CN104946591A

CN104946591A - 制备rpe 细胞和rpe 细胞的组合物的改良方法

Info

Publication number: CN104946591A
Application number: CN201510271562.4A
Authority: CN
Inventors: C·马尔库伊特; L·勒米奥克斯; W·霍尔米斯; P·休尔塔斯; L·维尔纳
Original assignee: Advanced Cell Technology Inc
Current assignee: Astellas Institute for Regenerative Medicine
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2015-09-30
Also published as: EP2209888A4; US20220049217A1; IL204956A0; DK2209888T3; IL292561A; US20190062703A1; KR101849329B1; US20150086512A1; PL2209888T3; CA2702386C; EP2209888A1; CN101878295A; EP2209888B1; JP2020115882A; JP6692768B2; JP2022079484A; KR101849336B1; CA3177952A1; CA2702386A1; CA3006687A1

Abstract

本发明提供用于从人胚胎干细胞或从其他人多潜能干细胞制备RPE细胞的改良方法。本发明还涉及源自人胚胎干细胞或其他人多能(mult ipotent)或多潜能(plur ipotent)干细胞的人视网膜色素上皮细胞。源自胚胎干细胞的hRPE细胞与成人和胎儿来源的RPE细胞在分子上是不同的，并且与胚胎干细胞也不同。本文所述的hRPE细胞对于治疗视网膜变性疾病是有用的。

Description

制备RPE 细胞和RPE 细胞的组合物的改良方法

本申请是申请号为200880118061.0的中国专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2007年10月12日提交的美国临时申请第60/998,766号、2007年10月12日提交的第60/998,668号、2008年1月2日提交的第61/009,908号、和2008年1月2日提交的第61/009,911号的优先权权益。每个上述申请的公开内容均通过引用整体并入本文。

发明背景

视网膜色素上皮(RPE)是紧邻感觉神经性视网膜外侧的色素细胞层。这层细胞滋养视网膜视细胞，并且附着于下面的脉络膜(视网膜后的血管层)和上面的视网膜视细胞。RPE充当滤器来决定从脉络膜到达视网膜的营养物。此外，RPE在视网膜和脉络膜之间提供隔离。RPE的解体干扰视网膜的代谢，引起视网膜变薄。视网膜变薄可能具有严重的后果。例如，视网膜变薄可能引起“干性”黄斑变性并且还可能导致可能引起“湿性”黄斑变性的不适当的血管形成。

鉴于RPE在维持视觉和视网膜健康中的重要性，在研究RPE和开发体外制备RPE细胞的方法方面已进行了显著的努力。体外制备的RPE细胞可以用于研究RPE的发育；用于鉴定引起RPE解体的因素；或鉴定可用于刺激内源RPE细胞修复的药剂。此外，体外制备的RPE细胞本身可以用作替代或修复患者的受损的RPE细胞的全部或部分的治疗。当以这种方式使用时，RPE细胞可以提供治疗黄斑变性以及全部或部分由RPE损坏所引起的其他疾病和病症。

体外制备的RPE细胞用于筛选或用作治疗剂的用途依赖于可用于以系统的定向的方式制备大量RPE细胞的方法。这种系统化的分化方法与基于例如从转化的细胞系或其他来源自发分化RPE细胞的已有方案相比，将提供更为显著的优势。

发明概述

本发明提供用于从人多潜能(pluripotent)干细胞如人胚胎干细胞和人诱导性多潜能干细胞中分化RPE细胞的方法。该方法用于制备大量分化的RPE细胞以用于筛选测定；研究RPE的基本生物学以及用作治疗剂。如本文所述，使用这种方法从诸如人胚胎干细胞的多潜能干细胞分化而来的RPE细胞与人胚胎干细胞以及源自成人和胎儿的RPE细胞在分子上是不同的。

本发明还提供源自人多潜能干细胞的RPE细胞的制剂和药物制剂。此类RPE细胞制剂与人胚胎干细胞以及源自成人和胎儿的RPE细胞在分子上不同。

本发明首次提供了由人胚胎干细胞分化的RPE细胞的详细分子表征。该详细表征包括与源自其他来源的RPE细胞(例如，成人RPE细胞和胎儿RPE细胞)以及人胚胎干细胞的比较。此分析不仅提供了对RPE细胞的更深理解，还揭示了自人胚胎干细胞分化的RPE细胞具有将这些细胞与先前描述的RPE细胞区别开的独特分子性质。

本发明提供RPE细胞的制剂，所述制剂包括RPE细胞的基本上纯化的制剂。示例性RPE细胞是从如人胚胎干细胞或iPS细胞的人多潜能干细胞分化而来的。可以将人多潜能干细胞来源的RPE细胞进行配制并用于治疗视网膜变性疾病。此外，人多潜能干细胞来源的RPE细胞可用于以下筛选测定：鉴定调控RPE细胞存活(体外和/或体内)的药剂；研究RPE细胞成熟；或鉴定调控RPE细胞成熟的药剂。使用此类筛选测定所鉴定的药剂可以在体外或体内使用，并且可以提供可单独使用或与RPE细胞组合使用来治疗视网膜变性疾病的其他治疗剂。

本发明提供用于从胚胎干细胞或其他多潜能干细胞制备RPE细胞的改良方法。本发明的方法可以用于制备分化的RPE细胞。任选地，可以调控分化的RPE细胞的成熟水平(如通过色素沉积水平评估)以便制备分化的RPE细胞、成熟RPE细胞、或它们的混合物。还提供了治疗眼睛疾患的改良方法。具体地，这些方法包括使用源自人胚胎干细胞的RPE细胞来治疗或改善眼部疾患的症状，尤其是全部或部分由内源RPE层的损伤或解体引起或恶化的眼部疾患。

在某些方面，本发明提供用于制备视网膜色素上皮(RPE)细胞培养物的方法。在某些实施方式中，培养物是基本上纯化的培养物，该培养物含有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或大于99％的分化的RPE细胞(至少75％的培养物是分化的RPE细胞，无论成熟水平如何)。在某些实施方式中，基本上纯化的培养物含有至少30％、35％、40％或45％的成熟分化的RPE细胞。在某些实施方式中，基本上纯化的培养物含有至少50％的成熟分化的RPE细胞。在其他实施方式中，基本上纯化的培养物含有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的成熟分化的RPE细胞。在某些实施方式中，分化的RPE细胞源自人胚胎干细胞、人iPS细胞、或其他多潜能干细胞。

在某些实施方式中，该方法包括下列步骤：

a)提供人胚胎干细胞；

b)在营养物丰富的低蛋白培养基中将所述人胚胎干细胞培养为胚状体，所述培养基任选地含有无血清B-27补充物；

c)在营养物丰富的低蛋白培养基中将所述胚状体培养为贴壁培养物，所述培养基任选地含有无血清B-27补充物；

d)在营养物丰富的低蛋白培养基中培养(c)的细胞贴壁培养物，所述培养基不含无血清B-27补充物；

e)在能够支持高密度体细胞培养物生长的培养基中培养(d)的细胞，由此细胞培养物中出现了RPE细胞；

f)使(e)的培养物与酶接触；

g)从培养物中选择RPE细胞并将所述RPE细胞转移到含有补充有生长因子的培养基的单独培养物中以制备RPE细胞的富集培养物；以及

h)使所述RPE细胞的富集培养物繁殖以制备RPE细胞的基本上纯化的培养物。

在某些其他方面中，本发明提供了制备成熟视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，所述方法包括下列步骤：

a)提供人胚胎干细胞；

d)在营养物丰富的低蛋白培养基中培养步骤(c)的细胞贴壁培养物，所述培养基不含无血清B-27补充物；

f)使(e)的培养物与酶接触；

g)从培养物中选择RPE细胞并将所述RPE细胞转移到含有补充有生长因子的培养基的单独培养物中以制备RPE细胞的富集培养物；

h)使所述RPE细胞的富集培养物繁殖；以及

i)培养所述RPE细胞的富集培养物以制备成熟RPE细胞。

在上述任一方面的某些实施方式中，RPE细胞的基本上纯化的培养物可以含有分化的RPE细胞和成熟分化的RPE细胞二者。在成熟RPE细胞中，色素水平可以变化。然而，可以根据色素沉积水平的增加和更多的柱形形状将成熟RPE细胞与RPE细胞从视觉上区别开。

在某些实施方式中，培养物中成熟分化的RPE细胞的百分比可以通过降低培养物的密度来降低。因此，在某些实施方式中，所述方法还包括传代培养成熟RPE细胞群以制备含有较小成熟RPE细胞百分比的培养物。

在某些实施方式中，在将细胞培养为胚状体时所用的培养基可以选自适于将细胞培养为胚状体的任何培养基。例如，本领域的技术人员可以从商业上可获得的或专有培养基中选择。可以使用能够支持高密度培养物的任何培养基，例如用于病毒、细菌或真核细胞培养物的培养基。例如，培养基可以是营养物丰富、无蛋白的培养基或营养物丰富、低蛋白的培养基。例如，人胚胎干细胞可以在MDBK-GM、OptiPro SFM、VP-SFM、EGM-2、或MDBK-MM中培养。在某些实施方式中，培养基还可以含有B-27补充物。

在某些实施方式中，本文所述的培养基还可以补充有一种或多种生长因子。可以使用的生长因子包括：例如EGF、bFGF、VEGF、和重组胰岛素样生长因子。培养基还可以含有下列补充物：例如，肝素、氢化可的松、抗坏血酸、血清(诸如，例如胎牛血清)、或生长基质(诸如，例如来自牛角膜上皮的胞外基质、基质胶(matrigel，BD biosciences)、或明胶)。

在某些实施方式中，可以使用机械或酶方法来从胚状体培养物中的非RPE细胞集簇中选择RPE细胞，或促进贴壁细胞的传代培养。示例性的机械方法包括但不限于用吸管吸打或用引针切割。示例性酶方法包括但不限于适于使细胞解离的任何酶(例如，胰蛋白酶、胶原酶、分散酶)。在某些实施方式中，使用非酶溶液来使细胞解离，例如高EDTA含量的溶液，如基于Hanks的细胞解离缓冲液。

在某些实施方式中，对于上述相关步骤的任何一个来说，将细胞培养约3天至45天，如7天、7-10天、7-14天、或14-21天。在某些实施方式中，将细胞培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45天、或约46天。在某些实施方式中，将细胞培养低于或等于约45、40、35、30、25、21、20、18、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天。注意，对于上述相关方法步骤的每一个来说，可以将细胞在每个步骤培养相同的时间段，或在一个或多个步骤中培养不同的时间段。

在某些实施方式中，将RPE细胞进一步培养以制备成熟RPE细胞培养物。RPE细胞和成熟RPE细胞二者均为分化的RPE细胞。然而，成熟RPE细胞的特征在于与分化的RPE细胞相比色素水平增加。成熟水平和色素沉积水平可以通过增加或降低分化的RPE细胞培养物的密度来调控。因此，可以进一步培养RPE细胞以制备成熟RPE细胞。可选择地，可以降低含有成熟RPE细胞的培养物密度以降低成熟分化的RPE细胞的百分比并增加分化的RPE细胞的百分比。

用于培养RPE细胞的培养基是适于细胞培养的任何培养基，并可以由技术人员来选择。例如，可以使用能够支持高密度培养物的任何培养基，例如用于病毒、细菌或动物细胞培养物的培养基。例如，本文所述的细胞可以在VP-SFM、EGM-2、和MDBK-MM中培养。

在上述任一方面的某些实施方式中，将所述RPE细胞的基本上纯化的培养物(具有或不具有成熟RPE细胞)冷冻储存。可以通过本领域已知的任何适合方法(例如低温冷冻)来储存细胞并且可以在适于储存细胞的任何温度将细胞冷冻。例如，可以在约-20℃、-80℃、-120℃、或适于储存细胞的任何其他温度下将细胞冷冻。低温冷冻的细胞在适合的容器中储存并且经过储存准备以降低细胞损伤的风险和使细胞在解冻后存活的可能性最大。在其他实施方式中，将RPE细胞保持在室温下，或在例如约4℃下冷藏。

在上述任一方面的某些实施方式中，所述方法根据药品生产质量管理规范(good manufacturing practice，GMP)进行。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞根据药品生产质量管理规范(GMP)而获得。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞是从在不损坏剩余胚胎情况下从早期胚胎中移出的一个或多个卵裂球获得的。

在上述任一方面的某些实施方式中，所述方法用于制备制剂，所述制剂包含至少1×10⁵个RPE细胞、至少5×10⁵个RPE细胞、至少1×10⁶个RPE细胞、至少5×10⁶个RPE细胞、至少1×10⁷个RPE细胞、至少2×10⁷个RPE细胞、至少3×10⁷个RPE细胞、至少4×10⁷个RPE细胞、至少5×10⁷个RPE细胞、至少6×10⁷个RPE细胞、至少7×10⁷ 个RPE细胞、至少8×10⁷个RPE细胞、至少9×10⁷个RPE细胞、至少1×10⁸个RPE细胞、至少2×10⁸个RPE细胞、至少5×10⁸个RPE细胞、至少7×10⁸个RPE细胞、或至少1×10⁹个RPE细胞。在某些实施方式中，制剂中RPE细胞的数目包括分化的RPE细胞，与成熟水平无关，也与分化的RPE细胞和成熟RPE细胞的相对百分比无关。在其他实施方式中，制剂中RPE细胞的数目是指分化的RPE细胞或成熟RPE细胞的数目。

在某些实施方式中，所述方法还包括配制分化的RPE细胞和/或分化的成熟RPE细胞以制备适于移植的RPE细胞制剂。

在另一方面，本发明提供用于治疗或预防特征为视网膜变性的病症的方法，所述方法包括给需要其的受治疗者施用有效量的包含RPE细胞的制剂，所述RPE细胞源自人胚胎干细胞、iPS细胞、或其他多潜能干细胞。特征为视网膜变性的病症包括：例如斯特格黄斑营养不良(Stargardt's macular dystrophy)、老年性黄斑变性(干性或湿性)、糖尿病性视网膜病和色素性视网膜炎。在某些实施方式中，RPE细胞使用本文所述的一种或多种方法从人多潜能干细胞获得。

在某些实施方式中，制剂是预先冷藏保存的，并且在移植前解冻。

在某些实施方式中，治疗方法还包括施用环孢菌素或一种或多种其他免疫抑制剂。当使用免疫抑制剂时，它们可以全身性或区域性(locally)施用，并且它们可以在RPE细胞施用之前、同时、或之后施用。在某些实施方式中，免疫抑制剂治疗在RPE细胞施用之后持续数周、数月、数年或无期限。

在某些实施方式中，治疗方法包括施用单剂量的RPE细胞。在其他实施方式中，治疗方法包括其中在某个阶段多次施用RPE细胞的疗程。示例性疗程可以包括每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次、每两年一次或每年一次的治疗。可选择地，治疗可以分期进行，其中最初需要多剂量(例如，第一周需要每日给药)，随后需要较少和较低频率的给药。还包括了许多治疗方案。

在某些实施方式中，施用的RPE细胞包括分化的RPE细胞和成熟 RPE细胞的混合群体。在其他实施方式中，施用的RPE细胞包括分化的RPE细胞的基本上纯化的群或成熟RPE细胞的基本上纯化的群。例如，施用的RPE细胞可以含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或小于1％的其他RPE细胞类型。

在某些实施方式中，RPE细胞在药学上可接受的载体或赋形剂中配制。

在某些实施方式中，包含RPE细胞的制剂以悬浮液、基质(matrix)或基底(substrate)形式移植。在某些实施方式中，制剂通过注射到眼睛的视网膜下间隙来施用。在某些实施方式中，给受治疗者施用约10⁴至约10⁶个细胞。在某些实施方式中，所述方法还包括通过测量受治疗者中的视网膜电流图反应、视动敏度阈值、或亮度阈值来监测治疗或预防的效力的步骤。所述方法还可以包括通过监测细胞的免疫原性或眼睛中细胞的迁移来监测治疗或预防的效力。

在某些方面，本发明提供用于治疗或预防特征为视网膜变性的病症的药物制剂，所述药物制剂包含有效量的RPE细胞，所述RPE细胞源自人胚胎干细胞或其他多潜能干细胞。可以根据施用途径将药物制剂配制在药学上可接受的载体中。例如，可以配制制剂以用于施用到眼睛的视网膜下间隙。组合物可以包含至少10⁴、10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、或10⁷个RPE细胞。在某些实施方式中，组合物可以包含至少2×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸个RPE细胞。在某些实施方式中，RPE细胞可以包括成熟RPE细胞，因此细胞数目包括了分化的RPE细胞和成熟分化的RPE细胞二者的总和。

在另一方面，本发明提供用于筛选鉴定调控RPE细胞存活的药剂的方法。例如，自人胚胎干细胞分化而来的RPE细胞可以用于筛选促进RPE存活的药剂。作为治疗方案的一部分，可以单独或与RPE细胞组合使用已鉴定的药剂。可选择地，可以将已鉴定的药剂用作培养方法的一部分以改善体外分化的RPE细胞的存活。

在另一方面，本发明提供用于筛选鉴定调控RPE细胞成熟度的药剂的方法。例如，可以使用由人ES细胞分化而来的RPE细胞来筛选促进RPE成熟的药剂。

在上述任一方面的某些实施方式中，所述方法根据药品生产质量管理规范(GMP)来进行。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞或其他多潜能干细胞根据药品生产质量管理规范(GMP)获得。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞通过从早期胚胎中移出一个或多个卵裂球而不损坏剩余胚胎而得到。

