JP2002505441A

JP2002505441A - 選択的細胞分析

Info

Publication number: JP2002505441A
Application number: JP2000534626A
Authority: JP
Inventors: ルイスエイ．カメントスキー，
Original assignee: コンピュサイトコーポレイション
Priority date: 1998-03-02
Filing date: 1999-03-01
Publication date: 2002-02-19
Also published as: AU2884499A; CA2321203A1; WO1999045094A1; EP1066368A1; EP1066368A4

Abstract

(57)【要約】試料細胞の選択された小さい部分の、試料スライドの静止領域および非常に局在化された領域におけるレーザー走査分析のための方法およびデバイスであり、ここで、細胞は、走査目的の細胞に主に特異的に選択される。試料は、選択される細胞の特徴に特異的に合わせた接着媒体で前処理され得、これによって、特定の細胞に接着性を与える。次いで、試料スライドを、同時作用する接着材料または接着デバイス、あるいは非妨害性ゲートの位置における濾過デバイスに局所的に提供され、これによって統計的に有意な数の選択された細胞は、ゲート位置に到達しないかまたは接着されず、そして残存する選択されない細胞は、ゲート位置から除去される。次いで、そのゲート位置を、レーザー走査型サイトメーターにより増大された効率で走査する。接着材料は、ゲーティング領域の表面上にコートされるか、または磁気感受性粒子を提供される。後者の実施態様において、局在化された磁石が、ゲーティング領域に磁化された選択された細胞を接着するために、ゲーティング領域に隣接して配置される。目的の細胞は、サブセット（例えば、白血球および単球）を有する細胞のクラスまたはセットであり得、分析目的のサブセットの特性を有する。従って、最初の試薬は、接着のために用いられ、そしてさらなる試薬は、サブセットを作製し、そして所望の特徴を分析するために用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、分析のために互いに変化する型および特徴の細胞を選択的に分離す
ることに使用されるデバイスおよび方法に関し、ならびに特にレーザー走査型サ
イトメーターで使用されるような方法およびデバイスに関する。

【０００２】（発明の背景）種々の医学的条件に関する重要な細胞に基づく多くのアッセイが、フローサイ
トメトリーの使用を通じて開発されてきた。フローサイトメトリー装置は、細胞
が光線（しばしば、レーザー）を通る単一のファイルでキュベット中を流動する
ように作製される場合、細胞の複数の光学的特性を測定する。細胞が光と相互作
用する場合、蛍光および散乱発光の両方が放出され、これはフォトセンサによっ
て測定され得る。細胞を、測定の前に、特定の細胞構成要素に結合する蛍光色素
と適切に反応させる場合、測定される蛍光の量は、特定の細胞構成要素（例えば
、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または特定のタンパク質）の各々に直接的に関連し得る。こ
れらの色素は、細胞中の特定のタンパク質に順に結合し得る抗体に、十分に確立
された技術によって結合体化され得る。フローサイトメーターのセンサによって
測定される、生じた蛍光を使用して、細胞あたりの特定のタンパク質の量を定量
し得るか、または異種細胞集団（例えば、血液）における１つ以上の細胞の型を
差次的に計数し得る。さらに、蛍光色素は、特定の核酸配列に付着し得る。これ
は順に、細胞の核酸内の特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に結合して、特定の遺伝
子型を有する細胞を印付ける。

【０００３】この後者の技術は、（フローサイトメトリーにおいて必要とされるような）懸
濁液中の細胞において調製を実行することが困難であるので、より近年開発され
たレーザー走査型サイトメトリーによって、より有利に行われ得る（米国特許第
５，１０７，４２２号に記載される）。現在、レーザー走査型サイトメーターは
、ＣｏｍｐｕＣｙｔｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡか
ら、ＬＳＣ（登録商標）という登録商標で市販されている。これは、顕微鏡用ス
ライド表面上で調製され、そして静置された細胞を測定するために設計される。

【０００４】フローサイトメトリー技術は、生物医学的な研究において広範に使用されてい
るが、白血病およびＡＩＤＳの診断およびモニタリングを除いては、臨床的な使
用に対して広範に適用されていない。静止したサンプルを用いるレーザー走査型
サイトメトリーは、全ての他の臨床的な設定における使用に対して、より適切で
ある。レーザー走査型サイトメトリーにおいて、蛍光および散乱は、顕微鏡用ス
ライドのような固体基板上に置かれた細胞において測定される。調製された細胞
（上記のようなフローサイトメトリーに関して）は、基板上に細胞を見出し、そ
してこれらの蛍光発光および散乱発光を測定するためにコンピュータ制御下で基
板にわたってレーザービームを移動し、そして基板を移動することによって、測
定される。走査型サイトメトリーによって得られたデータは、フローサイトメト
リーのデータと等価であるが、使用において、より大きな有効性を有し、かつオ
ペレータエラーについてほとんど限界を有さなかったことが示されている（例え
ば、ＫａｍｅｎｔｓｋｙらＳｌｉｄｅ−ＢａｓｅｄＬａｓｅｒＳｃａｎｎ
ｉｎｇＣｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＡｃｔａＣｙｔｏｌｏｇｉｃａ４１：１２３
〜１４３（１９９７）を参照のこと）。さらに、レーザー走査型サイトメトリー
は、フローサイトメトリーの使用では利用可能でない、多くの便益を有すること
が示されている。

【０００５】第１に、スライド上の細胞の異種集団が走査され得、細胞の複数の特性が測定
され、そして使用者の指示の下で、装置が、可視的な観察または写真のために、
あるいはデータを併合する鍵として各細胞の配置を使用する複数のアッセイから
データを組み合わせるように、特定の規定されたセットの特性を有する細胞を再
配置し得る。

【０００６】第２に、各細胞が多くのデータエレメントで走査されるので、細胞の構成要素
は、核または細胞質のような細胞の画分に対して配置され得、そして蛍光スポッ
トが計数されるインサイチュハイブリダイゼーションのような試験が、実行され
得る。

【０００７】第３に、細胞はスライドのような基板の表面上で測定されるので、インサイチ
ュハイブリダイゼーションのような特定のアッセイが可能である。なぜなら、こ
れらのアッセイは、懸濁した細胞で実行されることが困難だからである。なぜな
ら、必要とされる複数の遠心分離に起因して失われるため細胞はインタクトのま
まではないからである。

【０００８】現在細胞が含まれる培地から、細胞を分離することなく細胞上で複雑な手順の
工程を実行することもまた、可能である。これは、現在主に、細胞を落とすため
に、遠心分離によって行われ、その結果上清が注がれ得る。フローサイトメトリ
ーの使用者のために、血液のような細胞の異種集団は、分析の前に遠心分離、カ
ラム、沈降、または溶解によって特定の細胞型を分離することにより、予め処理
されなければならない。次いで、細胞を、蛍光色素を結合した抗体のような試薬
と反応しなければならない。そして、細胞を、研究室の遠心分離機を使用して、
これらの反応の間、およびこれらの反応後に洗浄しなければならない。結果とし
て、フローサイトメトリーは、多くの有用な診断および予後の適用に採用されて
いない。なぜなら、調製用の手順が複雑であり、種々のプロトコルを実行および
制御し、ならびに装置を作動するために、高度に訓練された作業者が要求される
からである。さらに、多くの適用のために、これらの試験は高度に訓練された操
作者が利用可能でなく、そしてさらに患者の処置を決定することがすぐに必要で
ある救急室において、手術現場において、新生児のユニットの近くまたは診察室
において実行されなければならない。レーザー走査型サイトメトリーは、このよ
うな多くの問題を除去する。

【０００９】しかし、レーザー走査型サイトメーターの使用に対して唯一の制限が存在する
。例えば、このような使用の重要な特徴は、試料を測定するために必要とされる
時間が走査される領域に直接比例することである。従って、１０，０００個の細
胞が１０ミリメートル四方の領域にわたって配置される場合、細胞が１ミリメー
トル四方の領域中に配置される場合に比べて、試料を処理するために１０倍長い
時間が必要である。現在のコンピュータ速度のために、データ処理は非常に速い
ので、試料を処理するための時間は、試料の領域にわたってレーザービームを走
査するために必要な時間によって主に制御および制限される。しかし、多くのア
ッセイ（試料として血液を使用するアッセイの全てを含む）において、試料は異
種性であり、アッセイのための正常な目的細胞は全試料の細胞の小画分のみであ
る。例えば、白血球の各々の特定の型と同様、多くの赤血球が通常１０００倍存
在する。従って、無関係な細胞の存在は、無関係な細胞もまた測定および分析さ
れなければならない場合、所定の数の目的の細胞を分析するための処理時間の増
加を生じる。なぜなら、細胞を重複することなく表面上に全細胞を配置するため
に、より大きな領域が必要であるからである。しかし、所望の小さな走査領域中
のサンプル全体を都合良く単純に配置することは、目的の細胞の重複を伴って、
存在する無関係な細胞の複数の層を生じ、それによって、事実上測定処理自体を
妨げる。従って、目的の細胞のみが、走査される小さな領域に残存する場合、お
よび無関係な細胞が測定の前に除去される場合に、非常に有利である。

【００１０】先行技術の方法において、特異的に選択された分析物を、それに結合する試薬
による表面上での分析物の捕捉によって表面に付着され、そしてその後、分析物
自体の量が測定される（米国特許第５，６３７，４６９号を参照のこと)。しかし、しばしば、細胞の付着を引き起こすために必要とされる適用可能な試薬は、
無関係な細胞を伴わずに表面に付着する適切なサブセット（すなわち、目的の細
胞）において必ずしも得られるとは限らない。

【００１１】（発明の要旨）従って、本発明の目的は、示された限定領域からの無関係な細胞などを除去す
るとともに、異種細胞試料の走査領域を限定し、そして意味のある測定を提供す
るために、統計学的に有意な限定領域中に目的の細胞を与えるレーザー走査型サ
イトメトリーの効力を増大させるための手段を提供することである。

