JP2009530616A - 有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物 - Google Patents

Abstract

有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物およびその作製方法を開示する。リファレンスコントロール組成物は、固定非有核血球から作製された有核赤血球成分および懸濁培地を含む。非有核血球の天然の細胞サイズは、前記血液サンプルの有核赤血球の核サイズと実質的に類似する。有核赤血球成分は、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、またはブタの赤血球から作製することができ、実質的に核酸を含まない。リファレンスコントロール組成物は、さらに、白血球成分、赤血球成分、血小板成分、網状赤血球成分、またはその組み合わせを含むことができる。血液分析器での有核赤血球の測定のためのリファレンスコントロール組成物の使用方法をさらに開示する。

Description

（発明の分野）
本発明は、有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物ならびに血液分析器で血液サンプルの有核赤血球を決定するためのリファレンスコントロール組成物の作製方法および使用方法に関する。

（発明の背景）
品質管理は、長きにわたり臨床血液学における必要且つ日常的な手順である。種々の血球型の計数の精度は、適切なコントロール生成物の使用およびコントロール生成物の使用方法に一部依存する。装置故障の可能性が絶えず存在するので、現在利用可能な粒子計数のための多数の型の装置と共にコントロール生成物の使用による品質管理が必要である。自動粒子計数装置の品質管理プログラムの伝統的な維持方法は、全血標準として新鮮なヒト血液を提供することからなる。しかし、この新鮮な血液は１日しか使用できず、したがって、より長い製品寿命を有する種々のコントロール生成物が開発されてきた。

コントロール生成物で一般に使用されている粒子は、分析されることが意図される粒子または細胞の型を模倣するか近づけている。その結果として、これらの粒子は、しばしば、アナログ粒子と呼ばれている。アナログ粒子を、装置内で分析されるべき粒子または細胞の特徴に類似する一定の特徴を有するように選択またはデザインすべきである。特徴およびパラメーターの例には、サイズ、体積、表面の特徴、粒状性、光散乱特性、および蛍光特性の類似が含まれる。

種々の市販のリファレンスコントロール生成物が現在利用可能であり、これらは、ヒト血球のアナログとして種々の処理または固定したヒトまたは動物血球を使用している。特許文献１（Ｙｏｕｎｇら）は、処理または固定した動物有核赤血球から作製されたいくつかの白血球アナログを含む血液学コントロールを教示している。市販の血液学コントロールは、赤血球、血小板、網状赤血球成分、および有核赤血球成分も含むことができ、その多くが細胞アナログから作製されている。

有核赤血球（ＮＲＢＣ）または赤芽球は、免疫赤血球である。これらは、通常、骨髄中に存在するが、末梢血中に存在しない。しかし、貧血および白血病などの一定の疾患では、有核赤血球は、末梢血中にも存在する。したがって、ＮＲＢＣの測定は臨床的に重要である。近年、血液学装置による血液サンプル中の有核赤血球の測定のためのいくつかの検出方法が報告されている。特許文献２（Ｋｉｍら．）は、有核赤血球および白血球のフローサイトメトリー分析方法を開示している。本方法は、白血球サンプルとＮＲＢＣとを区別するために、蛍光、低角度光散乱、および軸方向の光の損失（ａｘｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）の測定を使用する。特許文献３（Ｋｉｍら）は、ＮＲＢＣ、白血球、および損傷白血球を区別し、フローサイトメトリーによって血液サンプル中の白血球を区別する方法をさらに開示している。

特許文献４および特許文献５（Ｌｉら）は、血液サンプル光散乱シグナルの２つのシグナルの測定によって有核赤血球を区別する方法を開示し、光散乱およびＤＣインピーダンスシグナルの測定によって有核赤血球を区別する方法をさらに開示している。特許文献６および特許文献７（Ｌｉら）は、ＤＣインピーダンス測定の使用によるＮＲＢＣの決定方法を開示している。特許文献８（Ｈｕｏら）は、三次元ＤＣ、ＲＦ、および光散乱の測定と組み合わせたインピーダンス測定による有核赤血球を区別する方法を開示している。

有核赤血球の検出方法が開発されており、有核赤血球成分またはＮＲＢＣアナログを含むいくつかの血液学コントロールが報告されている。

特許文献９および特許文献１０（Ｋｉｍら）は、溶解および固定した鳥類または魚類赤血球または溶解および固定したヒトリンパ球から作製された有核赤血球（ＮＲＢＣ）アナログを含む血液学コントロールを開示している。特許文献９および特許文献１０は、さらに、鳥類または魚類赤血球の溶解試薬での１〜５分間の溶解およびその後の残存する核の固定剤での６０〜７０℃で１０分間の固定によってＮＲＢＣアナログを調製する方法を開示している。

特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５（Ｒｙａｎ，ｅｔ ａｌ）は、有核トリ血球由来のＮＲＢＣアナログを含む血液学コントロールを開示している。本方法は、トリ赤血球（シチメンチョウまたはニワトリの赤血球など）を緩衝液中で洗浄する工程および洗浄した細胞をリン酸グルタルアルデヒド溶液で固定する工程を含む。特許文献１６（Ｗａｎｇら）は、市販の固定有核ニワトリ赤血球である有核赤血球（ＮＲＢＣ）アナログを含む血液学コントロールを開示している。

特許文献１７および特許文献１８（Ｒｙａｎ）は、核を含む血球の安定化または溶解し、有核血球から細胞質を除去するが、核に関する膜の一般的構造を保存し、処理した有核血球を固定することによる血液学コントロールのための有核赤血球成分の作製方法を開示している。

全ての上記引例は、血液サンプル中の有核赤血球の測定用のリファレンスコントロールのための有核赤血球成分を作製するための有核血球の使用を教示している。

特許文献１９（Ｊａｃｏｂｓら）は、有核赤血球成分を含む血液学コントロールおよびその作製方法を開示している。コントロールは、有核赤血球を模倣するための粒子表面に付着した核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を有する粒子（非固定ウマ、ヒツジ、またはウシ細胞など）を含む。本方法は、非固定赤血球表面へのＲＮＡの共有結合性架橋を教示する。この場合、赤血球は有核細胞であっても非有核細胞であってもよい。ＲＮＡコーティングした非有核赤血球を、蛍光測定を使用した有核赤血球の測定のために使用することができる。Ｊａｃｏｂｓら．は、ＲＮＡコーティングウマ赤血球から作製したＮＲＢＣアナログをインピーダンスおよび光散乱の測定によって測定することができることをさらに開示している。

