DE3044015C2 - Verfahren und Einrichtung zur Präparation von in Teilung vorliegenden Zellen für die Chromosomenanalyse - Google Patents

Description

Einsaugen einer im Gewebekulturgefäß (1) erkennbaren Zelle (4) im Teilungszustand (Mitose, Metaphase) mittels der in einem Mikromanipulator (6) gehaltenen und geführten Mikropipette (5);

Überfahren der mit der Mikropipette eingesaugten Zelle (4) in eine Präparationseinrichtung (11);

Einleiten der eingesaugten Zelle (4) in eine hypotone Lösung (22);

Zuführen von Fixationslösung zum Abtöten der Zelle (bei 23);

Auftropfen der präparierten Zelle in Lösung auf einen Objektträger (24) zur anschließenden Analyse.

2. Einrichiung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 ζικ Präp.« .ation von in Teilung vorliegenden Zellen fcr die Chromosomenanalyse von durch Amniozentese (Fruf tblasenpunktierung) gewonnenen Zellen eines Fetus in der pränatalen Diagnostik, wobei die Zellen in einem Gewebekulturgefäß in einer Nährflüssigkeit vorliegen, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung eine sterile, mit ihrer vorderen Spitze manipulierbar in das Gewebekulturgefäß (1) einführbare Mikropipette (5) aufweist, daß die Mikropipette mit einer Absaugeinrichtung (8) zum Einsaugen von in dem Gewebekulturgefäß (1) erkennbaren Zellen in Teilung (Mitosen 4) verbunden ist, und daß die in die Mikropipette eingesaugten Zellen in eine Präparationseinrichtung (11) einbringbar sind.

3. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropipette (5) über eine an ihrem hinteren Ende angeschlossene Verbindungsleitung (7) mit der Präparationseinrichtung (11) verbunden ist, und daß zum Einbringen der eingesaugten Zellen (4) in die Präparationseinrichtung (U) mindestens eine Pumpe (8) vorgesehen ist.

4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Verbindungsleitung (7, 13) ein Sensor (21) zum Erfassen von in die Mikropipette (5) und die Verbindungsleitung eingesaugten Zellen (4) zugeordnet ist, daß die Verbindungsleitung zu einer Saugpumpe (8) führt und vor dieser Pumpe eine zu der Präparationseinrichtung (11) führende Abzweigungsleitung (14) aufweist, in die bei Erfassen einer eingesaugten Zelle durch den Sensor diese Zelle steuerbar einleitbar ist.

5. Einrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Präparationseinrichtung (11) zumindest eine Glaspipette (17) aufweist, die vorzugsweise automatisch in mehrere festgelegte Stellungen (1 bis Vl, F i g. 4) überführbar ist, und daß die Glaspipette in einer dieser Stellungen mit der Abzweigungsleitung (14) verbindbar ist, um eine durch den Sensor (21) erfaßte Zelle (4) aus der Verbindungsleitung (7,13) abzusaugen.

6. Einrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropipette (5') nach Einsaugen einer oder mehrerer Zellen (4) in Teilung in eine Halterung (32') einer automatisiert betriebenen Präparationseinrichtung (H') einsetzbar ist, in der

ίο sie über mehrere Stationen gesteuert zur Präparation der Zellen führbar ist

7. Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß längs des Weges der in der Präparationseinrichtung (H') geführten Mikropipette (5') ein Behälter (22') mit hypotoner Lösung, ein weiterer Behälter (23') mit Fixationslösung sowie eine Halterung (36) für mehrere Objektträger (24') vorgesehen sind, um während des geführten Weges des Mikropipette (5') zur Präparation der Zellen jeweils nacheinander aus den Behältern Lösung in die Mikropipette einzuziehen und danach einen oder mehrere Tropfen auf die Objektträger aufzubringen.

8. Einrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Pipette (17, 5') in der Präparationseinrichtung (11, 11') in einem Revolverkopf mit mehreren Drehstellungen eingesetzt ist.

9. Einrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropipette (5)

jo zum Einsaugen von Zellen (4) in einem Mikromanipulator (6) gehalten und mit Hilfe dieses Mikromanipulator führbar ist

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und auf eine Einrichtung zur Präparation von in Teilung vorliegenden Zellen gemäß den Oberbegriffen der

to Patentansprüche 1 bzw. 2.

Derartige Verfahren und Einrichtungen werden insbesondere in Zusammenhang mit der Pränatal-Diagnostik eingesetzt, d. h. in der Untersuchung eines ungeborenen Kindes im Mutterleib. Mit der Pränatal-Diagnostik lassen sich z. B. Erbkrankheiten des Ungeborenen erkennen. Hierzu ui'crsucht man eine Probe des Fruchtwassers, in dem das Ungeborene schwimmt. Um eine solche Probe zu erhalten, wird eine Fruchtblasenpunktierung (Amniozentese) vorgenommen: etwa in der

16. Schwangerschaftswoche wird nach vorheriger Ultraschallsicht, mit der festgestellt wird, in welcher Stellung sich der Fetus in der Fruchtblase befindet oder unter Ultraschallicht durch die Bauchdecke der Mutter in die Fruchtblase eine Kanüle eingeführt und die gewünschte Probemenge von Fruchtwasser in einer Spritze aufgezogen.

Ein Teil des gewonnenen Fruchtwassers kann biochemisch untersucht werden, wodurch sich z. B. Stoffwechselstörungen innerhalb des Mutier-Kind-Haushaltes feststellen lassen. Der Rest des Fruchtwassers wird in Gewebekulturgefäßen, z. B. Petri-Schalen unter bestimmten Bedingungen etwa bei Körpertemperatur aufbewahrt, wobei die im Fruchtwasser befindlichen lebenden Zellen angezüchtet und nach einer

•>5 Kulturdauer von etwa 12 bis 16 Tagen weiteraufbereitet werden. Für einige Untersuchungen benötigt man Zellen, die gerade dabei sind sich zu teilen; dieses Zellteilungsstadium wird allgemein mit Meiaphase

bezeichnet Nur in Zellen in Metaphase oder in Prophase bzw. Prometaphase hat sich das Erbmaterial zu fadenförmigen Chromosomen verdichtet, während es ansonsten ein unentwirrbares Knäuel bildet Zur Vorbereitung der Chromosomenanalyse wird der Zellösung ein bestimmtes Medikament (Colcemid) beigegeben, das die Zellteilung im Stadium der Metaphase arretiert und damit die Zahl der Zellteilungen (Mitosen) im Stadium der Metaphase erhöht. Hiernach müssen die lebenden Zellen in Metaphase für die Analyse aufbereitet werden. Hierfür sind heute weltweit zwei verschiedene Techniken gebräuchlich, und zwar die sogenannte »in situ Technik« und die »Trypsinierungstechnik«, vgl. hierzu Therkelsen, A. J.: Cell-culture and cytogeneiic techniques in Prenatal diagnosis, Stuttgart, Ferdinand Enke Publishers 1979, S. 258—275. Um für die Chromosomenanalyse eine ausreichende Anzahl von Mitosen, d. h. Zellen in Teilung, zur Verfügung zu haben, muß bei diesen beiden Aufbereitungstechniken gewartet werden, bis ausreichendes ZeHmaterial angewachsen ist Hierbei vergehen zwischen 9 und etwa 14 Tagen. Das gesamte vorhandene angezüchtete ZeHmaterial wird gemeinsam mit den für die Diagnostik allein interessierenden Mitosen abgetötet d. h. fixiert Das restliche ZeHmaterial geht demnach bei der Aufarbeitung etwa für andere mögliche Untersuchungen verloren.