【００１２】本発明の別の目的は、限定領域中に配置される細胞のセットを生じることによ
って、異種試料から目的の細胞を含む細胞のセットを分離し、その後、目的の細
胞のサブセットと、目的の細胞ではない他の細胞のセットとの間を識別し、次い
で、目的の細胞のサブセット上でのみ測定を実行することである。以下で、「目
的の細胞」に対する参照は、他に示されない限り、「目的の細胞のサブセットを
含む、細胞のセット（例えば、赤血球、白血球、微生物など）」（例えば、単球
）を含む。

【００１３】本発明の別の目的は、レーザー走査型サイトメーターの光センサによって測定
され得るマーカー試薬によって表面の限定領域に付着する細胞の中から、目的の
細胞のサブセットを同定することである。

【００１４】本発明のなお別の目的は、１つ以上のさらなるマーカー試薬を使用することで
ある。このマーカー試薬は、レーザー走査型サイトメーターにおいて、さらなる
光センサによって測定される目的の細胞の特徴を同定する。

【００１５】本発明のさらに別の目的は、熟練していない操作者によって使用される注意点
（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）の装置として使用される、可能なレーザー走査
型サイトメーターによる。ここで、試料は、使用者が介入することなく使い捨て
の遠心管内でレーザー走査型サイトメーターにおいて処理され、そしてここで、
この遠心管は、試料と蛍光色素とを反応させるために必要である全ての必要な試
薬を含み、ならびに無関係な細胞を除去し、そしてサイトメーターによって走査
される表面上の小さな領域に関連する細胞を配置するための手段を提供する。

【００１６】一般に、本発明は、レーザー走査型サイトメーターによって試験するために、
目的の細胞（または、サブセットとして目的の細胞を含む細胞のセット）を顕微
鏡用スライドのような静止した試料基板の限定領域に付着するための方法および
デバイスを包含する。本発明の方法は、以下の工程を包含する：ａ）目的の細胞、またはそのサブセットとして目的の細胞を含む選択された細
胞のセットに結合する異種細胞の試料サンプルを、付着手段を用いて処理する工
程；ｂ）付着手段と結合した細胞を、二次付着手段によって限定領域の基板に付着
させる工程；ｃ）関連する場合、選択された細胞のセットが付着される場合に、あるセット
の他の細胞からの目的のサブセットの付着した細胞の間を識別する手段を用いて
識別する工程；およびｄ）基板の限定領域においてレーザー走査型サイトメーターを用いて目的の細
胞を分析する工程。

【００１７】あるいは、上記の方法において工程「ａ」および「ｂ」は、表面自体が付着手
段で最初に提供される工程と置換され得る。これによって、目的の細胞、または
サブセットとして目的の細胞を含む細胞のセットは、試料サンプルを予め処理す
ることなく、インサイチュで表面に付着する。あるいは、無関係の細胞は、多孔
膜の使用によって分離され得る。

【００１８】実際の使用法に合わせられる、特に好ましい実施態様において、この分析およ
び分離は、３つの分離工程において実施される：ａ）関連する試薬による表面への付着のための、異種サンプル全体からの一般
的なクラスの細胞の最初の分離が存在する；ｂ）付着される目的の細胞、とりわけ他の関連するが無関係な細胞（すなわち
、測定が独占的に考えられる、実際の細胞）を、それを同定するためにマーカー
試薬（細胞を接着するために使用される試薬とは異なる）を用いて印付けて、他
の付着された細胞から分離する；およびｃ）目的の印付けられた細胞の特定の特性（単に数値ではない）の決定のため
に１つ以上の試薬を使用する。

【００１９】この手順の結果として、本発明に従って、細胞の臨床的に重要な複雑な特性（
例えば、それらの活性化状態または他の細胞に対する結合）が、決定され得る。

【００２０】本発明のデバイスの特定の実施態様において、上記の方法に効果を及ぼすこと
において使用されるスライドは、流体試料をロードする導管と共に提供される。
ここで、二次接着手段を有する、妨害しないゲーティング手段は、導管の最小領
域において提供される。上記ゲーティング手段は、予め選択された限定されたゲ
ーティング領域において二次接着手段の適用と共に、それに付着する接着手段を
有する細胞の接着に影響を及ぼす。

【００２１】本発明の方法に従って、試料基板の表面の限定領域に対して特定の型の細胞を
接着するために、３つの異なる技術が存在する。

【００２２】第１の技術において、異種試料の細胞を常磁性粒子と反応させる。常磁性粒子
は、粒子を抗体に結合させる材料で被覆されており、そしてこの抗体は、この試
料中の目的の細胞型の表面上で抗原に結合するために選択される。次いで、異種
試料を、被覆された常磁性粒子と反応させる。これによってこの粒子は目的の細
胞（または目的の細胞のサブセットを含むセットの細胞）に結合する。生物学的
アッセイにおいてこのような粒子を製造および使用するための技術は、米国特許
第３，９３３，９７７号；同第３，９７０，５１８号；同第４，０１８，８８６
号；同第４，０４７，８１４号；同第４，２１９，４１１号；同第４，２３０，
６８５号；同第４，６９５，３９３号；同第５，４１１，８６３号；および同第
５，５４３，２８９号に記載される。

【００２３】目的の細胞は、基板に接着され、そしてそれによって以下の手順のいずれかに
よって、無関係の細胞から分離される：ａ）懸濁液を、フローチャンバ中の磁場をあふれ出させるように作製して、表
面上に目的の細胞を保持し得る。上記の全てにおいて、この常磁性材料は、二次
接着手段を含む（これは、米国特許第４，２１９，４１１号；同第４，７３１，
３３７号および同第５，０５３，３４４号に記載される手段に類似する）。

【００２４】ｂ）目的の細胞は、静止した流体内の懸濁された細胞を通して磁場を移動し、
それによって、細胞は、本来の静止された懸濁液の中または外側の領域に対する
磁場に従うことによって、無関係の細胞から分離され得る。（米国特許第３，９
８５，６４９号、同第３，７１２，４７２号、同第４，２７２，５１０号、同第
４，２９２，９２０号、および同第５，５６７，３２６号を参照のこと）。先行
技術はまた、磁場によって１つの液相から第２の液相へ粒子および細胞を移動さ
せることを記載する（例えば、米国特許第４，７７７，１４５号および同第５，
２７９，９３６号）。

【００２５】選択された細胞を表面領域に接着する第２の方法は、所望の限定領域において
、抗体を基板表面上に直接的に沈着することである。試料を表面に接触させ、直
ちに、目的の細胞表面上の抗原は表面上の対応する抗体に結合し、および無関係
の細胞を洗い流す。セルロース結合ドメインのような試薬は、抗原の捕捉を達成
するために、表面に結合する抗体を増大させるために市販されている。この技術
は、Ｎｏｒｄｅｎら、ＡｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｏｄｅｌｏｆＡ
ｆｆｉｎｉｔｙＣｅｌｌＳｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１６
：１５〜３３（１９９４）によって総説されている。

【００２６】本発明に従って、選択された細胞を表面領域に接着する第３の方法は、多孔を
有する膜フィルターを使用することである。これは、他が保持されている間に、
特定の型の細胞を膜に選択的に通過させることを可能にする。この方法論は、一
般に血球を分離するために、ならびに赤血球および血小板（これらは、白血球が
膜表面上に保持されている間に、容易に５ミクロンのサイズの孔を通過する）か
ら白血球を分離するために有利に使用されている。このようなフィルターは、Ｏ
ｓｍｏｔｉｃｓ，Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡのような多くの供給元から市販され
ている。これらの膜は、膜表面上にあふれ出すように作製される試料と共に、Ｍ
ｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡによっ
て製造されるＭＦＳＢｏｒｏｓｉｌｉｃａｔｅ微小繊維のような吸収剤上に積
層され得、それによって、無関係な細胞および流体が孔を通過する間、選択され
た細胞を捕捉する。試料がマーカー試薬と混合された後に、フィルター表面に対
して、毛管作用が試料の流動を生じるために利用され得る。吸収剤は、廃液リザ
ーバとして作用するチャンバにおいて、膜の下に配置され得る。

【００２７】先行技術は磁性の、抗体の接着および濾過技術を備えているが、先行技術は、
レーザー走査型サイトメトリーを用いるような細胞構成要素の分析のための磁性
の親和性付着または濾過の使用を教示も示唆もしていない。

【００２８】一般に、フローサイトメトリーを用いて、細胞を蛍光色素に結合体化した抗体
と反応させ、次いで洗浄する。複数の遠心分離を使用して、反応試薬から細胞を
分離して、反応工程および洗浄工程を実行する。また、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ
ｑｕｅのような物理的な分離技術または細胞分析技術を使用して、無関係な細胞
の数を減少させる。本発明に従って、レーザー走査型サイトメトリーは、記載さ
れるような固相アッセイの利用を開発するために利用される。

【００２９】本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の説明および図面から、より明
らかになる。

【００３０】（発明の詳細な説明）本発明の方法およびデバイスは、レーザー走査型サイトメトリ技術の使用と組
合わせられた場合に、多くの特定の細胞構成成分のアッセイを実施し得る機器シ
ステムの開発を可能にする。これにより、熟達していない使用者が、注意点を伴
う機器として、迅速に結果を得ることが可能である。多くの臨床的に重要なアッ
セイを、本発明の使用を示す実施例によって以下に記載する。これらの臨床的に
重要なアッセイは、フローサイトメトリを使用して開発されてきたが、フローサ
イトメトリの使用に固有の問題の理由から、慣用的な臨床医学において使用され
てこなかった。

【００３１】（実施例Ｉ）レーザー走査型サイトメーターによって実施可能なアッセイの中には、新生児
または成体の敗血症によって引き起こされる特定の血球の活性化についての試験
があり、これは、これらの細胞と細菌との相互作用から生じる血液顆粒球の活性
化を測定することによって検出され得る（例えば、ＤａｖｉｓらＮｅｕｔｒａ
ｐｈｉｌＣＤ６４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｉｎｄｉｃａｔｏｒｏｆａｃｃｕｔｅｉｎｆｌａｍａｔｉｏ
ｎａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｉｔｏｒｏｆｉｎｔｅｒｆｅ
ｒｏｎ−γ ｔｈｅｒａｐｙ、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ
１：３−１２（１９９５）を参照のこと。全血からの白血球は、ＣＤ４５抗体に
よって標本基板の狭い面積の表面上で捕捉される。蛍光色素をＣＤ１５と結合し
て顆粒球に結合し、それによって顆粒球を同定するために使用する。抗体ＣＤ１
１ｂ（これは、細胞の活性化状態の機能として、顆粒球表面上で発現される）に
結合した第２の色素の蛍光を、レーザー走査型サイトメーターによって測定する
。成体の敗血症に対する試験を、ＣＤ１１ｂの代わりに抗体ＣＤ６４に置換する
ことによって実施する。