さらに、一定の非有核赤血球（ヒト、シチメンチョウ、およびサメの赤血球など）は、血液学リファレンスコントロール（特許文献２０に記載のリファレンスコントロールなど）のための白血球小集団のアナログの作製のために使用されている。
米国特許第５，５１２，４８５号明細書 米国特許第５，５５９，０３７号明細書 米国特許第５，８７９，９００号明細書 米国特許第５，８７４，３１０号明細書 米国特許第５，９１７，５８４号明細書 米国特許第６，４１０，３３０号明細書 米国特許第６，６７３，６１８号明細書 米国特許第６，４７２，２１５号明細書 米国特許第６，１８７，５９０号明細書 米国特許第５，８５８，７９０号明細書 米国特許第６，４０６，９１５号明細書 米国特許第６，４０３，３７７号明細書 米国特許第６，３９９，３８８号明細書 米国特許第６，２２１，６６８号明細書 米国特許第６，２００，５００号明細書 米国特許第６，４４８，０８５号明細書 米国特許第６，６５３，１３７号明細書 米国特許第６，７２３，５６３号明細書 米国特許出願公開第２００５／０１３６４０９号明細書 米国特許第４，７０４，３６４号明細書

特に容易に利用可能な非有核血球を使用したＮＲＢＣアナログの作製のために広範な血球供給源を使用することができることが望ましい。

（要旨）
１つの態様では、本発明は、血液サンプルの有核赤血球を模倣するための固定非有核血球から作製した有核赤血球成分、および有核赤血球の測定のための血液分析器への成分の送達に適切な懸濁培地を含む、有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物に関する。非有核血球の天然の細胞サイズは、測定すべき血液サンプルの有核赤血球の核サイズと実質的に類似する。本発明の目的に適切な非有核血球には、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタの赤血球またはその組み合わせが含まれる。さらに、有核赤血球成分は、実質的に核酸を含まない。

さらに、リファレンスコントロール組成物は、白血球成分、赤血球成分、血小板成分、網状赤血球成分をさらに含むことができる。

さらなる態様では、本発明は、有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を作製する方法に関する。本方法は、測定すべき有核赤血球の核のサイズと実質的に類似する天然の細胞サイズを有する非有核血球を提供する工程、非有核血球を固定培地で固定する工程、および固定非有核血球を懸濁培地に懸濁して、リファレンスコントロール組成物を形成する工程を含む。本方法は、固定前に非有核血球を、非有核血球を球形化する（ｓｐｈｅｒｅ）ための球形化試薬（ｓｐｈｅｒｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）と接触させる工程をさらに含むことができる。

別の態様では、本発明は、有核赤血球成分の測定のためのリファレンスコントロール組成物の使用方法に関する。本方法は、測定すべき血液サンプルの有核赤血球を模倣するための固定非有核血球から作製した有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を提供する工程、血液サンプルの有核赤血球の測定に適合した血液分析器を提供する工程、リファレンスコントロール組成物を血液分析器で分析し、有核赤血球成分を測定する工程、およびリファレンスコントロール組成物中の有核赤血球成分を報告する工程を含む。ここに、有核赤血球成分の測定を、ＤＣインピーダンスシグナルの測定、光散乱シグナルの２つの角度の測定、ＤＣインピーダンスシグナルおよび光散乱シグナルの測定、軸方向の光の損失（ａｘｉａ ｌｌｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）およびＤＣインピーダンスシグナルの測定、または軸方向の光の損失および光散乱シグナルの測定によって行う。光散乱シグナルの２つの角度が、１０°未満で検出される両方の低角度光散乱シグナル、または１つの低角度光散乱シグナルおよび１つの中角度（ｍｅｄｉｕｍ ａｎｇｌｅ）光散乱シグナルまたは直角光散乱シグナルであり得る。さらに、有核赤血球成分の測定を、血液サンプルの第１のアリコートの第１のＤＣインピーダンスシグナルの測定、ならびに血液サンプルの第２のアリコートの第２のＤＣインピーダンスシグナル、高周波インピーダンスシグナル、および光散乱シグナルの測定によって行う。

（発明の詳細な説明）
１つの態様では、本発明は、有核赤血球（ＮＲＢＣ）成分を含むリファレンスコントロール組成物ならびに有核赤血球成分およびリファレンスコントロール組成物の調製方法を提供する。

より具体的には、１つの実施形態では、リファレンスコントロール組成物は、血液サンプルの有核赤血球を模倣するための固定非有核血球から作製した有核赤血球成分、および該有核赤血球の測定のための血液分析器への成分の送達に適切な懸濁培地を含む。本発明の目的のために、有核赤血球成分および他の細胞型成分を、アナログ（例えば、ＮＲＢＣアナログ）ともいう。

適切な非有核血球の天然の細胞サイズは、模倣すべき有核赤血球の核のサイズと実質的に類似する天然の細胞サイズを有するべきである。以後に記載の方法による処理の際、非有核血球のサイズを、有核赤血球を模倣するためにさらに調整することができる。有核赤血球の模倣に適切な非有核血球には、種々の動物非有核赤血球が含まれ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタの赤血球またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

血液サンプルの有核赤血球は、通常、溶解条件下で血液分析器により、白血球と共に測定される。血液サンプルを、豊富な成熟赤血球を溶解するための溶解試薬と混合する。溶解条件下で、成熟赤血球が完全に溶解する一方で、有核赤血球の細胞膜は損傷し、細胞質が実質的に放出される。主に核であり、場合によっては、使用した溶解試薬に依に応じて損傷した細胞膜である有核赤血球の残存部分を、種々の公知の検出方法によって測定する。全段階で、有核赤血球のサイズは、本質的に各のサイズである。