Die derart aufbereiteten Mitosen, die die Chromosomen enthalten, werden anschließend mit Farbstoffen angefärbt, die selektiv an bestimmten Stellen jedes Chromosoms haften und ein für das Chromosom charakteristisches Bänderungsmuster erzeugen. Die Chromosomen werden lichtmikroskopisch gezählt und beurteilt. Ebenso ist es möglich, die Chromosomen mit einem hochauflösenden Mikroskop zu fotografieren und entsprechend zu beurteilen. In der Regel steht etwa drei Wochen nach Fruchtwasseransatz die abschließende Diagnose fest Mit der Diagnose können bei dem ungeborenen Kind genetisch bedingte Krankheiten, so z. B. Mongolismus, festgestellt werden. Außerdem kann auch das Geschlecht des Kindes bestimmt werden. Diese Diagnosen können durch Studium der Anordnung und eventuellen Anomalien der üblicherweise 46 und davon 22 als Paaren vorliegenden Chromosomen gestellt werden.

Wie bereits oben erwähnt, sind bis zur endgültigen Diagnose meist etwa zwei Wochen vergangen. Wünschenswert wäre für eine die Zellteilung ausnützende Diagnose, wenn das Ergebnis möglichst rasch vorliegen würde, d. h. wenn die bisherige Verfahrensdauer verkürzt werden könnte und dies nicht nur aus medizinischen, sondern auch aus psychologischen Gründen für die behandelte Mutter des ungeborenen Kindes. Aus medizinischen Gründen wäre es außerdem wünschenswert, daß bei der Aufbereitung der Mitosen nicht auch das übrige ZeHmaterial abgetötet würde, da dieses ansonsten auch noch für andere Zeiluntersuchungen verwendet werden könnte. Bei den bisherigen Aufbereitungsmethoden ist dies jedoch kaum möglich, da eine relativ hohe Anzahl von Zellen in Metaphase vorhanden sein müssen, um innerhalb des sonstigen abgetöteten Zellmaterials noch analysiert werden zu können. Wünschwenswert wäre demnach auch eine Aufbereitungsmethode, in der die Zellen in Teilung, d. h. in der Metaphase von dem sonstigen Zellmaterial getrennt werden könnte!. Hiedurch stünde einmal das übrige ZeHmaterial für weitere Untersuchungen zur Verfügung; zum anderen könnte damit auch die Probenmetige des aus der Fruchtblase zu nehmenden Fruchtwassers reduziert werden, die im allgemeiner,-etwa fünfzehn bis zwanzig Milliliter, entsprechend etwa einem Zehntel der gesamten Fruchtwassermenge einer Schwangeren in der sechzehnten Schwangerschaftswoche enthält

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Einrichtung zur Aufbereitung bzw. Präparation von Zellen in Teilung bzw. Metaphase

i" (Mitosen) anzugeben, mit denen die für die Enddiagnose benötigte Zeit bei einer Zelluntersuchung gegenüber bisherigen Verfahren verkürzt werden kann; außerdem soll das übrige Zellmaterial bei der Aufbereitung der Mitosen nicht in Mitleidenschaft gezogen werden.

Diese A.ufgabe ist für ein Verfahren gemäß der Erfindung durch die im ersten Patentanspruch angegebenen Verfahrensschritte gelöst; eine Einrichtung gemäß der Erfindung zur Durchführung dieses Verfahrens ist im Patentanspruch 2 beschrieben.

Gemäß der Erfindung werden bereits zu der Zeit in der sich die ersten Zeilen teilen und Mitosen bilden, diese Mitosen mit Hilfe einer Mikropipette aus dem Gewebekulturgefäß abgesaugt und zur weiteren Aufbereitung in eine Präparationseinrichtung überführt. In der Präparaiionseinrichtung werden die Mitosen in eine hypotone Lösung gegeben, z. B. Kaliumchlorid oder destilliertes Wasser, und dort vorzugsweise bei Körpertemperatur während einer Zeitspanne zwischen 10 bis 40 Minuten gehalten. In dieser Zeit quellen die Mitosen

in auf, die anschließend durch Einleiten einer Fixationslösung, z. B. einer Mischung aus Methanol und Eisessig im Verhältnis 3:1, abgetötet werden. Der erwähnte sogenannte hypotone Schock und das Abtöten der Mitosen kann z. B. in einer Pipette erfolgen. Die Mitosen sinken in der senkrecht gehaltenen Pipette nach unten und lagern sich in der Nähe der Austropföffnung der Pipette an. Aus der Pipette wird nun ein Tropfen auf einen Objektträger für die anschließende mikroskopische Untersuchung gebracht.

