DE69532334T2

DE69532334T2 - Verfahren zur Stabilisierung von einer wässerigen Alkalische-Phosphatase Lösung

Info

Publication number: DE69532334T2
Application number: DE69532334T
Authority: DE
Inventors: Jingzhi Xu; Masayuki Nozawa
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1994-10-21
Filing date: 1995-10-17
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2015-10-18
Also published as: DE69502905D1; EP0709458A1; DE69532334D1; EP0794249A3; EP0709458B1; EP0794249A2; DE69502905T2; EP0794249B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung einer wäßrigen Lösung von alkalischer Phosphatase oder ihren Derivaten, welche als Reagens in der Forschung oder in der klinischen Diagnostik auf der Grundlage eines Enzym-Immunoassays verwendet wird bzw. werden.
Beschreibung des Stands der Technik:
In der jüngsten Zeit werden Enzym-Immunoassays und Chemilumineszenz-Enzym-Immunoassays häufig in der klinischen Diagnostik verwendet. Unter den in solchen Immunoassays verwendeten Enzymen sind die alkalische Phosphatase und ihre Derivate (im weiteren als "ALP und/oder verwandte Substanzen" bezeichnet) besonders wichtige Enzyme. Deshalb ist die Lagerungsstabilität für die Leistungsfähigkeit der resultierenden Reagentien oder Produkte sicherzustellen.
Es ist übliche Praxis, daß für diese ALP und/oder verwandten Substanzen in Puffern, wie HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure) (pH 7,5–8,2), TEA (Triethanolamin) (pH 7,6–8,0) oder Tris (Tris (hydroxymethyl)aminomethan) (pH 8,0–8,5), gelagert bzw. aufbewahrt und zur Reaktion gebracht werden. Es ist jedoch festgestellt worden, daß die Stabilität von ALP und/oder verwandten Substanzen in solchen Puffersystemen ungenügend ist, wenn die Temperatur hoch (25°C oder darüber) ist oder wenn die Lagerung über einen längeren Zeitraum stattfindet.
Somit sind, obwohl es wünschenswert ist, ALP und/oder verwandte Substanzen in Lösung aufzubewahren und sie bei einer Temperatur von 37°C umzusetzen, um die Handhabung zu erleichtern und eine gute Reproduzierbarkeit zu erhalten, die Bedingungen, unter denen sie verwendet werden, tatsächlich erheblich eingeschränkt. Das bedeutet, daß sie bei niedrigeren Temperaturen gehandhabt werden müssen oder in gefriergetrocknetem Zustand zu lagern sind, was die Handhabung umständlich macht und die Kosten erhöht.
Um diese Probleme zu lösen, sind über viele Jahre hinweg Verbesserungen der Technologien zur Stabilisierung von ALP und/oder verwandten Substanzen in Lösung gemacht worden. Typische Verfahren umfassen die chemische Modifizierung von Enzymen und die Zugabe von zweiwertigen Metallionen wie Mg²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺, Cd²⁺ oder wasserlöslichen Sulfiden. Die herkömmlichen Verfahren erzielten jedoch keine zufriedenstellende Stabilisierung und ließen somit das Problem der Stabilität unbeantwortet.
Portmann et al. (Helv. Chim. Acta, Vol. 65, 2668–2681 (1982)) haben ein modifiziertes und verbessertes Verfahren zur Isolierung von alkalischer Phosphatase aus Kalbsdärmen beschrieben. Nach diesem Verfahren wird die Phosphatase als homogenes Glycoprotein erhalten, welches Zink, Magnesium und Phosphorsäure festgebunden enthält.
Im Hinblick darauf haben die benannten Erfinder sorgfältige Untersuchungen nach einem Verfahren zur Stabilisierung einer wäßrigen Lösung von ALP und/oder verwandten Substanzen durchgeführt und gefunden, daß diese Substanzen stabil über einen längeren Zeitraum bei hohen Temperaturen gelagert werden können, wenn eine Verbindung mit einer in bezug auf ALP reversiblen Bindungsaktivität einer wäßrigen Lösung von ALP und/oder verwandten Substanzen zugesetzt wird. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Entdeckung gemacht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es. ist daher, die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur stabilen Lagerung einer wäßrigen Lösung von ALP und/oder verwandten Substanzen über einen längeren Zeitraum ohne Deaktivierung dieser Substanzen selbst bei relativ hohen Temperaturen (25°C oder darüber) bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird eine Enzymlösung bereitgestellt, die alkalische Phosphatase oder ein Derivat davon und eine Verbindung mit einer gegenüber alkalischer Phosphatase reversiblen Bindungsaktivität enthält, wobei die Verbindung aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorsäureester, einem Alkalimetallsalz der Phosphorsäure oder einem Phosphorsäureester und einem Gemisch davon ausgewählt ist.