非有核血球の天然の細胞サイズを、血液分析器による等張血液希釈物への細胞の懸濁および直流（ＤＣ）インピーダンス測定または低角度光散乱測定による細胞の測定よって決定することができる。本明細書中で使用される場合、用語「天然の細胞サイズ」は、採血中の抗凝固剤との接触および測定中の等張希釈剤との接触を除き、ｉｎ ｖｉｔｒｏで処理されない実質的に天然状態の細胞サイズをいう。

非有核血球から作製された有核赤血球成分を、以下の過程によって生成することができる：
（１）模倣すべき有核赤血球の核のサイズと実質的に類似する天然の細胞サイズを有する非有核赤血球を含む一定量の全血を採取すること、
（２）遠心分離によって他の細胞成分（白血球、血小板、および血漿芽含まれる）から非有核赤血球を分離すること、
（３）押し固めた細胞を洗浄液で洗浄すること、
（４）非有核血球を固定培地で固定すること、
（５）固定非有核血球を洗浄液で洗浄すること、および
（６）固定非有核血球を適切な懸濁培地中に懸濁して、血液分析器での分析のためのリファレンスコントロール組成物を形成すること。

１つの適切な洗浄液は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。当業者に公知の他の洗浄液も使用することができる。さらに、固定前に非有核血球を球形化するために球形化剤（ｓｐｈｅｒｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を洗浄液に添加することができる。あるいは、洗浄した血球を、固定前に個別の球形化試薬で処理することができる。球形化剤の適切な例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：陰イオン性界面活性剤（アンモニウムペルフルオロアルキルカルボキシラート（Ｆｌｕｏｒａｄ（商標）ＦＣ−１４３として市販されている、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）、ラウロイルミリストイル乳酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｌａｕｒｏｙｌ ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）（Ｐａｔｉｏｎｉｃ（商標）１３８Ｃとして市販されている、Ｒ．Ｉ．Ｔ．Ａ Ｃｏｒｐ，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＩＩＩ．）が含まれる）；非イオン性界面活性剤（ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コルアミド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロック共重合体、Ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ダコニル−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシド，ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ステアリン酸のポリエチレングリコールエステル、エトキシル化ココモノグリセリド，オクチフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、エトキシル化オクチルフェノール、および直鎖アルコールが含まれる）、または陽イオン性界面活性剤のうちで、ココヒドロキシエチルイミダゾリン、ラウリルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、または両性イオン界面活性剤のうちで、ラウラミドプロピルベタイン、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート、ココアミドプロピルベタイン、ココアミドスルホベタイン、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート、およびＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート。

固定培地は、固定培地の適切な浸透圧を得るための固定剤および浸透圧調整剤を含む。固定培地の浸透圧を、使用した特定の非有核血球および必要なアナログの特性に基づいて決定する。浸透圧調整剤の適切な例には、アルカリ金属リン酸塩、アルカリ土類金属塩化物、およびアルカリ金属硫酸塩が含まれるが、これらに限定されない。固定剤には、アルデヒド、オキサゾリジン、アルコール、環状尿素、またはその組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。適切な例には、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアゾリジニル尿素（ＤＵ）、イミダゾリジニル尿素（ＩＤＵ）、ジメチロール尿素、ジメチロール−５，５−ジメチルヒダントイン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、５−ヒドロキシメチル−１−アザ−３，７−ジオキサビシクロ（３．３．０）オクタン、５−ヒドロキシポリメチレンオキシ−メチル−１−アザ−３，７−ジオキサビシクロ（３．３．０）オクタン、ヒドロキシメチルグリシン酸ナトリウム、およびその混合物が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、またはその組み合わせなどのアルデヒド固定剤を使用する。固定培地中のアルデヒド固定剤の濃度は、約０．１％〜約２．０％の範囲であり得る。

非有核赤血球の天然の細胞サイズが模倣すべき有核赤血球の核のサイズより大きい場合、固定培地は、固定過程中に細胞サイズを縮小し、模倣すべき有核赤血球の核のサイズに酷似するＮＲＢＣアナログが得られるように、等張な天然の細胞環境よりも高い浸透圧を有する。対照的に、非有核赤血球の天然の細胞サイズが模倣すべき有核赤血球の核のサイズより小さい場合、固定培地は、固定過程中に細胞サイズを増大させ、模倣すべき有核赤血球の核のサイズに酷似するＮＲＢＣアナログが得られるように、等張な天然の細胞環境よりも低い浸透圧を有する。

固定過程は、約４時間〜約２４時間であり得る。典型的には、非有核赤血球を、固定培地中で穏やかに混合しながら約１０〜約１６時間インキュベーションする。

懸濁培地の１つの適切な例には、リン酸緩衝化生理食塩水および血漿物質の水溶液が含まれる。本明細書中に定義するように、血漿物質の水溶液は、血清物質、血漿タンパク質と組み合わせた血清物質、およびその混合物の水溶液を含む。本明細書中でさらに定義するように、血漿タンパク質は、血漿中に含まれる１つまたは複数のタンパク質を含む。好ましくは、かかる血漿タンパク質には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン、フィブリノゲン、およびその混合物が含まれる。これらの培地は、長期安定性を付与するための当業者に公知の他の成分を含むことができる。実施例１は、懸濁培地の２つの例示的処方物を提供する。適切な培地の他の例は、米国特許第４，２１３，８７６号、同第４，２９９，７２６号、同第４，３５８，３９４号、同第３，８７３，４６７号、同第４，７０４，３６４号、同第５，３２０，９６４号、同第５，５１２，４８５号、および同第６，５６９，６８２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）により完全に記載されている。

実施例１は、ウマ赤血球を使用したＮＲＢＣアナログの例示的調製過程を示す。実施例２は、ヒツジ赤血球を使用したＮＲＢＣアナログの例示的調製過程を示す。本明細書中に記載の過程を使用して生成されたＮＲＢＣアナログは、懸濁培地中で６ヶ月を超えて安定である。