【００３２】さらに、成体において、ＣＤ１１ｂ顆粒球活性化を使用して、血管形成術また
はステント手術後の患者の状態を決定する。抗血小板抗体またはトロンビンによ
る表面へのそれらの捕捉およびＣＤ４２ｂのような抗体によるそれらの同定の後
に、ｐ−セレクチンに対するＡＡＣ−２のような抗体によって測定されるような
、血液の別の構成成分である血小板の活性化を、心臓血管疾患についてのアッセ
イにおいて使用する。

【００３３】（実施例ＩＩ）心筋梗塞（ＡＭＩ）ならびに他の血管病理の早期検出についての感受性アッセ
イが考案され、そしてフローサイトメトリを使用して試験されている（米国特許
第５，５０３，９８２号に記載される）。このアッセイは、動脈損傷後に、循環
する血小板が活性化され、血液単核細胞に結合する血小板表面へのｐ−セレクチ
ンの輸送を生じるという発見に基づく。患者の血液標本中での、複合体化されて
いない単核細胞に対する血小板と複合体化された単核細胞の高い比率が、ＡＭＩ
の指標となる。

【００３４】本発明に従って、ＣＤ４５抗体によって狭い面積の表面上に全血由来の白血球
を捕捉し、そして単核細胞に結合するＣＤ１４抗体に蛍光色素を結合して、そし
てそれらを同定するためにこれを使用し得る。ＣＤ４２ｂ抗体またはＣＤ６１抗
体（これは、血小板に結合する）に結合した第２の蛍光色素の蛍光を測定する。
単核細胞の総数に対する第２の蛍光を有する単核細胞の数の比率を、アッセイの
測定において使用する。

【００３５】（実施例ＩＩＩ）本発明の方法を使用して、細胞表面上の薬物占有率についてアッセイする。こ
のタイプの１つの重要な臨床的に有用なアッセイは、血小板タンパク質ＧＰＩＩ
ｂ／ＩＩＩａが薬物に結合されているかまたは血小板タンパク質ＧＰＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａがフィブリノゲンに結合し得るかのいずれかを測定することである（米国
特許第５，４４０，０２０号に記載される）。そのような薬物は、種々の心臓血
管疾患の処置のために開発される。過剰な処置は他の状態（例えば、発作）をも
たらすので、これらの薬物の占有率のレベルをモニターすることが必要である。
これらの薬物の診断的アッセイを実施するための技術は、米国特許第５，１１４
，８４２号に開示される。

【００３６】本発明の方法に従って、血液をＡＤＰアゴニストによって活性化し、薬物に占
有されていない血小板へのフィブリノゲンの結合を生じさせる。その後、全血標
本由来の血小板を、ＣＤ４２ｂ抗体によって狭い面積の基板表面上に捕捉する。
蛍光色素をＣＤ４１抗体（これは、フィブリノゲンの結合領域とは異なる領域中
でＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａタンパク質と結合する）と結合する（米国特許第５，３
７２，９３３号）。ＲＩＢＳ抗体（これは、順に、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
に結合される場合に、フィブリノゲンに結合する）に結合した第２の蛍光色素の
蛍光を測定する。各捕捉された血小板についての第１の蛍光強度に対する第２の
蛍光の比率を測定し、そしてこの比率の分布およびその推定される誘導体を、ア
ッセイの測定としてレポートする。

【００３７】本発明の方法はまた、免疫表現型を分類する（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐ
ｉｎｇ）（例えば、ＡＩＤＳ患者のモニタリングのため、または種々の白血病を
診断するためにＴ４細胞をカウントする）ために使用され得る。これは現在、集
中化されたフローサイトメトリー機器のための主な適用であり、そして結果が迅
速には必要とされないので臨床的に使用され、その結果、高価で労働集約的なフ
ローサイトメーターが使用され得る。

【００３８】しかし、レーザー走査型サイトメーターを伴って使用される場合、本発明は、
白血球の示差的なカウントの非常に高容量の臨床的アッセイの理由により、別に
有用である。なぜなら、レーザー走査は視覚的な観察に対して事象を再配置する
ことが可能であり、これはフローサイトメトリでは可能ではないからである。本
発明の使用では、全血由来の白血球をＣＤ４５のような抗体によって狭い面積の
表面上で捕捉し、ＣＤ３のような抗体（これはＴリンパ球に結合する）に蛍光色
素を結合させ、そしてそれらを同定するためにこれを使用し得る。そしてＣＤ４
のような抗体（これはＴ４ヘルパーリンパ球に結合する）に結合した第２の蛍光
色素の蛍光を測定する。Ｔリンパ球の総数に対する第２の蛍光を有するＣＤ４陽
性細胞の数の比率を、アッセイの測定として使用する。これは、他の細胞型を検
出するために、多くの他のＣＤ抗体に拡張され得る。本開示の方法は、抗体に結
合した２つより多い蛍光色素を使用することによって、１つの型の細胞の検出以
上に拡張され得ることが意図される。

【００３９】（図面および好ましい実施態様の詳細な説明）図１ａおよび１ｂを参照して、標本（例えば、患者由来の血液）を、閉鎖され
た末端のチューブ１中に置く。チューブ１は、採血のために使用される標準的な
真空容器（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）であり得、これはその頂部にゴム製の密封挿
入物１２を有する。チューブ１は、ディスポーザブル２のスリーブ１３内に挿入
され、それによってチューブ３およびチューブ４の挿入物１２への貫通を引き起
こす。ディスポーザブル２（好ましくは、成形プラスチック材料製）は、３つの
チャンバー５、７および８、ならびに２つのポート６および９を備える。試薬は
、ディスポーザブルのチャンバー５内に含まれる。１つの実施態様において（こ
こでは、抗体で被覆された磁性粒子を使用して、表面への細胞の接着を引き起こ
す）、チャンバー５は被覆された磁性粒子を含む。好ましい実施態様において、
チャンバー５は細胞性抗原に対する２つ以上の抗体（これらは各々異なる蛍光色
素に結合される）を含む。チャンバー５は、チューブ４ならびにポート６に連結
される。標本チューブ１およびディスポーザブル２からなるアセンブリは、図１
１に示される分析機器８０の標本の入り口ポート８１内に挿入される。

【００４０】アッセイは、試験サイクルを開始する機器の入力キーを押すことによって、使
用者により起動される。機器内の圧力供給源に連結されたポート６を加圧し、次
いで加圧中でサイクルして、チャンバー５に含まれる試薬をチューブ４を通して
侵入させ、そしてチューブ１中で標本と混合する。この試薬は２つ以上の抗体を
含み、各々は異なる蛍光色素に結合される。好ましい実施態様において、これら
はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびフィコエリトリン（Ｐ
Ｅ）であり、これらはアルゴンイオンレーザーの波長エネルギーによって励起さ
れる。ＣＹ３、ＣＹ５、ＡＰＣ、ＣＹ５．５、またはＣＹ７のような他の色素は
、他の気体または半導体レーザーによる励起のために使用され得る。細胞が磁場
によって接着される好ましい実施態様の試薬はまた、ＣＤ４５のような抗体（こ
れは、ＣＤ４５についての白血球細胞の抗原のような、細胞表面抗原に結合する
）で被覆された磁性粒子を含む。そのような粒子は、ＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅＢ
ｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡから市販される。表面上で被
覆された抗体によって直接的に細胞を捕捉する別の実施態様においては、磁性粒
子は試薬の一部ではない。

【００４１】ポート６を通して圧力を変化させることによって標本を混合するインキュベー
ション期間の後、ポート６を通した圧力は維持されるが、ポート９は開かれる。
標本混合物は、チューブ３からチャンバー７まで流動する。チャンバー７は、標
本細胞が、より低い表面上すれすれ（ここには、磁場の勾配が存在する）を流動
するように深さ５０〜４００ミクロンの寸法を有する。チャンバー７の幅は、良
好な統計学的結果のために捕捉されることが必要とされる細胞数に依存した値で
セットされる。なぜなら、細胞は流れに対して垂直に捕捉されるからである。代
表的なチャンバーの幅は約５ｍｍである。磁石を、エリア１０で流れに対して垂
直な線に沿って強力な磁気勾配を生成するように、機器内に配置する。これは実
施例において、チャンバー７に対して方向付けられた磁極面、およびエリア１０
の中心線に配置された磁石端を有する長方形の棒磁石を使用することによって達
成される。磁気勾配を増強するために、チャンバー７は、流れに対して垂直にデ
ィスポーザブル中に埋め込まれた、三角形の断面を有する常磁性のワイヤを含み
得、その結果ワイヤの頂部が細胞流動に接近し、そして底部が磁石と接触する。
標本はチャンバー７を通して流動するので、磁性粒子に結合した細胞は、エリア
１０において接着する（すなわち、これは事実上、細胞についての予め決められ
た「ゲーティングエリア（ｇａｔｉｎｇａｒｅａ）」である）。ポート６は、
次いで、チャンバー５を通り、そしてチャンバー７に入る流動のために作製され
たリン酸緩衝化生理食塩水の供給源に連結される。これによって、表面エリア１
０から不適切な細胞を洗浄する。廃棄物はチャンバー８に回収される。細胞は、
チャンバー７の幅および磁場勾配に特徴的な分布幅によって規定されるエリア１
０（非流動の妨害ゲート）にわたって回収される。場およびチャンバーの寸法は
、目的の細胞が、使用される標本について単層として捕捉されるように適切に調
整される。他の実施態様において、細胞は、磁場および磁性粒子の代わりに、抗
体を被覆した表面エリア１０を使用して捕捉され得る。