Diese und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Beispiel 6, die den Effekt der Stabilisierungsmittel auf eine ALP-AFP-Verbindung zeigt.
Die 2 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse von Beispiel 7, die den Effekt der stabilisierenden Mittel und von Wärme auf eine ALP-AFP-Verbindung zeigt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen, welche eine in bezug auf ALP reversible Bindungsaktivität aufweisen und die als Stabilisierungsmittel verwendet werden, Phosphorsäureester und ihre Alkalimetallsalze oder Alkalimetallsalze der Phosphorsäure. Diese können trotz des Umstandes, daß sie vorher nicht verwendet worden sind, da sie das Meßsystem beeinträchtigen, eingesetzt werden. Spezielle Beispiele der Verbindung, die erwähnt werden können, sind
Inositolphosphat und seine Salze, Riboflavinphosphat und seine Salze und Serinphosphat und seine Salze. Beispiele der Alkalimetallsalze der Phosphorsäure umfassen Kaliumphosphate wie KH₂PO₄/K₂HPO₄. Beispiele für Inositolphosphat und seine Salze umfassen Natriumphytat (Natriuminositolhexaphosphat).
Diese Verbindungen können an sich als Puffer verwendet werden, oder sie können, nachdem sie einem anderen Puffer zugesetzt worden sind, eingesetzt werden. Auf jeden Fall können die gleichen Wirkungen erhalten werden.
Die Menge dieser Stabilisierungsmittel, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, variiert in Abhängigkeit von dem eingesetzten Stabilisierungsmittel, dem angestrebten stabilisierenden Effekt und der Löslichlceit. Im allgemeinen werden sie vorzugsweise in einer solchen Menge zugesetzt, daß ihre Konzentration in der wäßrigen Lösung, welche ALP und/oder verwandte Substanzen enthält, nicht weniger als 1 mM und insbesondere 2,5–500 mM beträgt, um eine ausreichende stabilisierende Wirkung zu erzielen. Zum Beispiel wird, wenn ein Alkalimetallsalz der Phosphorsäure verwendet wird, sie in einer solchen Menge verwendet, daß ihre Konzentration in der wäßrigen Lösung innerhalb eines Bereichs von 10 bis 250 mM liegt. Wenn Natriumphytat verwendet wird, können Konzentrationen, die niedriger sind als in Fällen, in denen andere Verbindungen eingesetzt werden, zum Beispiel eine Konzentration von 1 mM, eine stabilisierende Wirkung hervorrufen, da diese Verbindung 6 Phosphorsäuregruppen in einem Molekül aufweist.
Der pH der wäßrigen Lösung, welche das erfindungsgemäß verwendete Stabilisierungsmittel enthält, beträgt vorzugsweise 5,5 bis 8,5 und insbesondere 5,5 bis 7,5. In diesem Zusammenhang soll angemerkt werden, daß, selbst wenn der pH-Wert innerhalb eines Bereichs von 5,5 bis 8,5 eingestellt wird, die erfindungsgemäß erzielbaren stabilisierenden Effekte nicht erhalten werden könnten, wenn das erfindungsgemäß verwendete Stabilisierungsmittel nicht eingesetzt wird.
Das erfindungsgemäße Stabilisierungsverfahren kann auf wäßrige Lösungen angewendet werden, die ALP und/oder Derivate von ALP enthalten. Die ALP-Derivate sind keinen besonderen Beschränkungen unterworfen. Beispiele für ALP-Derivate, die verwendet werden können, sind ALPs, die an Proteine (Antigene, Antikörper, Avidin etc.), Peptide, Haptene, Coenzyme (Biotin etc.), Zucker (Lektin etc.), Nucleinsäuren (DNA-Sonden, RNA-Sonden etc.) gebunden sind. Die Antigene und Antikörper, die verwendet werden können, sind keinen besonderen Beschränkungen unterworfen und ihre Art, Konzentration und dergleichen kann gemäß der Assay-Substanz usw. bestimmt werden.