■to Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung können bereits einzelne Mitosen, die in dem Gewebekulturgefäß entstehen, für eine Analyse aufbereitet werden. Es braucht demnach nicht abgewartet zu werden, bis eine für bisherige Aufbereitungsverfahren genügend hohe Anzahl von Mitosen in der Zellkultur vorhanden ist. Aufgrund dieser Aufbearbeitung des Zellmaterials kann die Enddiagnose wesentlich früher als bisher bei Anwendung herkömmlicher Aufbereitungsmethoden gestellt werden; der Zeitgewinn beläuft sich im Mittel

so auf etwa eine Woche, da bei einem Verfahren gemäß der Erfindung sofort nach Einsetzen von Zellteilungen Mitosen für die Präparation und anschließende Analyse gesammelt werden können, während bei herkömmlichen Methoden für eine erfolgversprechende Analyse mehrere Tage nach Beginn der Zellteilung abgewartet werden müssen, bevor das ZeHmaterial aufbereitet werden kann.

Ein weiterer Vor'.eil bei einer Methode gemäß der Erfindung liegt darin, daß bei der Präparation der Zellen in Metaphase das außerdem vorhandene Zelimäterial nicht in Mitleidenschaft gezogen wird; d!e.';es Zellmaterial kann demnach ungestört weiterwachsen und weiter Mitosen produzieren und selbstverständlich auch zu anderen Zelluntersuci/jngen herangezogen werden. Die aus dem Gewebekulturgefäß bei Pipettierung abgezogene Flüssigkeitsmenge kann durch eine sterile Nährlösung ständig ergänzt werden. Mit einem Verfahren und einer Einrichtung gemäß

der Erfindung können die etwa für eine Chromosomenuntersuchung benötigten, sich in Zellteilung befindenden Zellen gezielt gesammelt und für die anschließende Analyse präpariert werden. Diese Selektion ermöglicht auch, daß die für die Präparation notwendigen s Arbeitsschritte weitgehend automatisiert werden können. Als einzige manuelle Tätigkeit verbleibt das selektive Einsammeln einer oder mehrerer Mitosen mittels einer Mikropipette, die über einen Mikromanipulator gesteuert wird. Die Mikropipette und die von ι ο dieser einzusaugenden Mitosen in dem Zellmaterial werden über ein stark vergrößertes Invertoskop beobachtet. Die Mitosen erscheinen unter dem Invertoskop als runde glasartige Kügelchen mit einem scharf kontrastierenden Rand, sind also in der Regel für den Beobachter gut zu erkennen.

Nach dem Einsaugen einer Mitose in die Mikropipette kann die Zeile im Prinzip nach zwei Methoden weiterbearbeitet werden.

Entweder wird die Mikropipette von dem Mikromanipulator entfernt und in eine separate Präparationseinrichtung eingesetzt. In dieser wird die Mikropipette automatisch über mehrere Stationen geführt. In der ersten Station wird in die Mikropipette, wie oben beschrieben, eine hypotone Lösung eingesaugt, in der die Mitosen quellen. In einer zweiten Station werden die Mitosen in einer Methanol-Eisessig-Mischung abgetötet und schließlich in einer dritten Station auf einen Objektträger tropfenweise aufgebracht. Das Abtöten bzw. Fixieren der Mitosen kann auch auf den Jo Objektträgern erfolgen, indem den die Mitose oder die Mitosen enthaltenen Tropfen ein Tropfenfixationsmittel beigemengt wird.

Eine andere Möglichkeit der Aufbereitung besteht darin, die in der Pipette eingesaugten Mitosen Ober eine Verbindungsleitung, im allgemeinen einen sehr dünnen Schlauch in eine Präparationseinrichtung zu saugen, in der dann die eingesaugten Mitosen wie erläutert aufbereitet werden und anschließend auf einen Objektträger aufgebracht werden. *o

Unabhängig von dem angewendeten Prinzip können diese Schritte für die Aufbereitung der Zellen vollständig automatisiert werden.