記載の過程を使用した非有核動物赤血球の固定によって生成されたＮＲＢＣアナログが、自動化血液分析器での白血球および有核赤血球の測定のための血液サンプル混合物の調製のために使用される溶解試薬に耐性を示すことが見出された。ＮＲＢＣアナログは、溶解条件下で、そのサイズまたは体積を実質的に維持する。サンプル混合物中で測定する場合、ＮＲＢＣアナログは、溶解条件下で血液サンプルの有核赤血球と類似しており、実質的にその核体積が類似する。したがって、ＮＲＢＣアナログが非有核血球から作製されるにもかかわらず、ＮＲＢＣアナログが、測定条件下で、血液サンプルの有核赤血球と類似の一定の性質を保有すると理解することができる。当該分野で公知のＮＲＢＣアナログと異なり、本発明のＮＲＢＣアナログは、実質的に核酸を含まない。１つの態様では、本発明の非有核血球から作製されたＮＲＢＣアナログは、細胞核を含まない。別の態様では、本発明のＮＲＢＣアナログは、細胞膜表面のコーティングもしくは化学結合または細胞膜への融合を行った天然または合成の核酸を含まない。したがって、豊富な非有核動物赤血球を使用して、簡潔な製造過程によって本発明のＮＲＢＣアナログを生成することができると認識され得る。

さらなる実施形態では、リファレンスコントロール組成物は、白血球（ＷＢＣ）を模倣する白血球成分をさらに含む。白血球成分の存在下で、ＮＲＢＣ成分と白血球成分との間の比を使用して、１００ＷＢＣあたりのＮＲＢＣ数を報告することができ、これは、臨床検査での血液サンプルの有核赤血球の報告のために使用される単位と同一である。好ましくは、白血球成分またはアナログは、１つの主要な白血球小集団（顆粒球またはリンパ球など）と類似の性質を有する。

さらに、白血球成分は、１つを超える白血球小集団成分またはアナログ（例えば、差分分析のための白血球小集団を模倣するための２つ、３つ、４つ、または５つの白血球小集団アナログ）を含むことができる。白血球アナログの適切な例には、当該分野で公知のように、安定化および固定化哺乳動物白血球ならびに処理および／または固定ヒトおよび動物赤血球が含まれる。１つの実施形態では、米国特許第５，３２０，９６４号および同第５，５１２，４８５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に教示のように、白血球アナログを、インピーダンスと光散乱測定との組み合わせを使用した差分分析のために、処理したガチョウおよびワニ赤血球から作製することができる。別の実施形態では、米国特許第４，７０４，３６４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に教示のように、白血球アナログを、インピーダンス測定を使用した差分分析のために、処理したトリおよびヒト赤血球から作製することができる。さらなる実施形態では、白血球アナログを、固定哺乳動物白血球から作製することができる。哺乳動物白血球を、白血球アナログの調製中の全血中の赤血球の溶解前に固定する。

任意選択的に、哺乳動物白血球および赤血球を、白血球アナログの調製過程中のリポタンパク質との接触によってさらに処理することができる。米国特許第５，３２０，９６４号、同第５，５１２，４８５号、同第６，４０６，９１５号、同第６，４０３，３７７号、同第６，３９９，３８８号、同第６，２２１，６６８号、および同第６，２００，５００号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に教示のように、白血球または赤血球の固定前にリポタンパク質と接触させることができ、固定後且つ保存中に懸濁培地中で接触させることもできる。

別の実施形態では、本発明は、懸濁培地中に上記有核赤血球成分、白血球成分、さらに赤血球成分および血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物を提供する。

赤血球成分は、安定化したヒトまたは動物の赤血球、好ましくは安定化ヒト赤血球であり得る。赤血球成分の作製過程は、米国特許第４，２９９，７２６号および同第４，３５８，３９４号（その全体が参考として援用される）に詳述されている。血小板成分は、安定化したヒトまたは動物の血小板または他の細胞から作製した血小板アナログであり得る。米国特許第４，２６４，４７０号、同第４，３８９，４９０号、および同第４，４０５，７１９号（その全体が参考として援用される）に開示のように、１つの適切な例は、血小板アナログとしての処理したヤギ赤血球の使用である。

血液サンプルの赤血球と類似して、リファレンスコントロール組成物中の安定化ヒト赤血球を、有核赤血球および白血球の測定のための血液サンプルの調製で通常使用される溶解条件下で溶解し、分析器が適切に操作される場合、この赤血球は測定中に検出されるべきではない。溶解条件下で血液サンプルの血小板はサイズが小さくなり、血小板は、有核赤血球の測定の検出閾値未満であるか、有核赤血球から分離される。上記の血小板アナログは、溶解条件下で血液サンプルの血小板の応答を模倣する。したがって、リファレンスコントロール組成物中の赤血球成分および血小板成分は、溶解試薬に対するコントロール組成物の応答だけでなく、装置上の反応条件もさらに反映する。したがって、赤血球および血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物は、装置操作条件に関するさらなる情報を得ることができる。

さらに、赤血球および血小板アナログを含むリファレンスコントロール組成物を、赤血球および血小板の測定に使用することもできる。この測定は、自動化血液分析器での白血球および有核赤血球の測定と共に一般に行われる。

任意選択的に、リファレンスコントロール組成物は、網状赤血球の分析のための網状赤血球成分をさらに含むことができる。網状赤血球成分を、当該分野で公知の方法（例えば、米国特許第６，３９９，３８８号、同第６，４０３，３７７号、および同第６，４０６，９１５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の方法）を使用して作製することができる。

実施例３は、実施例１に記載の過程、単一集団の白血球成分、赤血球成分、および血小板成分を使用した、ウマ赤血球から作製したＮＲＢＣアナログを含むリファレンスコントロール組成物の調製を例示する。実施例４は、本発明の有核赤血球成分、複数の白血球小集団アナログ、赤血球成分、および血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物の調製をさらに例示する。

