JPH09509328A

JPH09509328A - 出生前遺伝子解析における使用のための母体循環における胎児幹細胞の相違する拡大

Info

Publication number: JPH09509328A
Application number: JP7525227A
Authority: JP
Inventors: ブランチェピー．アルター，
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1994-03-25
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 1997-09-22
Anticipated expiration: 2015-01-11
Also published as: AU684935B2; MXPA96004278A; WO1995026507A1; US5580724A; JP2996513B2; ES2111401T3; EP0752104A1; AU2229895A; DE69501326D1; CA2186366C; CA2186366A1; DE69501326T2; EP0752104B1

Abstract

(57)【要約】本発明の方法は、妊娠女性の血液および胎児細胞の増幅を用いて、胎児のスペースを侵襲することのない出生前診断を容易にする。この方法は、羊水穿刺または絨毛膜絨毛サンプリングよりも侵襲性が少なくかつ簡単である。なぜなら、胎児細胞サンプルを得るために母体から血液を取る工程のみ包含するからである。調べられている公知の分子変異を有する特定の疾患がある場合、このサンプルからの細胞は、胎児物質について富化されるDNAの供給源である。この疾患が赤血球に関連する場合、この方法は分析用の胎児赤血球細胞を提供する。この疾患は白血球に関連する場合、種々のサイトカインが胎児白血球を選択的に生成するために用いられ得る。特定の診断危険性（例えば、母体の高齢）のない異常染色体パターンが調べられている場合、この培養方法は胎児起源の細胞を分割する工程を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】出生前遺伝子解析における使用のための母体循環における胎児幹細胞の相違する拡大発明の背景本発明は、遺伝子病の出生前診断を目的とする胎児細胞の非侵襲性サンプリングに関する。他により提案された候補細胞は、白血球、赤血球様細胞、およびトロホブラストを含む。第１または第２トリメスターに母体の循環中に入り込む胎児血液量は、中期トリメスター(midtrimester)までは１日当たり２μlまたは合計で50〜200μlと見積もられる（Parksら）。他の見積りでは、約1/50,000の細胞が胎児性であると示唆される（Schroderら）。最近の研究により、この比は妊娠15週で1/144,000から妊娠後期の1/4,000まで増加することが決定された（Hama daら）。本明細書で使用する略号を以下に示す： BFU-E バースト形成単位-赤血球様 BPA バースト促進活性 BSA ウシ血清アルブミン CFU-E コロニー形成単位-赤血球様 Ep エリスロポエチン FACS 蛍光活性化細胞選択 FCS ウシ胎児血清 FISH 蛍光インサイチュハイブリダイゼーション GM-CSF 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 GPA グリコホリンＡ Hb ヘモグロビン IL-3 インターロイキン-3 IL-6 インターロイキン-6 MACS 磁気活性化細胞選択 MNC 単核細胞 mRNA メッセンジャーリボ核酸 PCR ポリメラーゼ連鎖反応 RT-PCR 逆転写PCR SCF 幹細胞因子(stem cell factor) TFR トランスフェリンレセプター TSPR トロンボスポンジンレセプター Zipurskyらは、胎児ヘモグロビンに対するKleihauer-Betke染色を用いて、母体の循環中の胎児赤血球（送達の直後ではあるが）を最初に示した（Zipursky 〜10％において50,000個の母体細胞あたり１個より多い胎児細胞が存在すること CS)を用いて、すべてのRh D^- ABO適合母親の血液中に1:4,000から1:80,000の範囲の頻度（200μlの胎児血液に対応）でRh D⁺赤血球を発見した（Parksら）。