Weitere Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen in Verbindung mit der +5 nachfolgenden Beschreibung hervor, in der zwei Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnung näher erläutert sind. In der Zeichnung stellt dar

Fig. 1 eine Prinzipdarstellung einer Einrichtung zum Sammeln von Zellen, in Teilung (Mitosen) mit einer Mikropipette gemäß der Erfindung;

F i g. 2A und 2B Darstellungen zur Erläuterung des Einsaugens einer Mitose in die Mikropipette;

Fig.3 eine schematische Gesamtdarstellung einer automatisierten Einrichtung zum Präparieren von Mitosen gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung;

Fig.4 eine schematische Darstellung der einzelnen Präparationsschritte in der Einrichtung gemäß F i g. 3;

F i g. 5 eine automatisierte Einrichtung zum Ausfüh- «> ren der in F i g. 4 gezeigten Präparationsschritte;

Fig.6 eine Darstellung einer automatisierten Einrichtung zum Präparieren von Mitosen gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung.

in einer Perri-Schaie 1 ist Fruchtwasser mit lebendem Zellmaterial 2 enthalten, das in einer Nährlösung 3 bei einer Temperatur von etwa 37'C angezüchtet wird. Nach einer Kulturdauer von etwa drei Tagen beginnen sich einzelne Zellen des Zellmaterials zu teilen. Diese Zellen haben in der sogenannten Metaphase etwa kugelförmige Gestalt und heben sich von aem übrigen Zellmaterial hierdurch ab; diese Mitosen sind in F i g. 2 mit 4 bezeichnet.

In die Petri-Schale 1 wird nun eine Mikropipette 5 eingeführt, die mit Silikonöl steril präpariert ist und deren öffnung an der vorderen Spitze etwa einen Durchmesser zwischen 20 und 60 μ aufweist. Die Mikropipette 5 ist in einem Mikromanipulator 6 gehalten und kann mit diesem Mikromanipulator in allen drei Raumrichtungen beliebig bewegt werden. Derartige Mikromanipulatoren sind bekannt und brauchen deshalb hier nicht näher beschrieben zu werden. Mit dem hinteren Ende der Pipette 5 ist ein Schlauch 7 verbunden, der zu einer regulierbaren Pumpe 8 führt. Diese Pumpe ist eine Schlauch- bzw. Peristaltik-Pumpe. Derartige Pumpen werdenjn der Medizintechnik zur Förderung empfindlicher Flüssigkeiten, z. B. von Blutplasma, eingesetzt und sind bekannt, so daß sie hier nicht näher beschrieben zu werden brauchen. Anstelle einer Schlauch- bzw. Peristaltik-Pumpe kann selbstverständlich eine andere Saugvorrichtung eingesetzt werden.

Die Bewegungen der Mikropipette 5 werden über ein stark vergrößerndes optisches System, in diesem Falle ein Invertoskop 9 mit etwa 60facher Vergrößerung visuell beobachtet und entsprechend gesteuert.

In den F i g. 2A und 2B sind zwei über das Invertoskop aufgenommene Bilder dargestellt. In diesen Figuren sind neben sonstigem fur folgende Untersuchungen nicht interessierendem Zellmaterial zwei Mitosen 4 erkennbar. Eine der Mitosen befindet sich direkt vor der öffnung an der vorderen Spitze der Mikropipette 5. Nachdem die Mikropipette über den Mikromanipulator in diese Position gebracht worden ist, wird die Pumpe 8 angestellt, so däS, wie in F i g. 28 gezeigt, die Mitose in die Mikropipette eingesaugt wird. Sobald dies geschehen ist. kann die Pumpe 8 vorerst abgeschaltet werden.

Anschließend daran können auf die gleiche Weise noch weitere Mitosen aus der Petri-Schale 1 gesammelt werden. Die einzige gesammelte Zelle oder auch mehrere gesammelte Zellen werden anschließend weiterverarbeitet. Dies geschieht in einer Einrichtung gemäß den Fig.3 und 4 bzw. in einer Einrichtung gemäß der F i g. 5; beide Einrichtungen sind weitgehend automatisiert.