在另一方面，本发明包括了用于制备RPE细胞或其制剂的起始材料除人胚胎干细胞之外，可以为其他类型的人多潜能干细胞。举例来说，本发明包括了使用诱导性多潜能干(iPS)细胞作为使用本文所述的方法来分化RPE细胞的起始材料。这种iPS细胞可以从细胞库中获得，或者是预先获得的。可选择地，iPS细胞可以在开始向RPE细胞分化之前新制备。

在一个实施方式中，将由多潜能干细胞包括iPS细胞分化而来的RPE细胞或制剂用于治疗方法中。

本发明还提供由人胚胎干细胞(hESC)或其他人多潜能干细胞终末分化而来的功能性人视网膜色素上皮细胞(hRPE)。在非人的灵长类移植实验中，可以借助于这些hRPE的独特物理特征，如通过它们的独特mRNA和蛋白表达，而将它们与其他细胞辨别开。此外，当植入到经过验证的视网膜变性动物模型中时，hRPE可以治疗患病动物中的视网膜变性。因此，本发明的hRPE可用于治疗受各种视网膜变性疾患折磨的患者。因此本发明提供用于治疗视觉退化疾病和疾患的可再生hRPE来源，该hRPE可以在GLP类似性和GMP依从性条件下制备和生产。

在某些实施方式中，本发明提供源自人胚胎干细胞的人视网膜色素上皮细胞，该细胞有色素沉积并且表达在不是人视网膜色素上皮细胞的细胞中不表达的至少一种基因。在某些实施方式中，人视网膜色素上皮细胞从至少一种蛋白、分子、或天然环境中所发现的其他混杂物中分离。

在另一实施方式中，本发明提供细胞培养物，所述细胞培养物包含源自人胚胎干细胞或其他多潜能干细胞的人RPE细胞，该人RPE细胞有色素沉积并且表达在不是人RPE的细胞中不表达的至少一种基因。当以这种方式使用时，有色素沉积是指任何水平的色素沉积，例如，在由ES细胞分化RPE细胞时最初发生的色素沉积。色素沉积可以随细胞密度和分化的RPE细胞的成熟度变化。然而，当细胞被说成有色素沉积时，该术语应理解为是指任何和所有水平的色素沉积。

在一些实施方式中，细胞培养物包含基本上纯化的人RPE细胞群。基本上纯化的hRPE细胞群是其中hRPE细胞构成了群体中至少约75％的细胞的细胞群。在其他实施方式中，基本上纯化的hRPE细胞群是其中hRPE细胞构成了群体中至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、97.5％、98％、99％或甚至大于99％的细胞的细胞群。在一些实施方式中，细胞培养物中hRPE细胞的色素沉积是均匀的。在其他实施方式中，细胞培养物中hRPE细胞的色素沉积是不均匀的，并且RPE细胞培养物包含分化的RPE细胞和成熟RPE细胞二者。本发明的细胞培养物可以包含至少约10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、或至少约10⁹个hRPE细胞。

本发明提供色素沉积程度不同的人视网膜色素上皮细胞。在某些实施方式中，人视网膜色素上皮细胞的色素沉积与hRPE细胞终末分化后的一平均人色素上皮细胞相同。在某些实施方式中，人视网膜色素上皮细胞的色素沉积比hRPE细胞终末分化后的平均人视网膜色素上皮细胞的色素沉积更多。在某些其他实施方式中，人视网膜色素上皮细胞的色素沉积比终末分化后的平均人视网膜色素上皮细胞的色素沉积更少。

在某些实施方式中，本发明提供由ES细胞或其他多潜能干细胞分化而来并表达(在mRNA和/或蛋白水平上)下列物质的一种或多种(1、2、3、4、5、或6种)的人RPE细胞：RPE-65、斑萎蛋白(bestrophin)、PEDF、CRALBP、Otx2、和Mit-F。在某些实施方式中，通过mRNA表达测量基因表达。在其他实施方式中，通过蛋白表达测量基因表达。在某些实施方式中，RPE细胞基本上不表达ES特异性基因，如Oct-4，碱性磷酸酶、nanog、和/或Rex-1。在其他实施方式中，RPE细胞表达pax-2、pax-6、和/或酪氨酸酶中的一种或多种(1、2或3种)。在某些实施方式中，pax-2、pax-6、和/或酪氨酸酶的表达将分化的RPE细胞与成熟分化的RPE细胞区别开。在其他实施方式中，RPE细胞表达表2中所列的标记物的一种或多种，并且所述一种或多种标记物在RPE细胞中的表达与在人ES细胞中的表达(如果有的话)相比是上调的。在其他实施方式中，RPE细胞表达表3中所列的标记物的一种或多种，并且所述一种或多种标记物在RPE细胞中的表达与在人ES细胞中的表达(如果有的话)相比是下调的。

在某些实施方式中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含源自人胚胎干细胞或其他多潜能干细胞的人RPE细胞。药物制剂可以包含至少约10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、或约10⁹个hRPE细胞。

在其他实施方式中，本发明提供本文所述的RPE细胞的冷藏保存的制剂。冷藏保存的制剂可以被冷冻储存数天或数年。可以通过本领域内已知的任何适合方法储存细胞，例如，低温冷冻；并且可以在适于细胞储存的任何温度下冷冻细胞。例如，可以在约-20℃、-80℃、-120℃或适于细胞储存的任何其他温度下冷冻细胞。低温冷冻的细胞在适合的容器中储存并且经过储存准备以降低细胞损伤的风险并使细胞在解冻后存活的可能性最大。在其他实施方式中，可以将RPE细胞保持在室温下，或在例如约4℃下冷藏。本文所述的组合物的冷藏保存的制剂可以包含至少约10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、或约10⁹个hRPE细胞。在某些实施方式中，在冷藏保存后将本发明的hRPE细胞从储存中恢复。在某些实施方式中，大于65％、70％、75％、或大于80％的RPE细胞在冷藏保存后保持活力。在其他实施方式中，大于85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或大于99％的RPE细胞在冷藏保存后保持活力。

在另一方面，本发明提供人RPE细胞的基本上纯化的制剂，所述人RPE细胞具有本文所述的结构、分子和功能特征的任何组合。可以将此类制剂配制成药物制剂以供施用，和/或可将其配制以供冷藏保存。

在另一方面，本发明提供本文所述的人RPE细胞在制造药物中的用途，该药物用于治疗需要其的患者的病症。在另一个实施方式中，本发明提供包含本文所述的人RPE细胞的细胞培养物在制造药物中的用途，该药物用于治疗需要其的患者的病症。在另一个实施方式中，本发明提供包含本文所述的人RPE细胞的药物制剂在制造药物中的用途，该药物用于治疗需要其的患者的病症。可以治疗的病症包括但不限于视网膜变性疾病，如斯特格黄斑营养不良、色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼以及糖尿病性视网膜病。在某些实施方式中，本发明提供用于治疗或预防特征为视网膜变性的病症的方法，所述方法包括给需要其的受治疗者施用有效量的包含RPE细胞的制剂，所述RPE细胞源自哺乳动物胚胎干细胞。特征为视网膜变性的病症包括：例如斯特格黄斑营养不良、老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、和色素性视网膜炎。

在其他实施方式中，本发明提供源自人胚胎干细胞或其他多潜能干细胞的人RPE细胞的溶液，所述RPE细胞具有本文所述特征的任何组合。这种溶液可以含有至少约10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、或约10⁹个本文所述的hRPE细胞。这种溶液适于注射给受治疗者。这种溶液适合本文所述的冷藏保存。本发明还提供这些溶液用于制造药物的用途，该药物用于治疗可以通过施用RPE细胞来治疗的疾病，例如眼睛的视网膜变性疾病。

在另一方面，本发明的RPE细胞源自在GMP条件下预先获得的人胚胎干细胞或其他多潜能干细胞。在一个实施方式中，人ES细胞从卵裂早期胚胎的一个或多个卵裂球获得，任选地不损坏所述胚胎。在另一个实施方式中，人ES细胞来自人胚胎干细胞的文库。在某些实施方式中，所述人胚胎干细胞的文库包含干细胞，所述干细胞的每一个对于人群中存在的至少一个MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的(nullizygous)，其中干细胞的所述文库的各成员与该文库中剩余成员相比对于不同组的MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的。在又一些实施方式中，人胚胎干细胞的文库包含对于人群中存在的所有MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的干细胞。在某些其他实施方式中，本发明提供RPE细胞的文库，每个所述RPE细胞对于人群中存在的至少一个MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的，其中所述RPE细胞的文库的各成员与该文库中剩余成员相比对于不同组的MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的。在又一些实施方式中，本发明提供对于人群中存在的所有MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的人RPE细胞的文库。

在上述任一方面的某些实施方式中，将所述RPE细胞的基本上纯化的培养物(具有或不具有成熟RPE细胞)冷冻储存。可以通过本领域内已知的任何适合方法来储存细胞，例如低温冷冻；并且可以在适于细胞储存的任何温度下冷冻细胞。例如，可以在约-20℃、-80℃、-120℃或适于细胞储存的任何其他合适温度下冷冻细胞。将低温冻存的细胞储存在适合的容器中并且经过储存准备以降低细胞损伤的风险并使细胞在解冻后存活的可能性最大。在其他实施方式中，可以将RPE细胞保持在室温下，或在例如约4℃下冷藏。

在上述任一方面的某些实施方式中，根据药品生产质量管理规范(GMP)制备人RPE细胞。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞根据药品生产质量管理规范(GMP)而获得。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞是从在不损坏剩余胚胎情况下从早期胚胎中移出的一个或多个卵裂球获得的。如此，本发明提供了GMP依从性RPE细胞制剂，所述制剂包括RPE细胞的基本上纯化的制剂。此类制剂基本上没有病毒、细菌、和/或真菌污染或感染。

在上述任一方面的某些实施方式中，RPE细胞的组合物或制剂包含至少1×10⁵个RPE细胞、至少5×10⁵个RPE细胞、至少1×10⁶个RPE细胞、至少5×10⁶个RPE细胞、至少1×10⁷个RPE细胞、至少2×10⁷个RPE细胞、至少3×10⁷个RPE细胞、至少4×10⁷个RPE细胞、至少5×10⁷个RPE细胞、至少6×10⁷个RPE细胞、至少7×10⁷个RPE细胞、至少8×10⁷个RPE细胞、至少9×10⁷个RPE细胞、至少1×10⁸个RPE细胞、至少2×10⁸个RPE细胞、至少5×10⁸个RPE细胞、至少7×10⁸个RPE细胞、或至少1×10⁹个RPE细胞。在某些实施方式中，制剂中的RPE细胞数目包括分化的RPE细胞，与成熟水平无关，也与分化的RPE细胞和成熟分化的RPE细胞的相对百分比无关。在其他实施方式中，制剂中RPE细胞数目是指分化的RPE细胞或成熟RPE细胞的数目。

在某些方面，所述方法还包括配制分化的RPE细胞和/或分化的成熟RPE细胞以制备适于移植的RPE细胞制剂。

在另一方面，本发明提供用于治疗或预防特征为视网膜变性的病症的方法，该方法包括给需要其的受治疗者施用有效量的包含RPE细胞的制剂，所述RPE细胞源自人多潜能干细胞。在某些实施方式中，使用本文所述的任何方法来获得RPE细胞。特征为视网膜变性的病症包括：例如斯特格黄斑营养不良、老年性黄斑变性(干性或湿性)、糖尿病性视网膜病、和色素性视网膜炎。

在某些实施方式中，治疗方法还包括施用环孢菌素或一种或多种其他免疫抑制剂。当使用免疫抑制剂时，它们可以全身性或区域性施用，并且它们可以在RPE细胞施用之前、同时、或之后施用。在某些实施方式中，免疫抑制剂治疗在RPE细胞施用之后持续数周、数月、数年或无期限。

在某些实施方式中，施用的RPE细胞包括分化的RPE细胞和成熟RPE细胞的混合群体。在其他实施方式中，施用的RPE细胞包括基本上纯化的分化的RPE细胞群或成熟RPE细胞群。例如，施用的RPE细胞可以含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或小于1％的其他RPE细胞类型。

在某些实施方式中，包含RPE细胞的制剂以悬浮液、基质(matrix)或基底(substrate)形式移植。在某些实施方式中，制剂通过注射到眼睛的视网膜下间隙来施用。在某些实施方式中，制剂为经角膜施用。在某些实施方式中，给受治疗者施用约10⁴至约10⁶个细胞。在某些实施方式中，所述方法还包括通过测量受治疗者中的视网膜电流图反应、视动敏度阈值、或亮度阈值来监测治疗或预防的效力的步骤。所述方法还可以包括通过监测细胞的免疫原性或眼睛中细胞的迁移来监测治疗或预防的效力。

在某些方面，本发明提供用于治疗或预防特征为视网膜变性的病症的药物制剂，所述药物制剂包含有效量的RPE细胞，所述RPE细胞源自人胚胎干细胞。可以根据施用途径将药物制剂配制在药学上可接受的载体中。例如，可以配制制剂以用于施用到眼睛的视网膜下间隙或角膜。组合物可以包含至少10⁴、10⁵、5×10⁵、6×10⁵、7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、或10⁷个RPE细胞。在某些实施方式中，组合物可以包含至少2×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸个RPE细胞。在某些实施方式中，RPE细胞可以包括成熟RPE细胞，因此细胞数目包括了分化的RPE细胞和成熟分化的RPE细胞二者的总和。

在另一方面，本发明提供用于筛选鉴定调控RPE细胞存活的药剂的方法。例如，从人胚胎干细胞分化而来的RPE细胞可以用于筛选促进RPE存活的药剂。作为治疗方案的一部分，可以单独或与RPE细胞组合使用已鉴定的药剂。可选择地，可以将已鉴定的药剂用作培养方法的一部分以改善体外分化的RPE细胞的存活。

在上述任一方面的某些实施方式中，所述方法根据药品生产质量管理规范(GMP)来进行。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞根据药品生产质量管理规范(GMP)而获得。在上述任一方面的某些实施方式中，从中分化RPE细胞的人胚胎干细胞是从在不损坏剩余胚胎情况下从早期胚胎中移出的一个或多个卵裂球得到的。

在另一方面，本发明包括了用于制备RPE细胞或其制剂的起始材料除人胚胎干细胞之外可以为其他类型的人多潜能干细胞。举例来说，本发明包括了使用具有hES特征的诱导性多潜能干(iPS)细胞可以类似地用作使用本文所述的方法来分化RPE细胞的起始材料。这种iPS细胞可以从细胞库中获得，或者是预先获得的。可选择地，iPS细胞可以在开始向RPE细胞分化之前新制备。

本发明包括了上文或下文所述的方面和实施方式的任何组合。例如，包括分化的RPE细胞和成熟RPE细胞的任何组合的RPE细胞制剂可用于治疗本文所述的任何疾病和病症。类似地，本文所述的使用人胚胎干细胞作为起始材料来制备RPE细胞的方法可以使用任何人多潜能干细胞作为起始材料以类似的方式进行。

附图简述

图1为显示源自人胚胎干细胞的人RPE细胞个体发育的示意性模型。

图2为显示通过实时定量反转录PCR(qPCR)进行的hES细胞和人胚胎干细胞来源的RPE细胞的基因表达比较的图。

图3为显示通过实时定量反转录PCR(qPCR)进行的ARPE-19细胞(预先得到的RPE细胞系)和人胚胎干细胞来源的RPE细胞的基因表达比较的图。

图4为显示通过实时定量反转录PCR(qPCR)进行的胎儿RPE细胞和人胚胎干细胞来源的RPE细胞的基因表达比较的图。

图5为显示通过实时定量反转录PCR(qPCR)进行的成熟RPE细胞和hES细胞的基因表达比较的图。

图6为显示hES特异性标记物和RPE特异性标记物的蛋白质印迹分析的显微照片。源自hES细胞(泳道2)的胚胎干细胞来源的RPE细胞(泳道1)不表达hES特异性蛋白Oct-4、Nanog、和Rex-1。然而，胚胎干细胞来源的RPE细胞表达包括下列的RPE特异性蛋白：RPE65、CRALBP、PEDF、斑萎蛋白、PAX6、和Otx2。使用肌动蛋白作为蛋白上样对照。

图7为显示微阵列基因表达的主要分量(component)分析图的图。代表69％的变异性的分量代表细胞类型，而分量2代表细胞系(即，遗传变异性)。基因表达图谱的近线性分散表征了源自hES细胞的hRPE的个体发育。

发明详述

为了能够充分理解本文所述发明，列出了下列详细描述。详细描述了本发明的各实施方式并且可以通过所提供的实施例进一步进行举例说明。

除非另外指明，否则本文所用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的那些含义相同。尽管可以将类似或等同于本文所述的方法和材料的那些方法和材料用于本发明或用于测试本发明，但下文描述了适合的方法和材料。所述的材料、方法和实施例仅为示例性的，并不意图具有限制性。

本文所提到的所有出版物、专利、专利公布和申请以及其他文件通过引用整体并入本文。

为了进一步定义本发明，本文提供了下列术语和定义。

如本文说明书和贯穿所附的权利要求书中所用的“一个”、“一种”和“所述”的含义包括复数个指示物，除非上下文清楚指明并非如此。同样，如本文说明书中所用的“之中”的含义包括“之中”和“之上”，除非上下文清楚指明并非如此。

在整个说明书中，词语“包含”或其变化形式如“包含”(comprises)或“包含”(comprising)应理解为意指包括所述的整数或整数的组，但是不排除任何其他整数或整数组。

所谓“胚胎”或“胚胎的”意指未被植入母宿主的子宫膜的发育细胞团。“胚胎细胞”是从胚胎分离或胚胎中所含有的细胞。它还包括早至2-细胞期所获得的卵裂球和聚集的卵裂球。

