体の型を決定する工程とを含む。

これらのおよび他の本発明の局面は以下の詳細な説明を参月することにより明らかになるであろう。

発明の詳細な説明上記の如く、本発明の一局面によれば、母親の血液由来の胎児の有核エリスロイド細胞を１１厚化する方法を提供する。母親の血液は、他の多くの型の細胞のうちの成人および胎児の有核エリスロイド細胞を含む。本発明の升力によって、胎児の′ｆ復エリスロイド細胞は母親血液中に１０１中の１程度の低い値から、１０”中の約１、好ましくは１０”中の約１なる濃度にまで濃厚化できる。本発明の内容において、有核エリスロイド細胞は後を含み、一般的には赤芽球および他のエリスロイドプリカーサ細胞を含有する。ＱＭＩの血液は、当分野で周知の技術によって妊婦から得ることができる。好ましくは、前腕前部静脈（腕静脈）などの容易に得ることのできる源から、公知の静脈穿刺技術により末梢血を取り出す。一旦母親の血液を取り出した後、公知の方法を利用して凍結するが、あるいは４℃にて最大４〜７日間保存できる。種々の凝集防止剤を必要に応じて該血液に添加する。

凝９１防止剤としては特にＡＣＤ　、　ＣＰＯＡ、　ＥＤＴ＾およびヘパリンを包含する。

次いで、この母親の血液を本発明に従って選別法にかけ、更なる精製操作を必要とすることなく、例えば蛍光−活性化細胞選別装ｆ　（ＦＡＣＳ）を使用して、該選別法で選択的に濃厚化した胎児細胞を得ることができる。一般に、本発明の方法は、（１）該母親の血液を、固定化したリガンドまたは後に固定化されるリガンドの何れかと共に、該リガンドが該胎児有核エリスロイド細胞と結合し、結果として固定化されるようにインキュベートＴる工程と、（２）未結合の血液物質を除去する工程と、（３）該結合細胞を、２日児有核エリスロイド細胞につき選択的に濃厚化する工程とを含む。上記の如く、これらの基本的な工程は別の順序で、例えば（１）母親の血液を胎児の有核エリスロイド細胞につき濃厚化する工程、（２）該濃厚化さｎた細胞を、固定化したりガントまたは後に固定化されるリガンドの何れかと共にインキュベートする工程、および（３）未結合のｍａ物質を除去する工程といった順序て実施することも可能である。本発明は、「免疫選択装置および方法（■ｍｍｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ）Ｊと題する米国特許出１７］第０７１５１３．５４３号、および［屈曲性の容器を使用した、粒子を分離するための’ＩｔＨ並びに方法（Ａｎ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　Ｕｓｉｎｇ　ａ　Ｐｌｉａｂｌｅ　Ｖｅｓｓｅ戟jＪと題する米国特許出願１０７１５９９．７９６号に記載されているような装置を使用して実施することもできる。これら文献を本発明の参考文献とする。

更に、「細胞分離のための改良された装置および方法（ｌｔｔｐｒｏｖｅｄ＾ｐｐａｒａｔｕｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｃｅ１ｌ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ）Ｊと題する継続中の米国特許出願第　号（代理人文書Ｎｏ、　２０００７２．４０７）（二の特許の全内容を本発明の参考とする）に記載されているような免疫親和性カラムを使用することも可能である。手短かに言えば、この特許出願の一局面においては、「細胞分離機」が提供され、ｉｔ裟装はサンプル流体からターゲット細胞を分離するためのカラムアセンブリーを含み、該カラムアセンブリーはカラムと、サンプル流体供給バッグと、流体捕集バッグとを含み、そこで該カラムは該サンプル流体供給バッグからの該サンプル流体を受け取り、かつ該ターゲット細胞を該サンプル流体から分離し、しかも該ターゲット細胞を保持するようになっており、また蚊流体捕集バッグは該カラムから遊離した後の該ターゲット細胞を受け取るようになっている。該細胞分離装置は、該カラムの内容物を攪拌するための攪拌手段（該カラム中に保持された該サンプル細胞をｍ離するのに役立ち、該カラム内容物を種々の強度で攪拌するための駆動シグナルに応答して、該サンプル細胞の遊離する速度を変更する）と、該カラムから該流体捕集バッグへと流動する流体の光学密度を表すカラムシグナルを与えるためのカラムセンサー手段と、該カラムから流出してくる該流体を選択的に該流体ｔ＋［バッグに流入させるためのカラムバルブ制御シグナルに応答するカラムバルブ手段と、該細胞分離機の動作を制御するｔ；めのデータプロセッサ一手段とを含み、該データプロセッサ一手段は該駆動シグナルを与えるための駿カラムシグナルおよび該カラムバルブ＃御シグナルに応答して、該ターゲット細胞が不十分な濃度で収集されるのを防止する。本発明の一態様では、セルプロ社（Ｃｅｌ　［Ｐｒｏ、ワシントン、ボーチル）から入手できるセブラテルク（ＣＥＰＲＡ置Ｃ：商ｇＡ）細胞分離装置を使用する。

本発明の一局面においては、該母親の血液を、胎児の有核エリスロイド細胞と特異的に結合できる固定化したリガンドと共に、該細胞と該リガンドとを結合するのに十分な条件並びに晴間インキュベートする。一般的に、４〜３７°Ｃにて、１５〜３０分間インキュベートすることが好ましい。このインキュベーシジン工程を、該細胞をカラムに通過させつつ実施する場合、流量を十分に低くして、診細胞を結合させるべきである。好ましくは、該細胞を少なくとも１５分掛けて、該カラムの床を通過させるべきである。

上記の如く、該リガンドは、胎児有核エリスロイド細胞を特異的に結合できるようなものとして選択すべきである。本発明の内容において、該リガンドは、これが胎児有接エリスロイド細胞に結合できる場合にはｒ特異的に結合するＪものであるべきであり、かつ該母親の血液細胞の約１０％以上に結合してはならない。

結合胎児有核エリスロイド細胞対地の細胞の相対的な割合は、αフェータルプロテイン（Ａｌｐｈａ　Ｆｅｊａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ））等の特異的マーカーを使用した分析により容易に決定できる。例えば、以下にＩＲｋする方法の任意の時点において、胎児細胞対母親の細胞の相対的な割合は、グルコースオキシダーゼまたはフルオレセイン結合抗−＾ＦＰ抗体の伍れかを使用して測定できる。これに関しては、Ａ、クロッイック（Ｋｕｌｏｚｉｋ）＆１．Ｈ，バウロビッッキー（ＰａｗｌｏｗｉＬｚｋｉ）、　ｒ母親の循環系における胎児細胞・直接的ＡＦＰ−免疫蛍免疫蛍光石検出（Ｆｅｔａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｔｅｒｎａｌ　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ：　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｄｔｒｅｃｔ　ＡＦＰ−１＋ｎｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）」、　Ｈｕｔ＋ａｎ　Ｇｅｎ■煤A、　１９８２゜６２、　ｐ、　２２１を参照のこと。この測定は、好ましくは２以上のｍ製工程を経た後に実施する・胎児の有核エリスロイド細胞と詩興的に結合するリガンドは当分野において公知であり、その例はエリスロポエチン（カリフ中ルニア州すウザンドオークスのアムゲン社（Ａｍｇｅｎ））、トランスフェリン（Ｍｏ州、セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈａｍｉｃａｌ　Ｇｏ、））および選択された抗体類を包含する。有核エリスロイド細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体が特に好ましい。有接エリスロイド細胞に対するモノクローナル抗体、例えば抗− トランスフェリンレセプタ抗体等は、公知の供給業者（カリフ中ルニア州マウンテンビューのベクトンディフキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社（Ｂｅｃｔｏｒ＋　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｏｏｃｙｔｏｒ＋ｅｔｒｙ５ｙｓｔｅａ＋ｓ））から得ることがてきる。また、モノクローナル抗−エリスロイド抗体、例えばＥＰ−１は当分野で周知の技術を利用して製造できる。例えば、ヨコチ（Ｙｏｋｏｃｈｉ）等、「エリスロイド関連始原細胞レベルから成熟した赤芽球までの、エリメロイド細胞上での制限された発現をもつ抗原決定基を検出するモノクローナル抗体（Ｌｌｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＡｎｌｉｂＯｄｉｅＳ　ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＡｎｔｉｇｅ＋＋ｉｃ　Ｄａｔｅｒ＋ｎ１ｎａｎｔＳ　ｌ’１ｉ狽 ■@Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｎ　Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　Ｃｅ１ｌｓ：　Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　Ｃｏｍｍ１ｔｔｅｄ　Ｐ窒盾■■獅奄撃盾■ Ｌｅｖｅｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｍａｔｕｒｅ　Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔ）Ｊ、　Ｂｌｏｏｄ、　１９８４．６３．　ｐ、　＋３７６およびヘf ィーゾラ（）１ｃｄｄｙ　Ｚｏｌａ）４Ｍ、モノクローナル抗体、技術の手引き（ｌｊｏｎｏｃｌｏｎａｌ＾ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　ＩＪａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、　Ｆ１ａ州、ボカラトンのＣＲＣプレス（＋９８７）を参照のこと。簡単に言えば、細胞は胎児肝臓のクローン化エリスロイド培養物から免疫化により生成され、始原細胞について濃厚化できる。かくして、抗原および初期スクリーニングに利用される細胞のａ団は未成熟の赤芽球、中間の成熟度の赤芽球、および多分ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅ　Ｗの始原細胞を含む可能性がある。これらの細胞を静脈内免疫化に使用して、次いで牌細胞を取り出し、標準的な方法を利用して該牌細胞とミエローマセルライン、例えばＮＳＩ　とを融合することができる。生成する融合細胞、即ちハイブリドーマを、次いで公知の方法を使用して、上記の細胞についてスクリーニングすることができる（上記のヨコチの文献を参照のこと）。