本発明の有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を、種々の測定方法を使用した有核赤血球測定に使用することができる。実施例３は、ＤＣインピーダンス測定またはＤＣ測定とＶＣＳ測定との組み合わせを使用した有核赤血球の測定のための有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物の使用方法を例示する。本明細書中で使用される用語、「ＶＣＳの測定または検出方法」は、直流（ＤＣ）および高周波（ＲＦ）インピーダンスならびに血球の光散乱シグナル（フローセルを通過させる場合）を測定する三次元測定テクノロジーをいう。ＶＣＳ検出方法は、米国特許第５，１２５，７３７号（その全体が参考として援用される）中に詳述されている。ＤＳ測定とＶＣＳ測定との組み合わせを使用した有核赤血球の測定方法は、米国特許第６，４７２，２１５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に完全に記載されている。

典型的には、自動化血球分析器で、血液サンプルのいくつかのアリコートを、異なる毛級小集団の測定のために個別に処理する。Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧＥＮ*ＳまたはＬＨ７５０血液分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で、血液サンプルのいくつかのアリコートを、異なる分析モードで同時に分析する。血液サンプルの第１のアリコートを、血液希釈剤によって希釈して、第１のサンプル混合物を形成し、赤血球および血小板を、ＤＣインピーダンス測定によって測定して、赤血球および血小板のパラメーターを得る。同時に、血液サンプルの第２のアリコートを血液希釈剤および第１の溶解試薬と混合して第２のサンプル混合物を形成し、第２のサンプル混合物をＤＣインピーダンス測定によって測定して白血球数を得、白血球を３つの小集団に区別し、有核赤血球を分析した。サンプルの第３のアリコートを第２の溶解試薬と混合し、その後に安定化試薬と混合して第３のサンプル混合物を形成した。第３のサンプル混合物をフローセルの送達させ、５つの小集団への白血球の差分分析および有核赤血球の分析のためにＶＣＳ検出方法によって測定した。

図１Ａおよび２Ａは、実施例３により完全に記載のように、１００ＷＢＣあたり約２７個のＮＲＢＣを含む正常な全血サンプルおよび臨床全血サンプルの第２のアリコートから得たＤＣヒストグラムを示す。示すように、臨床血液サンプル中の有核赤血球は、ヒストグラムの左端の明確なピークとして出現した一方で、正常血液サンプルは同一領域に細胞集団は認められなかった。

図１Ｂおよび２Ｂは、図１Ａおよび２Ａに示す正常および臨床血液サンプルの第３のアリコートから得たＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。示すように、臨床血液サンプル中の有核赤血球は散布図の左下に存在した一方で、正常血液サンプルは同一領域に明らかな量の細胞は認められなかった。ＲＬＳは、中角度光散乱シグナルおよびＤＣインピーダンスシグナルの関数として定義される、用語「回転光散乱」の略語であることに留意のこと。

図３Ａおよび３Ｂは、それぞれ実施例３のリファレンスコントロール組成物の第２のアリコートから得たＤＣヒストグラムおよび第３のアリコートから得たＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。図３Ａに示すように、固定ウマ赤血球から作製したＮＲＢＣアナログはヒストグラムの左端に存在し、これは、ヒト有核赤血球と酷似している。図３Ｂに示すように、ＮＲＢＣアナログはヒト有核赤血球の同一領域中の散布図の左下に存在し、固定ガチョウ赤血球は、ＤＣヒストグラムおよびＤＣ対ＲＬＳ散布図の両方がヒトリンパ球と酷似していた。例示するように、実施例３のリファレンスコントロール組成物を、ＤＣのみの測定のために使用するか、ＤＣ測定とＶＣＳ測定との組み合わせのために使用することができる。

実施例３がＤＣ測定法およびＶＣＳ測定法を使用したリファレンスコントロール組成物の使用を例示しているにもかかわらず、本発明の有核赤血球成分が有核赤血球の核のサイズに酷似したアナログサイズを有するので、リファレンスコントロール組成物を、細胞サイズの測定に基づく種々の検出方法と共に使用することができる。これらには、インピーダンス、光散乱、および軸方向の光の損失の測定が含まれるが、これらに限定されない。

低角度光散乱および軸方向の光の損失の測定を、有核赤血球の測定のために使用した。用語「低角度光散乱」は、入射光線から１０°未満で検出される光散乱シグナルをいい、一般に、前方光散乱ともいう。

軸方向の光の損失（ＡＬＬ、前方吸光（ｆｏｒｗａｒｄ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）としても公知）は、一般に、入射光線ビームの粒子通過に起因する光エネルギーの減少であり、光検出器によって検出される。入射光線のビームが粒子に衝突した場合、光は散乱または消衰し、その両方によって入射光線からエネルギーが取り出され、入射ビームが減衰する。この減衰を、消衰（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）という。入射光線のビームの軸に沿って認められる場合、これを、軸方向の光の損失という。一般に、ＡＬＬシグナルは、入射光線から約０°〜約１°の角度で検出される。本発明の好ましい実施形態では、ＡＬＬシグナルは、入射光線の軸から約０．５°未満の円領域中で回収される。ＡＬＬシグナルは、細胞のサイズに強い影響を受ける。軸方向の光の損失の測定によって入射光線のビーム由来のエネルギーの損失を測定するのに対して、低角度光散乱測定は光の増加を測定し、これら２つの異なる光学的特性の測定には異なる電子回路が必要である。

有核赤血球測定のためのリファレンスコントロールとして本発明のリファレンスコントロール組成物を使用することができる測定方法および装置の１つの適切な例は、米国特許第５，８７４，３１０号および同第５，９１７，５８４号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。より具体的には、有核赤血球の測定を、光散乱シグナルの２つの角度の測定によって行う。１つの実施形態では、光散乱シグナルの２つの角度は、入射光線から１０°未満、好ましくは約０°〜約４°で検出される両低角度光散乱シグナルである。別の実施形態では、第１の光散乱シグナルは低角度光散乱シグナルであり、第２の光散乱シグナルは中角度または垂直の光散乱シグナルである。さらに、有核赤血球の測定を、光散乱シグナルおよびＤＣインピーダンスシグナルの測定によって行うこともできる。