Wie aus Fig.3 hervorgeht, ist das hintere Ende der Mikropipette 5 mit einem Schlauch 7 verbunden, der über eine Präparationseinrichtung 11 zu der erwähnten Pumpe 8 führt. Der Auslaß der Pumpe 8 endet in einem Auffang-Reservoir 12, in dem die mit den Mitosen abgezogene Nährlösung aus der Petri-Schale aufgefangen wird.

Die Präparationseinrichtung 11 ist näher in Fig.4 dargestellt Der Schlauch 7 ist in der Präparationseinrichtung 11 über eine kurze Strecke durch ein Glasrohr 13 unterbrecher«. In dem Glasrohr 13 ist eine Abzweigungsleitung 14 vorgesehen, deren aus dem Glasrohr 13 herausragendes Ende einen konischen Sitz 15 aufweist und durch einen schematisch dargestellten Deckel 16 abschließbar ist In den konischen Sitz 15 der Abzweigungsleitung 14 ist die vordere Spitze einer Glaspipette 17 einsetzbar, deren oberes Ende über einen VerbindiHigsschiauch i8 mit einer nur schematisch dargestellten zweiten Schlauchpumpe 19 verbunden ist

Zwischen dem von der Mikropipette 5 kommenden Schlauch 7 und der Abzweigungsleitung 14 ist an dem

Glasrohr 13 noch ein Sensor 21 vorgesehen, in diesem Falle eine Lichtschranke aus Lichtsender und Lichtempfänger. Mit dom Sensor 21 kann festgestellt werden, wann sich eine Mitose 4 an dem Sensor in dem Glasrohr 13 vorbeibewegt.

In Fig.4 sind sechs Stellungen I bis VI der G ^pipette 17 dargestellt, in der die mit der Mikropipette 5 angesaugten Mitosen 4 behandelt werden.

Anfangs befindet sich die Glasppette in der Stellung I. Die Abzweigungsleitung 14 ist durch den Abschlußdeckel 16 abgeschlossen.

Falls eine Mitose 4 aus dem Petri-Gefäß mit der Mikropipette 5 eingesaugt worden ist, wird die Schlauchpumpe 8 so lange betätigt, bis durch den Sensor is 21 festgestellt worden ist, daß sich die eingesaugte Mitose 4 durch die Lichtschranke bewegt hat. Darauf wird automatisch dis Pumps S abgestellt, so dsß die Mitose nicht weiter transportiert wird, daraufhin der Abschlußdeckel 16 von der Abzweigungsleitung 14 entfernt und die Glaspipette durch einen hier nicht dargestellten Stellmotor in Richtung der gebogenen Bahn P1 aus der Stellung I gemäß F i g. 4 in die Stellung II gebracht, in der die vordere Spitze der Glaspipette 17 in den konischen Sitz 15 der Abzweigungsleitung 14 eingreift Anschließend wird die Saugpumpe 19, in der Regel wiederum eine regulierbare Schlauchpumpe, für eine bestimmte Zeit eingeschaltet. Während dieser Zeit wird aus dem Glasrohr 13 Ober die A' »weigungsleitung 14 ein bestimmtes FlQssigkeitsvolumen in die Glaspipette 17 eingesogen, wobei dieses Flüssigkeitsvolumen so berechnet ist, daß sich die mit dem Sensor 21 erfaßte Mitose 4 auf jeden Fall in der Glaspipette 17 befindet.

Die Glaspipette wird danach aus dem konischen Sitz 15 gehoben, und dieser durch den Abschlußdeckel 16 abgeschlossen.

Die Glaspipette 17 wird dann durch den Stellantrieb in die Position III geführt, in der sie sich über einem Gefäß 22 mit einer hypotonen Lösung befindet. Diese *o Bewegung erfolgt längs des schematischen Pfeiles P 2. Aus dem Gefäß 22 wird eine bestimmte Menge, in der Größenordnung zwischen 50 und 500 μΐ hypotoner Lösung in die Glaspipette 17 eingesaugt Die Glaspipette 17 wird danach aus dem Gefäß zurückgezogen und *5 bei einer Temperatur von etwa 37° C während 10 bis 40 Minuten in der Stellung III gehalten.