該リガンドとしては、必ずしも完全に特異的に結合する抗体を使用する必要はない。より具体的には、該抗体の結合領域が、胎児の有接エリスロイド細胞と特異的に結合することのみが必要とされる。従って、抗体フラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｔフラグメント等を本発明で使用できる。また、該特異的に結合する抗体の跋結合領域を新規なタンパクに組み込み、これをリガンドとして使用することも可能である。ライヒマン（ＲｅｉｃｈＩＩｌａｎｎ）等ｒ治療のためのヒト抗体の再構成（Ｒｅｓｈａｐｉｆｌｇ　Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉ、ｅＳ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８８．３３２D１１Ｐ、　３２３−３２７．フェアフ中イエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）等「ヒト抗体の再構成：アンチリゾチーム活性の組み込み（Ｒ＠ｓｈａｐｉｎｇ　ＨｕＩＩａｎ　Ａ耐１ｂｏｄｉｓｓ：　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎ　Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ａ■ ｔｉｖｉｌすＪ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８９，２３９．　ｐｐ、　１５３４ −１５３６：およびロノ（−ツ等「高いアフィニティーおよびその抗原に対する特異性をもつ抗体の、タンパク工学による生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ａｎｄ　５ｐａｃｉｆｊｃｉ狽凵@ｆｏｒ　Ｈｓ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）Ｌ　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８７．３２８．　ｐｐ、　７３１−７３Sを参照のこと。

本発明においては、該リガンドを固定化して、結合した細胞を他の血液物質からの分離を可能ならしめる。多くの適当な担体が当分針で周知であり、その例とシテハ、特＋：中空綴＊　（Ｍａｓｓ州、デンバーのアミコン社（Ａｍｊｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製ノモノ）、ビーズ（Ｐａｉｎ（（（、ワーリントンのポリサイエンスズ社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）製）、磁性ビーズ（Ｃａｌｉｆ、州、マウンテンビューのロビンサイエンティフィック（Ｒｏｂｂｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、プレート、皿およびフラスコ（Ｎ、　Ｙ、州、フーニングのコーニングガラスワークス（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ））、メツシュ（Ｃａｌｉｆ州、マウンテンビューのベクトンデイブキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｊｎｓｏｎ））　、スクリーンおよび硬質織１１１（ニーデルマン（Ｅｄｅｌｍａｎ）等の米国特許第３．８４３．３２４号およびクロダ（Ｋｕｒｏｄａ）等の米国特許第４．４１６．７７７号を参照のこと）　、脛（Ｍａｓｓ州、ベブドフオードのミリポア社（Ｍ…１ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、））およびデイブプスティック等を包含する。上記以外の種々の出所の興なる担体も存在する。特に好ましいものは、ノくイオゲル（Ｂｏｉｇｅｌ）　Ｐ−６０（商標：　Ｃａ１ｉＬ州、リッチモンドの）（イオラド社（ＢＩＯＲＡＤ））等の担体である。バイオゲルＰ−６０は多孔性のポリアクリルアミドヒドロゲルビーズである。このビーズは、一般的に球状で平均サイズ約２５０μであり、約６０．０００ダルトンを越える分子を排除する平均孔径を有する。

様々な方法を利用して、該リガンドを担体上に固定できる。例えば、抗体等のリガンドを、当分針で周知の種々の方法によって該担体に直接結合できる。例えば、Ｊ、に、インマン（Ｉｎｍａｎ）、メソッズインエイザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｗ＋ｏｌ。

ｇｙ）、　Ｖｏｌ、　３４．アフィニティー技術、酵素精製（Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｅｃ＋ｚｙｍｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、パートＢ、Ｗ、Ｂ、ジャコピー（Ｊａｋｏｂｙ）ＡＭ、ウイルチｚ７り（ｌｌｉｌｃｈｅｋ）ｍ、アカデミツクプレス、Ｎ、Ｙ、、　ｐ、　３０　（１９７４）およびｙ、ウイルチェク（ｍｉｌｃｈｅｋ）　＆ｗ、ベイヤー（Ｂａｙｅｒ）、　ｒ生物分析用途におけるアビジン−ビオチン複合体（Ｔｈｅ　Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　８ｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、　Ａｎａｌｙ煤A　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８８．　１７＋、　ｐｐ、　１−３２を参照のこと。これら方法は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアノゲンブロミド、塩化トシル、ビオチン／アビジンおよびビオチン／ストリブタビジンの使用を含む、ｌ！リガンドを担体上に固定化した後、母親の血液を該固定化されたリガンドと共に、該リガンドと該細胞との結合を可能とするのに十分な条件並びに＃ｌＪＩインキユベーシーンすることができる０本発明の内容において、この結合を生ずるのに適した条件は約り℃〜約３７℃にて生理的バッファー中でのインキュベージ２ンを含む。特に好ましい温度は、約４°Ｃ〜室温の範囲内である。インキュベージ１ン時間は該リガンドの該細胞に対するアフィニティーおよび結合力に依存し、また容易に決定できる。一般的に、約１５分〜１時間のインキュページ目ンが好ましい。インキュベージジンに引き続いて、未結合血液物質を除去して、ここに記載した方法を利用して胎児細胞を濃厚化することができる。

本発明の他の局面においては、母親の血液サンプルを第一の構成要素と化学的に結合するりガントと共に適当な条件下でインキュベージ１ンし、次いで固体担体に固定化された第二の構成要素に吸着させる。該第−の構成要素は約１０”Ｍ− ’を越えるアフィニティーで該第二の構成要素と結合できるものであるべきである。

多くの適当な第−構成要素−第二構成要素結合対が当分針で周知である。これらは、特にビオチン−アビジン、ビオチンーストレブタビジン、ビオシチン−アビジン、ビオシチンーストレブタビジン、メトトレキセートージヒドロフ中レートリダクターゼ、５−フルオロウラシルーチミジレートシンセターゼ、リボフラビン−リボフラビン結合プロティン、抗体−タンパクＡ、および抗体−タンパクＧを包含する。好ましい態様において、該第−の構成要素はビオチンであり、かつ該第二の構成要素はアビジンである。

上記結合対の何れかが該第二の構成要素として機能し、その対となる構成要素が該第−の構成要素として機能する。更に、該第−構成要素−第二構成要素結合対の組み合わせを使用することもできる。例えば、ビオチンは該リガンドに結合し、該担体に吸着される。次いで、これらの細胞、リガンド、ビオチン−複合体およびビオチン、担体−複合体を、アビジンと共にインキュベーシーンする工程によって一緒に結合することができる。アビジンは多価であワて、該細胞を固定化スる、細胞、リガンド、ビオチン、アビジン、ビオチン、１１体−複合体の形成を可能とする。

この態様の一例においては、母親の血液サンプルを、ビオチンと結合した抗体と共に、結合を生ずるのに十分な条件並びに時間斗ンキュベートする。次に、このサンプルを固定化されたアビジンを含む担体と共にインキュベートするか、あるいは該担体上に通す。該ビオチンと結合した抗体に結合した細胞は該固定化アビジンに吸着し、かくして細胞を未結合血液物質から分離できる。次いで、未結合血液物質を除去し、以下に記載の方法を利用して胎児細胞を濃厚化することができる。

更に別の本発明の局面においては、２一段階法を使用して、該胎児の有核エリスロイド細胞を固定化する。簡単に言えば、箪−のリガンドを、上記の如き適当な条件下で、該母親の血液サンプルと共にインキュベートする。次いて、第一の構成要素と化学的に結合している第二のリガンドを添加する。この第二のリガンドは該第−のリガンドに結合し得る。次に、この細胞、第一リガント、第二リガンド、第−構成要素一複合体を、固定化された第二の構成要素に吸着させ、かくして細胞を未結合の血液物質から分離できる。該第−構成要素−第二構成要素結合対の代表例は既に上で述べた。該第−リガントの代表例はエリスロポエチン、トランスフェリンおよび選択された抗体を包含する。一旦該第一リガントが選択されると、ｔ！第二リガンドはこれが破第−リガントを特異的に認識し、かつこれと結合するように選択される。好ましいｔＩｉｔｌにおいては、該第二リガンドは抗体、例えば抗−エリスロボエチン（カナダ、バンク−バー８．０．のテリーフｔツクスラボラトリー（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））　、抗−トランスフェリン（ＣａｌＨ，州、テメクラのケミコンインターナショナル社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｌ、　Ｉｎｃ、））または抗−イムノグロブリン抗体である。抗−イムノグロブリン抗体は当分針で周知の方法を利用して！［ｆｉ！するか、あるいは特にＮｏ州、セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｇ＋ａ　Ｃｈｅｏ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、）およびＣａＨｆ、州、マウンテンピユーのベクトンディフキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｏ＋ｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　５ｙｓｔａａ＋ｓ）等の製造元から人手できる。