【００４２】細胞捕捉相の完了後、表面エリア１０は、図２に概略的に示されるようなレー
ザー走査型サイトメーターによって走査される。この走査は、好ましくは細胞を
捕捉するために使用されたものと同じ機器内にて実施され得るか、または第２の
独立した機器内で実施され得る。ディスポーザブル２６は、可動性ステージ３３
に保持される。この機器は、アルゴンイオン、ＨｅＮｅ、または半導体レーザー
のようなレーザー２０を含み、そしてこの選択は使用される蛍光色素に依存する
。レーザー光線２１は、二色性ミラー２２によって反射され、そしてコンピュー
ター制御された走査ミラー２３に反射される。そのような走査ミラーは、例えば
、ＧｅｎｅｒａｌＳｃａｎｎｉｎｇ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、ＭＡから市販され
る。この光線をレンズ２４および２５を通過させて、エリア１０に焦点を合わせ
た線走査を作製する。この線走査の寸法は、好ましくは走査範囲内の細胞捕捉エ
リアの幅であり、そしてビーム直径で５〜１０ミクロンである。ディスポーザブ
ル２６は、ステージ３３により走査に対して垂直に可動して、エリア１０の全て
をラスター走査する。各細胞はレーザー光線と衝突すると、走査点内の各蛍光色
素の量に比例して蛍光の光を放射する。この蛍光はレンズ２５によって回収され
、そしてレーザー光路２１を通して戻って画像化され、ここでこれは二色性ミラ
ー２２を通過するように視準化する。好ましい実施態様において、２つの蛍光放
射が測定される。二色性ミラー２７は、２つの波長範囲に放射を分割し、光学フ
ィルター２８および３１は、光センサー２９および３２によって検出される波長
範囲をさらに規定する。抗体で被覆したエリア１０を使用する実施態様において
、前方角散乱を測定するための第３の検出器を使用して、細胞のデータを見出し
、そして個々の細胞に属するデータを隔離することが意図される。この検出器は
、ディスポーザブル２６の下方に、レーザー光路に沿って配置される、光遮断バ
ーおよび光センサーからなる。

【００４３】全てのフォトセンサーからのデータシグナルを、固定速度（例えば、６２５，
０００Ｈｚ）で同時にデジタル化する。スキャンミラーおよびディスポーザブル
プラットフォームの移動に起因してスキャンビームが領域１０を横切る場合、デ
ジタルデータのラスターまたはピクセル値が生成され、そしてコンピュータのメ
モリ内に保存される。図３は、蛍光放射細胞をスキャンする場合の１つのセンサ
ーからのデータを示している。ここで、各ピクセル位置での密度はデータ値を表
している。代表的な細胞からのデータは、ピクセル３０により表される。設定閾
値を越える設定番号の連続値が任意のセンサーデータに見出された場合、細胞が
見出される。あるいは、細胞データの存在を検出し、そして細胞データを確認す
るためにスキャッターセンサーを使用し得る。コンピュータープログラムはまず
、見出された各細胞に属するデータを確認する。これは細胞を取り囲む輪郭３１
’を閾値で生成する。センサー輪郭の最も大きな輪郭を選択し、そして全ての細
胞データが使用されるようにこれを拡大する。次いで、各輪郭内のピクセル値を
合計する。２つのさらなる輪郭３２’および３３を、コンピュータによって、輪
郭３１’からの設定間隔を作成する。各センサーについて、これらの輪郭間のピ
クセル値を平均して、対応する細胞センサー合計から減算されるバックグランド
レベルを決定する。統合値の結果は、各センサーにより検出されるその細胞から
の蛍光放射に比例し、そしてまたこの結果は、細胞上の特異的抗原または蛍光色
素分子に結合した他の成分の数に比例する。

【００４４】さらなる情報（例えば、各細胞の輪郭におけるピクセル数と等しい輪郭領域ま
たは輪郭における最大ピクセル値）を算出し得、そしてそれらを使用して、細胞
クラスターから単一の細胞を区別し得、そして細胞状態を区別し得る。

【００４５】上記のように決定された統合値を使用して、使用者に提示される情報の内容を
決定する。このデータは、実施例に記載されるように、２つのパラメータ散布図
、度数分布図、または数値として提示され得る。この結果を、スクリーン、英数
字表示、または印刷された形式で表示し得る。

【００４６】本発明に従って、種々の細胞の決定および特徴付けのレーザースキャンサイト
メトリーから得られる試験を証明するような以下の実施例を提供する。

【００４７】（実施例１）本実施例は、細胞を規定された領域内の表面に接着するための磁性粒子捕捉を
使用して、特定のディスポーザブル設計に対する細胞捕捉の有効性を測定するた
めの実験を記載する。全血液を、イソチオシアン酸フルオレッセイン（ＦＩＴＣ
）に結合された抗体を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１：１に
希釈した。このサンプルに関して、全ての白血球に結合するマウス抗ヒト抗体Ｃ
Ｄ４５を使用した。インキュベート期間後、ＰＢＳで細胞を洗浄し、そして５０
μｌのＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの抗マウス抗体に結合され
た磁性粒子を、１００μｌの試料に添加した。

【００４８】図４に概略して示されるディスポーザブルデバイス４０を、標準的な顕微鏡ス
ライドに５ｍｍのワイドチャネルを有する２００μの厚さの接着被覆マイラーテ
ンプレート４１を接着することによって構築した。標準的なガラスのカバーガラ
ス４３を、２００μ×５ｍｍのフローチャンネル４２を形成するようにこのスラ
イドの中央に接着した。棒磁石を、一方の極がスライドの背面と直接接触し、そ
して流路と直角であるようにこのスライドの下に接着した。２つの強力な傾斜磁
場を試料流路に沿って配置するこの方法により、磁石の２つの縁の近傍において
、磁気被覆された細胞の最大捕捉が生じると予期される。

【００４９】試料をフローチャンネルの右側にピペットで移し、そしてこの試料をチャンネ
ルを通じて毛管作用により流動させた。コットンウィックをフローチャンネルの
左端に配置し、次いでＰＢＳをフローチャンネルにピペットで移し、このスライ
ドに付着していない全ての無関係の細胞を洗浄除去した。これは、スライド表面
に付着している過剰の磁性粒子に由来するライン４４の、磁石の第１の端に一致
する位置（傾斜磁場が最も強い）での出現を生じた。

【００５０】ディスポーザブルスライドをＣｏｍｐｕＣｙｔｅＬＳＣ（商標登録）（Ｃｏ
ｍｐｕＣｙｔｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）（レー
ザー走査型サイトメーター）の顕微鏡ステージ上に配置し、そしてカバーガラス
領域部分をスキャンして、ＦＩＴＣ蛍光の検出に基づいて、見出される各細胞の
位置を確認した。各細胞の位置を図５ａの散布図５０として提示し得、ここにお
いて、各ドットはＸおよびＹの座標軸で細胞を表す。流路に沿う位置の関数とし
て細胞数を、図５ｂの度数分布図５１のようにプロットし得、ここにおいて、各
Ｘ位置で細胞数をプロットする。

【００５１】磁石の先行端および後続端での傾斜磁場が等しいと想定される場合、試料およ
び洗浄液がチャンバーを通って流動する間、適所で捕獲され得る細胞を設定およ
び固定する効率を算出することが可能である。この実験において、第１の勾配近
辺で捕捉された細胞数は、第２の勾配近辺での数の約２倍である。勾配間で捕捉
された少量の細胞について、効率は約５０％として算出される。目的の細胞のサ
ブセットの偏った捕捉が存在しない場合、本発明の実行は高い効率を必要としな
いことに注意すべきである。スキャンされ得る狭い領域内で統計学的に有意な数
の細胞を捕捉することが要求される。

【００５２】（実施例２）実施例１に記載されるように構成されたディスポーザブルは、残りの全ての実
施例で使用された。この例において、使用された同じ抗体を用いて細胞を捕捉し
て、第１の蛍光色素を用いてそれらの存在を検出する。そして、これらの細胞の
特性を、第２の抗体および蛍光色素を使用して測定する。

【００５３】全血の試料を、ＦＩＴＣ結合マウス抗ヒト抗体ＣＤ４２ｂ（血小板に結合する
）およびフィコエリトリン（ＰＥ）結合マウス抗ヒト抗体ＡＣＣ−２（活性化し
た血小板の表面に見出されるｐ−セレクチンに結合する）を含むＰＢＳと１：１
で混合した。ＰＥ蛍光は、ＦＩＴＣ蛍光から適切な光学的フィルターにより分離
し得る波長である。この実施例は、患者の血液試料における活性化された血小板
の数および程度を示すことを意図する。インキュベーションの後、５０μｌの抗
マウス抗体結合磁性粒子を１００μｌの混合物に添加し、インキュベートし、そ
してフローチャンバーに加えた後にＰＢＳで洗浄した。これを、ＡＣＣ−２抗体
を含まない第二のコントロール血液試料を用いて繰り返した。これらの２つの試
料のアッセイの後に得られたＬＳＣディスプレイを、図６ａ〜ｄに示す。コント
ロール試料において検出された血小板の位置分布を、図６ａの散布図６０および
図６ｄの度数分布図６１として示し、そしてこれらは実施例１と類似する。図６
ｃのスペクトル重複を補正した散布図６３は、プロットしたＡＣＣ−２抗原測定
値対血小板あたりのＣＤ４２ｂ抗原に基づいた活性化のレベルを示す。フローサ
イトメトリー表現型決定において実施される場合、このデータをフィルタースペ
クトル重複について補正した。図６ｂのディスプレイ６２の４つの象限各々にお
ける事象数を計数した。８３％の血小板事象が、図６ｃのコントロール試料の散
布図ディスプレイ６３（この象限における計数は１２％であった）と比較した場
合、相対的に高レベルのＡＣＣ−２ｐ−セレクチン発現を有した。

【００５４】他の抗体（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａまたはフィブリノーゲン、および血
小板のｐ−セレクチンに結合する抗体）を使用して細胞の活性化を測定し得るこ
とが理解される。本方法は、ＣＤ１１ｂまたはＣＤ６４のいずれか、あるいは活
性化された顆粒球上で発現される他の抗体を使用して、顆粒球の活性化を測定す
るために使用されることもまた考えられる。第１の抗体が、目的の細胞を捕捉す
るために使用される抗体と異なり得ることもまた理解され得る。