术语“胚胎干细胞”是指胚胎来源的细胞。更具体地，它是指从胚泡或桑椹胚的内细胞团分离的细胞，并且它们已经作为细胞系进行了系列传代。该术语还包括从胚胎的一个或多个卵裂球分离的细胞，优选不损坏剩余的胚胎。该术语还包括通过体细胞核移植产生的细胞，即使该过程使用了非胚胎细胞。

术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)如同本领域内所使用的一样用于本文中。此术语包括从人胚泡或桑葚胚的内细胞团获得的作为细胞系进行了系列传代的细胞。hES细胞可以通过下列方法获得：用精子或DNA使卵细胞受精、核移植、孤雌生殖、或通过产生在HLA区域具有纯合子的hES细胞的方法。人ES细胞还是通过下列方法由合子、卵裂球、或胚泡期哺乳动物胚胎所获得的细胞：精子与卵细胞的融合；核移植；孤雌生殖；或染色质再编程，随后将再编程的染色质包括到质膜中以产生细胞。本发明的人胚胎干细胞包括但不限于MA01、MA09、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14和ACT30胚胎干细胞。在某些实施方式中，用于制备RPE细胞的人ES细胞根据GMP标准获得和保持。无论人胚胎干细胞的来源或用于制备它们的具体方法如何，它们都可以根据下列因素来鉴定：(i)分化成所有三个胚层的细胞的能力；(ii)至少Oct-4和碱性磷酸酶的表达；以及(iii)当移植到免疫减弱的动物中时产生畸胎瘤的能力。

术语“人胚胎来源的细胞”(hEDC)是指桑葚胚来源的细胞，胚泡来源的细胞，包括内细胞团、胚盾、或上胚层的那些细胞，或早期胚胎的其他全能或多潜能干细胞，包括原始内胚层、外胚层、和中胚层以及它们的衍生物，还包括卵裂球和来自聚集的单个卵裂球的细胞团或来自不同发育期的胚胎，但是不包括作为细胞系而经过传代的人胚胎干细胞。

如本文所用的术语“多潜能干细胞”包括胚胎干细胞、胚胎来源的干细胞和诱导性多潜能干细胞，而与多潜能干细胞的获得方法无关。多潜能干细胞功能上定义为如下的干细胞：(a)在移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化成所有三个胚层的细胞类型(例如，可分化为外胚层、中胚层、和内胚层细胞类型)；(c)表达胚胎干细胞的一种或多种标记物(例如，表达Oct 4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)。示例性的多潜能干细胞可以使用例如本领域内已知的方法产生。示例性的多潜能干细胞包括源自胚泡期胚胎的ICM的胚胎干细胞、以及源自卵裂期或桑葚期胚胎的一个或多个卵裂球(任选地不损坏剩余的胚胎)的胚胎干细胞。这种胚胎干细胞可以由通过受精或通过无性方法制备的胚胎材料产生，所述无性方法包括体细胞核移植(SCNT)、孤雌生殖和单雄生殖。其他示例性多潜能干细胞包括诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)，该诱导性多潜能干细胞通过因子(在本文中称为再编程因子)的组合的表达或表达诱导使体细胞再编程而产生。iPS细胞可以使用胎儿、出生后、新生儿、少年或成人体细胞产生。在某些实施方式中，可以用于将体细胞再编程为多潜能干细胞的因子包括：例如，Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc、和Klf4的组合。在其他实施方式中，可用于将体细胞再编程为多潜能干细胞的因子包括：例如，Oct 4、Sox2、Nanog、和Lin28的组合。在其他实施方式中，通过表达至少2种再编程因子、至少3种再编程因子、或至少4种再编程因子来再编程体细胞。在其他实施方式中，鉴定了其他再编程因子，并将它们单独或与一种或多种已知的再编程因子组合使用来将体细胞再编程为多潜能干细胞。

术语“RPE细胞”和“分化的RPE细胞”和“ES来源的RPE细胞”和“人RPE细胞”全文可互换使用，是指使用本发明的方法从人胚胎干细胞分化来的RPE细胞。该术语一般用来指分化的RPE细胞，而与细胞成熟水平无关，因此可以涵盖各成熟水平的RPE细胞。分化的RPE细胞可以通过它们的鹅卵石形态和色素的开始出现而从视觉上识别。分化的RPE细胞还可以从分子上鉴定，这根据基本上缺乏诸如Oct-4和nanog等胚胎干细胞标记物的表达和根据RPE标记物如RPE-65、PEDF、CRALBP和斑萎蛋白的表达而进行。注意当提到其他RPE样细胞时，它们一般具体被称为成人、胎儿或APRE19细胞。因此，除非另外指明，否则本文所用的RPE细胞是指从人胚胎干细胞分化而来的RPE细胞。

术语“成熟RPE细胞”和“成熟分化的RPE细胞”全文可互换使用，是指在RPE细胞开始分化后发生的改变。具体地，尽管可以部分根据色素的开始出现来识别RPE细胞，但是在分化后，成熟RPE细胞可以根据增强的色素沉积来识别。分化后的色素沉积并不表示细胞RPE状态的改变(例如，细胞仍然是分化的RPE细胞)。而是分化后色素的改变对应于培养和保持RPE细胞的密度。因此，成熟RPE细胞具有在开始分化后积累的较高的色素沉积。成熟RPE细胞比RPE细胞具有更多的色素沉积-尽管RPE细胞也确实具有某种水平的色素沉积。可以在较低密度下传代培养成熟RPE细胞以便使色素沉积降低。在这种情况中，可以培养成熟RPE细胞以制备RPE细胞。这种RPE细胞仍为表达RPE分化的标记物的分化的RPE细胞。因此，与RPE细胞开始分化时出现的色素沉积初始外观相比，分化后的色素沉积改变是现象性的，并且不表示细胞从RPE命运的去分化。注意分化后色素沉积的改变还与pax-2表达的改变相关。注意当提到其他RPE样细胞时，它们一般被具体称为成人、胎儿或APRE19细胞。因此，除非另外指明，否则本文所用的RPE细胞是指从人胚胎干细胞分化而来的RPE细胞。

“APRE-19”是指预先获得的人RPE细胞系的细胞。APRE-19细胞是自发产生的，而不是源于人胚胎或胚胎干细胞。

概览

本发明提供包含源自人胚胎干细胞或其他人多潜能干细胞的人视网膜色素上皮(RPE)细胞的制剂和组合物。RPE细胞至少在某种程度上是色素沉积的。RPE细胞不表达(任何可测量的水平的)胚胎干细胞标记物Oct-4、nanog或Rex-1。具体地，当通过定量RT-PCR评估时，这些ES基因在RPE细胞中的表达比ES细胞中低约100-1000倍。RPE细胞在mRNA和蛋白水平上确实都表达下列物质的一种或多种：RPE65、CRALBP、PEDF、斑萎蛋白、MitF和/或Otx2。在某些其他实施方式中，RPE细胞在mRNA和蛋白水平上都表达Pax-2、Pax-6、MitF、和酪氨酸酶的一种或多种。在上述任一方面的某些实施方式中，RPE细胞为成熟RPE细胞，该成熟RPE细胞与分化的RPE细胞相比具有增加的色素沉积。

本发明提供人RPE细胞、包含基本上纯化的人RPE细胞群的细胞培养物、包含人视网膜色素上皮细胞的药物制剂和人RPE细胞的冷藏保存制剂。在某些实施方式中，本发明提供所述人RPE细胞在制造治疗需要其的患者的病症的药物中的用途。可选择地，本发明提供所述细胞培养物在制造用于治疗需要其的患者的病症的药物中的用途。本发明还提供所述药物制剂在制造用于治疗需要其的患者的病症的药物中的用途。在上述任一方面，包含RPE细胞的制剂可以包括不同成熟水平的分化的RPE细胞，或者可以是关于某具体成熟水平的分化的RPE细胞基本上纯的。在上述任一方面的某些实施方式中，包含RPE细胞的制剂是根据药品生产质量管理规范(GMP)制备的(例如，制剂为GMP依从性的)。在某些实施方式中，包含RPE细胞的制剂基本上没有细菌、病毒或真菌污染或感染。

人RPE细胞(胚胎来源的或源自其他多潜能干细胞)可以根据它们的结构特性来鉴定和表征。具体地，并且在某些实施方式中，这些细胞的独特之处在于它们可以根据一种或多种标记物的表达或不表达(如在基因水平或蛋白水平所评估的)来鉴定或表征。例如，在某些实施方式中，分化的ES来源的RPE细胞可以根据一种或多种下列标记物的表达来鉴定或表征(例如，细胞可以根据至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种下列标记物的表达来表征)：RPE-65、斑萎蛋白、PEDF、CRALBP、Otx2、和Mit-F。另外或可选择地，ES来源的RPE细胞可以根据PAX2、酪氨酸酶、和/或PAX6的表达来鉴定或表征。另外或可选择地，hRPE细胞可以根据表1-3中任何表格所分析的一种或多种(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或大于10种)标记物的表达或不表达(如在基因水平或蛋白水平所评估的)来鉴定或表征。

另外或可选择地，ES来源的RPE细胞还可以根据细胞的色素沉积程度来鉴定和表征。快速分裂的分化的hRPE细胞是高度色素沉积的。然而，当细胞密度达到最大容量时，或当hRPE细胞发生特定成熟时，hRPE呈现它们特有的六边形表型，并且通过积累黑色素和脂褐素来增加色素沉积水平。如此，色素的开始积累充当了RPE分化的指示物，与细胞密度相关的色素沉积增加则充当RPE成熟的指示物。

包含RPE细胞的制剂包括相对于非RPE细胞类型来说是基本上纯的制剂，但是该制剂含有分化的RPE细胞和成熟分化的RPE细胞的混合物。包含RPE细胞的制剂还包括相对于非RPE细胞类型和相对于其他成熟水平的RPE细胞来说均为基本上纯的制剂。

对于上述实施方式的任一种，本发明包括了可源自人多潜能干细胞例如iPS细胞和胚胎干细胞的RPE细胞(如上文所述表征的)。在某些实施方式中，RPE细胞是使用本文所述的任何方法自人多潜能干细胞获得的。

RPE细胞分化

胚胎干细胞(ES)可以未分化状态无限期地保持在体外，也能够分化成几乎任何细胞类型，从而提供用于移植治疗的复新的和组织相容性细胞的无限来源。免疫排斥的问题可以通过核移植和孤雌生殖技术来克服。因此，人胚胎干(hES)细胞可用于研究人细胞的分化，并且被认为是移植治疗的可能来源。目前为止，已经报道了人和鼠ES细胞向多种细胞类型的分化(Smith，2001中综述)，包括心肌细胞[Kehat等人，2001；Mummery等人，2003；Carpenter等人，2002]；神经元和神经前体(Reubinoff等人，2000；Carpenter等人，2001；Schuldiner等人，2001)；脂肪细胞(Bost等人，2002；Aubert等人，1999)；肝细胞样细胞(Rambhatla等人，2003)；造血细胞(hematopoetic cell)(Chadwick等人，2003)；卵母细胞(Hubner等人，2003)、胸腺细胞样细胞(Lin RY等人，2003)；胰岛细胞(Kahan，2003)；和成骨细胞(Zur Nieden等人，2003)。

本发明提供人ES细胞向神经元谱系中的特化细胞视网膜色素上皮(RPE)的分化。RPE是在脉络膜和神经视网膜之间色素沉积致密的上皮单层。它充当血流与视网膜之间的屏障的一部分。它的功能包括脱落的视杆和视锥外节的吞噬作用、漫射光的吸收、维生素A代谢、类视黄醇再生和组织修复(Grierson等人，1994；Fisher和Reh，2001；Marmorstein等人，1998)。RPE可以通过其着黑色的细胞的鹅卵石细胞形态来识别。此外，有几种已知的RPE标记物，包括细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，一种也在顶微绒毛中存在的胞质蛋白(Bunt-Milan和Saari，1983)；RPE65，一种参与类视黄醇代谢的胞质蛋白(Ma等人，2001；Redmond等人，1998)；斑萎蛋白，Best卵黄样黄斑营养不良基因的产物(VMD2，Marmorstein等人，2000)；以及色素上皮衍生因子(PEDF)，一种具有血管生成抑制特性的48kD分泌蛋白(Karakousis等人，2001；Jablonski等人，2000)。

RPE在感光受体维持中起重要作用，各种RPE的体内障碍与许多视力改变疾病相关，例如RPE脱离、发育不良、萎缩、视网膜病、色素性视网膜炎、黄斑营养不良或变性，包括老年性黄斑变性，这会导致感光受体损伤和失明。由于RPE具有损伤修复能力，已经对其进行了广泛研究以应用于移植治疗中。已经在几种动物模型和人中显示(Gouras等人，2002；Stanga等人，2002；Binder等人，2002；Schraemeyer等人，2001；Lund等人2001的综述)RPE移植具有很好的视力恢复潜能。最近提出了RPE移植的另一种有前景的功能，并且它甚至达到了临床试验期：因为这些细胞分泌多巴胺，它们可以用于治疗帕金森病(Subramanian,2001)。然而，如果使用同种异体移植，则甚至在免疫特免的眼部，也存在移植物排斥的问题，这会阻碍此方法的进行。另一问题是对胎儿组织的依赖性，因为成人RPE具有极低的增殖潜能。本发明降低了发生移植物排斥的可能并且消除了对胎儿组织使用的依赖。

作为免疫相容性组织的来源，hES细胞能够容许移植治疗，因为免疫排斥的问题可以经由核移植技术来克服。人ES细胞的新的分化衍生物包括视网膜色素上皮样细胞和神经前体细胞的使用以及制备它们的分化系统的使用为移植提供了RPE和神经前体细胞的诱人的可能来源。

因此，本发明的一个方面提供产生源自人胚胎干细胞的RPE细胞的改良方法，所述人胚胎干细胞可以是纯化的和/或分离的。这种细胞可用于治疗视网膜变性疾病诸如，例如，色素性视网膜炎、黄斑变性和其他眼睛疾患。可以使用本发明制备的细胞类型包括但不限于RPE细胞和RPE祖细胞。还可以制备的细胞包括：虹膜色素上皮(IPE)细胞和其他与视力相关的神经细胞，如联络神经元(如，内核层(INL))的“转接”神经元)和无长突细胞。此外，可以制备视网膜细胞、视杆、视锥和角膜细胞。在本发明的另一个实施方式中，还可以制备提供眼睛脉管系统的细胞。

人胚胎干细胞是此方法的起始材料。可以用本领域内的任何已知方法来培养胚胎干细胞，如在存在或不存在饲养细胞的条件下。此外，可以使用任何方法制备的人ES细胞来作为制备RPE细胞的起始材料。例如，人ES细胞可以源自胚泡期胚胎，该胚泡期胚胎是卵子和精子体外受精的产物。可选择地，人ES细胞可以源自从卵裂早期胚胎取出的一个或多个卵裂球，任选地不损坏剩余胚胎。在又其他实施方式中，可以使用核移植来制备人ES细胞。作为起始材料，可以使用预先冷藏保存的人ES细胞。

在这种制备RPE细胞的方法的第一步中，将人胚胎干细胞培养为胚状体。可以沉淀胚胎干细胞，将其重悬于培养基中并涂覆在培养皿中(例如，低吸附培养皿)。细胞可以在足以使细胞高密度生长的任何培养基中培养，例如用于病毒、细菌、昆虫、或动物细胞培养的商业上可获得的培养基。在某些实施方式中，使用营养物丰富的低蛋白培养基(例如，MDBK-GM培养基，它含有约150mg/ml(0.015％)动物源蛋白)。当使用低蛋白培养基时，该培养基含有例如小于或等于约5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.016％、0.015％、或甚至低于或等于0.010％的动物源蛋白。注意当提到低蛋白培养基中存在的蛋白百分比时，是指单独的培养基并且不计算以例如B-27补充物形式存在的蛋白。因此，应了解，当在低蛋白培养基和B-27补充物中培养细胞时，培养基中存在的蛋白百分比可能更高。

在某些实施方式中，使用营养物丰富的无蛋白培养基(例如，MDBK-MM培养基)。培养基的其他实例包括：例如，OptiPro SFM、VP-SFM、和EGM-2。这类培养基可以包含营养组分，例如胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠、谷氨酰胺、白蛋白、乙醇胺、胎球蛋白、蛋白胨、纯化的脂蛋白材料、维生素A、维生素C和维生素E。

在某些实施方式中，在低蛋白或无蛋白培养基中的细胞培养物均补充有无血清B-27补充物(Brewer等人，Journal of Neuroscience Research 35:567-576(1993))。B27补充物的营养组分可以包括生物素、L-肉碱、皮质酮、乙醇胺、D+-半乳糖、还原型谷胱甘肽、亚油酸(lineleic acid)、亚麻酸、孕酮、腐胺、视黄醇乙酸酯、硒、三碘-1-甲状腺原氨酸(T3)、DL-α-生育酚(维生素E)、DL-α-生育酚乙酸酯(DL-alpha-tocopherol acedate)、牛血清白蛋白、过氧化氢酶、胰岛素、超氧化物歧化酶、和转铁蛋白。当在补充有B-27的无蛋白培养基中培养细胞时，无蛋白是指加入B-27之前的培养基。

培养基还可以含有下列补充物：例如，肝素、氢化可的松、抗坏血酸、血清(例如，胎牛血清)、或生长基质(诸如，例如，来自牛角膜上皮的胞外基质、基质胶(BD biosciences)、或明胶)。