好ましい態様において、Ｌ！第一リガントは胎児の有核エリスロイド細胞を特異的に認識する抗体、例えば抗−トランスフェリンレセプタ抗体（Ｃａｌｉｆ、州、マウンテンビューのベクトンディッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ社）である。この抗体を母親の血液サンプルと共にインキュベートする。次いで、ビオチン処理した（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｊｅｄ）抗−イムノグロブリン抗体、例えばビオチン処理した山羊抗−マウスＩｇＧ（第一構成要素と化学的に結合する第二リガンド）を添加して、該サンプルと共にインキュベートする。このサンプルを、次に該固定化された第二構成要素（二の場合には固定化されたアビジン）を含有する物質の床と共にインキュベートするか、あるいはその上を通過させる。この細胞、抗体、抗−イムノグロブリン抗体およびビオチン−複合体は該固定化されたアビジンに吸着し、かくして後の未結合血液物質の除去が可能となる。

上記の如く、該細胞が一旦固定化されれば、未結合の血液物質が除去可能となる。−態様においては、該固定化細胞を生理的バフファーですすぎ、これにより該未結合血液物質を除去する０選択された担体の型に応じて１種々の方法が該固定化細胞の洗浄に利用できる。これら方法は、特に該担体の水洗またはフラッシング、溶液からの該担体の磁気的な吸引、その後の生理的バッファー中への再懸濁、および遠心分離と、その後の再懸濁等を包含する。種々の生理的バフファーも当分針で周知であって、その例はＰＢＳ％ＰＢＳ＋アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、正常食塩水および細胞培養培地を包含する。

一旦米結合の血液物質を除去すれば、結合細胞を選択的に胎児の有核エリスロイド細胞について濃厚化できる。上記のように、少なくとも２種の興なる方法を別々にまたは一緒に利用できる。これら２１１の方法を一緒に実施する場合、丹れかの方法を先ず実施できる。−態様においては、該結合細胞をエリスロポエチン（Ｃａｌｉｆ、州、サウザンドオークスのアムゲン社（Ａｍｇｓｎ））の存在下で選択された条件下で培養する。エマージン（Ｅｍｅｒｓｏｎ）等、「造血成長因子による赤血球形成の発生上の調節−、骨髄、末梢血および胎児肝臓由来のＢＦＵ−Ｈの密度に関する分析（Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ａｅｎｔａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｒｙ４ｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ　ｂｙ　Ｈｅｏ＋ａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｇｒｏｗ狽■@Ｆａｃｔｏｒｓ：＾ｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ＢＦＬＩ−Ｅ　Ｆｒｏｍ　Ｂｏｎａ　Ｍａｒｒｏｗ、　Ｐ＠ｒｉｐｈａｒａｌ　aｌｏｏｄ　ａｎｄＦａｔａｌ　Ｌｉｖｅｒ）Ｊ、　Ｂｌｏｏｄ、　１９８９．７４（１）、　ｐｐ、　４９−５５およびリンチ等「ヒト胎児血液中の造血性始原細胞循環の研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｅｔａｌ　Ｂｌｏｏｄ）Ｊ、　Ｂｌｏｏｄ、　１９８２．　５９（５）、　ｐｐ、　９７６−X７９参照。

選択された培養条件は、一般的にエリスロボエチン以外の他のサイトカインを使用しない、拝準的な細胞培養培地中での育成を包含する。これは選択的に母親ではなく胎児の有核エリスミイド細胞の成育を特徴とする特に好ましい培地は、イスコブズモディファイドドウルベコ培地（Ｉｓｃｏｖｅｓ’　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃａｏｓ　１Ｊｅｄｉ＋ｕｎ）　（Ｎ、　Ｙ州、グランドアイランドのギブコ社（Ｇｉｂｃｏ））を包含し、これは最終濃度２０％の牛胎児血清および２ｕ／ｍｌの精製した尿中のヒトＥＰＯを含有する。

該第二の方法において、胎児有核エリスミイド細胞は、そのアンモニウムイオンの取り込みと、Ｑ！ｔの血液細胞、より具体的には母親のエリスミイド細胞の選択的な溶血に基いて選択的に濃厚化される。一般的な説明に関しては、ジャツブ（Ｊａｃｏｂｓ）　＆スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）、　ｒ赤血球を含むある種のイオン交換におけるカルボニックアンヒドラーゼの役割（Ｔｈｅ　Ｒｏｔｓ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ　ｉｎ　Ｃｅｒｔａｉｎ　Ｉｏｎｊｃ　Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ　Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）Ｊ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　ＰｈｙｓｉｏｌA、　１９４２゜モニアの輸送により測定した全赤血球細胞中のカルボニックアンヒドラーゼの運ｐ１１．４３０−４４０をｆＪ原のこと。簡単に言えば、該細胞を、アンモニア、塩素イオンおよびカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤の存在下で、該細胞内にアンモニウムイオンが蓄積されるのに十分な条件並びに晴間インキュベートする。これは、一般的に約５〜３０分間を要する。該細胞を、次にアンモニアと二酸化炭素との存在下で、母親の血液細胞が選択的に溶血されるようにインキュベートする。

本発明の内容において、多くの化合物が適当なアンモニア、塩素イオンおよび二酸化炭素源を与える。例えば、適当なアンモニア源は、特にアンモニアおよびアンモニウム塩を包含する。適当な塩素イオン源は、特にＮａＣ１，ＫＣＩ％ＶｇＣＩ、およびＣａＣ１！を含む。適当な二酸化炭素源は、特に溶液中の二酸化炭素、炭酸塩および重炭酸塩を含む。

更に、多くのカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤が当分野で公知であり、その例は特に大部分の一価のアニオン、例えばシアニドおよびシアネート、−価のスルフィド、スルホンアミド、およびアセタゾールアミドを包含する。リンズコフグ（Ｌｉｎｄｓｋｏｇ）等、　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍａｓ、　１９７１．５．ｐ、　５８７：ワード（Ｗａｒｄ）＆カル（Ｃｕｌｌ）、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　＋９７２．１５０．　ｐ、　４３６：およびボッカー（Ｐｏｃｋｅｒ）　＆ワタモリ（Ｗａｔａｍｏｒｉ）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９７３．　＋２．　ｐ、　２４７５を参照のこと。このカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤は生理的条件下で１！！能するように選択すべきである。好ましいカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤はスルフ７ニルアミドおよびアセタゾールアミドを包含する。

結合細胞を種々の方法により、濃厚化の前またはその後に遊離させることができる。結合細胞を濃厚化前に実施する場合には、該細胞を引き続き上記方法に従って濃厚化することができる。細胞を遊離するための種々の方法が当分野において公知である。そのようｔｉ方法の１種において、細胞はサイトカインと共に、またはサイトカインなしに培養できる。サイトカイン、例えばＩＬ−２は細胞の増殖を生ずるか、あるいは該細胞の表面特性を変化させて、該細胞またはその始原細胞を担体から：Ｍ離させる。もう一つの方法において、該リガンドまたは該細胞−リガント結合の１！１裂により、該細胞を遊離させることができる。種々の開裂性のリガンドおよび開裂酵素が当分野で知られており、その例は特にパパインおよびトリプシンである。更に別の方法においては、該細胞を機械的、重力的または電磁力で遊離し得る。特に好ましい方法は、例えばピペット処理、攪拌、８６、振動または超音波の印加によりビーズを攪拌することによる機械的攪拌法である。

本発明の他の局面においては、１ａ胞を先ず濃厚化し、次いで胎児有核エリスミイド細胞を吸着させ、未結合血液物質を除去する工程を含む方法が提供される。

簡単に言えば、胎児細胞は、先ず母親の血液をアンモニアおよび塩素イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼ阻害剤と共にインキュベートすることによりａＳ化できる。アンモニウムイオンを１ｆ積するのに十分な条件並びに時間該細胞をインキュベートした後、該細胞をアンモニアおよび二酸化炭素で処理して、母親の血液細胞を選択的に溶血させる。胎児細胞は、また上記の如くエリスロボエチンと共にインキュベートするか、あるいはエリスロボエチンおよび上記の該細胞をアンモニアおよび二酸化炭素で処理する方法を使用した組み合わせ処理によっても濃厚化できる。更に、上記の如く、これら２種の方法は任意の順序で実施できる。

上記方法の実施後に残される濃厚化された細胞は、上記方法の円れかを使用して固定化することができ、該固定化法は（１）濃厚化後に残される胎児有接エリスロイド細胞に特異的に結合する固定化リガンドの使用、（２）濃厚化後に残される細胞を、胎児有核エリスミイド細胞に特異的に結合できるリガンドと結合した第一の構成要素と共にインキュベートし、次いて該細胞を、約１０’ｌＪ−’を越える親和定数で該第−構成要素と結合できる固定化された第二の構成要素に吸着させる方法、および（３）濃厚化媛に残される細胞を第一のリガンドと共にインキュベートし、次いで該第−のリガンドと結合可能な第一の構成要素に化学的に結合する第二のリガンドと共に、該第二のリガンドと該第−のリガンドとが結合するのに十分な条件並びに時間インキュベートし、更に該細胞を、約１０’Ｍ −’を越える親和定数で該第−構成要素と結合できる固定化された第二の構成要素に吸着させる方法を包含する。