有核赤血球測定のためのリファレンスコントロールとして本発明のリファレンスコントロール組成物を使用することができる測定方法および装置のさらに適切な例は、同時係属特許出願番号１１／０４８，０８６号および同第１１／３３８，２２９号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に詳述されている。より具体的には、特許出願番号１１／０４８，０８６号に記載の方法は、軸方向の光の損失および低角度光散乱シグナル；軸方向の光の損失およびＤＣインピーダンスシグナル；または軸方向の光の損失、ＤＣインピーダンス、および低角度光散乱シグナルの測定によって有核赤血球を測定する。特許出願番号１１／３３８，２２９号に記載の方法は、軸方向の光の損失、ＤＣインピーダンス、中角度光散乱シグナル；軸方向の光の損失、低角度および中角度光散乱シグナル；または軸方向の光の損失、ＤＣインピーダンス、低角度および中角度光散乱シグナルの測定によって有核赤血球を測定する。好ましくは約１°〜７°の低角度光散乱シグナルを測定し、好ましくは約２０°〜約４５°の中角度光散乱シグナルを測定する。

全てがＮＲＢＣ成分の調製のために有核血球を使用する必要があるＮＲＢＣ測定のための既存のリファレンスコントロールと異なり、本発明のリファレンスコントロール組成物は、有核血球の使用を必要としない。その代わり、ＮＲＢＣ成分の作製のために、容易に利用可能且つ豊富な非有核赤血球を使用することができる。

実施例４は、ＮＲＢＣ成分，複数の白血球小集団アナログ、赤血球、および血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物を示す。赤血球、血小板、およびＮＲＢＣの測定に加えて、このリファレンスコントロール組成物を、ＶＣＳ測定を使用した５つの小集団への白血球の差分分析のためにさらに使用することができる。

以下の実施例は、本発明を例示し、特許請求の範囲に定義されるように、本発明の範囲を制限すると決して解釈されない。前述の開示に従って、種々の他の成分および比率を使用することができると理解されるであろう。

（実施例１）ウマ赤血球から作製した有核赤血球成分
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）

成分 量（ｇ／ｌ）
リン酸二水素ナトリウム： ０．２ｇ
リン酸一水素二ナトリウム７水和物： ２．０ｇ
アジ化ナトリウム： ０．１ｇ
塩化ナトリウム： ９．４ｇ
蒸留水で１Ｌにする： 約ｐＨ７．４
浸透圧３１５〜３４５ｍＯｓｍ／ｋｇＨ_２Ｏ


アナログ固定培地１

成分 量（ｇ／ｌ）
リン酸一水素二ナトリウム７水和物： ２．０ｇ
リン酸二水素ナトリウム： ０．２ｇ
塩化ナトリウム： ８．０ｇ
グルタルアルデヒド（２５％）： ４０ｍｌ
蒸留水で１Ｌにする： 約ｐＨ７．４
浸透圧２８５ｍＯｓｍ／ｋｇＨ_２Ｏ


懸濁培地１

成分 範囲（ｇ／ｌ） 好ましい範囲（ｇ／ｌ）
キサンチン化合物 １〜１０ ２〜７
アデノシン一リン酸 ０．１〜１．０ ０．２〜０．８
イノシン ０．１〜１．０ ０．２〜０．８
得るのに十分なｐＨ調整剤 ｐＨ５．８〜６．８ ｐＨ６．０〜６．５
得るのに十分な浸透圧調整剤 ２００〜４００ｍＯｓｍ ２５０〜３５０
防腐剤： 有効量 ２．０〜６．０
蒸留水で１Ｌにする


懸濁培地２

成分 好ましい範囲（ｇ／ｌまたはｍｌ／ｌ）
プロピルパラベン ０．３〜１．０ｇ
メチルパラベン ０．５〜１．０ｇ
塩酸プロカイン ０．１〜０．５ｇ
デオキシコール酸 ０．１〜０．９ｇ
ラクトース １０．０〜５０．０ｇ
アクチジオン ０．１〜０．６ｇ
クエン酸三ナトリウム無水物 ３．０〜８．０ｇ
クエン酸一水和物 ０．３〜０．９ｇ
リン酸二水素ナトリウム一水和物 ０．８〜２．５ｍｇ
塩酸フェネルガン ０．１〜１．０ｇ
コリスチメタン酸ナトリウム ０．２〜０．９ｇ
（ｃｏｌｉｓｔｉｍｅｔｈａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍ）
ペニシリンＧ．（ナトリウム塩） ０．５×１０^６〜３×１０^６単位
硫酸カナマイシン ０．２〜０．８ｇ
硫酸ネオマイシン ０．２〜１．０ｇ
５’−ＡＭＰ ０．４〜１．０ｇ
アデニン ０．２〜０．８ｇ
イノシン ０．４〜１．０ｇ
硫酸ジヒドロストレプトマイシン ０．２〜１．０ｇ
塩酸テトラサイクリン ０．２〜１．０ｇ
３０％ウシアルブミン １００〜３５０ｍｌ
蒸留水で１Ｌにする


ウマ赤血球を使用したＮＲＢＣアナログ調製のための処理工程
１．抗凝固薬を含む容器中でウマから５０ｍｌの全血を採取する。ウマ全血を遠心分離し、白血球、血小板、および血漿を含む上層を除去した。

２．密集したウマ赤血球をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、洗浄した密集細胞を残りのＰＢＳに再懸濁した。細胞洗浄工程は、１２００ｒｐｍで１５分間の遠心分離、その後の上清の除去、およびＰＢＳでの密集した細胞の再懸濁を含む一連の操作であった。

３．１ｍｌの密集したウマ赤血球を４９ｍｌのアナログ固定培地１を含む試験管に添加し、反転によって十分に混合して細胞処理懸濁液を形成させた。

４．試験管をローラーに置き、低速にて室温で一晩混合した。

５．工程（２）に記載のように、処理した細胞をＰＢＳで３回洗浄した。

６．処理細胞を懸濁培地１または２に再懸濁して、血液分析器での分析のためのＮＲＢＣリファレンスコントロール組成物を形成させた。

（実施例２）ヒツジ赤血球から作製した有核赤血球成分
５０ｍｌの全血をヒツジから採取し、工程３で以下に示すアナログ固定培地２を使用したこと以外は実施例１と同一の処理工程を使用して処理した。処理したヒツジ赤血球を、懸濁培地１に再懸濁して、別のＮＲＢＣリファレンスコントロール組成物を形成させた。