在本发明的这种方法中，RPE细胞由胚状体分化而来。从EB分离RPE细胞使得能够在体外富集培养中扩增RPE细胞。对于人细胞，RPE细胞可以从生长少于90天的EB获得。在本发明的某些实施方式中，RPE细胞在生长7-14天的人EB中产生。在其他实施方式中，RPE细胞在生长14-28天的人EB中产生。在另一个实施方式中，鉴定RPE细胞并且可以从生长28-45天的人EB将其分离。在另一个实施方式中，RPE细胞在生长45-90天的人EB中产生。可以任何间隔将用于培养胚胎干细胞、胚状体、和RPE细胞的培养基移除和/或替换成相同或不同的培养基。例如，可以在0-7天、7-10天、10-14天、14-28天或28-90天之后移除和/或替换培养基。在某些实施方式中，至少每天、每两天、或至少每三天替换培养基。

在某些实施方式中，洗涤从EB分化而来的RPE细胞，并使其解离(例如，通过胰蛋白酶/EDTA、胶原酶B、胶原酶IV、或分散酶)。在某些实施方式中，使用非酶溶液来解离细胞，如高EDTA含量的溶液诸如，例如基于Hanks的细胞解离缓冲液。

从解离的细胞中选择RPE细胞，将它们单独培养以制备RPE细胞的基本上纯化的培养物。RPE细胞根据与RPE细胞相关的特征来选择。例如，可以通过鹅卵石细胞形态和色素沉积来识别RPE细胞。此外，有几种已知的RPE标记物，包括：细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)，一种也在顶微绒毛中存在的胞质蛋白(Bunt-Milan和Saari，1983)；RPE65，一种参与类视黄醇代谢的胞质蛋白(Ma等人，2001；Redmond等人，1998)；斑萎蛋白，Best卵黄样黄斑营养不良基因的产物(VMD2，Marmorstein等人，2000)；以及色素上皮衍生因子(PEDF)，一种具有血管生成抑制特性的48kD分泌蛋白(Karakousis等人，2001；Jablonski等人，2000)。可选择地，RPE细胞可以根据细胞功能来选择，例如，脱落的视杆和视锥外节的吞噬作用、漫射光的吸收、维生素A代谢、类视黄醇再生、和组织修复(Grierson等人，1994；Fisher和Reh，2001；Marmorstein等人，1998)。评估还可以使用行为测试、荧光血管造影术、组织学、紧密连接传导性进行，或使用电子显微术评估。本发明的另一个实施方式是通过比较这类细胞与体内来源的细胞的信使RNA转录物来鉴定RPE细胞的方法。在某些实施方式中，在胚胎干细胞向RPE细胞分化期间的不同间期取细胞等分试样，进行上文所述的任何标记物表达的测定。这些特征能区分分化的RPE细胞。

RPE细胞培养基可以补充有一种或多种生长因子或药剂。可以使用的生长因子包括，例如，EGF、FGF、VEGF和重组胰岛素样生长因子。可用于本发明的其他生长因子包括6Ckine(重组的)、活化素A、αA-干扰素、α-干扰素、双调蛋白、血管生成素、B-内皮细胞生长因子、β动物纤维素、B-干扰素、脑源神经营养因子、C10(重组的)、心肌营养蛋白-1、纤毛神经营养因子、细胞因子诱导的中性粒细胞趋化物-1、内皮细胞生长补充物、嗜酸细胞活化趋化因子、表皮生长因子、上皮中性粒细胞活化肽-78、促红细胞生成素原、雌激素受体-α、雌激素受体-B、成纤维细胞生长因子(酸性/碱性，肝素稳定的，重组的)、FLT-3/FLK-2配体(FLT-3配体)、γ-干扰素、胶质细胞源神经营养因子、Gly-His-Lys、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、GRO-α/MGSA、GRO-B、GRO-γ、HCC-1、肝素结合的表皮生长因子样生长因子、肝细胞生长因子、调蛋白-α(EGF结构域)、胰岛素生长因子结合蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白-1/IGF-1复合体、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子II、2.5S神经生长因子(NGF)、7S-NGF、巨噬细胞炎性蛋白-1B、巨噬细胞炎性蛋白-2、巨噬细胞炎性蛋白-3α、巨噬细胞炎性蛋白-3B、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、NGF-B(人或大鼠重组的)、制瘤素M(人或小鼠重组的)、垂体提取物、胎盘生长因子、血小板源内皮细胞生长因子、血小板源生长因子、多营养因子、rantes、干细胞因子、基质细胞源性因子1B/前B细胞生长刺激因子、血小板生成素、转化生长因子α、转化生长因子-B1、转化生长因子-B2、转化生长因子-B3、转化生长因子-B5、肿瘤坏死因子(α和B)、和血管内皮生长因子。可根据本发明使用的药剂包括细胞因子，如干扰素-αA、干扰素-αA/D、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-γ诱导蛋白-10、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-1、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白细胞介素-15、白细胞介素-17、角质细胞生长因子、瘦素(leptin)、白血病抑制因子、巨噬细胞集落刺激因子、以及巨噬细胞炎性蛋白-1α。

根据本发明的药剂还包括激素和激素拮抗剂，如17B-雌二醇、促肾上腺皮质激素、肾上腺髓质素、α-黑素细胞刺激素、绒毛膜促性腺激素、皮质类固醇结合球蛋白、皮质酮、地塞米松、雌三醇、促卵泡激素、胃泌素1、胰高血糖素、促性腺素、氢化可的松、胰岛素、胰岛素样生长因子结合蛋白、L-3,3’,5’-三碘甲状腺原氨酸、L-3,3’,5-三碘甲状腺原氨酸、瘦素、黄体化激素、L-甲状腺素、褪黑激素、MZ-4、催产素、甲状旁腺素、PEC-60、垂体生长素、孕酮、催乳素、胰泌素、性激素结合球蛋白、促甲状腺激素、促甲状腺激素释放因子、甲状腺素结合球蛋白、和加压素。

此外，根据本发明的药剂包括胞外基质组分，如纤连蛋白、纤连蛋白的蛋白水解片段、层粘连蛋白、凝血酶敏感素、聚集蛋白聚糖、共结合蛋白聚糖(syndezan)。

根据本发明的药剂还包括各种因子的抗体，如抗低密度脂蛋白受体抗体、抗孕酮受体、内部抗体、抗α干扰素受体链2抗体、抗c-c趋化因子受体1抗体、抗CD118抗体、抗CD119抗体、抗集落刺激因子-1抗体、抗CSF-1受体/c-fins抗体、抗表皮生长因子(AB-3)抗体、抗表皮生长因子受体抗体、抗表皮生长因子受体磷酸化特异性抗体、抗表皮生长因子(AB-1)抗体、抗促红细胞生成素受体抗体、抗雌激素受体抗体、抗雌激素受体C-末端抗体、抗雌激素受体-B抗体、抗成纤维细胞生长因子受体抗体、抗碱性成纤维细胞生长因子抗体、抗γ-干扰素受体链抗体、抗γ-干扰素受人重组抗体、抗GFRα-1C-末端抗体、抗GFRα-2C-末端抗体、抗粒细胞集落刺激因子(AB-1)抗体、抗粒细胞集落刺激因子受体抗体、抗胰岛素受体抗体、抗胰岛素样生长因子-1受体抗体、抗白细胞介素-6人重组抗体、抗白细胞介素-1人重组抗体、抗白细胞介素-2人重组抗体、抗瘦素小鼠重组抗体、抗神经生长因子受体抗体、抗p60鸡抗体、抗甲状旁腺素样蛋白抗体、抗血小板源生长因子受体抗体、抗血小板源生长因子受体-B抗体、抗血小板源生长因子-α抗体、抗孕酮受体抗体、抗视黄酸受体-α抗体、抗甲状腺素核受体抗体、抗甲状腺素核受体-α1/Bi抗体、抗转铁蛋白受体/CD71抗体、抗转化生长因子-α抗体、抗转化生长因子-B3抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体和抗血管内皮生长因子抗体。

本文所述的生长因子、试剂和其他补充物可以单独或与其他因子、药剂或补充物组合使用。可以在细胞培养后立即或在细胞培养后任何时间将因子、药剂和补充物加入培养基中。

在某些实施方式中，将RPE细胞进一步培养以制备成熟RPE细胞培养物。用于培养RPE细胞的培养基可以是适于高密度细胞培养物生长的任何培养基，例如本文所述的培养基。例如，本文所述的细胞可以在VP-SFM、EGM-2、和MDBK-MM中培养。

下面提供上文所描述的本发明特征的某些可操作性组合的更详细描述。

在某些实施方式中，提供了预先获得的人胚胎干细胞培养物。hES细胞可以例如预先从胚泡获得(通过受精或核移植制备)或从早期卵裂期胚胎的一个或多个卵裂球获得(任选不损坏剩余胚胎)。将人ES细胞培养为悬浮培养物以制备胚状体(EB)。将胚状体悬浮培养约7-14天。然而，在某些实施方式中，可以悬浮培养EB小于7天(小于7、6、5、4、3、2、或小于1天)或大于14天。EB可以在任选地补充有 B-27补充物的培养基中培养。

以悬浮培养物培养EB后，将EB转移以制备贴壁培养物。例如，可以将在培养基中的EB涂覆到涂布有明胶的平板上。当以贴壁培养物培养时，可以将EB在与悬浮生长相同类型的培养基中培养。在某些实施方式中，当细胞以贴壁培养物培养时，培养基未补充B-27补充物。在其他实施方式中，培养基最初补充有B-27(例如，小于或等于约7天)，但是随后在贴壁培养的剩余阶段则在无B-27的条件下培养。可以贴壁培养物培养EB约14-28天。然而，在某些实施方式中，可以培养EB小于14天(小于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或小于1天)或大于28天。

RPE细胞开始从EB的贴壁培养物的细胞中分化。RPE细胞可以根据它们的鹅卵石形态和色素沉积的开始出现来从视觉上识别。随着RPE细胞继续分化，可以观察到RPE细胞集簇。

为了富集RPE细胞并建立RPE细胞的基本上纯化的培养物。使用机械和/或化学方法使RPE细胞彼此相互解离并与非RPE细胞解离。然后可将RPE细胞悬浮液转移到新培养基和新培养瓶中以提供富集的RPE细胞群。

富集的RPE细胞培养物可以在适合的培养基例如EGM-2中培养。这种培养基或功能等同物或类似培养基可以补充有一种或多种生长因子或药剂(例如，bFGF、肝素、氢化可的松、血管内皮生长因子、重组胰岛素样生长因子、抗坏血酸、人表皮生长因子)。

对于其中RPE细胞成熟化的实施方式，可以将RPE细胞进一步在例如MDBK-MM培养基中培养直至得到所需的成熟水平。这可以通过在成熟期间监测色素沉积水平的增加来测定。作为MDBK-MM培养基的替代物，可以使用功能等同物或类似培养基。无论用于使RPE细胞成熟的具体培养基如何，培养基都可任选地补充有一种或多种生长因子或药剂。

RPE细胞培养物，以及因此由这些培养物制备的RPE细胞制剂可以为含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、 2％、或小于1％的非RPE细胞的基本上纯的RPE细胞。在某些实施方式中，基本上纯化的(相对于非RPE细胞)培养物含有不同成熟水平的RPE细胞。在其他实施方式中，培养物相对于非RPE细胞以及相对于不同的成熟水平的RPE细胞来说是基本上纯的。

对于上述实施方式的任一个，本发明包括了可以源自人多潜能干细胞例如iPS细胞和胚胎干细胞的RPE细胞(特征如上文所描述)。在某些实施方式中，RPE细胞是使用本文所述的任何方法从人多潜能干细胞获得的。

分化的多潜能干细胞来源的RPE细胞制剂

本发明提供人多潜能干细胞来源的RPE细胞制剂。在某些实施方式中，所述制剂为人胚胎干细胞来源的RPE细胞制剂。在某些实施方式中，所述制剂为人iPS细胞来源的RPE细胞制剂。在某些实施方式中，所述制剂为包含分化的ES来源的RPE细胞的基本上纯化的(相对于非RPE细胞)制剂。所谓相对于非RPE细胞基本上纯化的意指制剂包含至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或甚至大于99％的RPE细胞。换言之，RPE细胞的基本上纯化的制剂含有小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或小于1％的非RPE细胞类型。在某些实施方式中，这种基本上纯化的制剂中的RPE细胞含有不同成熟水平/色素沉积水平的RPE细胞。在其他实施方式中，RPE细胞相对于非RPE细胞以及相对于其他成熟水平的RPE细胞来说均为基本上纯的。在某些实施方式中，所述制剂相对于非RPE细胞是基本上纯化并且是成熟RPE细胞富集的。所谓成熟RPE细胞富集的意指至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或甚至大于99％的RPE细胞为成熟RPE细胞。在其他实施方式中，所述制剂相对于非RPE细胞是基本上纯化的，并且是分化的RPE细胞而非成熟RPE细胞富集的。所谓富集的，意指至少30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或甚至大于99％的RPE细胞为分化的RPE细胞而非成熟RPE细胞。在某些实施方式中，成熟RPE细胞通过下列的一种或多种与RPE细胞区别开：色素沉积水平；Pax-2、Pax-6、和/或酪氨酸酶的表达水平。在某些实施方式中，所述制剂包括至少1×10³个RPE细胞、5×10³个RPE细胞、1×10⁴个RPE细胞、5×10⁴个RPE细胞、1×10⁵个RPE细胞、2×10⁵个RPE细胞、3×10⁵个RPE细胞、4×10⁵个RPE细胞、5×10⁵个RPE细胞、6×10⁵个RPE细胞、7×10⁵个RPE细胞、8×10⁵个RPE细胞、9×10⁵个RPE细胞、1×10⁶个RPE细胞、5×10⁶个RPE细胞、6×10⁶个RPE细胞、7×10⁶个RPE细胞、8×10⁶个RPE细胞、9×10⁶个RPE细胞、1×10⁷个RPE细胞、5×10⁷个RPE细胞、1×10⁸个RPE细胞、1×10⁹个RPE细胞、或甚至大于1×10⁹个RPE细胞。

在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞不表达ES细胞标记物。例如，如定量RT-PCR所评估的，RPE细胞中ES细胞基因Oct-4、nanog、和/或Rex-1的表达比ES细胞中低约100-1000倍。因此，与ES细胞相比，RPE细胞基本上是Oct-4、nanog、和/或Rex-1基因表达阴性的。

在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞在mRNA和蛋白水平上表达下列物质的一种或多种：RPE65、斑萎蛋白、PEDF、CRALBP、Otx2、和MitF。在某些实施方式中，RPE细胞表达这些标记物的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或六种。在某些实施方式中，RPE细胞在mRNA和蛋白水平另外或可选择地表达下列物质的一种或多种(1、2、或3种)：pax-2、pax6和酪氨酸酶。在其他实施方式中，RPE细胞的成熟水平由pax-2、pax6和酪氨酸酶的一种或多种(1、2、或3种)的表达来评估。

在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞在mRNA和/或蛋白水平表达表1中所列的RPE特异性基因(pax-6、pax-2、RPE65、PEDF、CRALBP、斑萎蛋白、mitF、Otx-2、和酪氨酸酶)的一种或多种(1、2、3、4、5、6、7、8、或9种)以及表1中所列的神经视网膜基因(CHX10、NCAM、巢蛋白、β-微管蛋白)的一种或多种(1、2、3、或4种)。然而， RPE细胞基本上不表达ES细胞特异性基因Oct-4、nanog、和/或Rex-1(例如，如通过定量RT-PCR所测定的，RPE细胞中的ES细胞特异性基因表达低了100-1000倍)。

在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞在mRNA和/或蛋白水平表达表2中所列基因的一种或多种基因(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或大于48种)，并且RPE细胞中所述一种或多种基因的表达与人ES细胞中的表达水平(如果有的话)相比是增加的。另外或可选择地，ES来源的RPE细胞在mRNA和/或蛋白水平表达表3中所列基因的一种或多种基因(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或大于25种)，但是RPE细胞中所述一种或多种基因的表达与人ES细胞中的表达水平相比是降低的(包括降低至几乎不可检测的水平)。

在某些实施方式中，RPE细胞的基本上纯化的制剂包含不同成熟水平的RPE细胞(例如，分化的RPE细胞和成熟分化的RPE细胞)。在这种情况下，制剂在指示色素沉积的标记物表达方面具有差异性。例如，尽管这类细胞可能具有基本上相同的RPE65、PEDF、CRALBP、和斑萎蛋白表达。但是根据成熟水平，这些RPE细胞可能在pax-2、pax-6、mitF、和/或酪氨酸酶的一种或多种的表达方面有所不同。

在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞是稳定的、终末分化的RPE细胞，它们不会去分化为非RPE细胞类型。在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞为功能RPE细胞。

在某些实施方式中，ES来源的RPE细胞的特征在于整合到角膜上视网膜、视网膜下，或移植或施用到动物中的其他能力。

制剂是依从GMP标准制备的。如此，在某些实施方式中，制剂为GMP依从性制剂。在其他实施方式中，制剂基本上没有病毒、细菌、和/或真菌感染和污染。

在某些实施方式中，将制剂冷藏保存以用于储存和以后使用。因此，本发明提供了包含RPE细胞的基本上纯化的冷藏保存制剂。将冷藏保存制剂在适于在冷藏保存期间和冷藏保存之后保持细胞活力的赋形剂中配制。在某些实施方式中，冷藏保存制剂包含至少1×10³个RPE细胞、5×10³个RPE细胞、1×10⁴个RPE细胞、5×10⁴个RPE细胞、1×10⁵个RPE细胞、2×10⁵个RPE细胞、3×10⁵个RPE细胞、4×10⁵个RPE细胞、5×10⁵个RPE细胞、6×10⁵个RPE细胞、7×10⁵个RPE细胞、8×10⁵个RPE细胞、9×10⁵个RPE细胞、1×10⁶个RPE细胞、5×10⁶个RPE细胞、6×10⁶个RPE细胞、7×10⁶个RPE细胞、8×10⁶个RPE细胞、9×10⁶个RPE细胞、1×10⁷个RPE细胞、5×10⁷个RPE细胞、1×10⁸个RPE细胞、1×10⁹个RPE细胞、或甚至大于1×10⁹个RPE细胞。冷藏保存制剂可以相对于非RPE细胞和/或相对于不同成熟水平的RPE细胞具有与上文所详细说明的相同的纯度。在某些实施方式中，RPE细胞的冷藏保存制剂中至少65％的RPE细胞在解冻后保持活力。在其他实施方式中，RPE细胞的冷藏保存制剂中至少70％、75％、80％、85％、90％、81％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％的RPE细胞在解冻后保持活力。