【００５５】（実施例３）これは、好ましい実施態様の適用の例である。ここにおいて、細胞を第１の抗
体を有する微小表面領域に捕捉し、第２の抗体を用いて細胞サブセットを同定し
、そしてそのサブセットの細胞の特徴を第３の抗体を用いて測定する。この実施
例は、血小板と複合体化した単球の割合を決定するためのアッセイを例示する。
このことは、心臓血管損傷が、循環している血液を活性化し、次いでその血小板
が順々に単球に結合するという先行技術において示されている。血小板非結合単
球に対する血小板結合単球の比率のアッセイは、心臓血管損傷（例えば、急性心
筋梗塞）の指標である。

【００５６】同じ個体由来の全血の２つのサンプルを入手した。２μＭのＡＤＰおよび５ｍ
ＭのＧＰＲＰを１つのサンプルに添加して、血小板を活性化した。血小板を活性
化した場合、血小板は単球を誘導するいくつかの白血球に結合した。各サンプル
を、３つの抗体を含むＰＢＳと１：１の割合で混合し、第１のマウス抗ヒトＣＤ
４５をＰｅｒｃｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの磁性粒子に結合した。Ｃ
Ｄ４５は、白血球上の共通の白血球抗原に結合する。第２の抗体、つまりマウス
抗ヒトＣＤ１４をＦＩＴＣに結合した。これは、単球に結合する。第３の抗体、
つまり血小板に結合するマウス抗ヒトＣＤ４２ｂを色素フィコエリトリン（ＰＥ
）に結合した。次いで、このサンプルをパラホルムアルデヒドを１％濃度まで添
加することによって固定して、血小板の活性化をさらに阻害した。各混合物を実
施例１に記載されるようなディスポーザブル内に配置した後、不適切な細胞をＰ
ＢＳで表面から洗浄した。各スライドをＬＳＣレーザースキャンサイトメーター
上でアッセイし、色素の各々から蛍光を測定した。細胞を検出し、そして各細胞
からのデータを、単球上のＣＤ１４に結合したＦＩＴＣに由来する緑色蛍光に基
づいて補正した。図７は、ＣＤ４２ｂ−ＰＥに結合した血小板に由来する燈色蛍
光の各補正における最大値の、重ね合わせた２つの度数分布表を示す。非活性化
サンプルの曲線７１は、活性化されたサンプルのアッセイ結果７２と明らかに異
なる。このことは、好ましい実施態様を使用して、血液試料における血小板単球
複合体についてアッセイし得ることを示す。

【００５７】この実験は、同じ色素を結合した抗体および捕捉試薬を使用して反復されたが
、新鮮な希釈されていない血液および固定されていない血液を、刺激されていな
い試料および刺激された試料の両方について使用した。この実験において、１０
μＭのＡＤＰを使用して血小板の単球への接着を刺激した。その結果を図７に示
す。ここにおいて、曲線７３は刺激されていない試料からのデータを表し、そし
て曲線７４はＡＤＰ刺激された試料からのデータを表している（これらは、見出
された各細胞のＣＤ４２ｂ−ＰＥの全蛍光を測定した）。図７の別のグラフにお
いて、７５は、刺激されていない試料からのデータを表し、そして７６は、ＡＤ
Ｐ刺激された試料からのデータを表している（見出された各細胞のＣＤ４２ｂ−
ＰＥの最大蛍光を測定した）。新鮮な同じ血液の刺激された試料および刺激され
ていない試料からの２つの集団は、明らかに識別可能である。血小板が活性化さ
れる場合、ＣＤ４２ｂが結合する抗原を減少し得るので、この実施例のアッセイ
に関して、他の血小板抗体（例えば、ＣＤ６１およびＣＤ４１）がＣＤ４２ｂよ
りも好ましいかもしれないことに注意されたい。

【００５８】（実施例４）実施例３のような好ましい実施態様の方法を使用して、Ｔ４抗原を発現してい
るリンパ球の割合をアッセイした。これは、ＡＩＤＳ患者をモニターするための
フローサイトメトリーについて行われるアッセイと共通のアッセイである。この
実施例において、試料をＣＤ４５磁性粒子と混合して、上記のように白血球を補
足した。この実施例において、試薬混合物は、ＰＥに結合されたマウス抗ヒトＣ
Ｄ３抗体およびＦＩＴＣに結合されたマウス抗ヒト抗体ＣＤ４を含んだ。ＣＤ３
はＴリンパ球上に見出される抗原に結合するが、ＣＤ４はＴ４またはヘルパーＴ
リンパ球に結合する。

【００５９】図８の散布図データを生じるスライドを実施例４に記載されるようにしてアッ
セイした。ＣＤ４を発現しているリンパ球は、残存しているＴリンパ球よりもよ
り高い緑色蛍光を有する。そしてＣＤ４を発現しているリンパ球は、ＣＤ４対Ｃ
Ｄ３の散布図の上部のクラスターを表す。ゲート領域を使用して、このアッセイ
は約５８％のＴ細胞がＴ４であることを示した。

【００６０】（実施例５）この実施例は、一般的な白血球の示差的計数を実証するための好ましい実施態
様を使用する。全血の標本を、磁性粒子に結合したＣＤ４５、および単核特異的
マウス抗ヒト抗体ＣＤ１４、および顆粒球特異的マウス抗ヒト抗体ＣＤ１５を用
いて、実施例３および４のように調製した。ＣＤ１４をＦＩＴＣに結合させ、そ
してＣＤ１５をＰＥに結合させた。スライドを２回アッセイし、１回目に緑色の
蛍光のデータを用いて輪郭を決定し、そして２回目にオレンジの蛍光を用いて輪
郭を決定した。これは、この方法でなされた。なぜならば、ＣｏｍｐｕＣｙｔｅ
ＬＳＣは、セグメントの細胞データに対して同時に２つのセンサーを使用する
手段を有していないからである。得られたデータを図９ａおよび９ｂに示す。こ
こで、２つの散布図は、それぞれ２つの各アッセイから得られたデータを示す。
オレンジの蛍光ゲートの散布図は、オレンジの蛍光を発現する９５％の細胞がＣ
Ｄ１５陽性であり、顆粒球であることを示す。象現領域４において約２９２０の
細胞を計測した。緑色の蛍光ゲートの散布図は、高いレベルのＣＤ１４を発現す
る象現領域１において９２％の細胞を示し、それらは顆粒球である。領域１にお
いて約８００の細胞を計測した。

【００６１】（実施例６）本実施例は、アゴニストｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）によって全
血の顆粒球の活性化の決定を実証するための好ましい実施態様を使用する。同じ
血液の標本の２つのサンプルを得た。１つのサンプルに、３７℃で、１０μＭ
ｆＭＬＰを添加し、そしてそのサンプルを１０分間インキュベートし、サンプル
の顆粒球の活性化をもたらした。両サンプルを２つの抗体を含むＰＢＳと１：１
で混合した。マウス抗ヒトＣＤ１５をＦＩＴＣに結合させ、そして顆粒球に結合
させた。第２の抗体である、顆粒球の活性化抗原に結合するマウス抗ヒトＣＤ１
１ｂを、色素フィコエリトリン（ＰＥ）に結合させた。インキュベーション期間
の後、パラホルムアルデヒドを最終濃度１％になるまで添加した。次いで、磁性
粒子に結合した５０μｌの抗マウス抗体を、１００μｌの各混合物に添加し、イ
ンキュベートし、そしてフローチャンバーに添加し、その後ＰＢＳで洗浄した。
各標本をＬＳＣサイトメーターでアッセイし、顆粒球に結合したＦＩＴＣからの
緑色の発光に基づく事象を検出および輪郭を描いた。ＣＤ１１ｂの顆粒球活性化
抗原への結合より生じたオレンジのＰＥ蛍光を測定した。これらの２つの標本の
アッセイ後に、得られた重ね合わせたＬＳＣヒストグラム提示を図１０ａに示す
。非活性化サンプルの細胞あたりの蛍光分布は、９１のように示される結果であ
り、そして活性化サンプルは分布結果９２を有した。これらの分布は、明らかに
互いに識別可能である。

【００６２】本実験を、同じ色素を結合した抗体および１０μＭｆＭＬＰ刺激剤を用いて
、非希釈血液で繰り返した。しかし、本実験において、この標本を洗浄せず、そ
して標本をＣＤ４５抗体に結合した磁性粒子と共に３０分間インキュベートし、
表面上でそれらを捕捉した。ＣｏｍｐｕＣｙｔｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＬ
ＳＣサイトメーターにおけるこれらの標本のアッセイの結果を図１０ｂに示す。
これは、２時間以内の引き抜きでアッセイした血液を曲線９３として示し、６時
間後にアッセイした血液を曲線９４として示し、そして同じ患者の血液の刺激化
標本を曲線９５として示し、細胞あたりＣＤ１１ｂ−ＰＥ蛍光の分布を示す。刺
激化標本アッセイのデータは、両方の非刺激化標本を明らかに識別可能である。

【００６３】抗体（例えば、コーティング磁性粒子またはレクチンを有する表面）を用いず
に細胞を捕捉する他の手段が考えられることを理解すべきである。抗体に結合し
ない色素を用いて細胞または細胞のサブセットを識別する手段もまた、考えられ
る。例えば、色素（例えば、細胞性核酸により採取されるプロピジウムヨウ化物
）は、細胞構成物質との相互作用の結果として蛍光末端産物を生成する化学基質
と同様に考えられる。核酸プローブのマーカーとしての使用もまた、考えられる
。