該細胞の固定化に引き続き、未結合血液物質を、上記の方法を利用して除去できる。未結合血液物質を除去した後に、該細胞を先ずエリスロボエチンの利用Ｉこより！Ｓ＋厚化した場合、該細胞はアンモニアと二酸化炭素とを使用する上記方法を利用して処理できる。同様に、未結合血液物質を除去した後に、これら細胞が先ず、アンモニアと二酸化炭素とを使用する上記方法で処理した場合、該細胞を次にエリスロボエチンで処理できる。

母親血液からの膜厚化された胎児細胞は、選択的に胎児細胞と結合できるマーカーと共に該細胞をインキュベートすることによって特徴付けされる。ターゲット細胞上における胎児細胞の存在がＱ＃！の細胞上の量の１０倍を越えた場合に、マーカーは核胎児細胞と特異的に結合する。種々のマーカーが当分野、で公知であって、その例はαフェータルプロテイン（“ＡＦＰ”）に対する抗体（これに関しては、クロッイック（Ｋｕｌｏｚｉｋ）等「母親循環系中の胎児細胞：ｉ！！接的ＡＦＰ−免疫蛍光法による検出（Ｆｅｊａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｔｅｒｎａｌ　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ：　Ｄｅｔｅｃｔｊｏｎ　ｂｙ　Ｄｉｒｅモ煤@ＡＦＰ−１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）Ｊ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔ、、　＋９８２．６２．　ｐｐ、　２２１−２２４を参照のこと）または抗原゛ｉ ”に対する抗体（これに関しては、ｙ、ｗ、カン（Ｋａｎ）等、「母親および胎児血に！混合物刀１らの胎児赤血球の抗−１血清によるｆＡ縮（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　。

（ＦｅｔａｌＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓＦｒｏｍａＭｉＮｕｒｅｏｆＭａｔｅｒｎａｌａｎｄＦｅｔａｌＢｌｏｏｄｂｙＡｎｆｉ−ｉ　Ｓｅｒｕｍ）Ｊ、　８ｆｏｏｄ、　１９７４．４３（３）、　ｐｐ、　４１１−４１５を参照のこと）を包含する。

該胎児細胞マーカーに対する抗体を当分野で周知の技術を」Ｉ用してｔｉｎして、胎児細胞の存在の検出に使用することができる。

本発明の好ましい磐様においては、「粒子表面からのリガンドの除去方法（Ｌｌｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｍｉｖｉｎｇ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｐａｒ４ｉｃｌａ　５ｕｒｆａｃｅ）１　と題する関連特許８頗（Ｕ、　Ｓ、特許出ＩＪＮｏ、　０７１５１３．０５６）に記載された方法によって、該細胞表置からリガンドを除去する。該特許出願を本発明の参考文献とする。このような除去は上記の如き′＃徴付げに先立って実施することが特に有利である可能性がある。

本発明の他の局面においては、母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法が提供され、該方法は（ａ）母親の血液サンプルを、胎児始原細胞と結合できる固定化されたリガンドと共に、該リガンドと該細胞との！？興的な結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）未結合の血液物質を除去して該胎児始原細胞を濃厚化する工程とを含む。本発明のこの局面において、胎児始原細胞は全能性の造血幹細胞並びに初期柏原細胞、例えばコロニー形成細１ｔ２１（ＣＦＣｓ）ヲ含む、　ＣＦＣＳノｆｔ％的例１；ＥＣＦＵ− Ｅ　、　ＣＦＵ−Ｇ　、　ＣＦＵ−Ｍ　、　ＣＦｔｌ−ＧＭ、　bＦＵ− ＧＥ四および８Ｆυ−Ｅ細胞を含有する。ＣＤ３４正細胞の１／３〜２７３程度が、一般的に幹細胞またはコロニー形成細胞であり得るという事実が与えられたので、ＣＤ３４細胞が濃縮されもしくはｖＩ製された場合には、胎児始原細胞も１ｉｉ１様に濃縮されもしくは精製されるものと理解すべきである。

上記の如く、ｔａの血液サンプルは胎児始原Ｉ！［ｌ胞と結合できる固定化されたリガンドと共にインキュベートされる。本発明の内容において、リガントカ成人および胎児細胞両者または胎児始原細胞のみの何れかとＩ！Ｉ連した抗原をｔ！議する場合に、該リガンドは胎児始原細胞と「結合する」。ここでいう抗原の代表例は上記のＣＤ３４抗原である。　１ｆｃＤ３４抗原を特異的に認識する抗体の代表的な例は、ＬＩＹ−１０およびＨＰＣ＾２　（Ｃａｌｉｆ、州、マウンテンビューのベクトンーディッキンソン（Ｂｅｅｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））　、　ＱＢＥＮＤ−１０（英国、ケンブリッジノカンタムハイオシステムス（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１２．８（Ｗａｓｈ、ボーチル（Ｂｏｔｈｅｌｌ）のセルブク（Ｃｅｌｌｐｒｏ））を包含する。このリガンドを上記の装置並びに方法で使用して、該胎児始原細胞を固定化できる。インキュベート後、該未結合血液物質を上記の如く除去し、該胎児始原細胞をＳ厚化する。本発明の内容において、該細胞の０．００１％以上が胎児始原細胞である場合に、細胞が濃厚化されたものとする。好ましくは、該胎児始原細胞は存在する細胞の０．１％以上、特に１％以上にまで濃厚化される。

本発明の別の局面においては、母校の血液由来の胎児始原細胞をＳ厚化する方法が提供され、該方法は（ａ）母親の血液サンプルを、胎児始原細胞と特異的に結合し得るｆ！！ｍされたリガンドと共に、該リガンドと該細胞とが特異的に結合するのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）該リガンド結合細胞の存在を検出する工程と、（Ｃ）該リガンド結合細胞を未結合細胞から分離する工程を含む。本発明のこの局面においては、細胞を、上記の如き、胎児始原細胞と特異的に結合できるリガンドと共にインキュベートする。但し、固定化するよりも軍ろこのリガンドを標識する。本発明においては１種々のａ議を利用でき、特にフルオレセイン−イソチオシアネート、フィコエリトリン、ローダミンイソチオシアネートまたはこのような高い蛍光性をもつ他の分子が好ましい。

フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）の利用により、Ｗｉｔｔした細胞を、次に検出し、未標識細胞（または非−リガント結合細胞）から分離して、胎児始原細胞を濃厚化することができる。

本発明の一態様によれば、インキュベート工程に先立って、母親の血液から、例えばフィコール濃度勾配に対して該母親の血液を漬勤させることにより赤血球を除去することもてきる。もう一つの態様においては、上記の未結合血液物質の除去工程に引き続き、上記の培養法を利用して、該結合細胞をエリスロポエチンの存在下でインキュベートする。

更に他の本発明の局面によれば、母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法が提供され、該方法は（ａ）母親の血液サンプルを、胎児始原細胞以外の細胞と特異的に結合できる固定化されたリガンドと共に、該リガンドと回他の細胞とが特異的に結合するのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）該非−結合胎児始原細龜を取り出して、該胎児始原細胞を濃厚化する工程とを含む。上記の如く、ＣＤ３４は胎児始原細胞上に見出すことのできる細胞−表面抗原である。しかしながら、多くの細胞表面抗原は始原細胞上に見出すことができず、従うて母親の血液サンプルから胎児始原細胞以外の細胞を枯渇させるのに利用できるかもしれない、このような抗原の代表例はＩａ、グリコホリン（Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｌｎ）、ＣＤ　３、ＣＤ１９、ＣＤＩＩ、　ＣＤ１４、ＣＤ３３およびＣ０４５を含む。このような抗原に特異的に結合する抗体等のリガンドは、例えばＣａ１ｊｆ、州、マウンテンビューのベクトンーディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＞等の製造業者から購入できる。

本発明の一態様によれば、インキュベート工程前に、例えばフィコール濃度勾配に対して母親の血液を流動させることにより、該血液から赤血球を除去することができる。

胎児細胞の利用ここに記載した如く、濃厚化した胎児細胞は種々の用途をもつ。例えば、その場での（インシチュー（Ｉｎ　５ｉｔｕ））ハイブリダイゼーシタンにより、選ばれた遺伝物質の存在が胎児細胞中に検出できる。同様に、ＤＮＡまたはＲＮＡ増幅も胎児細胞中の選択された遺伝子配列を検出するのに利用できる。本発明の方法は、公知の細胞遺伝学的技術により染色体の型の決定にかけることのできる程度に濃厚化された胎児細胞について特に有用であり、し細胞遺伝学的技術では該細胞の染色体の拡がりを顕微読下で観察する。

インシチューパイプリダイゼーシッンは、細胞中における選択された遺伝子物質の存在を検出する方法として利用できる。ピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ、　１９８８．８５．　ｐｐ、　９１３８−４２：ホフブマン（ＨｏｐＩｌｌａｎ）等、「インシチューハイブリダイゼーンロンによる膀胱癌の数量的染色体異常の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＮｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｗ＋ｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｂｌａｄｄｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｉｎ　５ｉｔｕ　gｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）Ｊ、　Ａ＋ｎ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｐａｔｈ、、　１９８９．１３５（６）、　ｐＬ　１１０５−１１１７を参照のこと。簡単に言えば、選択的に濃厚化された細胞と関連する遺伝物質を、先ず当分野で周知の技術を利用して露出させる。この遺伝物質を、次に該遺伝物質と特異的にハイブリダイゼーション可能な標識されたプローブと共に、ハイブリダイゼーシタンを生ずるのに十分な条件並びに時間インキュベートする。Ｋ、　Ｅ、デーピース（Ｄａｖｉｅｓ）。