本文所提供的RPE细胞为人细胞。然而，需注意人细胞可用于人患者以及动物模型或动物患者。例如，可以在大鼠、狗、或非人灵长类视网膜变性模型中测试人细胞。此外，人细胞可治疗性地用于治疗需要其的动物，如在兽医医学背景下。

制剂可以配制成在药学上可接受的载体或赋形剂中的药物制剂。优选的制剂经过特定配制以向眼睛施用(例如，视网膜下、角膜、眼睛等)。

在上述任一方面的某些实施方式中，RPE细胞源自人多潜能干细胞，如人胚胎干细胞或人iPS细胞。本发明包括了本文所述的任何制剂均可由适合的人多潜能干细胞获得。

包括了包括上述任何特征的一种或多种的制剂。

本发明包括了任何上述RPE细胞制剂，包括基本上纯化的制剂以及具有特定的最小数目的RPE细胞的制剂，可以用于治疗本文所述的任何适应症。另外，使用本文所述的任何方法分化的RPE细胞可用于治疗本文所述的任何适应症。

基于RPE细胞的治疗

RPE细胞和通过本文所述方法制备的和/或具有本文所述RPE细胞制剂的特征的包含RPE细胞的药物制剂可用于需要RPE细胞或RPE细胞能改善其治疗的基于细胞的治疗。下面的部分描述使用本发明提供的RPE细胞来治疗可获益于基于RPE细胞的治疗的各种病症的方法。将根据具体的病症、病症严重程度以及患者的总体健康状况来制定具体的治疗方案、施用途径、和任何辅助治疗。此外，在某些实施方式中，RPE细胞的施用可以有效地完全恢复视力损失或其他症状。在其他实施方式中，RPE细胞施用可以有效地降低症状的严重程度和/或阻止患者的病症进一步恶化。本发明包括了包含RPE细胞的制剂的施用可用于治疗(包括整体或部分地降低症状的严重程度)上述和下述的任何病症。此外，RPE细胞施用可用于帮助治疗内源RPE层的任何损伤的症状。

本发明包括使用本文所述的任何方法获得的RPE细胞，包括包含RPE细胞的制剂，可用于治疗本文所述的任何适应症。此外，本发明包括了本文所述的包含RPE细胞的任何制剂可用于治疗本文所述的任何适应症。

色素性视网膜炎是一种遗传病症，其中视受体由于异常的基因编程而逐渐受损。一些形式会引起在较小的年龄全盲，而其他形式则显示出具有极小的视力损坏的特征性“骨针”视网膜变化。该疾病影响着世界上大约150万人。在仅表达于RPE的基因中发现了引起常染色体隐性色素性视网膜炎的两种基因缺陷。一种是由于参与维生素A代谢的RPE蛋白(顺式视黄醛结合蛋白)。第二种涉及RPE所独有的另一种蛋白RPE65。本发明提供通过施用RPE细胞而治疗这两种形式的色素性视网膜炎的方法和组合物。

在另一个实施方式中，本发明提供用于治疗与视网膜变性相关的疾患包括黄斑变性的方法和组合物。

本发明的另一方面是RPE细胞用于治疗眼部疾病包括遗传性和获得性眼部疾病的用途。获得性或遗传性眼部疾病的实例为老年性黄斑变性、青光眼和糖尿病性视网膜病。

老年性黄斑变性(AMD)是西方国家中法定盲的最常见起因。黄斑下视网膜色素上皮的萎缩和脉络膜新血管形成(CNV)的发育继发地导致中央视敏度损失。对于大多数具有窝下鳞CNV和地理性萎缩(geographic atrophy)的患者，目前还没有可用的治疗来防止中央视敏度的损失。AMD的早期标志是视网膜色素上皮和布鲁赫(Bruch)膜之间的沉积(晶簇)。在疾病期间，脉络膜血管会向黄斑的视网膜下间隙出芽。这会导致中央视力和阅读能力的损失。

青光眼是给予眼压异常增加的一组疾病的名称。它会导致视野的限制和视力的一般性降低。最常见的形式是原发性青光眼；区分为两种形式：慢性钝角型青光眼和急性闭角型(acute angle closure)。继发性青光眼可能由感染、肿瘤或损伤引起。第三种形式是遗传性青光眼，它通常源自孕期的发育障碍。眼球中的房水处于某个压力下，该压力是眼睛光学特性所必需的。眼内压通常为15至20毫米汞柱，并且它由房水产生和房水流出之间的平衡来控制。在青光眼中，前房角中房水的流出受阻，从而使得眼内压升高。青光眼常在中年或老年人中发生，但遗传形式和疾病在儿童和青少年中也并非罕见的。尽管眼内压仅轻微升高，并且此外没有显著的症状，但逐渐会发生损伤，尤其是视野限制。相比之下，急性闭角会引起疼痛、发红、瞳孔扩大和重度视力障碍。角膜变得混浊并且眼内压大大升高。随着疾病进展，视野变得愈加狭窄，这可以使用眼科仪器视野计容易地测得。慢性青光眼对于增强房水流出的药物的区域施用反应很好。有时给予具有全身活性的物质来降低房水产生。然而，药物治疗并不总是能成功。如果药物疗法失败，则使用激光治疗或常规手术来制造新的房水流出口。急性青光眼是医学急症。如果眼内压未在24小时内降低，则产生永久性损伤。

糖尿病性视网膜病在糖尿病的情况下发生。它会导致血管内皮细胞的基膜因蛋白糖基化而增厚。这是早期血管硬化和毛细血管动脉瘤形成的原因。这些血管变化会在几年的过程内导致糖尿病性视网膜病。血管变化会引起毛细血管区域灌注不足。这导致了脂质沉积(硬性渗出物)和血管增生。糖尿病患者的临床过程是可以变化的。在老年性糖尿病(II型糖尿病)中，首先出现毛细血管动脉瘤。此后，由于毛细血管灌注削弱，在视网膜实质中出现硬性和软性渗出物和点状出血。在糖尿病性视网膜病的晚期，脂肪沉积物绕黄斑排列成类似冠状(环状视网膜病)。这些改变常伴随着眼睛后极水肿。如果水肿涉及了黄斑，则会有严重的急性视力退化。I型糖尿病的主要问题是眼底区域的血管增生。标准治疗为对眼底的受影响区域进行激光凝固。激光凝固开始在受影响的视网膜区域区域进行。如果渗出物持续，则将激光凝固区域延伸。具有最敏锐视力位点的视网膜中心，也就是黄斑和乳头黄斑束，不能被凝固，因为该过程会导致对视力最重要的视网膜部分受损。如果已经出现了增生，则将焦点(foci)非常密集地施加到增生的基底处通常是必需的。这使视网膜区域受损。结果是相应的视野损失。对于I型糖尿病，适当时机的激光凝固通常是拯救患者免于失明的唯一机会。

在某些实施方式中，本发明的RPE细胞可用于治疗中枢神经系统疾患。可以将RPE细胞移植到CNS中。目前，已在动物实验或在临床研究中在患有帕金森病的患者中采用了许多种不同的细胞类型。实例为从人胎儿脑部获得的胎儿细胞。已经在对300多位患有帕金森病的患者的临床研究中移植了来自中脑腹侧或多巴胺能神经元的胎儿细胞(有关综述参见Alexi T,Borlongan CV,Faull RL,Williams CE,Clark RG,Gluckman PD,Hughes PE(2000)(Neuroprotective strategies for basal ganglia degeneration:Parkinson’s and Huntington’s diseases(基底神经节变性的神经保护策略：帕金森病和亨延顿氏病)Prog Neurobiol 60:409470)。许多不同的细胞类型已用于患有帕金森病的患者或动物模型中以为了自发地或在基因转移后替代多巴胺(Alexi等人2000，如上)，这些不同的细胞类型包括非神经细胞，例如来自肾上腺皮质的细胞、生殖腺上的塞托利(Sertoli)细胞或来自颈动脉体的球细胞、成纤维细胞或星形细胞。移植的胎儿多巴胺能神经元的存活率为58％，这足以引起引起体征和症状的轻微改善(Alexi等人2000，如上)。

近年来，已经在体外分离、扩增了来自成年脊椎动物脑部的神经干细胞，并将它们再移植到CNS中，然后它们分化为纯的神经元。然而，它们在CNS中的功能还不确定。还将神经元前体细胞用于了基因转移(Raymon HK,Thode S,Zhou J,Friedman GC,Pardinas JR,Barrere C,Johnson RM,Sah DW(1999)Immortalized human dorsal root ganglion cells differentiate into neurons with nociceptive properties(永生化人背根神经节细胞分化为具有感受伤害特性的神经元).J Neurosci 19:54205428)。过表达NGF和GDNF的施旺细胞在帕金森病模型中具有神经保护作用(Wilby MJ,Sinclair SR,Muir EM,Zietlow R,Adcock KH,Horellou P,Rogers JH,Dunnett SB,Fawcett JW(1999)A glial cell line-derived neurotrophic factor-secreting clone of the Schwann cell line SCTM41enhances survival and fiber outgrowth from embryonic nigral neurons grafted to the striatum and to the lesioned substantia nigra(施旺细胞系SCTM41的神经胶质细胞系来源的分泌神经营养因子的克隆增强移植到纹状体和损伤的黑质中的胚胎黑质神经元的存活和纤维派生)J Neurosci 19:23012312)。

因此，本发明的另一方面是色素上皮细胞用于治疗神经疾病的用途，所述神经疾病尤其是神经系统疾病，优选CNS疾病，特别是帕金森病。

常见的CNS疾病的一个实例是帕金森病，它是一种脑部的慢性退行性疾病。该疾病由基底神经节区域中特化的神经细胞变性引起。多巴胺能神经元的死亡导致帕金森病患者中重要的神经递质多巴胺的合成降低。标准治疗是用L-多巴进行的药物治疗。L-多巴在基底神经节中被代谢为多巴胺，并在那里接管丢失的内源神经递质的功能。然而，L-多巴治疗会在若干年后损失其活性。

可以治疗或用于测试使用本文所述的方法制备的RPE细胞效力的色素性视网膜炎的动物模型包括啮齿动物(rd小鼠、RPE-65敲除小鼠、桶状(tubby-like)小鼠、RCS大鼠)、猫(阿比西尼亚猫)和狗(视锥变性的“cd”狗、进行性视杆-视锥变性的“prcd”狗、早期视网膜变性的“erd”狗、视杆-视锥发育不良1、2&3“rcd1、rcd2&rcd3”狗、感光受体发育不良“pd”狗、和Briard“RPE-65”(狗))。

本发明的另一个实施方式是用于从RPE系或前体获得具有较高的防止新血管生成能力的RPE细胞。这类细胞可以如下制备：使来自患者的体细胞老化以便使端粒酶缩短，其中已经过了至少10％的细胞正常复制寿命，然后使用所述体细胞作为核移植供体细胞以制备过表达血管发生抑制因子如色素上皮衍生因子(PEDF/EPC-1的细胞。可选择地，可以用抑制新血管形成的外源基因从遗传上修饰这类细胞。

本发明包括了由人多潜能干细胞(例如，人胚胎干细胞、iPS细胞、或其他多潜能干细胞)分化而来的RPE细胞的制剂可用于治疗上述疾病或病症的任一种以及内源RPE层的损伤。可以用包含不同成熟水平的分化的RPE细胞的混合物的RPE细胞制剂以及富集成熟分化的RPE细胞或分化的RPE细胞的分化的RPE细胞制剂来治疗这些疾病。

施用模式

本发明的RPE细胞可以局部(topical)、全身、或区域施用，如通过注射(如玻璃体内注射)；或作为装置或植入物(例如，缓释植入物)的一部分施用。

依据施用方法，可以将RPE细胞添加到缓冲的电解质平衡水溶液、具有下列物质的缓冲的电解质平衡水溶液中：润滑聚合物、矿物油或基于凡士林的药膏、其他油、脂质体、环糊精、缓释聚合物或凝胶。这些制剂可以局部施用到眼睛一段多达患者的整个寿命的时间，每天 1至6次施用。

在某些实施方式中，治疗患视网膜变性相关病症的患者的方法包括：通过下列方法施用本发明的组合物：区域(例如，通过眼内注射或插入释放本发明组合物的缓释装置)、通过局部方法或通过全身性施用(通过容许在体内全身吸收，或使药物在血流中积累然后分散到整个身体的施用途径，包括但不限于通过静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌肉内途径)。本发明组合物的眼内施用包括：例如，递送到玻璃体内、经角膜、结膜下、近巩膜(juxtascleral)、巩膜后、和眼睛的tenon囊下(sub-tenon)部分。参见，例如，美国专利第6,943,145；6,943,153；和6,945,971号，它们的内容通过引用并入本文。

本发明的RPE细胞可以药学上可接受的眼科制剂形式通过眼内注射来递送。例如，当通过玻璃体内注射施用制剂时，应将溶液浓缩以便可以递送最小的体积。注射剂的浓度可以为有效且无毒的任何量，这取决于本文所述的因素。在一些实施方式中，将用于治疗患者的RPE细胞配制成剂量为约10⁴个细胞/mL。在其他实施方式中，将用于治疗患者的RPE细胞配制成剂量为约10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、或10¹⁰个细胞/mL。

可以将RPE细胞配制为在药学上可接受的眼部载体中递送，以便使组合物保持与眼表面接触允许细胞渗透入受影响的眼睛区域的充足时间段，所述受影响的眼睛区域例如，前房、后房、玻璃体、房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫毛、晶状体、脉络膜、视网膜、巩膜、脉络膜上间隙、结膜、结膜下间隙、巩膜外间隙、角膜内间隙、角膜外间隙、睫状环、手术诱导的无血管区、或黄斑。包含本发明药剂尤其是配制成药物组合物的那些药剂的产品和系统，如递送载体-以及包含这类递送载体和/或系统的试剂盒也被包括为本发明的一部分。

在某些实施方式中，本发明的治疗方法包括将本发明的RPE细胞作为植入物或装置施用的步骤。在某些实施方式中，装置是用于治疗眼睛的医学病症的生物蚀解植入物，该植入物包含分散在生物可降解的聚合物基质中的活性药剂，其中至少约75％的活性药剂粒子具有小于约10μm的直径。将生物蚀解植入物制成适于植入眼睛区域的大小。眼睛区域可以为前房、后房、玻璃体腔、脉络膜、脉络膜上间隙、结膜、结膜下间隙、巩膜外间隙、角膜内间隙、角膜外间隙、巩膜、睫状环、手术诱导的无血管区、黄斑、和视网膜的任何一种或多种。生物可降解的聚合物可以为，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)共聚物。在某些实施方式中，聚合物中乳酸与乙醇酸单体的比率为约25/75、40/60、50/50、60/40、75/25重量百分比，更优选地约50/50。此外，PLGA共聚物可以为生物蚀解植入物的按重量计约20、30、40、50、60、70、80至约90％。在某些优选的实施方式中，PLGA共聚物可以为生物蚀解植入物的按重量计约30至约50％，优选地按重量计约40％。

根据本文所述方法施用的组合物体积还可以取决于诸如施用模式、RPE细胞数目、患者的年龄和体重、所治疗疾病的类型和严重程度的因素。例如，如果以液体口服施用，则包含本发明的组合物的液体体积可以为约0.5毫升至约2.0毫升、约2.0毫升至约5.0毫升、约5.0毫升至约10.0毫升、约10.0毫升至约50.0毫升。如果通过注射施用，则包含本发明的组合物的液体体积可以为约5.0微升至约50微升、约50微升至约250微升、约250微升至约1毫升、约1毫升至约5毫升、约5毫升至约25毫升、约25毫升至约100毫升、约100毫升至约1升。

如果通过眼内注射施用，则可以在患者的整个寿命期间周期性递送RPE细胞一次或多次。例如，可以每年1次、每6-12个月1次、每3-6个月1次、每1-3个月1次、或每1-4周1次地递送RPE细胞。可选择地，某些病症或疾患可能需要更频繁地施用。如果通过植入物或装置施用，则根据具体患者和所治疗的疾患或病症的需要，RPE细胞可以施用一次，或者在患者的整个寿命期间周期性施用一次或多次。类似地，还包括了随时间改变的治疗方案。例如，开始时可能需要较频繁的治疗(例如，每天一次或每周一次的治疗)。随着时间的过去，由于患者的病症有所改善，可能需要不那么频繁的治疗或甚至不需要进一步治疗。