【００６４】例えば、血液、薬品、または食物中に含まれる細菌は、レクチンを用いて表面
上に捕捉され得、表面にコートされるかまたは磁性粒子に結合される（例えば、
Ｐａｙｎｅら、ＴｈｅｕｓｅｏｆＩｍｍｏｂｏｌｉｚｅｄｌｅｃｔｉｎ
ｓｉｎｔｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｉｌ、Ｌｉｓｔｅｒｉａａ
ｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐ．Ｆｒｏｍｐｕｒｅｃｕｌｔｕｒｅ
ａｎｄｆｏｏｄｓ、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ７３：４１−５２（１９９２）を参照のこと）。全ての細菌より採
取される核酸特異的色素を用いることによって細菌を計数し得る。（概説、Ｋｅ
ｐｎｅｒら、ＵｓｅｏｆＦｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓｆｏｒＤｉｒｅｃ
ｔＥｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｏｆＴｏｔａｌＢａｃｔｅｒｉａｉｎＥ
ｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳａｍｐｌｅｓ：ＰａｓｔａｎｄＰｒｅｓｅｎ
ｔ、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ、５８：６０３−６１５
（１９９４）を参照のこと）。表面を走査し得、そしてこの場合の蛍光事象を計
数した。さらに、第２の色素（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎ
ｅ、ＯＲ．より入手可能）を用いて、細菌が生存しているか死んでいるかを決定
し得、そして示差的計数の生存細菌に添加し得る。第３に、細菌特異的抗体を使
用して、表面上の細菌型を決定し得る（例えば、Ｖｅｓｅｙら、Ｅｖａｌｕａｔ
ｉｏｎｏｆＦｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅｓａｎｄＥｘｃｉｔａｔｉｏｎ
ＳｏｕｒｃｅｓｆｏｒＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎＷａ
ｔｅｒＳａｍｐｌｅｓ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ２９：１４７−１５４（１９９
７）を参照のこと）。第４に、リボソームＲＮＡ特異的核酸プローブを使用して
、細菌を同定し得る。このことは、Ａｍａｎｎら、Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＩｎＳｉｔｕＤｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆＩｎｄｉｖｉｄｕａｌＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｅｌｌｓｗｉｔｈｏ
ｕｔＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｖｉｅ
ｗｓ５９：１４３−１６９（１９９５）によって概説される。

【００６５】細菌を捕捉するために使用される表面を、増殖培地中に埋め込み得、生きてい
る細菌を生存可能なように保持し得ることもまた考えられる。この場合、細菌を
再び産生し得る期間の後、捕捉領域は２回目を走査され得、標本を再アッセイし
た。レーザー走査型サイトメトリーは、本実施例において記載されるように、各
細胞の位置を記録するので、任意の見出される事象の蛍光における変化を測定し
得る。事象の輪郭を描くことは、調節され得、隣接する細菌が同じ外形内にある
ように十分大きな領域を含み得る。例えば、細菌あたりの核酸を測定する場合、
生存可能な細菌は第２のアッセイ中に測定される事象あたりのＤＮＡの量を増加
させ、そしてそれらの生存力を示す。第１および第２のアッセイについて局所的
な事象のパターン（実施例１において示され、そして記載される）は、ソフトウ
ェアによって比較され、第１および第２のアッセイにおける各事象のデータに対
応を決定し得る。次いで、対応する蛍光値は、２つのアッセイの間の全蛍光また
はサイズ特性の増大によって細菌の増殖を示す。

【００６６】抗体コート細胞捕捉方法を用いて１つを超える捕捉領域を使用して、異なる抗
体でそれぞれコートし、その結果異なる型の細胞を表面の異なる領域で捕捉する
こともまた意図される。このことは、複数の蛍光色素およびこれらの蛍光を検出
するための複数の装置センサーを使用する必要がなく、複数の細胞型のより複雑
なアッセイを可能にする。さらに、１つの標本を、複数のアッセイについて試験
し得る。

【００６７】以下の実施例は、本発明に従ってもたらされる細胞分離の第３の実施態様の様
式を示す。このような実施態様において、選択的細胞分離は、記載されるような
濾過系の手段によってもたらされる。

【００６８】（実施例７）本実施例は、全血標本から全ての白血球を、５ミクロン孔を有するメンブラン
によって赤血球から分離する実施態様を例示する。本実施例は、アゴニストｆ−
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）による全血顆粒球の活性化の決定について
のアッセイを実証する。

【００６９】同じ血液標本の２つのサンプルを得た。１０ＭｆＭＬＰを、１つのサンプル
に３７℃で添加し、そしてサンプルを、１０分間インキュベーションし、サンプ
ルの顆粒球の活性化を引き起こした。次いで、各サンプルを、２つの抗体を含む
ＰＢＳと１：１の割合で別々に混合した。一次抗体（顆粒球に結合するマウス抗
ヒトＣＤ１５）を、色素フィコエリトリン（ＰＥ）と結合させた。二次抗体（顆
粒球の活性化抗原に結合するマウス抗ヒトＣＤ１１ｂ）を、色素フルオレセイン
イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合させた。

【００７０】インキュベーション期間後、１００μｌの各混合物を、ＭＦＳＢｏｒｏｓｉ
ｌｉｃａｔｅｍｉｃｒｏｆｉｂｅｒａｂｓｏｒｂｅｎｔｍａｔｅｒｉａｌ
（ＭｉｃｒｏＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）
を覆って置かれたＯｓｍｏｔｉｃｓ（カタログ番号１０５７２）、孔径５ミクロ
ン、１３ｍｍメンブランフィルターの中心へピペットで注入した。これに次いで
直ちに、２００μｌのＰＢＳをメンブラン表面の中心上へピペットで注入した。
各フィルターを取り除き、顕微鏡スライド上に置き、スリップで覆い、そしてレ
ーザー走査型サイトメーターでアッセイした。顆粒球を検出し、そして顆粒球に
結合したＰＥからのオレンジの蛍光に基づいて輪郭を描いた。顆粒球活性化抗原
へのＣＤ１１ｂの結合から生じる緑色のＦＩＴＣ蛍光を、それぞれの輪郭化事象
について測定した。ＬＳＣサイトメーターは、それぞれの見出された事象の位置
を記録および表示することが可能であるので、ＬＳＣサイトメーターはこのよう
な目的のために使用された。第一の標本について、フィルター上のそれぞれの顆
粒球の位置を、図１２ａのドットプロット１０１として表示する。これらの２つ
の標本のアッセイ後、生じた１細胞あたりのＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ蛍光を重ね合
わせたＬＳＣヒストグラムの表示を図１２ｂに示す。非活性化サンプルの１細胞
あたりの蛍光の分布を、１０３として示し、そして活性化サンプルを分布１０４
として示す。これらの分布は、明らかにお互いに区別可能である。このヒストグ
ラム表示を、境界線１０５によって２つの領域に分け、そして境界の右（ＣＤ
１１ｂ陽性）側の細胞の数を、それぞれの非刺激化および刺激化標本について決
定した。これらのアッセイについて非刺激化数は、計数された全細胞の１５，８
８２個中８７個、すなわち５．１％であり、そして刺激化標本の数は、９０４３
個中７３４２個、すなわち８１．２％であった。

【００７１】（実施例８）これは、細胞を小表面積のメンブランに捕捉する第三の実施態様の適用の実施
例であり、ここで細胞のサブセットを一次抗体で同定し、そしてサブセットの細
胞の特性を、二次抗体で測定する。この実施例は、血小板と複合体化した単球の
割合を決定するアッセイを例示する。

【００７２】心臓血管の損傷は、循環する血液中で、次々に単球へ結合する血小板の活性化
を生じることが従来技術において示されている。血小板が結合した単球に対する
血小板が結合しない単球の結合の割合のアッセイは、急性心筋梗塞のような心臓
血管の損傷の指標である。

【００７３】同一個体から全血の４つのサンプルを得た。２μＭのＡＤＰおよび５μＭのＧ
ＰＲＰを２つのサンプルに添加し血小板を活性化した。血小板は、活性化された
場合、単球を含むいくつかの白血球に結合する。４つのサンプルのそれぞれを、
２つの抗体を含むＰＢＳと１：１の比率で別々に混合した。単球に結合する、マ
ウス抗ヒトＣＤ１４をＦＩＴＣへ結合させた一次抗体を、全ての標本に用いた。
二次抗体（マウス抗ヒトＣＤ４２ｂ）を１つの活性化したサンプル、および１つ
の非活性化サンプルに添加し、そして抗体（マウス抗ヒトＣＤ６２）を、１つの
活性化したサンプル、１つの非活性化サンプルに添加した。血小板に結合する両
方の抗体は、色素フィコエリトリン（ＰＥ）に結合した。１００μｌの各混合物
を、実施例７に記載されるようなフィルターの中央へピペットで移し、次いでＰ
ＢＳで表面から無関係な細胞を洗浄した。メンブランをスライドへ移し、そして
スリップを各メンブラン上に置いた。各スライドを、ＬＳＣレーザー走査型サイ
トメーターでアッセイし、それぞれの色素からの蛍光を測定した。細胞を検出し
、そして各細胞からのデータにより、単球上のＣＤ１４へ結合したＦＩＴＣから
の緑色の蛍光に基づいて、輪郭を描いた。図１３ａおよび図１３ｂは、１細胞あ
たりのオレンジの蛍光値の、２組の重ね合わされたヒストグラム、ＣＤ４２ｂ−
ＰＥ標本を結合した血小板由来のヒストグラム１０６、およびＣＤ６２−ＰＥ標
本を結合した血小板由来のヒストグラム１０６を示す。非活性化曲線１１０に活
性化曲線１１１との差異が認められるように、非活性化サンプルの曲線１０７７
に、活性化サンプルのアッセイの結果１０８との明らかに差異が認められた。こ
のヒストグラム表示を、それぞれ境界線１０９ａおよび１１２によって２つの領
域に分け、そして単球および血小板の複合体（陽性のＣＤ４２ｂまたはＣＤ６２
）からなる境界の右側の細胞の計数を、非刺激化標本および刺激化標本のそれぞ
れについて決定した。これらのアッセイについてＣＤ４２ｂを用いた非刺激化の
計数は、計数した細胞の合計の２４０８個のうちの１１１個、すなわち４．６％
であり、そして刺激化標本の計数は、２２６７個のうちの１６８１個、すなわち
７４．２％であった。ＣＤ６２を用いた場合、計数した細胞の合計の６０５３個
のうちの４４８個、すなわち７．４％であり、そして刺激化標本の計数は、４６
１６個のうちの３６１４個、すなわち７８．３％であった。必要な分離を効果的
にするためのこの実施態様は、血液標本における血小板単球複合体についてアッ
セイするためにもまた用いられ得る実施態様として、好ましい実施態様である。