ヒト遺伝疾患（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、　ＩＲＬブレス、オックスフォード、英日（１９８６）を参照のこと。最後にハイブリッド化した標識プローブを検出する。好ましい態様において、該遺伝物質は上記露出工種後に変性される０本発明の内容において、遺伝物質は全染色体、ＴＩＮＡおよびＲＮＡを含有する。

また、遺伝物質を増幅し、検出するための種々の方法が当分野で周知である。

例えば、選択された遺伝物質が存在する場合には、この物質は当分野で周知の技術を利用して増幅され、次いてその配列の存在につき検査される。フガン（Ｋｏｇａｎ）等、「増幅されたＤＮＡ配列の分析による遺伝疾患の胎児期における診断のための改良法（Ａｎ　Ｉｎｐｒｏｖｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｎａｔａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｓｅａ唐■刀@ｂ ’ｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ａｍ９１ｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）Ｊ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　ｏｆ　ＷｅпA、　１９８７゜３１７（１６）、　ｐｐ、　９８５−９９０：　ウィツト＆エリクソン（Ｗｉｔｔ　ａｎｄ　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ）、　ｒポリメラーゼ連鎖反応による乾燥血液検体由来のＹ−染色体ＤＮＡの迅速検出法（＾Ｒａｐｉｄ　１ｌｓｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｙ−Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｄｒｉｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｐｅｃｉｍｅ獅刀@ｂｙ　ｔｈａＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎａｔ、、璽９８９．８２．　ｐｐ、　２ｎ−２７４を参■B 増幅法はポリメラーゼ連須反応（−ＰＣＲ”Ｘムリス（Ｍａｌ　Ｉｔｓ）等の米図特軒第４．６８３．１９５号、ムリス等の米国特許第４．６８３．２０２号およびムリス等の米国特許第４．８００．１５９号、これらを本発明の参考文献とする）およびＲＮＡを主体とする増幅技術を含む。これについては、リザルデイ（Ｌｉｚａｒｄｊ）等、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　１９８８．６．　ｐｐ。

１１９７−１２０２：　クラ？　−（Ｋｒａｍｅｒ）等、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８９．３３９．　ｐｐ、　４０１−４０２：　Ｃｌｌクリk ｏｒｎｅｌｉ）等、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９８９．３５（９）、　ｐｐ、　１８２６−１８３１；　クラ？　−（jｒａａｅ「）等、米国特許第４．７８６．６００号を参照のこと。これら文献を本発明の参考文献とする。ＰＣＲ法は最も一般的に利用されているＤＮＡ配列の増幅法である。簡単に言えば、増幅は、反応混合物に適当なプライマー、酵素およびヌクレオチドを添加し、次いで数サイクル（２０−８０）の変性を繰り返し、アニールして少量のターゲツトＤＮＡを増幅することを要する。次いで、このＤＮＡ混合物を電気泳動法により分離し、標識されたプローブとハイブリッド化して、ＤＮＡのターゲット配列の存在を検出する。

該選択的に濃厚化された胎児細胞も染色体的に型決定できる。ヒューマンサイトジェネティックス（ｌｕｇ＋ａｎ　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、　Ｄ、Ｅ、ルーニー　（Ｒｏｏｎｅｙ）＆　Ｂ、　Ｈ，ツェブルコウスキー（ＣｚｅｐｕｌｋｏｕｓｋＤ、　ＩＲＬブレス、オックスフォード、英国（１９８６）を参照のこと。簡単に言えば、好ましい態様においては、少なくとも１０’個の他の細胞当たり１個の胎児細胞を含有するサンプルを、最終濃度２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）　（ハイクローン（ＨＹＣＬＯＮＥ）所見、ユタ、ローガン）および２υ ／ｎｌの高度にＷ１！２された組み換えエリスロポエチン（カナダ、Ｂ、　Ｃ，、バンク−バーのテリーフｔブクスラボラトリー（Ｔｅｒｒｙ　ＦＯＸ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））を含有するイスフブズモディファイドドゥルベフ培地（ＩｕＤＭＸＮ、　Ｙ、州、グランドアイランドのギプコ（Ｇｉｂｃｏ））中で２〜６日間培養して、中期の細胞の密度を高める。次いで、この細胞をコルセミド中でインキュベートし、固定し、ａｍ瞳のスライドに付着させ、トリプシン処理し、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ’　ｓ）染色剤で染色した。このスライドを次に染色体異常についてｉＩ［微鏡で走査する。

選択的に濃厚化した胎児細胞を始原において利用することも可能である。例えば、本発明の一局面においては、遺伝子をレトロウィルス内に挿入し、該レトロウィルスを、この遺伝子に欠乏する胎児細胞を感染するのに使用した。該感染した胎児細胞を、次に胎児（または他の個体）に投与して、該遺伝子欠陥を治療する。このようにして治療可能な疾患は多数あり、例えば＾ＤＡ、鎌状赤立状赤血球貧血セミアおよび５ＣＩＤを包含する。レトロウィルスへの遺伝子の挿入法も周知である（例えば、＋１１０９０１０１８７０；　ｗｏ　８８１０３１６７：　ｗｏ　８ｇ１０９６７０；　Ｗｏ　８９１０１７５０：　Ｎｏ　W９／＋１５３９およびＷｏ　８９１０９２７１を参照、これら全てを本発明の参考文献とする）。

胎児細胞は、また普遍的なドナー細胞としても利用できる。簡単に言えば、胎児始原細胞はレシピエンド中で成人由来の始原細胞程には強力な免疫反応を生じないので、副作用をあまり起こすことなく移植できる。従って、これらの胎児始原細胞はレシピエンドの遺伝性の代謝疾患を治療する目的で移植するのに利用できる。培養物中におけるその数を増大することにより、該胎児始原細胞を、癌に対する骨髄芽球療法後の骨髄移植の代わりに利用することさえも可能である。

更に１選択的に濃厚化された胎児細胞は腫瘍原性として、このような腫瘍原性の細胞の推移を研究し、あるいは研究並びに給断の目的で胎児細胞の発現およびｍ持を開時化することも可能である。胎児細胞中に挿入できる（例えば、上記のようなレトロウィルスにより）Ｐ、表的な形質転換遺伝子はＳＶ４０、Ｔｉ、　ｍｙｃ　、　ｒａｓおよびｓｒｃである。

更に４選択的に１ｍ厚化された胎児細胞は、後の研究、あるいは後の治療上の利用の目的で低温保存することもできる。簡単に言えば、幹細胞の凍結法は「接合細胞の凍結法（Ｊｌｅｆｈｏｄ　ｆｏｒ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ　ｃ＠１ｌｓ）Ｉ　と題する継続中の特許出１：Ａ（代理人の文書Ｎｏ、　２０００７２．４０９）に記載されている。これら方法も胎児始原細胞の凍結に利用できる。

以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するものではない。

１７ｇの乾燥バイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ）　Ｐ−６０（商標、　５０−１００メツシユ（湿潤）、粗いビーズ　Ｃａ１ｉｆ、州すッチモンドのバイオラド（ＢＩＯＲＡＤ）、カタログＮｏ、　１５０−１６３０）を１．５１の０．５Ｍ　ＮａＨＣＯ＋１０゜５λＩ　Ｎａ、Ｃｏ、に添加する。ｐ）１１ａＯＨにより１０．５にｔｌｊｌ？ＩＬ、ミキサー（ＲＺＲＩ、カナダ、オンタリオ、バートンのカルフ７モ（Ｃａｒｆａｍｏ））で酸ビーズに損傷を与えないように注意しながら２０〜３０分間攪拌する。次いで、この混合物を６０゛Ｃの水浴に入れる。該混合物が６０°Ｃに違しｔ：ら、時々攪拌しつつ更に２時間（６０’Ｃにて）インキュベートする。次に、この混合物を腋水浴から取り出し、水浴中に入れ、該混合物の温度を室温に戻す。

該ビーズを蒸留水または脱イオン水で数回洗浄し、真空装置に接続した粗いガラスフィルターを使用してＰＢＳで数回洗浄する。このカルボキシル化ゲルは４° ＣにてＦＢＳ中で保存でき、また減閏され、もしくは保存剤と共に保存した場合には、１年まで安定である。

実施例２・抜カルボキシル化バイオゲルのアビジン結合ＰＢＳを、先ず真空装置に接続された粗いガラスフィルターで濾過することにより、測定され一二量のカルボキシル化バイオゲルから黛く。次いで、このゲルを蒸留水または脱イオン水中で１５〜３０分間平衡化する。水中での平衡化は、該ゲルをその測定された量の約４倍まてにＨ：、ＥＪする。このゲルｌｉ＋１当たり（初めにＦＢＳ中で測定した量）　１０ｍ１の蒸留水または脱イオン水に、該ゲルを再度懸濁する。