在某些实施方式中，还在RPE细胞施用之前、同时、或之后给患者施用免疫抑制治疗。免疫抑制治疗可能在患者整个生命中都需要，或着需要较短的一段时间。

在某些实施方式中，将本发明的RPE细胞与药学上可接受的载体一起配制。例如，RPE细胞可以单独或作为药物制剂的组分施用。可以将主题化合物配制为以任何方便方法施用以用于人的药物中。在某些实施方式中，适于肠胃外施用的药物组合物可以包含RPE细胞与一种或多种下列物质的组合：药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液、或可以在即将使用前重构成无菌注射液或分散液的无菌粉末，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。本发明的药物组合物中可以采用的适合的水性和非水性载体的实例包括：水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇、聚乙二醇和类似多元醇)、及其适合的混合物；植物油，如橄榄油；和可注射的有机酯，如油酸乙酯。可以通过例如以下方法保持适当的流动性：使用涂覆材料，如卵磷脂；在分散液的情况下维持需要的粒径；和使用表面活性剂。

本发明的组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂来确保微生物作用的防止，所述抗细菌剂和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、山梨酸苯酚和类似抗细菌剂和抗真菌剂。还希望的是在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠和类似等渗剂。此外，可注射药物形式的延长吸收可以通过加入一种或多种延迟吸收的药剂诸如例如单硬脂酸铝和明胶来达成。

当施用时，用于本发明的治疗组合物当然是无致热原的生理上可接受形式。此外，可能希望将组合物装入胶囊或以粘性形式注射到玻璃体液中以递送到视网膜或脉络膜损伤位点。

工程化人胚胎干细胞中的MHC基因以获得复杂性降低的RPE细胞

用作制备本发明的RPE细胞的方法的起点的人胚胎干细胞还可以从人胚胎干细胞文库获得，它们中的每一个对于人群中存在的至少一个MHC等位基因为半合子的、纯合子的、或无效合子的。在某些实施方式中，所述干细胞文库的各成员与该文库中剩余成员相比对于不同组的MHC等位基因为半合子的或纯合子的。在某些实施方式中，干细胞文库对于人群中存在的所有MHC等位基因为半合子的或纯合子的。在本发明的内容中，对于一个或多个组织相容性抗原基因为纯合子的干细胞包括对于一个或多个(并且在一些实施方式中，所有)此类基因为无效合子的细胞。基因座的无效合子意指该基因在此座位是无效的，即，该基因的两种等位基因均缺失或失活。对所有MHC基因为无效合子的干细胞可以通过本领域内已知的标准方法制备，例如，基因打靶和/或杂合性丢失(LOH)。参见，例如美国专利公布US20040091936、US 20030217374和US 20030232430、和美国临时申请第60/729,173号，它们所有的公开内容通过引用并入本文。

因此，本发明涉及获得MHC复杂性降低的RPE细胞，包括RPE细胞的文库的方法。MHC复杂性降低的RPE细胞将增加治疗应用的可用细胞来源，因为它会消除与患者配型相关的困难。这些细胞可以源自被工程化为对于MHC复合体基因为半合子的或纯合子的干细胞。

人ES细胞可以包括对细胞MHC复合体中的姐妹染色体等位基因之一的修饰。可以使用用于产生基因修饰的多种方法(如基因打靶)来修饰MHC复合体中的基因。此外，随后可以将细胞中修饰的MHC复合体等位基因工程化为纯合子以便使姐妹染色体上存在相同的等位基因。可以使用诸如杂合性丢失(LOH)的方法来将细胞工程化以在MHC复合体上具有纯合子等位基因。例如，可以靶向来自亲本等位基因的一组MHC基因中的一个或多个基因来产生半合子细胞。可以通过基因打靶或LOH移除另一组MHC基因以制备无效系。这种无效系可以进一步用作其中丢掉了HLA基因阵列或单个基因的胚胎细胞系以制备半合子或纯合子库，该库具有除此外一致的遗传背景。

在一个方面，将文库中各成员对于至少一个HLA基因为纯合子的ES细胞系文库用于根据本发明方法获得RPE细胞。在另一方面，本发明提供RPE细胞(和/或RPE谱系细胞)的文库，其中选择几种ES细胞系并使其分化为RPE细胞。这些RPE细胞和/或RPE谱系细胞可用于需要基于细胞的治疗的患者。

因此，本发明的某些实施方式涉及将源自复杂性降低的胚胎干细胞的人RPE细胞施用给需要其的患者的方法。在某些实施方式中，本发明包括下列步骤：(a)鉴定需要涉及向他或她施用人RPE细胞的治疗的患者；(b)鉴定患者细胞表面表达的MHC蛋白；(c)提供通过本发明制备RPE细胞的方法制备的MHC复杂性降低的人RPE细胞文库；(d)从所述文库中选择与他或她的细胞上的此患者的MHC蛋白匹配的RPE细胞；(e)将步骤(d)的任何细胞施用给所述患者。这种方法可以在区域性的中心进行，例如，医院、诊所、医师诊所以及其他医疗保健机构。此外，选择为与患者匹配的RPE细胞，如果以很小的细胞数目储存的话，可以在患者治疗之前先扩增。

其他商业应用和方法

本发明的某些方面涉及达到商业数量的RPE细胞的制备。在具体实施方式中，大规模制备RPE细胞，需要时将其储存，并提供给医院、临床医生或其他医疗保健机构。一旦患者出现如下适应症：例如斯特格黄斑营养不良、老年性黄斑变性、或色素性视网膜炎，便可以及时定制和提供RPE细胞。因此，本发明涉及制备RPE细胞以获得商业规模的细胞的方法、包含从所述方法获得的RPE细胞的细胞制剂，以及将RPE细胞提供(即，制备、任选地储存、以及销售)给医院和临床医生的方法。

因此，本发明的某些方面涉及制备、储存和分销通过本文所公开的方法制备的RPE细胞的方法。在RPE制备之后患者治疗之前，可以将RPE细胞收获，纯化并任选储存。RPE细胞可任选地为患者特异性的或根据HLA或其他免疫原性特征特定选择的。

因此，在具体实施方式中，本发明提供将RPE细胞供应给医院、医疗保健中心、和临床医生的方法，其中将通过本文所公开的方法制备的RPE细胞储存；根据医院、医疗保健中心、或临床医生的要求定制；并施用给需要RPE细胞治疗的患者。在替代性实施方式中，医院、医疗保健中心、或临床医生根据患者的具体数据定制RPE细胞，根据患者的技术指标(specification)制备RPE细胞，随后将其提供给提出定制的医院或临床医生。

在某些实施方式中，从人胚胎干细胞分化RPE细胞的方法根据药品生产质量管理规范(GMP)进行。在某些实施方式中，人胚胎干细胞的最初获得或制备也根据药品生产质量管理规范(GMP)进行。可以在整个分化实验方案的一个或多个点测试细胞以确保例如，细胞或培养基中没有病毒、细菌、或真菌感染或污染。类似地，可以测试用作起始材料的人胚胎干细胞以确保没有病毒、细菌、或真菌感染或污染。

在某些实施方式中，扩大分化的RPE细胞或成熟分化的RPE细胞的制备规模以供商业应用。例如，该方法可用于制备至少1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁸、5×10⁸、1×10⁹、5×10⁹、或1×10¹⁰个RPE细胞。

本发明的另外方面涉及可以向潜在的患者接受者提供匹配的细胞的RPE细胞文库。因此，在一个实施方式中，本发明提供实施医药交易的方法，该方法包括下列步骤：提供对于至少一个组织相容性抗原为纯合子的RPE细胞制剂，其中细胞从包含可通过本文所公开的方法扩增的RPE细胞文库的这种细胞库中选择，其中各RPE细胞制剂对于人群中存在的至少一个MHC等位基因为半合子的或纯合子的，并且其中RPE细胞的所述库包含与该细胞库中的其他成员相比对于不同组的MHC等位基因各自为半合子或纯合子的细胞。如上文所提到的，可以使用基因打靶或杂合性丢失来制备用于获得RPE细胞的半合子或纯合子的MHC等位基因干细胞。在一个实施方式中，在选择了适于患者的具体RPE细胞制剂后，之后将其扩增以达到适于患者治疗的量。实施医药交易的方法还可以包括建立用于分销要销售的制剂的分销系统，或者可以包括建立销售小组以便营销药物制剂。

本发明的其他方面涉及本发明的RPE细胞作为下列背景的研究工具的用途：例如，药学、化学、或生物技术公司、医院、或学术机构或研究所。这些用途包括由胚胎干细胞分化而来的RPE细胞在鉴定例如以下的药剂的筛选测定中的用途：可用于促进体外或体内RPE存活或可用于促进RPE成熟的药剂。可以在体外或动物模型中研究鉴定的药剂来评估例如它们单独或与RPE细胞组合的可能用途。

本发明还包括由患者获得人ES细胞，然后制备并扩增从ES细胞获得的RPE细胞的方法。可以储存这些RPE细胞。此外，这些RPE细胞可用于治疗从中获得ES细胞的患者或该患者的亲属。

由于上述方法和应用涉及了治疗、药物制剂、以及RPE细胞储存，因此本发明还涉及适于此类应用的RPE细胞溶液。因此，本发明涉及适于注射到患者中的RPE细胞溶液。这种溶液可以包含在生理上可接受的液体(例如，生理盐水、缓冲盐水、或平衡盐溶液)中配制的细胞。溶液中细胞的数目可以为至少约10²并且低于约10⁹个细胞。在其他实施方式中，溶液中的细胞数可以介于约10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、或10⁸至约5×10²、10³、5×10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、或10⁹，其中上限和下限独立选择，只是下限应总是低于上限。此外，可以单次或多次施用来施用细胞。

通过本文所述的方法提供的细胞可立即使用，或者可以冷冻并冷藏保存数天或数年。因此，在一个实施方式中，本发明提供RPE细胞的冷藏保存制剂，其中所述冷藏保存制剂包含至少约10¹、10²、5×10²、10³、5×10³、10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵或10⁶。冷藏保存制剂还可以包含至少约5×10⁶、10⁷、5×10⁷、10⁸、15×0⁸、10⁹、5×10⁹、或10¹⁰个细胞。类似地，提供了冷藏保存RPE细胞的方法。RPE细胞可以在分化后、体外成熟后立即冷藏保存，或者在培养一段时间后冷藏保存。制剂中的RPE细胞可以包含分化的RPE细胞和成熟RPE细胞的混合物。

其他多潜能细胞

上述讨论关注的是人胚胎干细胞作为起始材料制备独特的RPE细胞的用途，以及使用从人胚胎干细胞分化的RPE细胞的制剂和方法。然而，可以类似地使用上文所详细说明的方法和用途采用其他类型的人多潜能干细胞作为起始材料来制备RPE细胞(和适合的制剂)。因此，本发明包括了任何本发明的上述和下述方面以及实施方式可以类似地应用于由其他类型的人多潜能干细胞分化而来的RPE细胞的方法和用途。特别要注意的是，鉴于诱导性多潜能干(iPS)细胞具有胚胎干细胞的特征，所以这些细胞可用于制备与由胚胎干细胞分化而来的RPE细胞相同或基本上相同的RPE细胞。

如本文所用的术语“多潜能干细胞”包括胚胎干细胞、胚胎来源的干细胞和诱导性多潜能干细胞，而与获得该多潜能干细胞的方法无关。多潜能干细胞功能上定义为如下的干细胞：(a)在移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化成所有三个胚层的细胞类型(例如，可分化为外胚层、中胚层、和内胚层细胞类型)；以及(c)表达胚胎干细胞的一种或多种标记物(例如，表达Oct 4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)。示例性多潜能干细胞可以使用例如本领域内已知的方法产生。示例性多潜能干细胞包括源自胚泡期胚胎的ICM的胚胎干细胞、以及源自卵裂期或桑葚期胚胎的一个或多个卵裂球的胚胎干细胞(任选地不损坏剩余的胚胎)。这种胚胎干细胞可以由通过受精或通过无性方法制备的胚胎材料产生，所述无性方法包括体细胞核移植(SCNT)、孤雌生殖、细胞再编程和单雄生殖。其他示例性多潜能干细胞包括诱导性多潜能干细胞(iPS)细胞，该诱导性多潜能干细胞通过因子(在本文中称为再编程因子)组合的表达或诱导表达使体细胞再编程而产生。iPS细胞可以使用胎儿、出生后、新生儿、少年或成人体细胞制备。在某些实施方式中，可以用于将体细胞再编程为多潜能干细胞的因子包括：例如，Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc、和Klf4的组合。在其他实施方式中，可用于将体细胞再编程为多潜能干细胞的因子包括：例如，Oct 4、Sox2、Nanog、和Lin28的组合。在其他实施方式中，通过表达至少2种再编程因子、至少3种再编程因子、或至少4种再编程因子来再编程体细胞。在其他实施方式中，鉴定了其他再编程因子，并将它们单独或与一种或多种已知的再编程因子组合使用来将体细胞再编程为多潜能干细胞。

胚胎干细胞为多潜能干细胞的一个实例。另一实例为诱导性多潜能干(iPS)细胞。

在某些实施方式中，多潜能干细胞为胚胎干细胞或胚胎来源的细胞。在其他实施方式中，多潜能干细胞为诱导性多潜能干细胞。在某些实施方式中，多潜能干细胞是通过体细胞中一个或多个再编程因子的表达或诱导表达而制备的诱导性多潜能干细胞。在某些实施方式中，体细胞为成纤维细胞，如真皮成纤维细胞、滑膜成纤维细胞、或肺成纤维细胞。在其他实施方式中，体细胞不是成纤维细胞，而是非成纤维性体细胞。在某些实施方式中，通过表达至少2种再编程因子、至少3种再编程因子、或4种再编程因子来再编程体细胞。在其他实施方式中，通过表达至少4种、至少5种、或至少6种再编程因子来再编程体细胞。在某些实施方式中，再编程因子选自Oct 3/4、Sox2、Nanog、Lin28、c-Myc、和Klf4。在其他实施方式中，所表达的再编程因子组包括上述再编程因子列表的至少1种、至少2种、至少3种、或至少4种，并且任选地包括一种或多种其他再编程因子。在某些实施方式中，至少1种、至少2种、至少3种、或至少4种上述或其他再编程因子的表达通过使体细胞与诱导一种或多种再编程因子表达的一种或多种药剂(如有机小分子药剂)接触来诱导。在某些实施方式中，使用组合的方法再编程体细胞，其中使一种或多种再编程因子表达(例如，使用病毒载体、质粒等)并且诱导一种或多种再编程因子表达(例如，使用有机小分子)。

在某些实施方式中，通过使用诸如逆转录病毒载体或慢病毒载体的病毒载体感染使再编程因子在体细胞内表达。在其他实施方式中，使用诸如附加体质粒(episomal plasmid)的非整合型病毒使再编程因子在体细胞内表达。当使用非整合型载体表达再编程因子时，可以使用以载体进行的体细胞的电穿孔、转染、或转化而在细胞中表达这些因子。

在某些实施方式中，多潜能干细胞由体细胞产生，并且所述体细胞选自胚胎、胎儿、新生儿、少年、或成人细胞。

通过再编程因子的表达或诱导表达制备iPS细胞的方法是本领域内已知的。简言之，用表达再编程因子的表达载体感染、转染或以其他方式转导体细胞。在小鼠的情况下，使用整合型病毒载体的四种因子(Oct 3/4、Sox2、c-Myc、和Klf4)的表达足以再编程体细胞。在人的情况下，使用整合型病毒载体的四种因子(Oct3/4、Sox2、Nanog、和Lin28)的表达足以再编程体细胞。然而，更少的因子或其他再编程因子的表达(或表达诱导)也可能是足够的。此外，使用整合型载体仅是在细胞中表达再编程因子的一种机制。可以使用其他方法，包括例如使用非整合型载体。

在某些实施方式中，至少1种、至少2种、至少3种、或至少4种上述或其他再编程因子的表达通过使体细胞与诱导一种或多种再编程因子表达的一种或多种药剂如有机小分子药剂接触来诱导。在某些实施方式中，使用组合的方法再编程体细胞，其中使一种或多种再编程因子表达(例如，使用病毒载体、质粒等)和诱导一种或多种再编程因子表达(例如，使用有机小分子)。

一旦细胞中表达再编程因子之后，便培养细胞。随着时间的过去，具有ES特征的细胞便出现在培养皿中。可以根据例如ES形态或根据可选择或可检测的标记物的表达来挑选细胞并进行传代培养。培养细胞以制备看上去像ES细胞的细胞培养物。这些细胞是推定的iPS细胞。

为了确定iPS细胞的多潜能性，可以在一种或多种多潜能测定中测试细胞。例如，可以测试细胞ES细胞标记物的表达；可以评估细胞在移植入SCID小鼠中时产生畸胎瘤的能力；可以评估细胞分化产生所有三种胚层细胞类型的能力。

一旦获得多潜能iPS细胞之后(新制备的或来自预先获得的细胞的库或储备物)，便可使用这种细胞来制备RPE细胞。

在某些实施方式中，iPS细胞制备是制备RPE细胞的初始步骤。在其他实施方式中，使用预先获得的iPS细胞。在某些实施方式中，使用来自特定患者或匹配供体的材料特异性地制备iPS细胞，目标是产生组织匹配的RPE细胞。在某些实施方式中，iPS细胞为基本上无免疫原性的全适供体细胞。

现在将参考下列实施例更完整地描述本发明，这些实施例仅为示例目的，而不应认为是对上述发明的限制。

实施例

现在对本发明进行一般性地描述，参考下列实施例将更容易理解本发明，包括这些实施例的目的仅为示例本发明的某些方面和实施方式，并非为了限制本发明。

胚胎干细胞的多潜能性部分是通过两种转录因子Oct4(Pou5f1)和Nanog精密的相互平衡来维持的。在ES细胞分化期间，这些基因的表达下调，并且最近的证据表明编码这些蛋白的基因的高度甲基化是其原因所在。这些基因的一种或两种的表达丢失导致了与细胞分化相关的基因的转录活化。