【００７４】特定の実施例および図面を伴う上記の議論は、単に本発明の例示に過ぎないこ
とが理解され、そして手順、材料およびプロセシングの工程の変更は、上記の特
許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく行われ得る
ことが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】図１ａは、本発明の開示の好ましい実施態様に従って構築された、ディスポー
ザブルの標本充填デバイスの略図である。

【図１ｂ】図１ｂは、本発明の開示の好ましい実施態様に従って構築された、ディスポー
ザブルの標本充填デバイスの略図である。

【図２】図２は、図１ａおよび図１ｂに示されるデバイス上で標本の測定を実施する際
に使用される、光学測定システムの略図である。

【図３】図３は、図２の光学測定システムとしての、レーザー走査型サイトメーターか
らの光検出器データの完成見取り図である。

【図４】図４は、図１ａおよび図１ｂにおいて使用されるディスポーザブルのスライド
デバイスの概略図であり、充填導管およびゲーティングエリアが示される。

【図５ａ】図５ａは、それぞれ散布図およびヒストグラムに示される、本発明の開示の実
施態様を使用するアッセイの例の、レーザー走査型サイトメーターからのデータ
である。

【図５ｂ】図５ｂは、それぞれ散布図およびヒストグラムに示される、本発明の開示の実
施態様を使用するアッセイの例の、レーザー走査型サイトメーターからのデータ
である。

【図６ａ】図６ａは、標本サンプルのアッセイの例のレーザー走査型サイトメーターから
のデータから作成された、種々のパラメータの細胞散布図である。

【図６ｂ】図６ｂは、標本サンプルのアッセイの例のレーザー走査型サイトメーターから
のデータから作成された種々のパラメータの細胞散布図である。

【図６ｃ】図６ｃは、標本サンプルのアッセイの例のレーザー走査型サイトメーターから
のデータから作成された種々のパラメータの細胞散布図である。

【図６ｄ】図６ｄは、図６ａのデータから得られたヒストグラムである。

【図７ａ】図７ａは、第３のヒストグラムを得るために分離されかつ重ね合わせられた、
血小板結合したＣＤ４２−ＰＥ−からの、レーザー走査された血球計算器データ
から得られた２つのヒストグラムである。

【図７ｂ】図７ｂは、第３のヒストグラムを得るために分離されかつ重ね合わせられた、
血小板結合したＣＤ４２−ＰＥ−からの、レーザー走査された血球計算器データ
から得られた２つのヒストグラムである。

【図７ｃ】図７ｃは、第３のヒストグラムを得るために分離されかつ重ね合わせられた、
血小板結合したＣＤ４２−ＰＥ−からの、レーザー走査された血球計算器データ
から得られた２つのヒストグラムである。

【図８】図８は、レーザー走査型サイトメーターによりアッセイされた標本から得られ
たデータより得られた、さらなる細胞散布図である。

【図９ａ】図９ａは、レーザー走査型サイトメーターによりアッセイされた標本から得ら
れたデータより得られた、さらなる細胞散布図である。

【図９ｂ】図９ｂは、レーザー走査型サイトメーターによりアッセイされた標本から得ら
れたデータより得られた、さらなる細胞散布図である。

【図１０ａ】図１０ａは、２つの標本のアッセイ後の、重ね合わせられたヒストグラムのヒ
ストグラムである。

【図１０ｂ】図１０ｂは、２つの標本のアッセイ後の、重ね合わせられたヒストグラムのヒ
ストグラムである。

【図１１】図１１は、本発明に従った標本の調製および分析において使用される分析機器
の完成見取り図である。

【図１２ａ】図１２ａは、本発明の別の実施態様の、フィルター上でのサンプルの各顆粒球
の位置のドットプロットである。

【図１２ｂ】図１２ｂは、図１２ａにおいて示されるサンプルおよび第２のサンプルの、１
細胞当たりのレーザー走査型サイトメーターのＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ蛍光のヒス
トグラムである。

【図１３ａ】図１３ａは、他の標本の１細胞当たりのオレンジの蛍光値の重ね合わせられた
ヒストグラムの２つのセットである。

【図１３ｂ】図１３ｂは、他の標本の１細胞当たりのオレンジの蛍光値の重ね合わせられた
ヒストグラムの２つのセットである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年３月２１日（２０００．３．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５ａ】