アナログ固定培地２

成分 量（ｇ／ｌ）
リン酸一水素二ナトリウム７水和物： ２．０ｇ
リン酸二水素ナトリウム： ０．２ｇ
塩化ナトリウム： ９．４ｇ
グルタルアルデヒド（２５％） ４０ｍｌ
蒸留水で１Ｌにする： 約ｐＨ７．４
浸透圧３２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ


（実施例３）
有核赤血球成分、白血球成分、ならびに赤血球および血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物
調製手順：
１．所定体積の実施例１の懸濁培地１を提供する。

２．所定量の安定化ヒト赤血球を培地に添加した。安定化ヒト赤血球を、米国特許第４，２９９，７２６号および同第４，３５８，３９４号に記載の手順にしたがって処理した。

３．所定量の血小板成分を、安定化ヒト赤血球を含む懸濁培地に添加した。血小板成分を、米国特許第４，２６４，４７０号、同第４，３８９，４９０号、および同第４，４０５，７１９号に記載の手順にしたがって、固定ヤギ赤血球から作製する。

４．固定ガチョウ赤血球から作製した所定量の白血球成分を、安定化ヒト赤血球および血小板成分を含む懸濁培地に添加した。

５．所定量の実施例１の固定ウマ赤血球を、安定化ヒト赤血球、血小板成分、および白血球成分を含む懸濁培地に添加した。

６．形成されたリファレンスコントロール組成物を穏やかに混合した。

対応するヒト全血サンプルの細胞濃縮物を模倣するために、赤血球、白血球、および血小板成分の細胞濃縮物を調製した。一定レベルの有核赤血球、好ましくは、１〜５０ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣの範囲を含む臨床サンプルを模倣するために、有核赤血球成分の細胞濃縮物を調製した。

上記過程から得たリファレンスコントロール組成物を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＨ７５０血液分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製）で分析した。Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＨ７５０血液分析器は、赤血球を測定するための３つの非焦点フロー孔（ｎｏｎ−ｆｏｃｕｓｅｄ ｆｌｏｗ ａｐｅｒｔｕｒｅｓ）およびＤＣ−インピーダンス検出器を使用するＲＢＣ浴；白血球数を測定し、白血球を３つの小集団に区別し、有核赤血球を分析するための３つの非焦点フロー孔およびＤＣ−インピーダンス検出器を使用するＷＢＣ；および白血球を５つの小集団に区別するためのＶＣＳ検出系を備えたフローセルを有する。ＶＣＳ検出システムは、ＤＣインピーダンス、高周波インピーダンス、およびフローセルを通過した細胞の中角度光散乱シグナルを測定する。

血液サンプルまたはリファレンスコントロール組成物を、Ｃｏｕｌｔｅｒ ＬＨ７５０血液分析器によって吸引した。１．６μｌサンプルの第１のアリコートを、等張血液希釈剤（ＬＨ７００シリーズ希釈剤）で６２５０：１の希釈比で希釈して、第１のサンプル混合物を形成した。次いで、第１のサンプル混合物を、真空源（ｖａｃｕｕｍ ｓｏｕｒｃｅ）によって３つの孔組を介して引き込んだ。ＤＣインピーダンス検出器によって孔を通過させて赤血球パラメーターを得た時に各血球を測定した。２８μｌサンプルの第２のアリコートを、６ｍｌのＬＨ７００シリーズ希釈剤で希釈し、１ｍｌの第１の溶解試薬（Ｌｙｓｅ Ｓ（登録商標）ＩＩＩ ｄｉｆｆ）と混合して、第２のサンプル混合物を形成させた。第２のサンプル混合物を、真空源によって３つの孔組みから引き込み、白血球数を得ることによって測定し、白血球を３つの小集団に区別し、有核赤血球を分析した。３４μｌサンプルの第３のアリコートを、５４０μｌ の第２の溶解試薬（Ｅｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ（登録商標）ＩＩ）と混合して、赤血球を溶解し、その後に２１８μｌの安定化試薬（Ｓｔａｂｉｌｙｓｅ）と混合して、第３のサンプル混合物を形成させた。第３のサンプル混合物を、白血球の５つの小集団への差分分析および有核赤血球の分析のためにフローセルに送達させた。約１８℃〜約２８℃の範囲の温度で測定を行った。第２のアリコートサンプルおよび第３のアリコートサンプルの測定から得たデータを分析して、有核赤血球を報告した。上記の全試薬は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．の製品であった。

図１Ａは、上記手順にしたがって分析した正常全血サンプルの第２のアリコートから得たＤＣヒストグラムを示す。示すように、３つの白血球小集団は、０〜４００ｆｌの範囲で分布し、細胞集団は、白血球の左側に認められなかった。図１Ｂは、同一の血液サンプルの第３のアリコートから得たＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。示すように、明らかな量の細胞は散布図の下部に存在しなかった。

図２Ａは、上記手順にしたがって分析した約２７ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含む臨床全血サンプルの第２のアリコートから得たＤＣヒストグラムを示す。示すように、有核赤血球は、ヒストグラムの左端に明らかなピークとして出現した。図２Ｂは、同一の臨床サンプルの第３のアリコートから得たＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。示すように、有核赤血球は、散布図の左下に存在した。

図３Ａおよび３Ｂは、上記リファレンスコントロール組成物の第２および第３のアリコートからそれぞれ得たＤＣヒストグラムおよびＤＣ対ＲＬＳ散布図である。示すように、固定ウマ赤血球は、ＤＣヒストグラムの左端に明らかなピークとして出現し、ＤＣ対ＲＬＳ散布図の左下に存在した。したがって、これらは、ＤＣおよびＤＣ対ＲＬＳ測定の両方においてヒト有核赤血球に酷似していた。他方では、固定ガチョウ赤血球はヒトリンパ球に類似していた。

（実施例４）ＮＲＢＣ成分、複数の白血球小集団アナログ、赤血球、および血小板成分を含む血液学リファレンスコントロール組成物
このリファレンスコントロール組成物の作製手順は、工程４で所定量の複数の白血球小集団アナログを、実施例１または２で作製した安定化ヒト赤血球、血小板成分、およびＮＲＢＣ成分を含む懸濁培地に添加することを除き、実施例３に記載の手順と本質的に同一である。