３０ｍｇのｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ−ＨＣＩ）　（Ｍ。

州、セントルイスのシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏ、）、カタログＮｏ、　Ｅ１７５０）を、初めに測定した量１ｍｌにつき添加する。ＨＣＩの滴下により、ｐＨを迅速に５゜５に調節する。ｐＨを５．５に維持するよう注意すべきである。というのは、ｐＨが５゜０米虜または６０を越える場合、該バイオゲルの活性は大幅に低下される。、該混合物を５分間攪拌する。

アビジン（Ｃａｌｉｆ、州、フォールブルブクのインターナシタナルエンザイムズ社（Ｉｎｊａｒｎａｊｉｏｎａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　Ｉｎｃ、））を、１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で脱イオン水に溶解する。次いて１０００μｇのアビジンを、ゲル１ｍ１（初めにＦＢＳ中で測定した量）につき即座に添加する。この混合物を１．５時間攪拌する。次いて、２Ｍのグリシンを添加して、該混合物中のグリシンの最終濃度を０．２Ｍとし、更に１時間攪拌する。

該ゲルを粗いガラスフィルターと真空装置とを使用して数倍の体積のＰＢＳで洗浄し、４’ＣにてＦＢＳ中に保存する。このゲルは約１年間安定である。

血液２０ｍ１を妊娠中の女性から得、４本の遠沈管内で、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する等体積のＰＢＳ　（ｌｌｏ　３＋ｇ、セントルイスのシグマケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｏ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、））中に懸濁する。

有核細胞数／ｍ＋を以下の方法で計数する。即ち混合し、抗−凝集処理された全血のアリコー）５０μｌを、３％酢酸溶液３ｆｆｉｌで希釈する。これを攪拌した後、７μｍの該希釈した血液サンプルを血球計の２つのチャンバーに入れる。

該細胞を約３分間沈降させた後、酢酸によって殆ど全てが溶解された細胞の杉を、教員されたノイバウエルの規則（ＶＷＲサイエンティフィック社（ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、　Ｃａ１ｉｆ、州、サンフランシスコ）によって血球計のチミンバー１機当たり４つの制御された場（冬場は０．Ｉ　Ｘｌ０−’μｌのサンプル体積に相当する）内で計数する。場当たりの核の平均数を６１　Ｘ　１０ ’なる希釈因子を掛けて、全血１＋ｎ＋当たりの有核細胞数を算出する。この平均値が場当たり１ＯｆｌＩＩの核未満である場合には、上記手順を繰り返す。但し、５０μｌの血液を僅かにｌｎｌの酢酸で希釈する。従って、新たな希釈因子は２１　Ｘ　１０’である。希釈された血液の入った各管に５ｏ＋１のヒストバック（）Ｉｉｓｔｏｐａｑｕｅ：シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏ。

））層を重ね、室温にて１５分間７００ｘｇにて造心処理する。該界面における細胞を集め、ＰＢＳ＋Ｉχ８ＳＡで１回洗浄する。生成するペレットを１００μ ｌのＰＢＳ＋Ｉ％ＢＳＡに再度懸濁する。

２０　ｍｇ、／ｍｌの抗−トランスフェリンレセプタ抗体（Ｃａｌｉｆ、川、マウンテンビューのベクトンディノキンソン、イムノサイトメトリーシステムズ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓ。

ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｊｒｙ　Ｓｙｓ＋ｅｎ＋ｓ））をＶ’ｌ−金物に添加し、氷上で１５分間インキュベートする。次いて、該細胞を４ｉｆのＰＢＳ＋１％ＢＳＡで１回洗浄し、約４００ｘｇにて５分間遠心処理する。

該細胞を、次に再度ｌ！ｌ濁して１ｉｆとし、１μ８７ｍ１のビオチン処理した山羊抗−マウスＩｇＧ（Ａｌａ州、バーミンガムのサザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ））を添加する。この混合物を氷上て１５分間インキュベートし、上記のようにＰＢＳ÷１％８ＳＡで２回洗浄する。

カラムの調製（上記の如くして調製した）カルボキシル化バイオゲル（Ｂｊｏｇｅｌ）Ｐ−３０（商りを室温に対して平衡化し、金床高さＩＣＩまでに９／１５カラム（Ｎ、　Ｊ、州、ビス力タウエイのファルマーシア社（ＰｈａｒｌＩＩａｃｉａ））に充填する。このカラムをＰＢＳで、次いでＰＢＳｎ％　ＢＳＡで洗浄する。このカラムは「予備カラム」として機能する。このアビジンカラムは上記のようにｔＩＩｎしたアビジン結合バイオゲルＰ−６０を含む。このアビジン結合バイオゲルを室温に対して平衡化し、全床高さ４ｅｍまでに９／１５カラムに入れる。久いで、このカラムを数倍の容積のＰＢＳで、次いでＰＢＳ＋５％ＢＳＡで洗浄する。

細胞の免疫吸着上記の如りｖＡ＆！シた細胞を、体積１ｍｌにまでＰＢＳ＋５％１ｌＳＡ中に再懸濁する。次いで、この細胞を穏やかに、該予備カラムフィルタのゲル床の上部に移す。該細胞を該予備カラムにより濾過し、１ｉｆのＰＢＳ＋’ｌＪ　ＢＳＡで洗浄する。螺動ポンプ（Ｉｌｌ。

Ｊ（（、ロックフォードのコール−バーマー（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ））により、該アビジンカラムからの流れを約１ｍ１／分の速度に制御する。該細胞の殆どが該アビジンカラム床の上部にまで流下したら、１〜２ｍｌのＰＢＳ＋ｓ％ＢＳＡを該アビジンカラムの上部に添加して、残留する細胞を洗い流す。該カラムを４〜６＋ｎｌのＰＢＳ＋５％ＢＳＡで、次いで４〜６ｍｌのＰＢＳで洗浄する。

吸着された細胞の該アビジンカラムからの分離該アビジンカラムを１５ｍ１の遠沈管の上部に置く。骸カラムのバルブを開放し、１５ｍ１のＲＰＭＩを、広い穴をもつ９−インチの移送ピペットで数カラムに添加する。このＲＰＭＩは、該ピペットを機械的攪拌並びに該細胞床の再懸濁のために利用しつつ、該カラｔ、に添加し、かくして細胞を該ゲルマトリックスから分離させ、かつ該遠沈管内に濾過しつつ落下させる。次いで、肢管を４００Ｘｇにて５分間遠心分離し、以下に記載する培養培地中に再懸濁する。

実施例４：胎児Ｗｔｘエリスロイド細胞の遺沢的濃厚化エリスロボエチンによる胎児細胞の膜厚化上記のアビジン−バイオゲルカラムから分離された細胞を、最終濃度２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）　（ハイクロン（）ＩＹＣＬＱＮＥ）　：商標、ユタ、ローガン）および２０／ｇｏ１の高度に精製された組み換えエリスロポエチン（カナダ、８．　Ｃ，、バンク−バーのテリーフォックスラボラトリ−（Ｔｅｒｒｙ　ＦＯＸ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））を含有するイスコブズモディファイドドゥルベフ培地（ＩＭＤＭ）　（Ｎ、Ｙ、州、グランドアイランドのギブコ社）中に再懸濁する。細胞を５ＸＩＯ’有核細胞／ｍｌに希釈し、その２００μｌを、丸底の９６ウエルを備えた組織培養プレート（Ｎ、Ｙ、州、コーニングのコーニングガラスワークス（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　ｌ’１ｏｒｋ３））の各ウェルに入れる。

アンモニウムイオン分化による胎児細胞のａｒ！１．化上記のアビジン−バイオゲルカラムから分離された細胞を、２Ｘ１０’育核細胞／ｍｌなる濃度に調節する。この細胞混合物の１容を冷却し、１８容の０．１８４４１Ｊ　ＮＨ，Ｃ１および２容の１０ＭＭアセタゾールアミドとを含有する２９°Ｃの溶液を添加する。

２分後に、２容の３１１ＭＮ）Ｉ　−ＨＣＯｓを素早く添加し、該混合物全体を３分間穏やかに撹拌する。細胞を３回ＰＢＳと共に遠心分離することにより洗浄して、細胞デブリスを除去する。

実施例５：インシチニーハイプリダイゼーシ畳ンｆＱ厚化細胞を低ｇＬ溶液（０，０７５賛ＫＣＩ）に１２分間３７℃にて暴露する。肢管を該インキュベート中に１回転倒させて、該細胞を懸濁状態に＃Ｓ持する。新たにＣｌ製した固定液（３：１メタノール：酢酸）　２０Ｍを該細胞に添加し、攪拌し、次いで約２５０１ｇにて８分間遠心分離処理する。新たな固定液を該細胞に添加し、室温にて１％間インキュベートする。該細胞を約２５０Ｘｇにて８分間遠心分離処理する。

新たな固定液を添加し、上記工程をもう一度繰り返す。最後に、該細胞を少量の固定液中に再ｌ！渇し、４℃にて一夜放置する。

翌日、該細胞を攪拌し、エタノールで清浄にし、かっ蒸奮水に浸漬しておいた顕微鏡用のスライド（ＩＩｌ、州、マグロ−パークのバクスター（Ｂａｘｔｅｒ））上に載せる。このスライドを２日間室温にて乾燥する。