【図５ｂ】

【図６ａ】

【図６ｂ】

【図６ｃ】

【図６ｄ】

【図７ａ】

【図７ｂ】

【図７ｃ】

【図８】

【図９ａ】

【図９ｂ】

【図１０ａ】

【図１０ｂ】

【図１１】

【図１２ａ】

【図１２ｂ】

【図１３ａ】

【図１３ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/24 Ｃ１２Ｑ 1/24 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｇ０１Ｎ 15/14 Ｃ 15/14 33/48 Ｍ 33/48 33/543 ５７５ 33/543 ５７５５８１Ｈ５８１ 33/569 Ｚ 33/569 1/28 Ｊ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 2G045 AA02 BB05 CA11 CA17 CA18 CA20 CA21 CA24 CA25 CB21 FA12 FA36 FB03 FB07 FB12 GB05 GB10 GC15 2G052 AA30 AA31 AA33 AD09 AD29 AD49 BA24 FC02 GA11 HC32 4B029 AA07 AA08 AA09 AA21 BB11 CC01 CC03 CC08 CC13 FA05 FA15 GB01 GB03 GB05 GB10 HA05 HA10 4B063 QA05 QA18 QA19 QQ08 QR48 QR56 QR66 QR83 QS33 QS39 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】レーザー走査型サイトメーターを用いて走査するために静止
基板に細胞を接着するための方法であって、該方法は、以下の工程：細胞を含む異種細胞サンプルを、該細胞の少なくともサブセットを結合し得る
結合剤に曝露して、それによって、該細胞の少なくとも該サブセットを基板の限
定領域に接着する工程；該基板の該限定領域を洗浄する工程；およびレーザー走査型サイトメーターを用いて該限定領域を走査して、該細胞の該サ
ブセットの少なくとも一部の少なくとも１つの特徴を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合剤は、前
記細胞の前記サブセットに特異的な抗体を含み、そしてここで、該結合剤は、前
記基板の前記限定領域に接着される、方法。
【請求項３】請求項１に記載の方法であって、ここで、前記結合剤は、前
記細胞の前記サブセットに存在するエピトープに特異的な抗体でコートされた磁
気的に接着可能な粒子を含む、方法。
【請求項４】前記基板に磁場を適用して、それによって、前記限定領域に
おいて前記細胞の少なくとも前記サブセットを局在させる工程をさらに包含する
、請求項３に記載の方法。
【請求項５】レーザー走査型サイトメーターを使用して異種細胞サンプル
中の目的の細胞を分析するための方法であって、該方法は、以下の工程：細胞を含む異種細胞サンプルを、該細胞の少なくともサブセットを結合し得る
結合剤に曝露して、それによって、該細胞の少なくとも該サブセットを基板の限
定領域に接着する工程；該異種細胞サンプルの少なくとも一部を検出可能な標識で標識する工程。該基板の該限定領域を洗浄する工程；およびレーザー走査型サイトメーターを用いて該標識したサンプルを分析し、該細胞
の該サブセットの少なくとも１つの特徴を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項６】サンプル中の細胞を分析するための方法であって、該方法は
、以下の工程：細胞を含む異種細胞サンプルを、該異種細胞サンプル中の選択された細胞に結
合し得る第一の結合剤に曝露し、それによって、該異種細胞サンプル中の少なく
とも該選択された細胞を基板の限定領域に接着する、工程；該異種細胞サンプルを、該選択された細胞の少なくともサブセットの第一の性
質を同定するために、第一の蛍光色素を含み、かつ該異種細胞サンプルの少なく
ともいくつかに結合し得る第二の結合剤に、曝露する工程；該異種細胞サンプルを、該選択された細胞の少なくとも該サブセットの第二の
性質を同定するために、第二の蛍光色素を含み、かつ該異種細胞サンプルの少な
くともいくつかに結合し得る第三の結合剤に、曝露する工程；該基板の該限定領域を洗浄する工程；およびレーザー走査型サイトメーターを用いて、該第一の蛍光色素を検出し、それに
よって、該選択された細胞の少なくとも該サブセットの該第一の性質を決定する
工程、および該第二の蛍光色素を検出し、それによって、該選択された細胞の少
なくとも該サブセットの該第二の性質を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項７】前記第一の結合剤が、前記基板の前記限定領域に接着される
、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記第一の結合剤が、ＣＤ４５抗体を含む、請求項７に記載
の方法。
【請求項９】請求項７に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サン
プルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ１５抗体であり、前記第三の結合剤
がＣＤ１１ｂ抗体であり、前記第一の性質が顆粒球の測定を含み、そして前記第
二の性質が活性化された顆粒球の測定を含む、方法。
【請求項１０】請求項８に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サ
ンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ１５抗体であり、前記第三の結合
剤がＣＤ６４抗体であり、前記第一の性質が顆粒球の測定を含み、そして前記第
二の性質が活性化された顆粒球の測定を含む、方法。
【請求項１１】請求項８に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サ
ンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ１４抗体であり、前記第三の結合
剤が血小板結合抗体であり、前記第一の性質が単球の測定を含み、そして前記第
二の性質が単球に結合した血小板の測定を含む、方法。
【請求項１２】請求項８に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サ
ンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ３抗体であり、前記第三の結合剤
がＣＤ４抗体であり、前記第一の性質がＴリンパ球の測定を含み、そして前記第
二の性質がＴ４ヘルパーリンパ球の測定を含む、方法。
【請求項１３】前記第一の結合剤が血小板結合抗体を含む、請求項７に記
載の方法。
【請求項１４】請求項１３に記載の方法であって、該方法はさらにフィブ
リノゲンの血小板への結合を促進するための化合物で前記細胞の少なくとも一部
を活性化する工程をさらに包含し、ここで、前記異種細胞サンプルが血液を含み
、前記第二の結合剤がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合抗体であり、前記第三の結合剤
が、フィブリノゲンに結合されるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合するためのＲＩＢ
Ｓ抗体であり、前記第一の性質がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを発現する血小板の測定
を含み、そして前記第二の性質が、フィブリノゲンに結合されるＧＰＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａを発現する血小板の測定を含む、方法。
【請求項１５】請求項６に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サ
ンプルを前記第一の結合剤に曝露する前期工程の間に、該第一の結合剤が、前記
基板の前記限定領域に磁気的に引き付けられ、それによって、該基板の該限定領
域に少なくとも前記選択された細胞を接着する、方法。
【請求項１６】前記第一の結合剤が、磁気的に引き付けられ得る粒子と会
合されたＣＤ４５抗体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ１５抗体であり、前記第三の結
合剤がＣＤ１１ｂ抗体であり、前記第一の性質が顆粒球の測定を含み、そして前
記第二の性質が活性化された顆粒球の測定を含む、方法。
【請求項１８】請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ１５抗体であり、前記第三の結
合剤がＣＤ６４抗体であり、前記第一の性質が顆粒球の測定を含み、そして前記
第二の性質が活性化された顆粒球の測定を含む、方法。
【請求項１９】請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ１４抗体であり、前記第三の結
合剤が血小板結合抗体であり、前記第一の性質が単球の測定を含み、そして前記
第二の性質が単球に結合した血小板の測定を含む、方法。
【請求項２０】請求項１６に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第二の結合剤がＣＤ３抗体であり、前記第三の結合
剤がＣＤ４抗体であり、前記第一の性質がＴリンパ球の測定を含み、そして前記
第二の性質が血小板に結合したＴ４ヘルパーリンパ球の測定を含む、方法。
【請求項２１】前記第一の結合剤が、磁気的に引き付けられ得る粒子と会
合された血小板結合抗体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】請求項２１に記載の方法であって、該方法はフィブリノゲ
ンの血小板への結合を促進するための化合物で前記細胞の少なくとも一部を活性
化する工程をさらに包含し、ここで、前記異種細胞サンプルが血液を含み、前記
第二の結合剤がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ結合抗体であり、前記第三の結合剤が、フ
ィブリノゲンに結合されるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合するためのＲＩＢＳ抗体
であり、前記第一の性質がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａを発現する血小板の測定を含み
、そして前記第二の性質が、フィブリノゲンに結合されるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ
を発現する血小板の測定を含む、方法。
【請求項２３】請求項６に記載の方法であって、該方法は、前記検出工程
において得られた少なくとも１つの性質を分析して、それによって、所望の結果
を達成する工程をさらに包含し、該工程は以下：新生児における敗血症によって引き起こされた、細菌との相互作用による血液
顆粒球の活性化を検出する工程、成体における敗血症によって引き起こされた、
細菌との相互作用による血液顆粒球の活性化を検出する工程、血液顆粒球の活性
化を決定することによって、血管形成後の患者の状態を決定する工程、血液顆粒
球の活性化を決定することによって、ステントを利用する手術後の患者の状態を
決定する工程、心筋梗塞を検出する工程、血管の病理を検出する工程、細胞表面
への薬物結合をアッセイする工程、免疫表現型を決定する工程、患者由来のＴ４
細胞をモニターする工程、および前記異種細胞サンプル中の全Ｔリンパ球に対す
るＴ４ヘルパーリンパ球の比を決定する工程、からなる群より選択される工程である、方法。
【請求項２４】前記第一の結合剤が、磁気的に引き付けられ得る粒子と会
合されたレクチンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項２５】前記基板の少なくとも一部が、レクチンでコートされる、
請求項６に記載の方法。
【請求項２６】請求項６に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サ
ンプルが細菌細胞を含み、前記第三の結合剤が抗体であり、前記第一の性質が細
菌細胞由来の核酸の測定を含み、そして前記第二の性質が該抗体によって特異的
に認識される性質である、方法。
【請求項２７】請求項６に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞サ
ンプルが細菌細胞を含み、前記第一の性質が細菌細胞由来の核酸の測定を含み、
そして前記第二の性質が生細菌細胞の測定を含む、方法。
【請求項２８】請求項６に記載の方法であって、該方法はさらに、前記検
出工程を一期間にわたって繰り返す工程をさらに包含し、ここで、前記異種細胞
サンプルが増殖培地中の細菌細胞を含み、前記第一の性質が細菌細胞由来の核酸
の測定を含み、そして前記第二の性質が生細菌細胞の測定を含む、方法。
【請求項２９】請求項６に記載の方法であって、該方法は、前記検出工程
において得られた少なくとも１つの性質を分析して、それによって所望の結果を
達成する工程をさらに包含し、該工程は以下：生存可能細胞について細菌細胞を分析する工程、特定の型の細菌細胞について細
菌細胞を分析する工程、細菌細胞を計数する工程、非生存可能細菌細胞に対する
生存可能細菌細胞の比を分析する工程、および経時的に細菌細胞を分析する工程
からなる群より選択される、方法。
【請求項３０】レーザー走査型サイトメーターを用いて走査するために静
止基板に細胞を会合するための方法であって、該方法は、以下の工程：細胞を含む異種細胞サンプルを濾過して、それによって、該異種細胞サンプル
中の少なくとも選択された細胞を、基板の限定領域と会合する工程；該基板の該限定領域を洗浄する工程；およびレーザー走査型サイトメーターを用いて該限定領域を走査して、少なくとも該
選択された細胞の少なくとも１つの特徴を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３１】レーザー走査型サイトメーターを使用して異種細胞サンプ
ル中の目的の細胞を分析するための方法であって、該方法は、以下の工程：細胞を含む異種細胞サンプルを濾過して、それによって、該異種細胞サンプル
中の少なくとも選択された細胞を、基板の限定領域と会合する工程；該異種細胞サンプルの少なくともサブセットを検出可能な標識で標識する工程
；該基板の該限定領域を洗浄する工程；およびレーザー走査型サイトメーターを用いて該標識したサンプルを分析し、少なく
とも該選択された細胞の少なくとも１つの特徴を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３２】前記異種細胞サンプルの少なくとも一部を第二の検出可能
な標識で標識する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】サンプル中の細胞を分析するための方法であって、該方法
は、以下の工程：細胞を含む異種細胞サンプルを濾過して、それによって、該異種細胞サンプル
中の少なくとも選択された細胞を、基板の限定領域と会合する工程；該異種細胞サンプルを、該選択された細胞の少なくともサブセットの第一の性
質を同定するために、第一の蛍光色素に結合体化し、かつ該異種細胞サンプルの
少なくともいくつかに結合し得る第一の抗体に曝露する工程；該異種細胞サンプルを、該選択された細胞の少なくともサブセットの第二の性
質を同定するために、第二の蛍光色素に結合体化し、かつ該異種細胞サンプルの
少なくともいくつかに結合し得る第二の抗体に、曝露する工程；該基板の該限定領域を洗浄する工程；およびレーザー走査型サイトメーターを用いて、該第一の蛍光色素を検出し、それに
よって、該選択された細胞の少なくとも該サブセットの該第一の性質を決定する
工程、および該第二の蛍光色素を検出し、それによって、該選択された細胞の少
なくとも該サブセットの該第二の性質を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項３４】請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第一の抗体がＣＤ１５抗体であり、前記第二の抗体
がＣＤ１１ｂ抗体であり、前記第一の性質が顆粒球の測定を含み、そして前記第
二の性質が活性化された顆粒球の測定を含む、方法。
【請求項３５】請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第一の抗体がＣＤ１５抗体であり、前記第第二の抗
体がＣＤ６４抗体であり、前記第一の性質が顆粒球の測定を含み、そして前記第
二の性質が活性化された顆粒球の測定を含む、方法。
【請求項３６】請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第一の抗体がＣＤ１４抗体であり、前記第二の抗体
が血小板結合抗体であり、前記第一の性質が単球の測定を含み、そして前記第二
の性質が単球に結合した血小板の測定を含む、方法。
【請求項３７】請求項３３に記載の方法であって、ここで、前記異種細胞
サンプルが血液を含み、前記第一の抗体がＣＤ３抗体であり、前記第二の抗体が
ＣＤ４抗体であり、前記第一の性質がＴリンパ球の測定を含み、そして前記第二
の性質がＴ４ヘルパーリンパ球の測定を含む、方法。
【請求項３８】請求項３３に記載の方法であって、該方法は、前記検出工
程において得られた少なくとも１つの性質を分析して、それによって所望の結果
を達成する工程をさらに包含し、該工程は以下：新生児における敗血症によって引き起こされた、細菌との相互作用による血液
顆粒球の活性化を検出する工程、成体における敗血症によって引き起こされた、
細菌との相互作用による血液顆粒球の活性化を検出する工程、血液顆粒球の活性
化を決定することによって、血管形成後の患者の状態を決定する工程、血液顆粒
球の活性化を決定することによって、ステントを利用する手術後の患者の状態を
決定する工程、心筋梗塞を検出する工程、血管の病理を検出する工程、免疫表現
型を決定する工程、ＡＩＤＳ患者由来のＴ４細胞をモニターする工程、およびＡ
ＩＤＳ患者由来の異種細胞サンプル中の全Ｔ細胞に対するＴ４ヘルパーリンパ球
の比を決定する工程、からなる群より選択される工程である、方法。
【請求項３９】請求項１に記載の方法を実施する際に使用するためのデバ
イスであって、該デバイスは、液体試料をロードする導管を備える濾過基板、お
よび該導管の流路の最小領域において二次接着手段を備える、非試料の流入を妨
げるゲーティング手段を備え、ここで、該ゲーティング手段は、該ゲーディング
手段に付着した一次接着手段を有する細胞の該ゲーティング手段への接着をもた
らすように適合され、該二次接着手段の適用は予め選択された限定ゲーティング
領域のみである、デバイス。
【請求項４０】請求項３０に記載の方法を実施する際に使用するためのデ
バイスであって、該デバイスは、液体試料をロードする導管を備える基板、およ
び該導管の流路の最小領域において二次濾過手段を備える、非試料の流入を妨げ
るゲーティング手段を備え、ここで、該ゲーティング手段は、大きさまたは変形
能力の差異を有する細胞の該ゲーティング手段への配置をもたらすように適合さ
れ、該二次濾過手段適用は、予め選択された限定ゲーティング領域に対してのみ
である、デバイス。