Anschließend wird die Glaspipette in ein Gefäß 23 mit eisgekühltem Fixationsmittel eingetaucht Das Fixationsmittel besteht aus einer Mischung von so Methanol und Eisessig im Verhältnis von 3:1. Eine definierte Menge in der Größenordnung von 200 bis 800 μΙ wird mit einer durch die Pumpe 19 vorgegebenen und einstellbaren Geschwindigkeit in die Pipette eingesaugt Die Glaspipette 17 wird danach aus dem Fixationsmittel zurückgezogen und in die Stellung V gebracht, in der sie sich über einem Objektträger 24 befindet Nach einer bestimmten, ebenfalls einstellbaren Fixationszeit.in der sich die präparierten Mitosen am vorderen Ende der Glaspipette 17 gesammelt haben, werden ein oder mehrere Tropfen des Pipetteninhaltes auf einen Objektträger 24 aufgetropft; die Objektträger werden dann in an sich bekannter Weise weiterbehandelt und zur Chromosomenanalyse verwendet

Die Glaspipette 17 wird danach in Stellung VI über ein Reinigungsgefäß 25 gebracht, in der die Pipette vollständig entleert und mehrfach mit einem Reinigungsmittel, z. B. destilliertem Wasser, gespült wird. Die gereinigte Glaspipette 17 wird danach wieder in die Stellung 1 überführt.

Die dargestellten und erläuterten Positionen I bis Vl der Glaspipette können z. B. mittels einer in F i g. 5 gezeigten Einrichtung automatisiert werden. Diese Präparationseinrichtung 11 weist einen Sockel 26 auf, auf dessen Oberseite ein um seine Standachse drehbarer Revolverkopf 27 steht. Die Stand- und Drehachse des Revolverkopfes trägt etwa in ihrer Mitte eine Aufnahmeplatte 28 mit sechs Halteöffnungen 29 für Glaspipetten 17. In eine dieser öffnungen wird eine Pipette eingesetzt, deren oberes Ende über den Schlauch 18 mit der auf dem oberen Ende der Revolverdrehachse angeordneten Pumpe 19 verbunden ist.

Sobald, wie oben beschrieben, mit dem Sensor 21 eine Zelle in Teilung festgestellt und die Pumpe 8 aHcTACfholtAf ivr\rA&n ict \uirA Hin Pir»*»tt<» 17 mit Hpm —~_e—........ .. _v....... .«., ...... .... . ._r.... .. ..... »....

Revolverkopf in diejenige der sechs möglichen Stellungen gebracht, in der sie direkt über dem konischen Sitz 15 der Abzweigungsleitung steht. Danach wird der Revolverkopf 27 abgesenkt, bis die Pipette auf diesem Sitz aufsitzt. Anschließend wird die Pumpe 19 eingeschaltet. Nach Einsaugen der bestimmten Flüssigkeitsmenge und Abschalten der Pumpe wird der Revolverkopf angehoben und automatisch in die nächste Position gedreht, in der sich die Pipette oberhalb des Behälters 22 mit der hypotonischen Lösung befindet Nach Absenken des Revolverkopfes wird die erwähnte Lösungsmenge angesaugt und die Pipette wieder hochgehoben. Durch eine entsprechende Steuerung können so alle in F i g. 4 gezeigten Positionen automatisch durchfahren werden. Selbstverständlich können in der gezeigten automatisierten Einrichtung auch mehr als nur eine Glaspipette behandelt werden; hierzu müßte die Pumpe 19 durch mehrere Pumpen ersetzt werden, die dann etwa in dem Sockel 26 der Einrichtung angeordnet würden, während an dem oberen Ende der Drehachse des Revolverkopfes ein entsprechender Verteiler vorzusehen wäre.