视网膜色素上皮(RPE)由神经外胚层发育而来并且定位邻近神经视网膜和脉络膜，它提供血管系统和视网膜之间的屏障。本文所提供的数据表明在终末分化后，RPE细胞在遗传上和功能上与周围的感光受体不同，尽管这些细胞可能共有共同的祖先。

这个模型表明我们的培养方法权利要求的独特元件通过FGF、EGF、WNT4、TGF-β、和/或氧化胁迫作用于信号MAP激酶和可能的C-Jun末端激酶通路来诱导成对盒6(Paired-box，PAX6)转录因子的表达。PAX6与PAX2协同作用以通过Mit-F和Otx2的协调来转录RPE特异性基因如酪氨酸酶(Tyr)和下游靶标如RPE-65、斑萎蛋白、CRALBP、和 PEDF而使成熟RPE终末分化。

为了表征人胚胎干细胞(hESc)分化为视网膜色素上皮(RPE)过程期间的发育阶段，使用几种测定来鉴定各代表性发育阶段的关键基因表达水平。在RPE细胞中发现了独特地表达为mRNA和蛋白的几种基因。例如，发现PAX6与PAX2一起作用以通过Mit-F和Otx2的协调来转录RPE特异性基因如酪氨酸酶(Tyr)和下游靶标如RPE-65、斑萎蛋白、CRALBP、和PEDF而使成熟RPE细胞终末分化。重要的是，mRNA和蛋白表达的RPE特异性标志不仅仅独特地来自hES细胞，也来自胎儿RPE和ARPE-19细胞。本文所述的RPE细胞表达在hES细胞、胎儿RPE细胞、或ARPE-19细胞中不表达的多种基因(图3、4、和6)。本发明的RPE细胞中独特的mRNA和蛋白的表达构成了使这些RPE细胞与本领域内的细胞如hES细胞、ARPE-19细胞、和胎儿RPE细胞不同的一组标记物。

实施例1：RPE分化和培养

将冷藏保存的hES细胞解冻并置于低粘附的Nunclon Petri培养皿中在补充有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、和B-27补充物的MDBK生长培养基(Sigma-SAFC Biosciences)或OptimPro SFM(Invitrogen)中悬浮培养。hES细胞预先已从卵裂早期的人胚胎活检的单个卵裂球获得。没有损坏剩余的人胚胎。使用源自单个卵裂球的两种hES细胞系-MA01和MA09。将细胞培养7-14天成为胚状体(EB)。

7-14天后，将EB涂布到涂覆有来自猪皮肤的明胶的组织培养板上。在补充有L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、并且不存在B-27补充物的MDBK生长培养基或OpimPro SFM中使EB再生长14-28天成为贴壁培养物。

在EB的贴壁培养物的细胞中，RPE细胞变得可见并通过它们的鹅卵石细胞形态和色素沉积出现而识别。

实施例2：RPE分离和繁殖

随着贴壁培养物中持续出现分化的RPE细胞，分化的RPE集簇变为在细胞形状上是视觉明显的。将冷冻的胶原酶IV(20mg/ml)解冻并稀释至7mg/ml。将胶原酶IV应用于含有RPE集簇的贴壁培养物中(6-孔板的每孔中应用1.0ml)。约1-3小时后，胶原酶IV解离细胞集簇。通过将RPE集簇与培养物中的其他细胞解离，得到了富集的RPE细胞悬浮液。将富集的RPE细胞悬浮液从培养板移出并转移到具有10ml MEF培养基的组织培养皿中，用干细胞切割工具(Swemed-Vitrolife)将色素沉积团块转移到含有3ml MEF培养基的6孔板的孔中。挑选出所有的团块后，将色素细胞的悬浮液转移到含有7ml MEF培养基的15ml锥形管中，并以1000rpm离心5分钟。移去上清。将0.25％胰蛋白酶和细胞解离缓冲液的5ml 1:1混合物添加到细胞中。将细胞在37℃孵育10分钟。通过用5ml移液管吸打分散细胞直至剩下极少量团块。将5ml MEF培养基添加到细胞中并将细胞以1000rpm离心5分钟。移去上清液并将细胞涂布到涂覆有明胶的板上，原始培养物在EGM-2培养基中以1:3分开。

通过在EGM-2培养基中继续培养来扩增RPE细胞培养物。使用0.25％胰蛋白酶EDTA和细胞解离缓冲液的1:1混合物将细胞按需要以1:3至1:6的比率传代。

为了富集成熟分化的RPE细胞，使细胞在EGM-2中生长至接近汇合。然后将培养基换为MDBK-MM(SAFC Biosciences)以有助于进一步促进RPE细胞成熟。

实施例3：通过实时定量反转录PCR(qPCR)测量的RPE特异性的mRNA表达

为了表征人胚胎干细胞(hES)分化为视网膜色素上皮(RPE)过程期间的发育阶段，使用几种测定来鉴定各代表性发育阶段的关键基因表达水平。开发了qPCR以提供在RPE分化过程中所感兴趣的细胞类型特异性mRNA转录物丰度的定量的和相对测量。qPCR用于测定在人胚胎干细胞、眼睛发育期间的神经视网膜细胞、和由人胚胎干细胞分化而来的RPE细胞中独特表达的基因。各细胞类型的基因列于下表1中。

表1 hES、神经视网膜/眼睛、和hRPE细胞的特异性基因

测得hES特异性基因包括Oct-4(POU5F1)、Nanog、Rex-1、TDGF-1、SOX-2和DPPA-2。神经外胚层/神经视网膜特异性基因包括CHX10、NCAM、巢蛋白、和β-微管蛋白。相比之下，通过qPCR测量发现由人胚胎干细胞分化而来的RPE细胞独特地表达PAX-6、PAX-2、RPE-65、PEDF、CRALBP、斑萎蛋白、MitF、Otx-2、和Tyr。

如从qPCR数据明显的，hES特异性基因在源自hES的RPE细胞中显著下调(近1000倍)，而RPE和神经外胚层特异性的基因在源自hES的RPE细胞中则大量上调(约100倍)。

此外，完全成熟RPE的qPCR分析显示了RPE特异性标记物RPE65、酪氨酸酶、PEDF、斑萎蛋白、MitF、和Pax6的高水平表达。这种发现还详细说明了上述的个体发育，并且与关于Pax2诱导的MitF调节和与终末分化的RPE相关的基因的下游激活的当前文献相一致。

实施例4：通过蛋白质印记分析鉴定的RPE特异性蛋白表达

为了验证上述qPCR结果并鉴定RPE细胞中独特表达的蛋白，选择hES特异性和RPE特异性标记物亚组作为蛋白质印记测定的候选物，从而证明PCR检测的信号的翻译。蛋白质分析用半定量(经由光密度测定法)和定性数据提供对其他测定的稳健度的绝对测量。结果照片显示在图6中。使用肌动蛋白作为蛋白上样对照。

源自hES细胞的RPE细胞不表达hES特异性蛋白Oct-4、Nanog、和Rex-1，而它们表达RPE65、CRALBP、PEDF、斑萎蛋白、Pax6、和Otx2。因此，这些蛋白为由hES细胞分化的RPE细胞的主要标记物。相比之下，APRE-19细胞显示了蛋白质组学标记物表达的非决定性模式。

实施例5：RPE细胞的微阵列基因表达谱

体外人工纯化的、hES细胞分化的hRPE在扩增阶段的培养中发生了显著的形态学事件。以薄培养物涂布的单细胞悬浮液去色素，并且在表面区域细胞增加。hRPE细胞在细胞迅速分裂的扩增期间保持这种形态。然而，当细胞密度达到最大容量时，RPE呈现它们的六边形特征表型并且通过积累黑色素和脂褐素增加色素沉积水平。

色素沉积水平在我们的RCS大鼠模型的药理学研究中起着重要作用。因此，我们经由对源自单卵裂球来源的hES细胞系MA01和MA09二者的hRPE细胞的微阵列进行了全基因表达分析。此外，分析了胎儿RPE、ARPE-19、和视网膜母细胞瘤细胞系作为对照。

我们的数据表明这种表型变化是由这些细胞的全基因表达模式改变驱使的，特别是关于PAX6、PAX2、Otx2、MitF、和Tyr的表达。

图7描绘了根据负责各样品变异性的最小基因数目所得的各样品的主要分量分析散点图。分量1，代表69％变异性，表示细胞类型，而分量2代表细胞系(即，遗传变异性)。如可以清楚地看到，基因表达谱的近线性分散表征了源自hES细胞的hRPE的个体发育。

根据比较相应的hES细胞系与其RPE对应物的ANOVA分析，我们选择了100个表达最高和最低的基因，并且进行了计算分析来选择与多潜能和眼睛发育相关的基因。上调基因显示在表2中。下调基因显示在表3中中。

表2 微阵列上报道的所感兴趣的上调基因

表3 微阵列上报道的所感兴趣的下调基因

本发明公开证明了人RPE细胞可以在良好定义并且可再现的条件下由人ES细胞可靠地分化并且扩增-代表了用于视网膜变性疾病患者的细胞的无尽来源。这些细胞的浓度将不受可用性限制，而是可以滴定至个体的精确临床需要。如果医师认为必要的话，该细胞群在患者的寿命内重复输注或移植也是可能的。此外，建立可以从中制备RPE细胞的匹配的或复杂性降低的HLA hES系的库的能力可能降低或消除对一起施用免疫抑制药物和/或免疫调节方案的需要。

本发明公开还证明由本文所述的方法分化的RPE细胞表达hES细胞、胎儿RPE细胞、或ARPE-19细胞所不表达的多种基因。本发明ES细胞来源的RPE细胞的mRNA和蛋白表达的独特分子指纹构成了一组标记物，如RPE-65、斑萎蛋白、PEDF、CRABLP、Otx2、Mit-F、PAX6和PAX2，该组标记物使得这些RPE细胞与诸如hES细胞、ARPE-19细胞、以及胎儿RPE细胞的本领域内的细胞不同。

实施例6：使用来自胚胎干细胞的RPE细胞来恢复视功能

某些视网膜疾病的特征为视网膜色素上皮(RPE)变性，这继而会导致感光受体损失。实例包括人的斯特格黄斑营养不良和皇家外科学院(Royal College of Surgeons,RCS)大鼠中由遗传决定的营养不良。此过程还可能在黄斑变性中起作用，黄斑变性仅在美国就影响了超过1千万的人。

我们研究了源自胚胎干细胞系并且在GMP依从性条件下制备的高度特征化的人RPE细胞能够最佳地恢复RCS大鼠中的视功能的条件。将MAO1和MAO9-来源的RPE细胞注入23天(P23)的RCS大鼠的视网膜下间隙，手术后保持口服环孢菌素A的免疫抑制。通过从上丘记录的视动敏度阈值和亮度阈值来测试功效。将所有处理的眼睛与假注射和未处理的眼睛比较。在这些功能评估后进行组织学检测。

实验结果显示RCS大鼠中清楚的地剂量反应。包含5×10⁴个RPE细胞的制剂的施用仅比假注射轻微改善了视动阈值，而包含2×10⁵个RPE细胞的制剂则产生比对照改善的表现。包含5×10⁵个RPE细胞的制剂产生长时间保持的优异性能。在P60以0.48c/d进行的动物比假注射(0.26c/d)明显改善(p<0.001)，其中一些处理的眼睛显示出正常阈值(0.6c/d)并且在最好的情况下在P90时超过0.5c/d(假注射和未处理动物得到0.16c/d的数字，该水平表明了实质的视力缺损)。

P94时的上丘记录还显示RPE细胞注射的眼睛中亮度阈值反应显著较低，其中一些个体的记录值在正常范围内。组织学研究显示供体细胞以半连续的色素细胞层紧靠内源宿主RPE的内部排列。供体RPE细胞是RPE65和斑萎蛋白阳性的，这表明移植细胞为RPE细胞，并且该细胞在移植后保持着它们的细胞命运。

此外，移植的动物与对照动物相比保持感光受体厚度。RPE处理动物中在恢复区域内感光受体为4-5层细胞厚，相比之下，在假注射和未处理对照中则仅为单层。

结果表明源自胚胎干细胞并且在GMP依从性条件下制备的高度特征化的RPE细胞在移植到RCS大鼠的视网膜下间隙后存活，不迁移到视网膜，并且继续表达RPE的分子特征。更重要的是，它们在光受体变性的动物模型中以剂量依赖形式显著恢复视功能。数据还表明这些细胞可以有效地限制和/或逆转在人疾病中RPE引起的感光受体变性所伴随的视力衰退。

参考文献

Strauss,O.,Stumpff,F.,Mergler,S.,Wienrich,M.&Wiederholt,M.The Royal College of Surgeons rat:an animal model for inherited retinal degeneration with a still unknown genetic defect.Acta anatomica 162,101-111(1998).

McLaren,M.J.,An,W.,Brown,M.E.&Inana,G.Analysis of basic fibroblast growth factor in rats with inherited retinal degeneration.FEBS letters 387,63-70(1996).

McHenry,C.L.,et al.MERTK arginine-844-cysteine in a patient with severe rod-cone dystrophy:loss of mutant protein function in transfected cells.Investigative ophthalmology&visual science 45,1456-1463(2004).

Duncan,J.L.,et al.An RCS-like retinal dystrophy phenotype in mer knockout mice.Investigative ophthalmology&visual science 44,826-838(2003).

Vollrath,D.,et al.Correction of the retinal dystrophy phenotype of the RCS rat by viral gene transfer of Mertk.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98,12584-12589(2001).

Gal,A.,et al.Mutations in MERTK,the human orthologue of the RCS rat retinal dystrophy gene,cause retinitis pigmentosa.Nature genetics 26,270-271(2000).

D'Cruz,P.M.,et al.Mutation of the receptor tyrosine kinase gene Mertk in the retinal dystrophic RCS rat.Human molecular genetics 9,645-651(2000).

Piesse,C,et al.Expression of aminopeptidase B in the developing and adult rat retina.Exp Eye Res 79,639-648(2004).

Craitoiu,S.&Florescu,M.[The development of the pigment epithelium and its interrelation with uveal pigment cells].Oftalmologia 41,12-14(1997).

Mitashov,V.I.[Cell sources,regulatory factors and gene expression in the regeneration of the crystalline lens and retina in vertebrate animals].Izvestiia Akademii nauk,298-318(1996).

Grefenstette,J.,Kim,S.&Kauffman,S.An analysis of the class of gene regulatory functions implied by a biochemical model.Biosystems 84,81-90(2006).

Melnick,M.,Chen,H.,Min Zhou,Y.&Jaskoll,T.The functional genomic response of developing embryonic submandibular glands to NF-kappa B inhibition.BMC developmental biology 1,15(2001).

Palumbo,M.C,Colosimo,A.,Giuliani,A.&Farina,L.Essentiality is an emergent property of metabolic network wiring.FEBS letters 581,2485-2489(2007).

Papin,J.A.,Price,N.D.,Edwards,J.S.&Palsson,B.B.The genome-scale metabolic extreme pathway structure in Haemophilus influenzae shows significant network redundancy.J Theor Biol 215,67-82(2002).

Price,N.D.,Papin,J.A.&Palsson,B.O.Determination of redundancy and systems properties of the metabolic network of Helicobacter pylori using genome-scale extreme pathway analysis.Genome research 12,760-769(2002).

Yun,A.J.,Lee,P.Y.&Doux,J.D.Efficient inefficiency:biochemical"junk"may represent molecular bridesmaids awaiting emergent function as a buffer against environmental fluctuation.Medical hypotheses 67,914-921(2006).

Federici,D.&Downing,K.Evolution and development of a multicellular organism:scalability,resilience,and neutral complexification.Artificial life 12,381-409(2006).

Csermely,P.,Soti,C.&Blatch,G.L.Chaperones as parts of cellular networks.Advances in experimental medicine and biology 594,55-63(2007).

Gillies,R.J.&Gatenby,R.A.Adaptive landscapes and emergent phenotypes:why do cancers have high glycolysis？J Bioenerg Biomembr(2007).

Henshall,D.C.&Murphy,B.M.Modulators of neuronal cell death in epilepsy.Curr Opin Pharmacol(2007).

Mekel-Bobrov,N.,et al.The ongoing adaptive evolution of ASPM and Microcephalin is not explained by increased intelligence.Human molecular genetics 16,600-608(2007).

Moudy,R.M.,Meola,M.A.,Morin,L.L.,Ebel,G.D.&Kramer,L.D.A newly emergent genotype of West Nile virus is transmitted earlier and more efficiently by Culex mosquitoes.The American journal of tropical medicine and hygiene 77,365-370(2007).

Sanchez,J.A.,Aguilar,C.,Dorado,D.&Manrique,N.Phenotypic plasticity and morphological integration in a marine modular inver tebrate.BMC Evol Biol 7,122(2007).

Marc,R.E.,Jones,B.W.,Watt,CB.&Strettoi,E.Neural remodeling in retinal degeneration.Progress in retinal and eye research 22,607-655(2003).

Yeo,S.,et al.Character ization of DNA methylation change in stem cell marker genes during differentiation of human embryonic stem cells.Biochemical and biophysical research communications 359,536-542(2007).

Wang,Z.X.,et al.Zfp206 is a transcription factor that controls pluripotency of embryonic stem cells.Stem cells(Dayton,Ohio)25,2173-2182(2007).

Ulloa-Montoya,F.,et al.Comparative transcriptome analysis of embryonic and adult stem cells with extended and limited differentiation capacity.Genome Biol 8,Rl63(2007).

Sumi,T.,Tsuneyoshi,N.,Nakatsuji,N.&Suemori,H.Apoptosis and differentiation of human embryonic stem cells induced by sustained activation of c-Myc.Oncogene 26,5564-5576(2007).