複数の白血球小集団アナログを、米国特許第５，３２０，９６４号および同第５，５１２，４８５号に記載の手順にしたがって調製した。リファレンスコントロール組成物を、４５日間を超えた期間保存することができる。

このリファレンスコントロール組成物を、米国特許第６，４７２，２１５号に詳述されているＤＣインピーダンス測定とＶＣＳ測定との組み合わせを使用した有核赤血球の分析に使用することができる。

本発明を詳述し、且つ添付の図面に視覚的に示したが、これらを、本発明の範囲を制限すると解釈すべきではなく、むしろ、その好ましい実施形態の例示と解釈すべきである。しかし、上記明細書に記載し、添付の特許請求の範囲およびその法的等価物に定義の本発明の精神および範囲内で種々の修正形態および変更形態を実施することができることが明らかであろう。本明細書中に引用した全ての特許および他の刊行物は、明確に参考として援用される。

図１Ａは、実施例３に記載の手順にしたがって分析した、正常血液サンプルのＤＣヒストグラムを示す。図１Ｂは、実施例３に記載の手順にしたがって分析した、図１Ａに示す同一血液サンプルのＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。 図２Ａは、実施例３に記載の手順にしたがって分析した、２７ＮＲＢＣ／１００ＷＢＣを含む臨床サンプルのＤＣヒストグラムを示す。図２Ｂは、実施例３に記載の手順にしたがって分析した、図２Ａに示す臨床サンプルのＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。 図３Ａは、実施例３に記載の手順にしたがって分析した、実施例３のリファレンスコントロール組成物のＤＣヒストグラムを示す。図３Ｂは、実施例３に記載の手順にしたがって分析した、図３Ａに示す同一のリファレンスコントロール組成物のＤＣ対ＲＬＳ散布図を示す。

Claims (25)

1. 有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物であって、
   （ａ）血液サンプルの有核赤血球を模倣するための固定非有核血球から作製した有核赤血球成分、および
   （ｂ）該有核赤血球の測定のための血液分析器への該成分の送達に適切な懸濁培地
   を含む、リファレンスコントロール組成物。
2. 前記非有核血球が、前記血液サンプルの有核赤血球の核サイズと実質的に類似する天然の細胞サイズを有する、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
3. 前記非有核血球が、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタの赤血球またはその組み合わせを含む、請求項２に記載のリファレンスコントロール組成物。
4. 前記固定非有核血球が実質的に核酸を含まない、請求項２に記載のリファレンスコントロール組成物。
5. 白血球成分をさらに含む、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
6. 赤血球成分をさらに含む、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
7. 血小板成分をさらに含む、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
8. 網状赤血球成分をさらに含む、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
9. 有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を作製する方法であって、
   ａ）測定すべき有核赤血球の核のサイズと実質的に類似する天然の細胞サイズを有する非有核血球を提供する工程、
   ｂ）該非有核血球を固定培地で固定する工程、および
   ｃ）工程（ｂ）から得た固定非有核血球を懸濁培地に懸濁して、リファレンスコントロール組成物を形成する工程
   を含む、方法。
10. 前記非有核血球が、ウマ、ヒツジ、ウシ、ネコ、イヌ、ブタの赤血球またはその組み合わせを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記固定非有核血球が実質的に核酸を含まない、請求項９に記載の方法。
12. 処理溶液が固定剤および浸透圧調整剤を含む、請求項９に記載の方法。
13. 工程（ｂ）の前に前記非有核血球を、該非有核血球を球形化する（ｓｐｈｅｒｅ）ための球形化試薬（ｓｐｈｅｒｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）と接触させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
14. 白血球成分、赤血球成分、血小板成分、網状赤血球成分、またはその組み合わせを前記懸濁培地に添加する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
15. 有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を使用する方法であって、
    ａ）測定すべき血液サンプルの有核赤血球を模倣するための固定非有核血球から作製した有核赤血球成分を含むリファレンスコントロール組成物を提供する工程、
    ｂ）該血液サンプルの有核赤血球の測定に適合した血液分析器を提供する工程、
    ｃ）該リファレンスコントロール組成物を該血液分析器で分析し、該有核赤血球成分を測定する工程、および
    ｄ）該リファレンスコントロール組成物中の有核赤血球成分を報告する工程
    を含む、方法。
16. 前記有核赤血球成分の測定を、ＤＣインピーダンスシグナルの測定によって行う、請求項１５に記載の方法。
17. 前記有核赤血球成分の測定を、光散乱シグナルの２つの角度の測定によって行う、請求項１５に記載の方法。
18. 前記光散乱シグナルの２つの角度が、１０°未満で検出される低角度光散乱シグナルである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記光散乱シグナルの２つの角度が低角度光散乱シグナルおよび中角度（ｍｅｄｉｕｍ ａｎｇｌｅ）光散乱シグナルまたは直角光散乱シグナルである、請求項１７に記載の方法。
20. 前記有核赤血球成分の測定を、ＤＣインピーダンスシグナルおよび光散乱シグナルの測定によって行う、請求項１５に記載の方法。
21. 前記有核赤血球成分の測定を、軸方向の光の損失（ａｘｉａｌ ｌｉｇｈｔ ｌｏｓｓ）およびＤＣインピーダンスシグナルの測定によって行う、請求項１５に記載の方法。
22. 前記有核赤血球成分の測定を、軸方向の光の損失および光散乱シグナルの測定によって行う、請求項１５に記載の方法。
23. 前記光散乱シグナルが低角度光散乱シグナルである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルである、請求項２２に記載の方法。
25. 前記有核赤血球成分の測定を、前記血液サンプルの第１のアリコートの第１のＤＣインピーダンスシグナルの測定、ならびに該血液サンプルの第２のアリコートの第２のＤＣインピーダンスシグナル、高周波インピーダンスシグナル、および光散乱シグナルの測定によって行う、請求項１５に記載の方法。

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