このスライドを２ｘＳＣＣ（０，３０１Ｍａｉｌ、　０．０３０Ｍ　りｘ　ン酸ナトリウム）中ニホルムアミドを溶解した７０％の溶液中で２．５分間６８〜７０℃に加熱する。次いで、該スライドをエタノールの７０１水性溶液からなるリンス液に入れる。このリンスに引き続き、該スライドを連続的に、各５分間、７０％、９５ｚおよび１００％のエタノール溶液に入れる。各エタノール溶液は≦ −２０℃に維持する必要がある。該スライドを風乾する。

ページ（Ｐａｇｅ）等の方法（「単一の＊ｉ配列を、ヒ＋−ＸおよびＹ染色体上の多形および相同型へのハイブリッド化（Ｓｉｎｇｌｅ　ｃｏｐｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ　ｔｏ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｅ　ａｎｄ　ｈｏｆｆｉｏｌｏｆｏｕｓ　Ｉｏｃｉ　Ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｘ　ａｎｄ　Ｙ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）Ｊ、ＰＮ＾Ｓ、１Xｇ２．　７９゜ｐｐ、　５３５２−５３５６）に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクシタン（ＡｍｅｒｉｃａｌＴｙｔｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＸＡＴＣＣ）　Ｎｏ、　５７２６１からのプラスミドＤＮＡからプローブを調製する。但し、ビオチン−ｄＡＴＰを酸プローブに組み込んだ。スライド当たり２５μ ｌのビオチン処理したこのプローブ（５μｇ／ａ＋１）を微量遠沈管に入れる。

このプローブを５分間７０℃に加熱し１次いで即座に氷上に置く。２０ｕｌの該プローブ溶液を各スライド上に載せ、２２　Ｘ　４０ｍのカバースリップで覆う。これらのスライドをｉ１潤紙タオルライナーを伺えたボックス内に入れ、３７ ℃にて１２〜１８時間インキュベートする。

ＩｘＳＣＣ中に溶解したホルムアミドの５０％溶液を３７℃に加温する。カバースリップを該スライドから除去し、５０％ホルムアミド溶液に３０分間浸漬する。次いで、このスライドを２ＸＳＣＣ溶液内に穏やかに振盪しつつ３０分間入れ、次いで１ｘｓｃＣ中に穏やかに振盪しつつ３０分間入れる。フルオレセインで処理したアビジン（Ｃａｌｉｆ、州、バーリンガムのベクター（Ｖｅｃｔｏｒ））を１　：　１０００（ｌ　ｕ　ｇ／ａｌ）に希釈する。

訪スライドの裏面および細胞領域近傍を拭う。２００μＥの訪了ビジンーフルオレセインを各スライドに添加し、室温にて３０分間ボックス中でインキュベートする。

該スライドを順次（１）　４Ｘ　Ｓｅｃで１０分間、（２）　振ｌｌｉせずに４ｘ　ＳＣＣ，０，１ｆ）イージー２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）で１０分間および（３）　ＩＭ盪せずに４Ｘ　ＳＣＣで１０分間洗浄する。酸スライドの裏面および細胞領域近傍を拭う。１０μｌのアンチ−フェード（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）＋プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｗ＋）沃素（１０ｍｌのＰＢＳ、　１００　ｗのｐ−）二二レンジアミン、９０ｉ１１のグリセロール、ｐＨ８，０、１０ｇ／ｍｌのプロビジラム沃＊）を添加する。該スライドをカバースリップて覆い、４° Ｃにて保存する。必要ならば、該スライドは数日間保存できる。ターゲットＤＮＡは、蛍光の存在のために、顕微鏡下で観察可能である。

実施例６：染色体型の決定上記のＳ厚化した細胞を、１時１１３７℃にて１Ｌｇのフルセミド（Ｎｏ州、セントルイスのシグマ社（ＳｉｇＩｌｌａ））に暴露する。低張溶液（０，０７５Ｍ　ＫＣＩ）を該細胞に加え、３７℃にて１２分間インキュベートする。該管を該インキュベート中１０転何させて該細胞を懸濁状態に維持する。新たに調製した固定！（３：１メタノール：酢酸）の２０＊　ｔ−該細胞に添加し、攪拌し、次いで約２５０　Ｘｇにて８分間遠心処理する。該細胞に新たな固定液を添加し、次いで室温にて１時間インキュベートする。該細胞を約２５０　ｘｇにて８分間遠心処理し、再度新たな固定液を添加する。この工程を更に１回繰り返す。最後に、該細胞を少量の固定液に再懸濁し、４°Ｃにて一夜放置する。翌日、該細胞を攪拌し、エタノールで清浄化し、かり蒸習水に漬けておいた顕微鏡用のスライド（１１１，州、マグロウパークのバクスター（Ｂａｘｔｅｒ））上に置く。

該スライドを約３〜４日間風乾し、次いでｏ、　ｏｏｓ％トリプシン（ディフコバクトドリブシン（Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏｔｏｒｙｐｓｌｎ）、Ｃａ１ｌｆ、州、サンフランシスコのｖｗＲサイエンティフィック社（ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））で３０〜３５秒間処理する。酸スライドをＰＢＳ＋１％ＦＢＳで２回、次いでＰＢＳのみで洗浄する。該ＩＩｌ胞をライフ染色液（Ｍｏ２州、セントルイスのシグマケミカル社）て染色し、次いで脱イオン水で２回洗浄する。該スライドを中期細胞の存在につき走査し、公知の細胞遺伝学的手法によって型の決定を行う。

実施例７；分離なしの培養＾、　母親の血液＠親のサンプルを燐酸緩衝塩水ＣＰＢＳ）て１：１に希釈した。その２０＋ｎｌを遠沈管に入れ、次いで８ｍｌのフィコールハイバック（Ｆｊｃｏｌｌ　Ｈｙｐａｑｕｅ）を入れた。この管を１７００　ｒｐＨ（５００ｘｇ）にて１５分間遠心分離した。ベレット化された細胞を、再懸濁し次いで細胞を遠心処理することにより、２回洗浄した。該細胞を、２０％のウシ胎児血清（ハイクロン（ＨＹＣＬＯＮＥ）、　スタ、ローガン（Ｌｏｇａｎ））、２ｏＭのグルタミン、ｌ＋ｎＭのピルビン酸ナトリウム、Ｏ，ＩｍＭのＮＥＡ＾（非−必須アミノ酸、Ｍｄ州、ウォーカーズビルのウイッタカーバイオブロダクツ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））および１υ／ｍｌのＥＰＯ（カナダ、Ｂ、　Ｃ，、バンク−バーのテリーフォックスラボラトリ−）を含有する２０ｍ１のＩＭ［１Ｍ培養培地に再Ｗ燭した。該細胞懸濁液１０ｍ１を２つの７７５コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）フラスコの各々に入れ、５ＸＣＯ雪インキユベータ中で３７℃にて一夜インキスベートした。ｌａｍ芽細胞等の接着性細胞を、分離の前に除去する。

実施例８：アフィニティーカラム上の胎児柏原細胞の分離４名の９．音から採取したサンプルを実施例７に記載のように処理した。−夜インキユベートした後、被細胞培養物を計数し、１２００　ｒｐのにて１０分間遠心分離処理した。上澄を除去し、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含有するＰＢＳ　１０ｍｌ中に再懸濁し、＋２０Ｏｒｐｍ（２５０ｘｇ）にて１０分間遠心分離処理した。該上澄を除去し、被細胞を０．１ｚのＢＳＡを含有する１ｍｌのＦＢＳ中に再＠濁した。

抗体１２．８（Ｗａｓｈ、州、ボーチルのセルプロ（Ｃｌ１ｌＰｒｏ））　（抗 −ｅＤ３４抗体）を該細胞懸濁液に、最終濃度４０　ｕ　ｇ／ｍｌとなるように添加した。次いで、被細胞を氷上で３０分間インキュベートした。

３０分後、該細胞を遠心処理し、次いてＰＢＳ／ｌＸＢ５＾に再墾濁することにより２回洗浄した。次いで、ビオチン処理したウサギ抗−マウスＩｇＧ抗血清（Ｃａ１．州、サウスサンフランシスコのジムドラボラトリーズ（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を最終濃度１：１０００となるようｉ；添加し、氷上で３０分間インキュベートした。該細胞を遠心処理し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡに再懸濁することにより２回洗浄し、最後に５％のＢＳＡを含有するＰＢＳｉｍｌ中に再懸濁した。

アビジン処理したゲルを、本質的に上記実施例１および２に記載のようにＩＩｌ製し、ソフトカラム（継続中の米国特許出１Ｍ第０７１５９９．７９６号を参照のこと、これを本発明の参考文献とする）に、床の厚み４Ｃｌまで入れた。

実施例９：分離後の培養上記手順によって分離された吸着細胞を２０％のＦＢＳと２１１１０１のＥＰＯとを含有するＩＭＤＭ中に再懸濁した。次いで、該細胞を９６ウエルのコスタ− プレートにウェル当たり２００μｌの量（ウェル当たり約百万個の細１２Ｉ）で入れ、５ＸＣＯ雪インキユベータ中で３７℃にて５日間インキュベートしナニ。