母体の血液中の胎児赤芽球（および網状赤血球）は、Bianchiら(1990)により、トランスフェリンレセプター(TFR)に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞選択(FACS)を使用して妊娠16週程度の初期に同定された。Priceらは、グリコホリンＡ(GPA)に対する抗体の添加ならびに細胞のサイズ（前方光散乱）および粒度（側方散乱）に従う選別によりその富化を増強した。彼らは、ＸおよびＹ染色体に対するマーカーを用いたインサイチュハイブリダイゼーションを使用し、10⁷個の母体細胞当たり１個の胎児有核赤血球から10〜20細胞当たり１個に胞選択(MACS)はFACSより迅速であることを示唆したが、TFRに対する抗体は、有核胎児細胞の富化に対して効率的でないことを発見した。なぜなら、多くの赤芽球は反応性がなく、多くの網状赤血球（胎児性および母体性）はTFR-陽性であったからである。Bianchiら(1993)は、次いでTFR、GPA、およびトロンボスポンジンレセプター(TSPR)に対する抗体を組み合わせて、GPAが胎児有核細胞の回収に最も重要なマーカーであることを発見した。TFRおよびGPAを用いた多くの分析は、胎児／母体細胞の最終的な比率を決定しなかった；それらは、サザンブロットに対するDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅あるいは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)のいずれかを使用して雄性細胞または胎児異数性を検出した。妊娠母親血液中の胎児白血球の存在は、リンパ球の0.2〜１％におけるXY核型の検出に基づいて、Walknowskaらによって1969年ころには示唆されていた。分裂間期の細胞におけるＹ染色体またはＹ蛍光について試験した同様の研究において、胎児リンパ球は約0.1〜１％含まれた（Schroderら、1972；De Grouchyら；Sch roderら、1975；Grossetら；Siebersら；およびKirsch-Voldersら）。Herzenber gらはFACSを用いて、父系のHLA型について選別し、1,000個の選別された細胞当たり３個の出現率でＹ-陽性細胞を見出した；同グループによるより大規模な研究により、1/800〜1/60,000の出現率を見出した（Iversonら）。１つのグループは、α-フェトプロテインについて母体の単核細胞(MNC)を染色し、1/1,000の陽性細胞を発見した（Kulozikら）。Nakagomeらは、未分離の母体細胞由来のY DNA のPCR増幅を用いて、陽性のものがないことを見出した、このことは、胎児細胞は、1/25,000母体細胞より少ないことを示した。しかし、Kaoらは、このアプローチにより男性胎児を正しく同定でき、そして２個の胎児細胞で充分であることを示した。Loらは、２組のＹ-特異的プライマーを用いたネステッドPCRを用いて、300,000雌性細胞中の１個の雄性細胞を発見できた。より初期の雄性妊娠(male pregnacies)由来の残りのリンパ球の可能性を避けるために、Wessmanらは、抗M y7を用いて、母体単核細胞のサイトスピンスライド(cytospin slide)の顆粒球を同定し、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて約0.1％がY⁺であることを発見した。従って、母体血液中の胎児白血球の検出感度は広く変化し、恐らくアッセイ方法、富化方法、および妊娠年齢に依存する；特異性もまた変化し、ほとんどの報告には、偽陰性および偽陽性が含まれている。探された別の細胞タイプはトロホブラストで、これはモノクローナル抗体H315 で識別され得る（Covoneら、1984、およびMuellerら）。しかし、H315-陽性細胞は、非妊娠女性で見出され（Poolら）、そして非トロホブラスト細胞がこの抗原を吸収し得る（Covoneら、1988）ことが一致した見解である。確かに、Bruchらは、トロホブラストに対する３つのモノクローナル抗体で選別される陽性細胞は白血球の形態を有することを報告した。Cacheuxらは、モノクローナル抗体および磁気ビーズを用いて母体のリンパ球を涸渇させ、次いでトロホブラスト抗体およびFACSを用いた；1,000個の回収された細胞の４％がFISHでY-陽性であった。細胞分離の主要な方法は、モノクローナル抗体を用いる標識、およびFACS、ダイナール(Dynal)磁気ビーズまたは微小磁気ビーズ(MACS)を用いる分離を含んでいる。