Lavial,F.,et al.The Oct4 homologue PouV and Nanog regulate pluripotency in chicken embryonic stem cells.Development(Cambridge,England)134,3549-3563(2007).

Greco,S.J.,Liu,K.&Rameshwar,P.Functional Similarities among Genes Regulated by OCT4 in Human Mesenchymal and Embryonic Stem Cells.Stem cells(Dayton,Ohio)(2007).

Babaie,Y.,et al.Analysis of Oct4-dependent transcriptional networks regulating self-renewal and pluripotency in human embryonic stem cells.Stem cells(Dayton,Ohio)25,500-510(2007).

Zhang,X.,et al.Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos.Stem cells(Dayton,Ohio)24,2669-2676(2006).

Xiao,L.,Yuan,X.&Sharkis,S.J.Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor,Wnt,and bone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells.Stem cells(Dayton,Ohio)24,1476-1486(2006).

Player,A.,et al.Comparisons between transcriptional regulation and RNA expression in human embryonic stem cell lines.Stem cells and development 15,315-323(2006).

Pereira,L.,Yi,F.&Merrill,B.J.Repression of Nanog gene transcription by Tcf3 limits embryonic stem cell self-renewal.Mol Cell Biol 26,7479-7491(2006).

O'Neill,L.P.,VerMilyea,M.D.&Turner,B.M.Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations.Nature genetics 38,835-841(2006).

Lagarkova,M.A.,Volchkov,P.Y.,Lyakisheva,A.V.,Philonenko,E.S.&Kiselev,S.L.Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines.Cell cycle(Georgetown,Tex 5,416-420(2006).

He,S.,et al.Developmental expression of pluripotency determining factors in caprine embryos:novel pattern of NANOG protein localization in the nucleolus.Molecular reproduction and development 73,1512-1522(2006).

De Jong,J.,Weeda,S.,Gillis,A.J.,Oosterhuis,J.W.&Looijenga,L.H.Differential methylation of the OCT3/4 upstream region in primary human testicular germ cell tumors.Oncol Rep18,127-132(2007).

Hattori,N.,et al.Epigenetic regulation of Nanog gene in embryonic stem and trophoblast stem cells.Genes Cells 12,387-396(2007).

Hellman,A.&Chess,A.Gene body-specific methylation on the active X chromosome.Science(New York,N.Y 315,1141-1143(2007).

Ohm,J.E.,et al.A stem cell-like chromatin pattern may predispose tumor suppressor genes to DNA hypermethylation and heritable silencing.Nature genetics 39,237-242(2007).

Mitalipov,S.,Clepper,L.,Sritanaudomchai,H.,Fujimoto,A.&Wolf,D.Methylation status of imprinting centers for H19/IGF2 and SNURF/SNRPN in primate embryonic stem cells.Stem cells(Dayton,Ohio)25,581-588(2007).

Mitalipov,S.M.Genomic imprinting in primate embryos and embryonic stem cells.Reproduction,fertility,and development18,817-821(2006).

Greber,B.,Lehrach,H.&Adjaye,J.Silencing of core transcription factors in human EC cells highlights the importance of autocrine FGF signaling for self-renewal.BMC developmental biology 7,46(2007).

McEwen,B.S.Mood disorders and allostatic load.Biological psychiatry 54,200-207(2003).

Koob,G.F.Alcoholism:allostasis and beyond.Alcoholism,clinical and experimental research 27,232-243(2003).

Goldstein,D.S.&McEwen,B.Allostasis,homeostats,and the nature of stress.Stress(Amsterdam,Netherlands)5,55-58(2002).

Wei,Q.,et al.Overexpressing the glucocorticoid receptor in forebrain causes an aging-like neuroendocrine phenotype and mild cognitive dysfunction.J Neurosci 27,8836-8844(2007).

McEwen,B.S.Physiology and neurobiology of stress and adaptation:central role of the brain.Physiological reviews87,873-904(2007).

Kim,Y.,Laposky,A.D.,Bergmann,B.M.&Turek,F.W.Repeated sleep restriction in rats leads to homeostatic and allostatic responses during recovery sleep.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America104,10697-10702(2007).

Pinilla,I.,Lund,R.D.&Sauve,Y.Cone function studied with flicker electroretinogram during progressive retinal degeneration in RCS rats.Exp Eye Res 80,51-59(2005).

Crafoord,S.,Geng,L.,Seregard,S.&Algvere,P.V.Experimental transplantation of autologous iris pigment epithelial cells to the subretinal space.Acta ophthalmologica Scandinavica 79,509-514(2001).

Chuang,E.L.&Bird,A.C.Repair after tears of the retinal pigment epithelium.Eye(London,England)2(Pt 1),106-113(1988).

Ricci,F.,et al.Modulation of Ku70/80,clusterin/ApoJ isoforms and Bax expression in indocyanine-green-mediated photo-oxidative cell damage.Ophthalmic research 39,164-173 (2007).

Gregerson,D.S.,Lew,K.L.,McPherson,S.W.,Heuss,N.D.&Ferrington,D.A.RPE cells resist bystander killing by CTLs,but are highly susceptible to antigen-dependent CTL killing.Investigative ophthalmology&visual science 47,5385-5394(2006).

Kim,S.J.,et al.Differential expression of vitreous proteins in proliferative diabetic retinopathy.Current eye research 31,231-240(2006).

Linberg,K.A.,Fariss,R.N.,Heckenlively,J.R.,Farber,D.B.&Fisher,S.K.Morphological characterization of the retinal degeneration in three strains of mice carrying the rd-3mutation.Visual neuroscience 22,721-734(2005).

Qin,Y.,et al.Long-range activation of Sox9 in Odd Sex(Ods)mice.Human molecular genetics 13,1213-1218(2004).

Nishiwaki,A.,Ueda,T.,Ugawa,S.,Shimada,S.&Ogura,Y.Upregulation of P-selectin and intercellular adhesion molecule-1 after retinal ischemia-reperfusion injury.Investigative ophthalmology&visual science 44,4931-4935(2003).

Ida,H.,Boylan,S.A.,Weigel,A.L.&Hjelmeland,L.M.Age-related changes in the transcriptional profile of mouse RPE/choroid.Physiological genomics 15,258-262(2003).

Weigel,A.L.,Ida,H.,Boylan,S.A.&Hjelmeland,L.M.Acute hyperoxia-induced transcriptional response in the mouse RPE/choroid.Free radical biology&medicine 35,465-474(2003).

Sauka-Spengler,T.,Baratte,B.,Shi,L.&Mazan,S.Structure and expression of an Otx5-related gene in the dogfish Scyliorhinus canicula:evidence for a conserved role of Otx5and Crxgenes in the specification of photoreceptors.Development genes and evolution 211,533-544(2001).

Lovicu,F.J.,Kolle,G.,Yamada,T.,Little,M.H.&McAvoy,J.W.Expression of Crim 1 during murine ocular development.Mechanisms of development 94,261-265(2000).

Otani,A.,et al.Expressions of angiopoietins and Tie2 in human choroidal neovascular membranes.Investigative ophthalmology&visual science 40,1912-1920(1999).

Faure,V.,Courtois,Y.&Goureau,O.Differential regulation of nitric oxide synthase-II mRNA by growth factors in rat,bovine,and human retinal pigmented epithelial cells.Ocular immunology and inflammation 7,27-34(1999).

Mousa,S.A.,Lorelli,W.&Campochiaro,P.A.Role of hypoxia and extracellular matrix-integrin binding in the modulation of angiogenic growth factors secretion by retinal pigmented epithelial cells.Journal of cellular biochemistry 74,135-143 (1999).

Collinge,J.E.,Simirskii,V.N.&Duncan,M.K.Expression of tissue plasminogen activator during eye development.Exp Eye Res 81,90-96(2005).

Fisher,S.K.,Lewis,G.P.,Linberg,K.A.&Verardo,M.R.Cellular remodeling in mammalian retina:results from studies of experimental retinal detachment.Progress in retinal and eye research 24,395-431(2005).

Francis,M.K.,et al.Loss of EPC-1/PEDF expression during skin aging in vivo.The Journal of investigative dermatology122,1096-1105(2004).

Marc,R.E.&Jones,B.W.Retinal remodeling in inherited photoreceptor degenerations.Molecular neurobiology 28,139-147(2003).

Jones,B.W.,et al.Retinal remodeling triggered by photoreceptor degenerations.The Journal of comparative neurology 464,1-16(2003).

MacLaren,R.E.,et al.Autologous transplantation of the retinal pigment epithelium and choroid in the treatment of neovascular age-related macular degeneration.Ophthalmology114,561-570(2007).

Rezai,K.A.,Farrokh-Siar,L.,Godowski,K.,Patel,S.C. &Ernest,J.T.A model for xenogenic immune response.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238,352-358(2000).

Sauve,Y.,Klassen,H.,Whiteley,S.J.&Lund,R.D.Visual field loss in RCS rats and the effect of RPE cell transplantation.Experimental neurology 152,243-250(1998).

Oganesian,A.,et al.Scanning and transmission electron microscopic findings during RPE wound healing in vivo.International ophthalmology 21,165-175(1997).

Kohen,L.,Enzmann,V.,Faude,F.&Wiedemann,P.Mechanisms of graft rejection in the transplantation of retinal pigment epithelial cells.Ophthalmic research 29,298-304(1997).

Tamai,M.[Retinal pigment epithelial cell transplantation:perspective].Nippon Ganka Gakkai zasshi 100,982-1006(1996).

Gregerson,D.S.,Heuss,N.D.,Lew,K.L.,McPherson,S.W.&Ferrington,D.A.Interaction of retinal pigmented epithelial cells and CD4 T cells leads to T-cell anergy.Investigative ophthalmology&visual science 48,4654-4663(2007).

Sarks,S.,Cherepanoff,S.,Killingsworth,M.&Sarks,J.Relationship of Basal laminar deposit and membranous debris to the clinical presentation of early age-related macular degeneration.Investigative ophthalmology&visual science 48,968-977(2007).

Aisenbrey,S.,et al.Retinal pigment epithelial cells synthesize laminins,including laminin 5,and adhere to them through alpha3-and alpha6-containing integrins.Investigative ophthalmology&visual science 47,5537-5544(2006).

Espinosa-Heidmann,D.G.,et al.Cigarette smoke-related oxidants and the development of sub-RPE deposits in an experimental animal model of dry AMD.Investigative ophthalmology&visual science 47,729-737(2006).

Uno,K.,Bhutto,I.A.,McLeod,D.S.,Merges,C.&Lutty,G.A.Impaired expression of thrombospondin-1 in eyes with age related macular degeneration.Br J Ophthalmol 90,48-54(2006).

Wang,Z.,Paik,D.C,Del Priore,L.V.,Burch,R.L.&Gaillard,E.R.Nitrite-modified extracellular matrix proteins deleteriously affect retinal pigment epithelial cell function and viability:a comparison study with nonenzymatic glycation mechanisms.Current eye research 30,691-702(2005).

Gullapalli,V.K.,Sugino,I.K.,Van Patten,Y.,Shah,S.&Zarbin,M.A.Retinal pigment epithelium resurfacing of aged submacular human Bruch's membrane.Transactions of the American Ophthalmological Society 102,123-137；discussion 137-128(2004).

Gullapalli,V.K.,Sugino,I.K.,Van Patten,Y.,Shah,S.&Zarbin,M.A.Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.Exp Eye Res 80,235-248(2005).

Itaya,H.,Gullapalli,V.,Sugino,I.K.,Tamai,M.&Zarbin,M.A.Iris pigment epithelium attachment to aged submacular human Bruch's membrane.Investigative ophthalmology&visual science 45,4520-4528(2004).

Tezel,T.H.,Del Priore,L.V.&Kaplan,HJ.Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.Investigative ophthalmology&visual science 45,3337-3348(2004).

Roth,F.,Bindewald,A.&HoIz,F.G.Key pathophysiologic pathways in age-related macular disease.Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 242,710-716(2004).

Zarbin,M.A.Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration.Archives of ophthalmology122,598-614(2004).

Tian,J.,Ishibashi,K.&Handa,J.T.The expression of native and cultured RPE grown on different matrices.Physiological genomics 17,170-182(2004).

Koenekoop,R.K.Choroideremia is Caused by a Defective Phagocytosis by the RPE of Photoreceptor Disc Membranes,not by an Intrinsic Photoreceptor Defect.Ophthalmic genetics 28,185-186(2007).

Chang,Y.&Finnemann,S.C.Tetraspanin CD81 is required for the{alpha}vbeta5-integrin-dependent particle-binding step of RPE phagocytosis.Journal of cell science 120,3053-3063(2007).

Mukherjee,P.K.,et al.Photoreceptor outer segment phagocytosis attenuates oxidative stress-induced apoptosis with concomitant neuroprotectin D l synthesis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America104,13158-13163(2007).

Schutt,F.,Volcker,H.E.&Dithmar,S.[N-acetylcysteine improves lysosomal function and enhances the degradation of photoreceptor outer segments in cultured RPE cells].Klinische Monatsblatter fur Augenheilkunde 224,580-584(2007).

Martinez-Navarrete,G.C,Martin-Nieto,J.,Esteve-Rudd,J.,Angulo,A.&Cuenca,N.Alpha synuclein gene expression profile in the retina of vertebrates.Molecular vision 13,949-961(2007).

Nandrot,E.F.,et al.Essential role for MFG-E8 as ligand for alphavbeta5 integrin in diurnal retinal phagocytosis.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104,12005-12010(2007).

Warburton,S.,et al.Proteomic and phototoxic characterization of melanolipofuscin:correlation to disease and model for its origin.Molecular vision 13,318-329(2007).

Kolko,M.,et al.Identification of intracellular phospholipases A2 in the human eye:involvement in phagocytosis of photoreceptor outer segments.Investigative ophthalmology&visual science 48,1401-1409(2007).

Kaemmerer,E.,Schutt,F.,Krohne,T.U.,Holz,F.G.&Kopitz,J.Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis.Investigative ophthalmology&visual science 48,1342-1347(2007).

Lee,C.J.,Fishman,H.A.&Bent,S.F.Spatial cues for the enhancement of retinal pigment epithelial cell function in potential transplants.Biomaterials 28,2192-2201(2007).

Finnemann,S.C.&Nandrot,E.F.MerTK activation during RPE phagocytosis in vivo requires alphaVbeta5 integrin.Advances in experimental medicine and biology 572,499-503(2006).

Takahashi et al.(2007)Nat Protoc.2(12):3081-9.

Maherali et al.(2007)Cell Stem Cell 1:55-70.

Hanna et al.(2007)Science,6 December 2007,10.1126/science.l 152092(see also www.sciencexpress.org).

Meissner et al.(2007)Nature Biotechnology 25:1177-1181.

Mikkelsen et al.(2007)Nature,Vol 448,2 August 2007,doi:10.1038/nature06008.

Wernig et al.(2007)Nature,Vol 448,19 July 2007,doi:10.1038/nature05944.

Yu et al.(2007)Science,20 November 2007,10.1126/science.l 151526(see also www.sciencexpress.org).

Vogel and Holden(2007)Science 318:1224-1225.

Takahashi et al.(2007)Cell 131:861-872.

Li et al.(2005)Reproduction Research 130:53-59.

所有的出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文，如同具体并单独地指出各单独的出版物、专利或专利申请的全文通过引用整体并入一样。

等同形式

本领域技术人员应了解或能够使用常规实验确定本文所述的发明的具体实施方式的许多等同形式。下列权利要求意欲包含这些等同形式。

Claims

1.一种从人多潜能细胞制备视网膜色素上皮(RPE)细胞的方法，所述方法包括：

a)在含有少于5％的动物源蛋白的培养基中将人多潜能细胞培养7-14天以在悬浮培养物中形成胚状体；

b)在含有少于5％的动物源蛋白的培养基中将所述胚状体培养为贴壁培养物，由此在14-28天的贴壁培养物内出现了RPE细胞；

c)从步骤(b)的培养物中选择RPE细胞；

d)在含有选自EGF、bFGF、VEGF和重组胰岛素样生长因子中的一种或多种因子的培养基中培养在步骤(c)中选择的RPE细胞；以及

e)培养步骤(d)的RPE细胞以促进其成熟，由此制备包含RPE细胞的培养物。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括培养步骤(e)的所述RPE细胞以制备成熟RPE细胞的培养物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤(a)的培养基含有无血清B-27补充物并且步骤(b)的培养基不含有无血清B-27补充物；

4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中的所述培养基还含有下列因子的一种或多种：肝素、氢化可的松和抗坏血酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将(b)中的所述胚状体培养28天或更久。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括使步骤(b)的培养物与导致RPE细胞从所述贴壁培养物分离的酶接触以及选择分离的色素细胞或分离的包含色素细胞的细胞集簇。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述酶选自胶原酶IV和分散酶。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述人多潜能干细胞选自诱导性多潜能干(iPS)细胞和胚胎干细胞。

9.如权利要求7所述的方法，其中步骤(c)还包括使所选择的包含色素细胞的细胞集簇解离，从而形成含有RPE细胞的单细胞悬浮液。

10.一种包含人RPE细胞的组合物，所述人PRE细胞源自根据如权利要求1-9中任一项所述的方法的人多潜能细胞，其中所述组合物中的RPE细胞表达选自下列标记物的一种或多种：RPE-65、斑萎蛋白、PEDF、CRALBP、Otx2、Mit-F、Pax-2、Pax-6和酪氨酸酶，并且其中所述RPE细胞缺乏选自Oct-4、nanog和Rex-1的一种或多种ES细胞基因的实质表达，其中所述RPE细胞具有不同水平的色素沉积，并且其中所述组合物含有少于1％的非RPE细胞。