＾、　中期細胞展開物（ｓｐｒｅａｄｓ）のための細胞の調製５日間のインキュベート後、該細胞を微量遠沈管に移し、３７℃にて１時間コルセミド（ＳＯＯμ ｌ中１μｇ）に！ヰした。次いで、該細胞を１０００　ｒａｍにて５分間遠心処理し、１ｍｌの０．０７５Ｍ　ＫＣＩを添加した。新たに調製した固定液（３：ｌメタノール：酢酸）の２０滴を該細胞懸濁液に添加し、被細胞を再度５分間１０００　ｒｐｍにて遠心処理した。１ｍｌの固定液を添加し、該細胞を室温にて１＃同放置した。次いで、該細胞を５分１１１１０００　ｒｐ＋ｎにて遠心処理し、１１１１の固定液で３回洗浄し、５００μｎの容量で４°Ｃにて一夜放置した。翌日、中期細胞展開物をＣｌｌ１Ｌだ。

Ｂ、　中期展開物（カロタイピング（ｋａｒｏｔｙｐｉｎｇ））該展開物をｔｆｆｌにて数日間乾燥させた。次いで、スライドをディフコｌ＜クトトリブシン（Ｄ目ｃｏ　Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｓｉｎ）中に１分間入れた（ｆｌｕ／４５＋＋１）。該スライドを１％ＦＢ＾を含有するＰＢＳで、次いでＰＢＳのみで洗浄した。該スライドを新たなライ・ン染色剤中に３５秒間入れ、２回洗浄し、顧微競下で走査しＩこ。

実施例１０　：　ＣＦＳｓの測定２−のし−グルタミンと５０μ官７ｍｌのゲンタマイシンとを補充しｔニイスコブズメチルセルロース（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　１Ｊｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ：カナダ、ブリティ’）ンユコロンビア、バンク−バーのテリーフォックスラボラトリーズ）の３５ｍＬ１１プレート当たりＬｍｌを３７“Ｃに加温した。細胞は、３−倍希釈物を３回塗布して、該アッセイの精度を完全した。塗布した細胞の最大数は１０’／プレートであり、促しカラム−ｇｉ製細胞番二ついては３Ｘ１０°以下で塗布した。該細胞は各プレート表面上に均等１こ展開され、インキュベートした。５０細胞異常を含むコロニーをカウントし、ＣＦＵ−ＧＭ、　ＢＰＵ−Ｅまたはその他（例えば、ＣＰＵ−ＧＥＭＭ）として計数した。種々の壁のコロニーの和をとって、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）の全数を得た。

結果を以下の第１表に簡単にまとめた。

妊娠した女性出発細胞　８７９６吸着された細胞　６１３吸着されなかった細胞　１２３４妊娠していない女性出発細胞　３１９吸着された細胞　９０吸着されなかった細胞　７９男性出発細胞　６１８吸着された細胞　１９５吸着されなかった細胞　０ＣＰＣｓを比較すると、妊娠していない女性または男性に比して、有意に高い数の細胞が妊娠した女性から得られることが明らかである。細胞数における増加が、該妊娠した女性の骨髄からの始原細胞の移動によるものである可能性があるが、始原細胞における増加の少なくとも一部分は該母親のＷＩ環系内の胎児始原細胞によるものである。

実施例１１：インシチューハイブリダイゼーシタン実施例８で上記した如くして濃厚化した胎児細胞を、市販品として入手できるキット（染色体インシチューキット３１３７０：ＭＤ州ガイザースバーグのオンコール（０同様に上記実施例１０に記載した如く測定した。結果を以下の第２表に示す。

第２表：母親の血液由来の胎児細胞を培養し１次いでＹ−プローブを使用したインシチューハイブリダイゼーシタンの選択された結果−見上温堕盈！　非−吸着　」！！　非−吸着　羊膜またはＣｖＳＡ　１０　４８　０．０５　５０　２０　６５００　３　男性　男性８　１６　３８　０．１１　３１　１０　１４５０　１　男性　男性ＣＩ６　３５　０．１１　４５　２　１６１０　０　０　女性実施例１２　：　ＦＡＣ３分析実施例８で上記した如くして濃厚化した胎児細胞を、ＦＡＣＳにより分析した。

簡単に言えば、１２５．０００個の精製した細胞を２本の管に分割した。その１本には■８Ｇコントロールを、また第二の管にはＱＢｅｎｄ−１０（抗−ＣＩ１３４抗体）を最終濃度２０μｇ／ａ＋１で入れた。これら管を氷上で３０分間インキュベートし、次いで１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　４のＩで２回洗浄した。

次に、これら２つの管をｌ・５０希釈率の（ＦＩＴＣ−結合した）山羊抗−マウスＩｇＧで処理し、氷上で３０分間インキュベートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ　４ａ＋１で洗浄した。最終的に洗浄した後、該細胞を２００μｌのＰＢＳおよびプロピジウム沃素（ｌμｇ／ａ＋１）中にＳ濁し、　ＰＡＣ３ｃａｎ（ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｌｃｋｌｎｓｏｎ））上で分析した。

実施例１３；コロニーの捕集および再培養個々の胎児細胞コロニーを実施例１０のメチルセルロース培地から無菌条件下で捕集した。これらコロニーをエックスビボ（Ｅｘ　Ｖｉｖｏ）培地に入れ、次いでメチルセルロース培地に戻して、分化を観察した。単一の細胞から、クローン胎児細胞のコロニーが発生した。

クローン胎児細胞は同一であり、従って多数のサンプルの効果を細胞についてテストしたい場合におけるアッセイ（即ち、ある化合物が発癌性であるか否かを確立するために）で利用できる。これら細胞の幾つかがコントロールとして楓能し、一方で他の細胞を該化合物の作用に付すことができる。同様に、多数のアッセイを実施して、ある種の薬物に対する細胞の感受性を測定することができる。

加えて、該フロニーは所定の応答性についてスクリーニングでき、かつクローンはより詳細なアッセイに付すことができる。

本発明の特定の！！！様を例示の目的でここに記載してきたが、本発明の精神並びに範囲を逸脱することなく種々の変更を成しえることを、以上述べてきたことから理解すべきである。従って、本発明は添付した請求のａ！Ｉ！によってのみ限定される。

フロントページの続き（７２）発明者　ハイムフェルド　シェリーアメリカ合衆国　ワシントン州　９８０７２ウツデインヴイル　ノースイースト　ワンハントレッドアンドナインチイエイス　ストリート　１８３２６

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）母親の血液サンプルを、胎児始原細胞に結合できる固定化されたリガンドと共に、該リガンドの該細胞に対する特異的結合を可能とするに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）未結合血液物質を除去して、該胎児始原細胞を濃厚化する工程、を含むことを特徴とする母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法。
２．該インキュベーション工程前に、母親の血液から赤血球を除去する工程を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
３．該除去工程が、母親の血液を密度勾配処理によって分離する工程を含む請求の範囲第２項に記載の方法。
４．該未結合血液物質を除去する工程に引き続き、エリスロボエチンの存在下で該結合細胞をインキュベートする工程を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
５．（ａ）母親の血液を、胎児始原細胞に結合できる標識されたリガンドと共に、該リガンドの数細胞への特異的結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）該リガンド結合細胞の仔在を検出する工程と、（ｃ）該リガンド結合細胞を該未結合細胞から分離して、該胎児始原細胞を濃厚化する工程、を含むことを特徴とする母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法。
６．該インキユベーシヨン工程前に、母親の血液から赤血球を除去する工程を含む請求の範囲第５項に記載の方法。
７．該除去工程が、母親の血液を密度勾配処理によって分離する工程を含む請求の範囲第６項に記載の方法。
８．該未結合血液物質を除去する工程に引き続き、エリスロボエチンの存在下で該結合細胞をインキュベートする工程を含む請求の範囲第５項に記載の方法。
９．該標識が、フルオレセインーイソチオシアネート、フィコエリトリンおよびローダミンーイソチオシアネートからなる群から選ばれる請求の範囲第５項に記載の方法。
１０．該リガンドが抗体である請求の範囲第１または５項に記載の方法。
１１．該抗体が１２．８である請求の範囲第１０項に記載の方法。
１２．（ａ）母親の血液サンプルを、胎児始原細胞以外の細胞と結合できる固定化されたリガンドと共に、該リガンドの該他の細胞への特異的結合を可能とするのに十分な条件並びに時間インキュベートする工程と、（ｂ）該非結合胎児始原細胞を取り出して、該胎児始原細胞を濃厚化する工程、を含むことを特徴とする母親の血液由来の胎児始原細胞を濃厚化する方法。
１３．該インキユベーシヨン工程前に、母親の血液から赤血球を除去する工程を含む請求の範囲第１２項に記載の方法。
１４．該取り出し工程が、該母親の血液をフィコール濃度勾配に対して流動させる工程を含む請求の範囲第１３項に記載の方法。
１５．該リガンドが抗体である請求の範囲第１２項に記載の方法。
１６．母親の血液細胞と、胎児始原細胞とを含み、該胎児始原細胞が全細胞の０．００１％を越える量で存在することを特徴とする組成物。
１７．母親の血液細胞と、胎児始原細胞とを含み、該胎児始原細胞が全細胞の０．１％を越える量で存在することを特徴とする組成物。
１８．母親の血液細胞と、胎児始原細胞とを含み、該胎児始原細胞が全細胞の１％を越える量で存在することを特徴とする組成物。