分離後、得られた半精製細胞を、次いで特定の遺伝子または染色体のPCR 増幅またはインサイチュハイブリダイゼーション用いて、または分裂中期の標準核型判定により試験する。発明の要旨本発明の方法は、妊娠した女性の血液および胎児細胞増幅を用いて、胎児のスペースを侵襲することなく出生前の診断を容易にする。本方法は、羊水穿刺または絨毛膜の絨毛サンプリングより、侵襲性が少なく簡便である。なぜなら、母親から血液を抜き取り、胎児細胞サンプルを得ることのみを含むからである。既知の分子変異を伴う特定の疾病を探す場合、サンプルからの細胞は、胎児物質を富化したDNAの供給源である。疾患が、赤血球の関与する疾患である場合、本方法は分析のための胎児赤血球を提供する。疾患に白血球が関与する場合、異なるサイトカインを用いて、胎児白血球を選択的に産生し得る。特定の診断上の危険（例えば、母体の高齢）を伴わない異常な染色体パターンを探す場合、培養方法は、胎児起源の分割中の細胞を提供する。目的は胎児の性決定と単純であるが、本発明を最適に効果的に使用する際には幾つかの問題が生じる。現在の技術において公知であるように、分子マーカーが利用可能である場合、DNA分析は最も容易に行われる。胎児幹細胞は母体の循環中へ不十分ながら漏れ得る。胎児は循環中の幹細胞数の減少を生じる内因性の造血性疾患を有し得る。母親は、鎌状赤血球症のような血液学的疾患を有し得、それによって母親自身の幹細胞が拡大し、そして胎児幹細胞の選択的増殖優位が阻害される。図面の簡単な説明図１は、赤血球形成のスキームである；始原細胞は、インビトロアッセイにより定義され、一方、前駆体および子孫は、骨髄および血液において形態学的に同定可能である。図2Aは、CFU-E由来のコロニーを示す。図2Bは、１つのBFU-E由来のバースト（burst）を示す。図3A、図3B、および図3Cは、胎児、新生乳児、および成人由来の血液BFU-E由来コロニーのエリスロポエチン用量反応曲線を示す。データを、最大成育のパーセンテージとして規格化した。白ヌキの符号の各々の曲線は、異なるドナーを表し、そして各々の点は、３連の培養（triplicate cultures）の平均値である。黒ヌリの符号の曲線は、全ての曲線の平均値を表す。図3A、胎児。図3B、新生児。図3C、成人。（Weinbergら、1992）。図4A、図4B、図4C、および図4Dは、胎児、新生乳児、および成人由来の血液赤血球様始原細胞の成育ポテンシャルを示す。図4Aおよび図4Cは、13日目のデータである；図4Bおよび図4Dは、成育がピークである日のデータである。図4Aおよび図4Bにおいて、データは、コロニー/（プレートした100,000細胞）として表されている。図4Cおよび図4Dにおいて、データは、BFU-E/mL血液として表されている。白ヌキの符号は、個々の実験を表す；黒ヌリの符号は、平均±１SDを表す。（ Weinbergら、1992）。図5A、図5B、図5C、および図5Dは、液体培養における赤血球様分化の形態学を示す。全てのスライドを、ベンジジンWright-Giemsaで染色した（本来の拡大率の1,000倍）。図5A、培養前０日目の単核細胞。図5B、７日後の培養物の第一相から回収した細胞。図5C、ヘモグロビン化赤芽球は、Epを有する第二相において７日後に現れる。図5D、Epを有する第二相において14日後に回収した成熟赤芽球および赤血球。Weinbergら、1993より。図６は、液体培養物中に100,00個の血液単核細胞をプレートした後に回収された細胞数を示す。最初の７日間は、サイトカインなしで、一方、第２の14日間は、Ep、SCF、IL-3、およびIL-6を有した。左は新生児である。右は成人である。斜線が引かれている棒は、ヘモグロビン化（多染性および正染性）赤芽球である。２重斜線が引かれている棒は、赤血球である。白ヌキ棒は、他の有核細胞（白血球および非ヘモグロビン化赤芽球）である。成人実験における２倍未満と比較して、新生児培養における細胞数の80倍以上の増幅に留意のこと。好適な実施態様の詳細な説明本発明は、胎児の造血性始原細胞細胞を富化させる新規のアプローチに関する。いくつかの研究は、胎児の始原細胞が、成人の始原細胞と異なることを示している（Weinbergら、1992；Forestierら）。母体の血液から得られた単核細胞の培養物は、培養の条件の操作により、成人子孫に対する胎児子孫の比率を改善するために用いられる。本発明者の以前の研究は、胎児、新生児、および成人赤血球様始原細胞細胞間に有益な差異が存在し得ることを示している。母体の血液における胎児幹細胞の存在は、本発明の重要な局面である。 Genetics Institute，Inc．（87 Cambridge Park Drive，Cambridge MA 02140 ）によりIL-6が提供された。Amgen，Inc．（Amgen Center，1840 Dehavilland D rive，Thousand Oaks CA 91320-1789）によりSCFが提供された。Immunex（51 Un iversity Street，Seattle WA 98101）によりIL-3が提供された。多能性幹細胞は、循環において存在する場合、成人においてこの胎児成分を見出すことが非常に難しい、低い比率で存在する。用語「始原細胞」は、特定の系統に決定づけられており、そして形態学的に識別可能でないが、それらの子孫により同定される細胞に用いる（図１）。最も初期の赤血球様細胞は、BFU-E（バースト形成単位−赤血球様）と呼ばれる（Axelrad）。血液または骨髄単核細胞を、Ficoll-hypaqueでの遠心分離後の低密度画分を回収することにより単離し、そしてエリスロポエチン（Ep）＋ウシ胎児血清を含むメチルセルロースまたは血漿血塊、またはバースト促進活性（BPA）（例えば、インターロイキン-3（IL-3 ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)）を含む、規定無血清培地中で培養する。現在用いられる方法は、Weinbergら(1983)に詳細に記載されている。約14日後、ヘモグロビン化赤芽球のいくつかのサブコロニーを有する大きなコロニーを、容易に同定し得る。より成熟した始原細胞CFU-E（コロニー形成単位−赤血球様）はEpを必要とし、そして８〜132の赤芽球を含有する小さなコロニーに７〜８日間内に発達する（図２）。「前駆体」は始原細胞よりも成熟しており、そして培養することなく形態学的に同定可能である。赤血球系列において、これらは、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、および正染性赤芽球を包含する。次いでこれらは、脱核する。従って、もはやDNAを含有しない。しかし、網状赤血球はグロビンRNAを含有し、異常血色素症の診断に用いられ得る。表１は、赤血球形成の種々の段階に対するいくつかの特定マーカー（通常、表面抗原；Sieffら；Lokenら；Okumuraら；Papayannopoulouら）を概説する。マーカーは、表面膜抗原である。Kit＝c-kit。 TFR−トランスフェリンレセプター。TSPR＝トロンボスポンジンレセプター。GPA＝グリコホリンＡ。Hb＝ヘモグロビン。これらの抗原は、通常胎児細胞を成人細胞と区別しない。そしてそれ故これらの抗原に対するモノクローナル抗体の母体の単核細胞との使用は、特定のカテゴリーのみを規定するために役立つ；この区画への胎児の寄与が相対的に過剰である場合は（例えば、赤芽球）、胎児細胞についての部分的な選択が達成され得る。CD34は、最も初期の幹細胞および始原細胞を同定するが、CD34は始原細胞が成熟するときに失われる。CD33は幹細胞段階の後に出現するが、CFU-Eのレベルにより消失する。c-kitチロシンキナーゼレセプターは初期に存在し、そしてまたB FU-Eの後に減少する。BFU-E後期に出現するマーカー（CFU-Eおよび赤芽球を特徴付け、そして網状赤血球上に持続する）は、トランスフェリンレセプターおよびトロンボスポンジンレセプターを包含する。分化した赤血球形成のマーカーは、血液型抗原、グリコホリンＡ、グロビンRNAおよびグロビンタンパク質である。本発明は赤血球様始原細胞のレベルにおける差異（Weinbergら、1992; Forest ierら）および刺激感受性を利用する。１つのパラメーターはEp用量応答曲線により規定された（図３）。Epは胎児BFU-Eまたは成人BFU-Eの増殖に必要である。胎児BFU-Eは成人BFU-EよりもEpに感受性であり、Ep 1/2max（最大増殖の50%のために要求されるEp）は0.4 U/mLに比較して0.3 U/mLである（表２）。より無視できない観察は、胎児コロニーの20〜40%が0.01 U/mLのEp濃度で出現したが、成人コロニーの＜５%がこの低いEp濃度で増殖したことである。大部分の胎児培養物はEp＜２U/mLで最大増殖に達したが、大部分の成人培養物は≧２U/ mLを必要とした。従って、培養のために使用されるEp濃度の選択は、胎児赤血球様子孫の選択的な濃縮のために重要であり得る。胎児BFU-E由来のコロニーは、成人BFU-E由来のコロニーよりも大きく、サブコロニーがより多くそして総細胞がより多い。標準的な培養条件下では（Ep2U/mL 、14日）、平均で10倍多いBFU-Eが胎児血液中に存在し、これはプレートされた1 0⁵単核細胞あたりのBFU-E、または特に血液１mLあたりのBFU-E（なぜならMNC/mL 血液は胎児血液において成人血液よりも高いので）のいずれかで表される（表２および図４）。胎児コロニーはまたより大きいので、全体の相対的な増幅は実質的に10倍以上となる。成人培養物の大部分は最大増殖に達するために14日より多く要したが、胎児培養物の大部分はそれまでにプラトーに達していた。従って、母体の循環由来のMNCの培養は、成人子孫に比較して胎児子孫についての相対的な濃縮に導き得るようである。胎児始原細胞と成人始原細胞との間の別の明白な差異は、胎児コロニー中の赤芽球が優勢に胎児ヘモグロビンを合成することである；これは異常ヘモグロビン症の出生前診断および胎児子孫の同定のための潜在的な適用を有する。本発明はまた、個体発生の種々の段階でのBFU-E間のさらなる差異に関する。この目的のために、最初にFibachらによって記載された液体培養系を改変した（ Weinbergら、1993）。単核細胞を第１期において約７日間幹細胞因子（SCF）（赤血球形成の初期およびその後の段階で作用する近年記載されたサイトカイン（ McNieceら））の存在下で培養する。次いで、生じる核形成した細胞を第２期においてEp単独またはEpとSCFを用いてさらに７〜14日間（合計14〜21日間）再培養する。図５は、成人血液培養物由来の、第０日目の単核細胞、第７日目の細胞、および第14日目および第21日目の最終産物を示す。開始時および第７日目の細胞は主にリンパ球および単球であるが、終了結果は核形成赤血球様細胞および無核赤血球様細胞を含む。新生児由来の培養物を、成人血液由来の培養物と比較する。新生児細胞の最大最終増幅は８〜45倍であり、この50〜100%は赤血球様であった（表３）。成人培養物において、増幅は３〜５倍であり、60〜90%の赤血球様細胞を含有していた。メチルセルロースアッセイにおける新生児についての５〜10倍と胎児についての10倍を比較すると、この系において成人細胞より新生児の約10倍の相対的な有利性が存在する（表３）。複数の供給源の帯および成人細胞をSCFを含むおよび含まないまたはSCF、IL3 およびIL6の組み合わせを含む液体培地中で培養した（表４中の結果を参照のこと）。20〜40 mLの血液を、正常成人または正常小児の分娩後の臍帯から採集し、そしてNaヘパリンを含有する減圧式注射管（vacutainer tube）中に入れた。これを室温に置いてそして１時間以内に処理した。血液をα培地（Gibco）で１：１に希釈し、そしてFicoll-hypaque（Pharmacia）中に20 mlのFicollあたり20 〜25 mlの希釈した血液の割合で重層した。単核細胞（MNC）をFicoll-hypaque上の18℃、30分間、450×gでの遠心分離により単離した。血漿および培地を除去し、そしてMNCを含有する境界面層を20 mlの２%のウシ胎児血清（FCS）を含むα培地中に採集した。細胞を同じ条件で２回洗浄し、そして２% FCSを含むα培地中に再懸濁した。次いでMNCを５×10⁶/mlで７日間、10% FCS単独、または＋SCF 10 0ng/ml、または＋SCF（AMGEN）100 ng/ml＋IL-3（Immunex）100 ng/ml＋IL-6（G enetics Institute）100 u/mlを含むα培地（ペニシリン0.1 u/mlおよびストレプトマイシン0.1μg/lを含む）中で培養した。室内空気インキュベーター（room air incubator）は、高い湿度および５% CO₂を有した。次いで、非接着細胞をフラスコの緩やかな振盪の後、細胞を含有する培地の吸引および上記のような遠心分離により回収した。細胞を３×10⁵/mlで、30％ FCS、１%ウシ血清アルブミン（BSA）、10-⁴Mβ-メルカプトエタノール、ペニシリン0.1 u/mlおよびストレプトマイシン0.1μg/mlならびにSCF 100 ng/ml、IL-3 100 ng/ml、およびIL-6 100 u/mlを含むα培地中で再プレートした。インキュベーション物は、５% CO₂および室内空気または５%酸素のいずれかを有する加湿したインキュベーター中にあった。21日後、細胞を、フラスコの振盪および細胞を含有する培地の吸引により回収した。細胞をCoulter ZBI中で計数し、そして細胞遠心分離スライド（cytoc entrifuge slide）を作製してベンジジン-Wright's-Giemsaで染色した。液体培養アッセイについては、さらに最適化を行っている。サイトカイン（Ep 、SCF、IL-3、IL-6）の組合せを用いると、新生児細胞は80倍より多く増幅し、そして成人細胞の２倍未満であり、これは赤血球様系列の細胞の50％を超える（図６）。従って、成人細胞に対する新生児細胞の相対的な富化は、40倍を超える；より良好な増殖が胎児始原細胞から得られるべきである。条件は表４について記載したとおりであった。メチルセルロースまたは液体培養の可能な使用を表５に示す。培養および他の条件は表４について記載したとおりであった。 50mLの母体血液は、通常には少なくとも５×10⁷単核細胞を生じる。50,000母体細胞当たり１個の胎児細胞（赤血球またはリンパ球の検査から得た上記で概略した概算値に基づく）と仮定すると、1,000胎児単核細胞が存在する。10⁵成人MN C当たり20成人BFU-Eおよび10⁵胎児MNC当たり200胎児BFU-Eと仮定すると、10,000 成人バーストおよび２胎児バーストが存在する。バーストが平均して1,000細胞を有する場合（しかし胎児バーストはそれより多くを有する）、メチルセルロース培養物において、10⁷成人細胞当たり2,000胎児細胞より多くが存在する。すなわち、1/5,000より多い。しかし、液体培養系がより有用である。ここに記載の数は最少数である。５×10⁷成人MNCは最大４倍増幅され、２×10⁸成人細胞を生じ、一方、その中の1,000胎児MNCは、少なくとも100倍増幅され、10⁵胎児細胞を生じる。成人に対する胎児の割合は現在少なくとも1/2,000である。この場合の出発物質は1/50,000胎児／成人細胞であった。同じ容積の母体血液から、このように液体系はより多い数の胎児細胞を提供する。いくつかのタイプの操作が、表１に示したマーカーに基づいて、細胞を培養する前または後で用いられ得る。幹細胞および／または始原細胞は、CD34、CD33、 17F11、DR、またはCD71を用いて富化され得る。分離方法は、パンニング、磁気ビーズ、MACS、またはFACSであり得る。富化は、０日目、または培養初期の間のある時点でなされ得る。次のEp依存期の間に、細胞は回収され得、そしてCD71、 CD36、血液群抗原、またはGPAを用いて赤血球様系統について富化され得る。これらの分離手段のいずれもが胎児細胞／母体細胞の比を必ずしも変えるわけではないが、赤血球様細胞の総収率を増加させる。胎児起源の細胞についての選択的富化は、適切な父性血液群抗原、または胎児赤血球特徴に対する抗体を用いて行われ得る（例えば、胎児ヘモグロビンまたはｉ抗原、胎児赤血球に特異的な膜抗原）。培養物はまた、サイトカイン操作を用いて破裂され得る。これは、成人成育よりむしろ胎児成育に好都合である。このような条件は、低濃度のEp（Weinbergら、1992）、IL-6の添加（Gardnerら）、またはEp、SCF、IL-3、およびIL-6を包含する因子の組合せを包含する。母体循環中の胎児細胞を用いる出生前診断は、以下のようにして行われる：血液（50ml）を妊娠８〜20週の妊娠中の女性から採取する。MNCをFicoll-hypa que上の遠心分離により単離し、SCF 100ng/ml、IL-3 100ng/ml、およびIL-6 100 u/mlを用いて、10％ FCSを添加したα培地において７日間５×10⁶/mlで培養する。次いで非接着細胞を回収し、そしてSCF 100ng/ml、IL-3 100ng/ml、およびIL-6 100u/mlに加えて、30％ FCS、１％ BSA、10^-4Ｍ β-メルカプトエタノール、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したα培地において３×10⁵/ mlで再プレートする。全ての培養を５％ＣＯ₂、および室内大気または５％Ｏ₂のいずれかの加湿インキュベーター中で行う。21日後に、細胞を回収する。（１）細胞遠心分離スライドを２×10⁵細胞で作製し、そして（胎児ヘモグロビンの）γグロビンに対する蛍光抗体で染色し、次いで目的のDNA配列についてのプローブを用いてFISH分析を行う。これらは、Ｘ、Ｙ、および第13染色体、第 18染色体、および第21染色体を包含する。これらはまた、ファミリーにおいて欠失または増幅が生じている変異体であると知られる特定の遺伝子を包含する。（２）細胞を遠心分離し、そして標準的な方法を用いてDNAを抽出する。胎児が危険にさらされる変異遺伝子（単数または複数）に特異的なプローブを用いる PCR増幅を行うためである。（３）細胞をビンブラスチンで１時間処理して中期を阻止し、そして標準的な方法を細胞遺伝解析のためのスライドを調製するために用いる。（４）RNAを細胞から抽出し、グロビンまたは他の赤血球特異的タンパク質（例えば、スペクトリンまたは他の膜タンパク質、または赤血球酵素）についての RNAの逆転写PCRのために用いる。分析（１）だけが、胎児赤血球様細胞についての独特のマーカー、抗γグロビンを利用する。しかし、これは非常に強力なマーカーである。なぜなら、全く正常である胎児細胞の同定は、致命的な疾患を排除するに十分であり得るからである。胎児細胞が特に同定されない場合は、変異の検出ができないことが常に疑われる。分析（４）は、大量の赤血球様細胞の増殖を利用する。分析（２）は、胎児細胞の相対的増幅を利用する；PCRは、培養前の約1/50,00 0に比較して約1/2,000の胎児／成人比でより確実である。分析（３）はなお、非常に労力を要する方法を必要とするが、自動化中期細胞検出器（automated metaphase finder）によりこの分析を実行可能にする；多くの正常細胞の中でわずかな異常細胞が認められること（すなわち、1/2,000）を必要とする。上記手順を増強するために、他の方法が利用可能であり、始原細胞または幹細胞について富化して、第一期における培養に置く細胞数を減少させる。これは、ネガティブ選択（単球およびＴ細胞の除去）ならびにポジティブ選択（例えば、 CD34を用いる）により行われ得る。約７日目、初期赤血球様細胞の特徴を有する細胞が富化され得る(例えば、CD7 1)。約14日目または約21日目、例えば、CD71、CD36、および/またはGPAを用いて赤血球様細胞は富化され得る。これらの培養から生じる細胞は純粋な胎生ではないが、出発材料よりは比較的胎生であり、そして主にPCR、FISH、または核型分析のような非分離材料に対して用いられてきたのと同じ分析技術に供し得る。さらに、グロビンmRNAを回収し得、そして異常ヘモグロビン症の診断のためのRT-PCRに使用され得る。胎児由来の赤血球様細胞は胎児ヘモグロビンに対する蛍光抗体による染色により同定され得る。以下の参考文献は、上記の本文に挙げる理由により、本明細書において関連する部分で参考として援用される。本明細書に記載の内容を研究すれば、選択的増幅および分析を達成するために、以下の請求項の範囲の手順および刺激因子の等価な改変が同業者に公知であることはいうまでもない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を包含する、胎児細胞に富む細胞サンプルを母体の血液から得るためのプロセス：母体の血液サンプルから細胞を得る工程；少なくとも１つのサイトカインを母体の細胞よりも胎児細胞においてより大きい刺激効果を有する量で含む培地中で、該細胞をインキュベートすることにより、胎児細胞増殖を選択的に刺激して胎児細胞に富む細胞サンプルを生成する工程。２．以下の工程を包含する、出生前遺伝子解析のためのプロセス：母体の血液サンプルから細胞を得る工程；少なくとも１つのサイトカインを母体の細胞よりも胎児細胞においてより大きい刺激効果を有する量で含む培地中で、該細胞をインキュベートすることにより、胎児細胞増殖を選択的に刺激して胎児細胞に富む細胞サンプルを生成する工程；および遺伝子の内容または異常について胎児細胞を分析する工程。３．前記サイトカインが、エリスロポエチン、幹細胞因子、インターロイキン− ３、およびインターロイキン−６のうち少なくとも１つである、請求項１または２に記載のプロセス。４．前記少なくとも１つのサイトカインが、幹細胞因子、インターロイキン−３、およびインターロイキン−６の組み合わせである、請求項１または２に記載のプロセス。５．前記サイトカインの量が、約100ng/mlまたはそれより低い、請求項４に記載のプロセス。６．胎児細胞濃度が、胎児細胞抗原に特異的な抗体を用いることによりモニターされる、請求項１または２に記載のプロセス。７．前記胎児細胞抗原が、胎児ヘモグロビンまたはｉ抗原である、請求項６に記載のプロセス。８．前記胎児細胞が胎児造血始原細胞である、請求項１または２に記載のプロセス。