In Fig.6 ist eine Präparationseinrichtung in Form einer kompakten Baueinheit 11' dargestellt. Die in Teilung befindlichen Zellen in dem Petri-Gefäß 1 werden, wie zu Fig. 1 erläutert, mit der Mikropipette 5' gesammelt so daß sich in dieser anschließend eine oder mehrere Mitosen befinden. Die Pipette ist über einen Schlauch T mit einer Pumpe verbunden, die den oben erwähnten Pumpen 8 oder 19 entspricht

Die Präparationseinrichtung 11' ist als kompaktes Tischgerät mit etwa L-förmigem Querschnitt ausgebildet An der Hochseite des Tischgerätes ist ein horizontal verfahrbarer Mikropipettenhalter 32 vorgesehen. Dieser Mikropipettenhalter 32 ist längs einer horizontalen Schiene 33 verschiebbar; außerdem sind mehrere, in diesem Falle entsprechend der Anzahl der Präparationsschritte drei Abzweigungsschienen 34 vorgesehen, die senkrecht zu der Schiene 33 verlaufen.

Nachdem ein oder mehrere Mitosen in die Mikropipette 5' nach dem obengenannten Verfahren eingesaugt worden sind, wird die Pipette 5' in die Halterung 32 eingesetzt Der Verbindungsschlauch T ist hierbei entweder ständig mit der Präparationseinheit 11' verbunden; ebenso ist es möglich, daß die Mikropipette 5' z. B. von der Pumpe für das Einsaugen der Mitosen in die Mikropipette nach dem Einsaugen getrennt wird.

Nach dem Einsetzen der Mikropipette 5' in den Pipettenhalter 32 wird dieser längs der horizontalen Schiene 33 bis zur ersten Abzweigungsschiene 34

geführt. In dieser Stellung befindet sich die Mikropipette 5' direkt oberhalb eines in der Grundplatte der Präparationseinrichtung ti' eingelassenen Gefäßes 22' mit einer hypotonen Lösung. Die Pipette 5' wird in diesen Behälter 22' eingetaucht, indem der Pipettenhalter 32 in die Abzweigungsschiene 34 einläuft.

Nach Ansaugen einer bestimmten Menge der hypotonen Lösung in die Pipette wird diese aus dem Behälter 22' herausgehoben und nach einer gewissen Einwirkzeit längs der zweiten Abzweigungsschiene 34 in einen Behälter 23' mit eisgekühltem Fixationsmittel eingetaucht. Aus diesem Behälter 23' wird eine bestimmte Menge von Fixationsmittel in die Pipette 5' eingezogen, worauf die Pipette aus dem Behälter 23' herausgehoben wird.

Nach einer gewissen Fixationszeit. während der sich die abgetöteten Zellen in der Pipette nahe deren Spitze

absetzen, wird der Pipettenhalter 32 über einen Objektträger 24 geführt und dort in die dritte Abzweigungsschiene eingefahren. Danach wird ein Tropfen der Pipettenlösung auf den Träger aufgetropft und dieser dann, wie oben erläutert, zur Analyse wei'er verwendet.

Die Objektträger 24' sind in einem Vorratsfach 36 in dem horizontalen Schenkel der Präparationseinrichtung It' enthalten, so daß nach Betropfung eines Objektträgers mit Pipettenlösung sofort ein zweiter Objektträger zur Verfügung steht.

Mit einem Verfahren und einer Einrichtung gemäß der Erfindung können Mitosen bereits etwa 4 bis 8 Tage nach Beginn der Zellanzüchtung zur weiteren Zelluntersuchung präpariert werden. Damit ergibt sich gegenüber herkömmlichen Methoden ein Zeitvorrang von ungefähr einer Woche.

Hierzu 3 Biaii Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Präparation von in Teilung vorliegenden Zellen für die Chromosomenanalyse von durch Amniozentese (Fruchtblasenpunktierung) gewonnenen Zellen eines Fetus in der Pränataldiagnostik, wobei die lebenden Zellen in einem Gewebekulturgefäß in einer Nährflüssigkeit zur Teilung gebracht, anschließend in diesem Teilungszustand fixiert, mit Hilfe einer Mikropipette erfaßt und für eine Zelluntersuchung bereitgestellt werden, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte: