JP2000019179A - 末梢血幹細胞採取物中の微小残存病変の検出方法 - Google Patents
末梢血幹細胞採取物中の微小残存病変の検出方法Info
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 自己末梢血幹細胞移植を目的として採取
された末梢血幹細胞採取物について１種以上の腫瘍細胞
表面抗原を検出し、得られた表面抗原パターンと、予め
作成された白血病細胞についての１種以上の腫瘍細胞表
面抗原のパターンとを対比する細胞移植用末梢血幹細胞
採取物中の微小残存病変の検出方法。 【効果】 白血病における自己末梢血幹細胞移植に際
し、移植用末梢血幹細胞中の微小残存病変の検出が迅速
かつ簡便に可能となる。
された末梢血幹細胞採取物について１種以上の腫瘍細胞
表面抗原を検出し、得られた表面抗原パターンと、予め
作成された白血病細胞についての１種以上の腫瘍細胞表
面抗原のパターンとを対比する細胞移植用末梢血幹細胞
採取物中の微小残存病変の検出方法。 【効果】 白血病における自己末梢血幹細胞移植に際
し、移植用末梢血幹細胞中の微小残存病変の検出が迅速
かつ簡便に可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、白血病治療に際
し、自己末梢血幹細胞移植を目的として採取された末梢
血幹細胞採取物中の微小残存病変を検出する方法に関す
る。
し、自己末梢血幹細胞移植を目的として採取された末梢
血幹細胞採取物中の微小残存病変を検出する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、急性白血病（acute leukemia:A
L）の治療の進歩は目覚ましく、殆どの症例を化学療法
や放射線療法により完全寛解（complete remission:C
R）に導入することが可能となってきた。寛解後療法と
しては、通常の化学療法の継続、自家骨髄移植術（auto
logous bone marrow transplantation:auto-BMT）、同
種骨髄移植術（allogeneic bone marrow transplantati
on:allo-BMT）、末梢血幹細胞移植術（peripheral bloo
d stem cell transplantation：PBSCT）が挙げられる。
L）の治療の進歩は目覚ましく、殆どの症例を化学療法
や放射線療法により完全寛解（complete remission:C
R）に導入することが可能となってきた。寛解後療法と
しては、通常の化学療法の継続、自家骨髄移植術（auto
logous bone marrow transplantation:auto-BMT）、同
種骨髄移植術（allogeneic bone marrow transplantati
on:allo-BMT）、末梢血幹細胞移植術（peripheral bloo
d stem cell transplantation：PBSCT）が挙げられる。
【０００３】なかでもＰＢＳＣＴは、その汎用性と簡便
性において極めて有用な支持療法として急速に普及して
きており、ＡＬに対する治療成績はａｕｔｏ−ＢＭＴと
比較して遜色のない成績が報告されており（Takamatsu,
Y.,et al.,Bone Marrow Transplant,13,325-327,199
4）、今後更に多くのＡＬ患者に適用されていくものと
考えられる。
性において極めて有用な支持療法として急速に普及して
きており、ＡＬに対する治療成績はａｕｔｏ−ＢＭＴと
比較して遜色のない成績が報告されており（Takamatsu,
Y.,et al.,Bone Marrow Transplant,13,325-327,199
4）、今後更に多くのＡＬ患者に適用されていくものと
考えられる。
【０００４】ＰＢＳＣＴは、造血幹細胞採取法の確立、
支持療法の発達で、より安全に施行できるようになって
きているが、解決されていない問題点もある。その一つ
が、移植片中に混在している微小残存病変（minimal re
sidual disease:MRD）である。末梢血幹細胞採取物（pe
ripheral blood stem cell harvest:PBSCH）には、骨髄
と比較して腫瘍細胞の混入が少ないことが報告されてい
る。しかし、ｂｃｒ／ａｂｌやＰＭＬ／ＲＡＲＡを指標
としたＲＴ−ＰＣＲ法によるＭＲＤの検討では、ＰＢＳ
ＣＨ中にＭＲＤが混入している症例が多く存在したこと
が報告されている（Br.J.Haematol.,85:578-583,199
3）。
支持療法の発達で、より安全に施行できるようになって
きているが、解決されていない問題点もある。その一つ
が、移植片中に混在している微小残存病変（minimal re
sidual disease:MRD）である。末梢血幹細胞採取物（pe
ripheral blood stem cell harvest:PBSCH）には、骨髄
と比較して腫瘍細胞の混入が少ないことが報告されてい
る。しかし、ｂｃｒ／ａｂｌやＰＭＬ／ＲＡＲＡを指標
としたＲＴ−ＰＣＲ法によるＭＲＤの検討では、ＰＢＳ
ＣＨ中にＭＲＤが混入している症例が多く存在したこと
が報告されている（Br.J.Haematol.,85:578-583,199
3）。
【０００５】ＰＣＲ法は非常に感度が高いとされている
が、そのために偽陽性が得られることも多く、その検体
の扱いには非常に注意を要し、特別な設備等が必要とな
り、経費や検査に要する時間を考えても、汎用性のある
検査法とはなり得ない。また、白血病細胞が経過中に変
異を起こし、ＰＣＲのターゲットとなる遺伝子が欠失し
てしまうことも報告されている（Provan,D.,et al.,Blo
od,88(6),2228-2235,1996）。このように、治療方針決
定の判断材料としてＰＢＳＣＨ中のＭＲＤを検出するこ
とは非常に重要であり、そのために、高感度で、迅速で
簡便な、客観性、定量性に富んだ検出法の出現が望まれ
ている。
が、そのために偽陽性が得られることも多く、その検体
の扱いには非常に注意を要し、特別な設備等が必要とな
り、経費や検査に要する時間を考えても、汎用性のある
検査法とはなり得ない。また、白血病細胞が経過中に変
異を起こし、ＰＣＲのターゲットとなる遺伝子が欠失し
てしまうことも報告されている（Provan,D.,et al.,Blo
od,88(6),2228-2235,1996）。このように、治療方針決
定の判断材料としてＰＢＳＣＨ中のＭＲＤを検出するこ
とは非常に重要であり、そのために、高感度で、迅速で
簡便な、客観性、定量性に富んだ検出法の出現が望まれ
ている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、末梢
血幹細胞採取物中の微小残存病変を迅速、かつ簡便に検
出する方法を提供することにある。
血幹細胞採取物中の微小残存病変を迅速、かつ簡便に検
出する方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
課題を解決すべく鋭意研究した結果、予め白血病細胞の
腫瘍細胞表面抗原のパターン化をしておき、治療後にお
いて細胞移植を目的として採取された末梢血幹細胞採取
物について腫瘍細胞表面抗原のパターンを検出し、その
両パターンを対比すれば、当該移植用の末梢血幹細胞採
取物中の微小残存病変が迅速かつ簡便に検出でき、更に
化学療法を行うべきか、当該微小残存病変を除去してＰ
ＢＳＣＴを行うか、そのままＰＢＳＣＴを行うべきかの
診断が可能となることを見出し、本発明を完成するに至
った。
課題を解決すべく鋭意研究した結果、予め白血病細胞の
腫瘍細胞表面抗原のパターン化をしておき、治療後にお
いて細胞移植を目的として採取された末梢血幹細胞採取
物について腫瘍細胞表面抗原のパターンを検出し、その
両パターンを対比すれば、当該移植用の末梢血幹細胞採
取物中の微小残存病変が迅速かつ簡便に検出でき、更に
化学療法を行うべきか、当該微小残存病変を除去してＰ
ＢＳＣＴを行うか、そのままＰＢＳＣＴを行うべきかの
診断が可能となることを見出し、本発明を完成するに至
った。
【０００８】すなわち、本発明は、自己末梢血幹細胞移
植を目的として採取された末梢血幹細胞採取物について
１種以上の腫瘍細胞表面抗原を検出し、得られた表面抗
原パターンと、予め作成された白血病細胞についての１
種以上の腫瘍細胞表面抗原のパターンとを対比すること
を特徴とする細胞移植用末梢血幹細胞採取物中の微小残
存病変の検出方法を提供するものである。
植を目的として採取された末梢血幹細胞採取物について
１種以上の腫瘍細胞表面抗原を検出し、得られた表面抗
原パターンと、予め作成された白血病細胞についての１
種以上の腫瘍細胞表面抗原のパターンとを対比すること
を特徴とする細胞移植用末梢血幹細胞採取物中の微小残
存病変の検出方法を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明方法においては、まず、白
血病細胞についての腫瘍細胞表面抗原のパターン化を行
う。ここで、細胞としては、骨髄血又は末梢血が挙げら
れる。また、腫瘍細胞表面抗原としては、例えば、ＣＤ
２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１
０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２
０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４
１ａ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＫＯＲ−ＳＡ、
ＨＬＡ−ＤＲ等が例示できる。
血病細胞についての腫瘍細胞表面抗原のパターン化を行
う。ここで、細胞としては、骨髄血又は末梢血が挙げら
れる。また、腫瘍細胞表面抗原としては、例えば、ＣＤ
２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１
０、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２
０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４
１ａ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＫＯＲ−ＳＡ、
ＨＬＡ−ＤＲ等が例示できる。
【００１０】腫瘍細胞表面抗原のパターン化は、細胞に
腫瘍細胞表面抗原に対する抗体を反応させ、反応した細
胞をフローサイトメトリーにより検出することにより行
うのが好ましい。
腫瘍細胞表面抗原に対する抗体を反応させ、反応した細
胞をフローサイトメトリーにより検出することにより行
うのが好ましい。
【００１１】本発明で使用される腫瘍細胞膜表面抗原に
対する抗体としては、種々の腫瘍細胞膜表面マーカー解
析用として用いられる抗体であれば特に制限されない
が、モノクローナル抗体が望ましい。使用する抗体は、
同じモノクローナル抗体であっても、抗体の種類や蛍光
物質によって、陽性細胞群の乖離に差がみられる。若干
の差であれば、陽性細胞率に有意な差を認めることはな
いが、蛍光強度が弱く陽性細胞群の乖離が不明瞭になる
ようなこともある。また、抗体の添加量は、陽性細胞が
著しく増加している検体においては、規定の添加量では
抗体量が不足するため陽性細胞群が弱蛍光を示し、陽性
細胞率の低下を示す場合が有り得るので、使用する抗体
と、その抗体量については予め検討することが望まし
い。
対する抗体としては、種々の腫瘍細胞膜表面マーカー解
析用として用いられる抗体であれば特に制限されない
が、モノクローナル抗体が望ましい。使用する抗体は、
同じモノクローナル抗体であっても、抗体の種類や蛍光
物質によって、陽性細胞群の乖離に差がみられる。若干
の差であれば、陽性細胞率に有意な差を認めることはな
いが、蛍光強度が弱く陽性細胞群の乖離が不明瞭になる
ようなこともある。また、抗体の添加量は、陽性細胞が
著しく増加している検体においては、規定の添加量では
抗体量が不足するため陽性細胞群が弱蛍光を示し、陽性
細胞率の低下を示す場合が有り得るので、使用する抗体
と、その抗体量については予め検討することが望まし
い。
【００１２】測定時の細胞数は、検体の状態に合わせて
それぞれ調整するが、例えば、１万〜２０万細胞数で測
定することが望ましい。
それぞれ調整するが、例えば、１万〜２０万細胞数で測
定することが望ましい。
【００１３】細胞の染色は、３重蛍光染色を行い、使用
する標識モノクローナル抗体としては、フルオレセイン
イソチオチアナート（ＦＩＴＣ）標識マウスＩｇＧ１、
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１
９、ＣＤ３４、ＣＤ６１、ＨＬＡ−ＤＲ、phycoerythri
n（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ４、ＣＤ１０、Ｃ
Ｄ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ
及びperidin chlorophyl protein（ＰｅｒＣＰ）標識Ｃ
Ｄ４５、ＦＩＴＣ標識ＣＤ４１ａ、ＰＥ標識ＣＤ１０、
ＰＥ標識ＫＯＲ−ＳＡ３５４４等が例示できる。
する標識モノクローナル抗体としては、フルオレセイン
イソチオチアナート（ＦＩＴＣ）標識マウスＩｇＧ１、
ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ１
９、ＣＤ３４、ＣＤ６１、ＨＬＡ−ＤＲ、phycoerythri
n（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ４、ＣＤ１０、Ｃ
Ｄ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、Ｃ
Ｄ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ
及びperidin chlorophyl protein（ＰｅｒＣＰ）標識Ｃ
Ｄ４５、ＦＩＴＣ標識ＣＤ４１ａ、ＰＥ標識ＣＤ１０、
ＰＥ標識ＫＯＲ−ＳＡ３５４４等が例示できる。
【００１４】より具体的には、治療前の白血病細胞を含
む骨髄血又は末梢血を溶血剤（８．２６ｇ ＮＨ4Ｃ
ｌ、１．００ｇ ＫＨＣＯ3、０．０４ｇ ＥＤＴＡ−
４Ｎａ／ＬＤＷ）を加えて室温にて５分間反応を行い、
混入赤血球の溶血操作を行った後、１５００rpm で１０
分間遠心分離を行い、溶血赤血球を含む上清を除く。沈
殿をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１％ ＢＳ
Ａ：０．１％ ｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ）にて細胞濃度
を１×１０6cells／mlに調整する。調整した細胞浮遊液
をサンプリングした後、それぞれの試験管に抗体を添加
する。その後４℃、遮光下にて３０分間反応させる。反
応後、ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメーターを用
いて測定する。
む骨髄血又は末梢血を溶血剤（８．２６ｇ ＮＨ4Ｃ
ｌ、１．００ｇ ＫＨＣＯ3、０．０４ｇ ＥＤＴＡ−
４Ｎａ／ＬＤＷ）を加えて室温にて５分間反応を行い、
混入赤血球の溶血操作を行った後、１５００rpm で１０
分間遠心分離を行い、溶血赤血球を含む上清を除く。沈
殿をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１％ ＢＳ
Ａ：０．１％ ｓｏｄｉｕｍａｚｉｄｅ）にて細胞濃度
を１×１０6cells／mlに調整する。調整した細胞浮遊液
をサンプリングした後、それぞれの試験管に抗体を添加
する。その後４℃、遮光下にて３０分間反応させる。反
応後、ＰＢＳで２回洗浄後、フローサイトメーターを用
いて測定する。
【００１５】フローサイトメーターは白血病細胞を正確
に測定するために、ＦＬ−ＳＳＣ表示法による解析を行
うのが望ましい。本方法は横軸に細胞に結合した抗体の
蛍光強度（fluorescence:FL）に、縦軸をＳＳＣ（side
scatter:SSC）に設定して展開したｄｏｔ−ｐｌｏｔを
用いる方法を採用するものである。このＦＬ−ＳＳＣ表
示法を用いて解析を行うと、抗体陽性細胞が明確とな
り、信頼性の高い白血病細胞の解析を可能とする。
に測定するために、ＦＬ−ＳＳＣ表示法による解析を行
うのが望ましい。本方法は横軸に細胞に結合した抗体の
蛍光強度（fluorescence:FL）に、縦軸をＳＳＣ（side
scatter:SSC）に設定して展開したｄｏｔ−ｐｌｏｔを
用いる方法を採用するものである。このＦＬ−ＳＳＣ表
示法を用いて解析を行うと、抗体陽性細胞が明確とな
り、信頼性の高い白血病細胞の解析を可能とする。
【００１６】以上の操作により、白血病細胞の表面抗原
のパターン化がなされる。当該パターンは、ＣＤ３４及
び／又はＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ
１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ及
びＫＯＲ−ＳＡから選ばれる１種以上の組み合わせによ
り行うのが好ましい。
のパターン化がなされる。当該パターンは、ＣＤ３４及
び／又はＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ
１４、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ及
びＫＯＲ−ＳＡから選ばれる１種以上の組み合わせによ
り行うのが好ましい。
【００１７】通常、ＰＢＳＣＨには個人差はあるが、約
０．１〜２．０％程度の正常細胞が存在しており、これ
ら細胞の９７〜９９％はＣＤ３４＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ
３８＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１９−、ＣＤ５６−の表
面抗原パターンを示している。骨髄中に存在する正常細
胞も同様の表面抗原パターンを示している。従って、こ
の正常細胞の表面抗原パターンと異なるパターンを有す
る細胞群は、ＭＲＤ細胞群であると判定できる。パター
ン化の例としては、下記表１の７パターンが挙げられ
る。パターンはこの７例に限定されるものでないことは
言うまでもない。
０．１〜２．０％程度の正常細胞が存在しており、これ
ら細胞の９７〜９９％はＣＤ３４＋、ＣＤ１３＋、ＣＤ
３８＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１９−、ＣＤ５６−の表
面抗原パターンを示している。骨髄中に存在する正常細
胞も同様の表面抗原パターンを示している。従って、こ
の正常細胞の表面抗原パターンと異なるパターンを有す
る細胞群は、ＭＲＤ細胞群であると判定できる。パター
ン化の例としては、下記表１の７パターンが挙げられ
る。パターンはこの７例に限定されるものでないことは
言うまでもない。
【００１８】
【表１】
【００１９】白血病治療後に、自己末梢血幹細胞移植を
目的として採取された末梢血幹細胞採取物に対して、上
記（００１４）〔治療前の白血病細胞についての腫瘍表
面抗原のパターン検出〕と同様の操作を行った後、フロ
ーサイトメーターを用いて測定する。フローサイトメー
ターは幹細胞を正確に測定するために、ＦＬ−ＳＳＣ表
示法による解析を行うのが望ましい。本方法は横軸に細
胞に結合した抗体の蛍光強度を、縦軸をＳＳＣに設定し
て展開したｄｏｔ−ｐｌｏｔを用いる方法を採用するも
のである。このＦＬ−ＳＳＣ表示法を用いて解析を行う
と、抗体陽性細胞が明確となり、信頼性の高い幹細胞の
解析を可能とする。得られたパターンと前記白血病細胞
についての表面抗原のパターンとを対比すれば、当該移
植用の末梢血幹細胞採取物中にＭＲＤがあるか否かが検
出できる。
目的として採取された末梢血幹細胞採取物に対して、上
記（００１４）〔治療前の白血病細胞についての腫瘍表
面抗原のパターン検出〕と同様の操作を行った後、フロ
ーサイトメーターを用いて測定する。フローサイトメー
ターは幹細胞を正確に測定するために、ＦＬ−ＳＳＣ表
示法による解析を行うのが望ましい。本方法は横軸に細
胞に結合した抗体の蛍光強度を、縦軸をＳＳＣに設定し
て展開したｄｏｔ−ｐｌｏｔを用いる方法を採用するも
のである。このＦＬ−ＳＳＣ表示法を用いて解析を行う
と、抗体陽性細胞が明確となり、信頼性の高い幹細胞の
解析を可能とする。得られたパターンと前記白血病細胞
についての表面抗原のパターンとを対比すれば、当該移
植用の末梢血幹細胞採取物中にＭＲＤがあるか否かが検
出できる。
【００２０】すなわち、表１記載の如く、移植用として
採取した末梢血幹細胞の表面抗原パターンが、白血病細
胞の表面抗原パターンと一致しなければＭＲＤは存在し
ないこととなる。そしてフローサイトメトリーにより、
ＭＲＤ混入率の算出及び混入ＭＲＤの除去ができる。
採取した末梢血幹細胞の表面抗原パターンが、白血病細
胞の表面抗原パターンと一致しなければＭＲＤは存在し
ないこととなる。そしてフローサイトメトリーにより、
ＭＲＤ混入率の算出及び混入ＭＲＤの除去ができる。
【００２１】かくして移植用末梢血幹細胞採取物中にＭ
ＲＤが検出された場合には、そのＭＲＤの混入量によっ
ても異なるが、移植をせず更に化学療法や放射線療法を
行うか、混入ＭＲＤを除去した後移植を行えばよい。一
方、ＭＲＤがほとんど検出されない場合には、そのまま
移植術を行えばよい。
ＲＤが検出された場合には、そのＭＲＤの混入量によっ
ても異なるが、移植をせず更に化学療法や放射線療法を
行うか、混入ＭＲＤを除去した後移植を行えばよい。一
方、ＭＲＤがほとんど検出されない場合には、そのまま
移植術を行えばよい。
【００２２】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではな
い。
するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではな
い。
【００２３】実施例１ ＜方法＞ （１）対象 白血病幹細胞の腫瘍細胞表面抗原の解析には、急性白血
病患者の抗癌剤治療前に採取された骨髄血を用いた。骨
髄血は採取後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮
遊させ、４℃にて保存し、２４時間以内に細胞表面抗原
の解析を行った。白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）検出パ
ネル作成用の実験検体は、表１に示した白血病細胞表面
抗原が検出された白血病細胞を、末梢血幹細胞採取物
（ＰＢＳＣＨ）に０．１％濃度になるよう混合して作成
した。末梢血幹細胞採取物は抗癌化学療法後の造血回復
期に採取し、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０にて１
×１０7cells／mlに調整し、４℃にて保存したものを使
用した。
病患者の抗癌剤治療前に採取された骨髄血を用いた。骨
髄血は採取後、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０に浮
遊させ、４℃にて保存し、２４時間以内に細胞表面抗原
の解析を行った。白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）検出パ
ネル作成用の実験検体は、表１に示した白血病細胞表面
抗原が検出された白血病細胞を、末梢血幹細胞採取物
（ＰＢＳＣＨ）に０．１％濃度になるよう混合して作成
した。末梢血幹細胞採取物は抗癌化学療法後の造血回復
期に採取し、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ−１６４０にて１
×１０7cells／mlに調整し、４℃にて保存したものを使
用した。
【００２４】（２）モノクローナル抗体 Becton Dickinson Immunocytometry Systems（ＢＤＩ
Ｓ）社のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴ
Ｃ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲと
フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ２α、ＣＤ
４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３
３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ及び
ペリジンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）標識Ｃ
Ｄ４５、Coulter社のＦＩＴＣ標識ＣＤ４１ａ及びＰＥ
標識ＣＤ１０、Medical & Biological Laboratories(MB
L)社のＰＥ標識ＫＯＲ−ＳＡ３５４４を用いた。
Ｓ）社のフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴ
Ｃ）標識マウスＩｇＧ１、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｃ
Ｄ８、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲと
フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウスＩｇＧ２α、ＣＤ
４、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３
３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ及び
ペリジンクロロフィルプロテイン（ＰｅｒＣＰ）標識Ｃ
Ｄ４５、Coulter社のＦＩＴＣ標識ＣＤ４１ａ及びＰＥ
標識ＣＤ１０、Medical & Biological Laboratories(MB
L)社のＰＥ標識ＫＯＲ−ＳＡ３５４４を用いた。
【００２５】（３）染色及び測定 染色は、３重蛍光染色法を行った。検体を溶血剤（８．
２６ｇ ＮＨ4Ｃｌ，１．００ｇ ＫＨＣＯ3，０．０４
ｇ ＥＤＴＡ−４Ｎａ／Ｌ ＤＷ）を用いて室温にて５
分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作
を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１
％，ＢＳＡ：０．１％ sodium azide）にて細胞濃度を
１×１０6cells／mlに調整した。調整した細胞浮遊液を
１００μｌずつそれぞれのチューブにサンプリングした
後、抗体を添加した。４℃、遮光にて３０分間インキュ
ベーションを行い、ＰＢＳにて２回洗浄を行った後、１
％パラホルムアルデヒド（CellFIX:BDIS) を用いて固定
した。
２６ｇ ＮＨ4Ｃｌ，１．００ｇ ＫＨＣＯ3，０．０４
ｇ ＥＤＴＡ−４Ｎａ／Ｌ ＤＷ）を用いて室温にて５
分間インキュベーションを行い、混入赤血球の溶血操作
を行った後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：０．１
％，ＢＳＡ：０．１％ sodium azide）にて細胞濃度を
１×１０6cells／mlに調整した。調整した細胞浮遊液を
１００μｌずつそれぞれのチューブにサンプリングした
後、抗体を添加した。４℃、遮光にて３０分間インキュ
ベーションを行い、ＰＢＳにて２回洗浄を行った後、１
％パラホルムアルデヒド（CellFIX:BDIS) を用いて固定
した。
【００２６】（４）測定方法 測定はＦＡＣＳｏｒｔ（ＢＤＩＳ）を用いて行った。機
器の設定はＣａｌｉＢＲＩＴＥ ｂｅａｄｓ（ＢＤＩ
Ｓ）を用いて、ＦＡＣＳＣｏｍｐ ｓｏｆｔｗａｒｅの
Ｌｙｓｅ−Ｗａｓｈ ｍｏｄｅにて行った。細胞の取り
込みはＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて
行い、骨髄血中の白血病細胞表面抗原解析の場合は１万
細胞、末梢血幹細胞採取物中の白血病細胞検出の場合は
１０万細胞測定した。
器の設定はＣａｌｉＢＲＩＴＥ ｂｅａｄｓ（ＢＤＩ
Ｓ）を用いて、ＦＡＣＳＣｏｍｐ ｓｏｆｔｗａｒｅの
Ｌｙｓｅ−Ｗａｓｈ ｍｏｄｅにて行った。細胞の取り
込みはＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて
行い、骨髄血中の白血病細胞表面抗原解析の場合は１万
細胞、末梢血幹細胞採取物中の白血病細胞検出の場合は
１０万細胞測定した。
【００２７】（５）骨髄血中の白血病細胞表面抗原解析
方法 測定した全細胞をＦＳＣ−ＳＳＣ表示によるｄｏｔ−ｐ
ｌｏｔに展開し、ＦＳＣ低レベルに存在するデブリスを
除外した。次に、ＣＤ４５−ＳＳＣ表示を用いてＣＤ４
５弱陽性領域の白血病細胞群にゲートを設定し、ゲート
内細胞をフルオレッセンス（ＦＬ）１−ＦＬ２表示に展
開し、白血病細胞表面抗原の解析を行った。
方法 測定した全細胞をＦＳＣ−ＳＳＣ表示によるｄｏｔ−ｐ
ｌｏｔに展開し、ＦＳＣ低レベルに存在するデブリスを
除外した。次に、ＣＤ４５−ＳＳＣ表示を用いてＣＤ４
５弱陽性領域の白血病細胞群にゲートを設定し、ゲート
内細胞をフルオレッセンス（ＦＬ）１−ＦＬ２表示に展
開し、白血病細胞表面抗原の解析を行った。
【００２８】（６）末梢血幹細胞採取物中の白血病細胞
表面抗原の解析方法 測定した全細胞をＦＳＣ−ＣＤ４５表示によるｄｏｔ−
ｐｌｏｔに展開し、ＦＳＣ低レベル・ＣＤ４５陰性領域
に存在するデブリスを除外した。次に、ＣＤ３４−ＳＳ
Ｃ表示を用いてＣＤ３４陽性細胞群領域にゲートを設定
し、ゲート内細胞をＦＬ１−ＦＬ２表示に展開し、混入
している白血病細胞の検出を行った。
表面抗原の解析方法 測定した全細胞をＦＳＣ−ＣＤ４５表示によるｄｏｔ−
ｐｌｏｔに展開し、ＦＳＣ低レベル・ＣＤ４５陰性領域
に存在するデブリスを除外した。次に、ＣＤ３４−ＳＳ
Ｃ表示を用いてＣＤ３４陽性細胞群領域にゲートを設定
し、ゲート内細胞をＦＬ１−ＦＬ２表示に展開し、混入
している白血病細胞の検出を行った。
【００２９】＜結果＞ （１）実験検体を用いた末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣ
Ｈ）中の白血病細胞検出実験に用いた検体の白血病細胞
表面抗原パターンを表２に示す。
Ｈ）中の白血病細胞検出実験に用いた検体の白血病細胞
表面抗原パターンを表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】ＣＤ３４＋／ＣＤ１９＋／ＫＯＲ−ＳＡ３
５４４＋の白血病細胞表面抗原を持つ表２中のケース１
の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞を０．１％混入さ
せた末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）を用いて、ＦＣ
Ｍ法による白血病細胞混入率の解析を行った。ＣＤ３４
陽性細胞集団は、ＣＤ３４＋／ＣＤ１９−／ＫＯＲ−Ｓ
Ａ３５４４−の正常幹細胞集団と、もう１群のＣＤ３４
＋／ＣＤ１９＋／ＫＯＲ−ＳＡ３５４４＋の急性リンパ
性白血病（ＡＬＬ）細胞集団に分かれ、急性リンパ性白
血病（ＡＬＬ）細胞集団比率は０．１％で、あらかじめ
混入した白血病細胞率と一致した（図１）。同様の方法
で、表２のケース２〜ケース７の白血病細胞を末梢血幹
細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）に混入させ、ＦＣＭ法による
検出を行った。全例において、あらかじめ混入させた白
血病細胞比率と検出された白血病細胞比率は一致した。
実験検体を用いた検討から得られた白血病細胞表面抗原
（ＡＡＥ）と考えられる細胞表面抗原の組合わせパター
ン１〜パターン７を作成した（前記表１）。それぞれの
パターンが示す細胞表面抗原の組合わせは、正常幹細胞
の細胞表面抗原パターンとは異なり、また正常骨髄血及
び末梢血中にも、それぞれのパターンが示す細胞表面抗
原の組合わせを持つ細胞はほとんど存在しない。正常末
梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）（ｎ＝２０）中のＣＤ
３４陽性細胞の表面抗原を検討した結果、パターン１〜
パターン６を示す細胞の比率は０．２％以下で、パター
ン７のＣＤ３４＋／ＣＤ３３−は０．５％を超える場合
があった（表１）。
５４４＋の白血病細胞表面抗原を持つ表２中のケース１
の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞を０．１％混入さ
せた末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）を用いて、ＦＣ
Ｍ法による白血病細胞混入率の解析を行った。ＣＤ３４
陽性細胞集団は、ＣＤ３４＋／ＣＤ１９−／ＫＯＲ−Ｓ
Ａ３５４４−の正常幹細胞集団と、もう１群のＣＤ３４
＋／ＣＤ１９＋／ＫＯＲ−ＳＡ３５４４＋の急性リンパ
性白血病（ＡＬＬ）細胞集団に分かれ、急性リンパ性白
血病（ＡＬＬ）細胞集団比率は０．１％で、あらかじめ
混入した白血病細胞率と一致した（図１）。同様の方法
で、表２のケース２〜ケース７の白血病細胞を末梢血幹
細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）に混入させ、ＦＣＭ法による
検出を行った。全例において、あらかじめ混入させた白
血病細胞比率と検出された白血病細胞比率は一致した。
実験検体を用いた検討から得られた白血病細胞表面抗原
（ＡＡＥ）と考えられる細胞表面抗原の組合わせパター
ン１〜パターン７を作成した（前記表１）。それぞれの
パターンが示す細胞表面抗原の組合わせは、正常幹細胞
の細胞表面抗原パターンとは異なり、また正常骨髄血及
び末梢血中にも、それぞれのパターンが示す細胞表面抗
原の組合わせを持つ細胞はほとんど存在しない。正常末
梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）（ｎ＝２０）中のＣＤ
３４陽性細胞の表面抗原を検討した結果、パターン１〜
パターン６を示す細胞の比率は０．２％以下で、パター
ン７のＣＤ３４＋／ＣＤ３３−は０．５％を超える場合
があった（表１）。
【００３２】（２）臨床検査での末梢血幹細胞採取物
（ＰＢＳＣＨ）中ＭＲＤの検出 治療前の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）−Ｍ２患者より採
取された骨髄血を用いて、ＣＤ４５弱陽性領域に存在す
る白血病細胞表面抗原解析を行った。解析された白血病
細胞の表面形質は、ＣＤ１３＋，ＣＤ１９ｄｉｍ，ＣＤ
３４＋，ＣＤ５６＋，ＨＬＡ−ＤＲ＋，ＣＤ４ｄｉｍで
あり、ＣＤ３４＋／ＣＤ５６＋の白血病細胞表面抗原を
持つ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞と考えられた（表
３）。後日、同患者のアフェレシスにより得られた末梢
血幹細胞採取物（ＢＰＳＣＨ）を用いて、このＣＤ３４
／ＣＤ５６の組合わせをマーカーとしてＭＲＤ検出を行
った。末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）中のＣＤ３４
陽性細胞集団を解析した結果、ＣＤ３４＋／ＣＤ５６−
の正常幹細胞集団（０．６７％）と、もう１群のＣＤ３
４＋／ＣＤ５６＋の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞集
団（１．２１％）が検出できた（図２）。
（ＰＢＳＣＨ）中ＭＲＤの検出 治療前の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）−Ｍ２患者より採
取された骨髄血を用いて、ＣＤ４５弱陽性領域に存在す
る白血病細胞表面抗原解析を行った。解析された白血病
細胞の表面形質は、ＣＤ１３＋，ＣＤ１９ｄｉｍ，ＣＤ
３４＋，ＣＤ５６＋，ＨＬＡ−ＤＲ＋，ＣＤ４ｄｉｍで
あり、ＣＤ３４＋／ＣＤ５６＋の白血病細胞表面抗原を
持つ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞と考えられた（表
３）。後日、同患者のアフェレシスにより得られた末梢
血幹細胞採取物（ＢＰＳＣＨ）を用いて、このＣＤ３４
／ＣＤ５６の組合わせをマーカーとしてＭＲＤ検出を行
った。末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）中のＣＤ３４
陽性細胞集団を解析した結果、ＣＤ３４＋／ＣＤ５６−
の正常幹細胞集団（０．６７％）と、もう１群のＣＤ３
４＋／ＣＤ５６＋の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞集
団（１．２１％）が検出できた（図２）。
【００３３】同様に、治療前の急性リンパ性白血病（Ａ
ＬＬ）患者より採取された骨髄血を用いてＣＤ４５弱陽
性領域に存在する白血病細胞表面抗原解析を行った。解
析された白血病細胞の表面形質はＣＤ１３＋，ＣＤ１９
＋，ＣＤ３３＋，ＣＤ３４＋，ＨＬＡ−ＤＲ＋であり、
ＣＤ３４＋／ＣＤ１９＋の白血病細胞表面抗原（ＡＡ
Ｅ）を持つ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞と考えら
れた（表３）。後日、同患者のアフェレシスにより得ら
れた末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）を用いて、この
ＣＤ３４／ＣＤ１９の組合わせをマーカーとしてＭＲＤ
検出を行った。末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）中の
ＣＤ３４陽性細胞集団を解析した結果、ＣＤ３４＋／Ｃ
Ｄ１９−の正常幹細胞集団（３．８３％）と、もう１群
のＣＤ３４＋／ＣＤ１９＋の急性リンパ性白血病（ＡＬ
Ｌ）細胞集団（０．４６％）が検出できた（図３）。以
上、実際の臨床検体においても、パターン１、パターン
２の白血病細胞表面抗原をマーカーとして用いることに
よって、末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）中のＭＲＤ
検出が可能であった。
ＬＬ）患者より採取された骨髄血を用いてＣＤ４５弱陽
性領域に存在する白血病細胞表面抗原解析を行った。解
析された白血病細胞の表面形質はＣＤ１３＋，ＣＤ１９
＋，ＣＤ３３＋，ＣＤ３４＋，ＨＬＡ−ＤＲ＋であり、
ＣＤ３４＋／ＣＤ１９＋の白血病細胞表面抗原（ＡＡ
Ｅ）を持つ急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞と考えら
れた（表３）。後日、同患者のアフェレシスにより得ら
れた末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）を用いて、この
ＣＤ３４／ＣＤ１９の組合わせをマーカーとしてＭＲＤ
検出を行った。末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）中の
ＣＤ３４陽性細胞集団を解析した結果、ＣＤ３４＋／Ｃ
Ｄ１９−の正常幹細胞集団（３．８３％）と、もう１群
のＣＤ３４＋／ＣＤ１９＋の急性リンパ性白血病（ＡＬ
Ｌ）細胞集団（０．４６％）が検出できた（図３）。以
上、実際の臨床検体においても、パターン１、パターン
２の白血病細胞表面抗原をマーカーとして用いることに
よって、末梢血幹細胞採取物（ＰＢＳＣＨ）中のＭＲＤ
検出が可能であった。
【００３４】
【表３】
【００３５】（３）急性白血病における適応可能頻度の
検討 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び急性リンパ性白血病
（ＡＬＬ）患者より採取された骨髄血で、治療前のｂｌ
ａｓｔ ｃｅｌｌｓ％が５０％以上の症例９８０例中、
ＣＤ３４が７０％以上の陽性を示した症例は３８２例
（３９．０％）であった。その内、白血病細胞表面抗原
（ＡＡＥ）と考えられる細胞表面抗原を持つ症例は２４
６例（６４．４％）であった（表４）。
検討 急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び急性リンパ性白血病
（ＡＬＬ）患者より採取された骨髄血で、治療前のｂｌ
ａｓｔ ｃｅｌｌｓ％が５０％以上の症例９８０例中、
ＣＤ３４が７０％以上の陽性を示した症例は３８２例
（３９．０％）であった。その内、白血病細胞表面抗原
（ＡＡＥ）と考えられる細胞表面抗原を持つ症例は２４
６例（６４．４％）であった（表４）。
【００３６】
【表４】
【００３７】白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ
３４陽性白血病症例は全て、パターン１〜パターン７に
分類できた。中でもパターン２の組合わせの適応可能頻
度が最も高く、ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ％が５０％以上
の症例中１６．３％、ＣＤ３４陽性症例中４１．９％、
白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ３４陽性症例
中６５．０％が適応可能であった。パターン３、５、７
の適応頻度はほとんど同じで、ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ
％が５０％以上の症例中約１０％、ＣＤ３４陽性症例中
約２５％、白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ３
４陽性症例中約４０％が適応可能であった。パターン
１、４、６の適応頻度はやや低く、ｂｌａｓｔ ｃｅｌ
ｌｓ％が５０％以上の症例中約５％、ＣＤ３４陽性症例
中約１０％、白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ
３４陽性症例中約２０％であった（表５）。
３４陽性白血病症例は全て、パターン１〜パターン７に
分類できた。中でもパターン２の組合わせの適応可能頻
度が最も高く、ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ％が５０％以上
の症例中１６．３％、ＣＤ３４陽性症例中４１．９％、
白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ３４陽性症例
中６５．０％が適応可能であった。パターン３、５、７
の適応頻度はほとんど同じで、ｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ
％が５０％以上の症例中約１０％、ＣＤ３４陽性症例中
約２５％、白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ３
４陽性症例中約４０％が適応可能であった。パターン
１、４、６の適応頻度はやや低く、ｂｌａｓｔ ｃｅｌ
ｌｓ％が５０％以上の症例中約５％、ＣＤ３４陽性症例
中約１０％、白血病細胞表面抗原（ＡＡＥ）を持つＣＤ
３４陽性症例中約２０％であった（表５）。
【００３８】
【表５】
【００３９】
【発明の効果】本発明方法によれば自己末梢血幹細胞中
のＭＲＤが簡単かつ迅速に検出でき、白血病のその後の
治療方針決定が容易にできる。
のＭＲＤが簡単かつ迅速に検出でき、白血病のその後の
治療方針決定が容易にできる。
【図１】実験検体を用いた末梢血幹細胞中の白血病細胞
表面抗原パターンの検出を示す図である。
表面抗原パターンの検出を示す図である。
【図２】急性骨髄性白血病患者より採取された末梢血幹
細胞採取物中のＭＲＤ検出結果を示す図である。
細胞採取物中のＭＲＤ検出結果を示す図である。
【図３】急性リンパ性白血病患者より採取された末梢血
幹細胞採取物中のＭＲＤの検出結果を示す図である。
幹細胞採取物中のＭＲＤの検出結果を示す図である。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA01 AA02 BA13 BB10 BB14 BB24 BB25 BB39 BB51 CA11 CB02 FA11 FA37 FB03 FB07 FB12 GC15
Claims (2)
- 【請求項１】 自己末梢血幹細胞移植を目的として採取
された末梢血幹細胞採取物について１種以上の腫瘍細胞
表面抗原を検出し、得られた表面抗原パターンと、予め
作成された白血病細胞についての１種以上の腫瘍細胞表
面抗原のパターンとを対比することを特徴とする幹細胞
移植用末梢血幹細胞採取物中の微小残存病変の検出方
法。 - 【請求項２】 腫瘍細胞表面抗原の検出が、腫瘍細胞表
面抗原に対する抗体と反応する細胞をフローサイトメト
リーにより検出するものである請求項１記載の検出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10240172A JP2000019179A (ja) | 1998-04-30 | 1998-08-26 | 末梢血幹細胞採取物中の微小残存病変の検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10-120627 | 1998-04-30 | ||
| JP12062798 | 1998-04-30 | ||
| JP10240172A JP2000019179A (ja) | 1998-04-30 | 1998-08-26 | 末梢血幹細胞採取物中の微小残存病変の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000019179A true JP2000019179A (ja) | 2000-01-21 |
Family
ID=26458170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10240172A Pending JP2000019179A (ja) | 1998-04-30 | 1998-08-26 | 末梢血幹細胞採取物中の微小残存病変の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000019179A (ja) |
-
1998
- 1998-08-26 JP JP10240172A patent/JP2000019179A/ja active Pending
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