Die Konzentration der ALP und/oder verwandten Substanzen in der wäßrigen Lösung ist keinen besonderen Beschränkungen unterworfen. Vorzugsweise liegt die Konzentration im Bereich von 0,05 bis 5.000 μg/ml, und insbesondere von 0,5 bis 1.000 μg/ml.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Stabilisierungsverfahren können ALP und/oder verwandte Substanzen über einen langen Zeitraum in Lösung, die für den Einsatz fertig ist, aufbewahrt werden. Die Lösung selbst kann in Reaktionen eingesetzt werden. Desweiteren werden, da ALP und/oder verwandte Substanzen bei hohen Temperaturen stabilisiert werden, immunologische Reaktionen beschleunigt, um die für den Assay erforderliche Zeit zu verkürzen und die Empfindlichkeit des Assays zu verbessern. Desweiteren erleiden ALP und/oder verwandte Substanzen in Reagentien für klinische Assays, die in Enzym-Immuno-Assays usw. verwendet werden, keinen Aktivitätsverlust und deshalb kann eine gute Reproduzierbarkeit des Assays erzielt werden.
Beispiele:
Die vorliegende Erfindung wird durch Beispiele weiter beschrieben, die nicht als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden sollten.
Beispiel 1:
Stabilisierende Wirkungen von verschiedenen Stabilsierungsmitteln auf ALP:
1. Herstellung einer ALP-Lösung
(1) Herstellung der Puffer
Zu 100 ml jeweils 2 verschiedener Puffer (KH₂PO₄/K₂HPO₄, HEPES, Natriumphytat), welche ein Stabilisierungsmittel und 2 verschiedene, herkömmliche Puffer (HEPES, TEA) enthielten, wobei die Konzentration 100 mM in den 4 Puffern betrug, wurde folgendes zugesetzt: Natriumchlorid (150 mM), BSA (1%), Magnesiumchlorid (2 mM), Zinkchlorid (0,2 mM) und Natriumazid (0,1%). Anschließend wurde 6N HCl verwendet, um den pH-Wert wie folgt einzustellen:
KH₂PO₄/K₂HPO₄ = 7,0,
HEPES/Natriumphytat = 7,0,
HEPES = 7,0 und
TEA = 7,6.
(2) Herstellung von ALP-Lösungen
Eine ALP-Lösung mit bekannter Konzentration wurde mit jedem der in Stufe (1) erhaltenen Puffern verdünnt, um ihre Konzentration auf 10 μg/ml einzustellen.
2. Assay-Verfahren
Von jedem der 4 oben beschriebenen ALP-Lösungen (Konzentration: 10 μg/ml) wurde eine vorbestimmte Menge entnommen und einem Hitzebelastungstest (50°C/10 min, Last (+)) unterworfen. Zur selben Zeit wurde die restliche Lösung 10 Minuten lang bei 4°C aufbewahrt (Kontrolle bzw. Vergleich, Belastung (-)). Nach Beendigung des Belastungstests wurden die Puffer durch einen TEA-Puffer unter Verwendung einer PD-10-Säule (Produkt von Pharmacia) ersetzt.
Die Vergleichsgruppen wurden ebenfalls diesem Pufferwechsel unterzogen. Von jeder der Proben, in denen die Puffer ersetzt wurden, wurden 500 μl Lösung entnommen. 50 μl p-Nitrophenylphosphat wurde zugesetzt. Nach zweiminütiger Reaktion wurde eine Lösung zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die enzymatischen Aktivitäten vor und nach dem Belastungstest wurden als Absorptionen bei 405 nm gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1a gezeigt.
Tabelle 1a
Wie sich aus Tabelle 1a ergibt, wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren nicht weniger als 96% der Aktivität von ALP selbst nach dem Hitzebelastungstest beibehalten. Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität bei konventionellen Verfahren auf weniger als 82% verringert.
Beispiel 2:
Stabilisierende Wirkungen von verschiedenen Stabilisierungsmitteln auf ALP-markierte Antikörper von Anti-α- Fetoprotein (AFP) (ALP-AFP)
A. Herstellung einer ALP-AFP-Verbindung:
1. Einführung eines Thiols in einen Anti-AFP-Antikörper unter Verwendung von N-Acetyl-DL-hornocysteinthiolacton (AHTL)

(1) 0,6 mg/0,01 ml AHTL wurden 5 mg eines gereinigten α-AFT-Antikörpers in 0,5 ml eines aus 0,1 M NaHCO₃/0,15 M NaCl/0,2 M Imidazol (pH 9,0) bestehenden Puffers unter Rühren bei 4°C zugesetzt. Die Reaktion wurde eine Stunde lang fortgesetzt.
(2) Nach Beendigung der Reaktion wurde die Antikörperprobe auf eine Sephadex-G 50-Säule aufgebracht und mit PBS/1,0 mM EDTA entsalzt. Die mit einem Thiol versehenen und auf eine leere Säule übertragenen Antikörper wurden gepoolt und die Menge des Proteins wurde bestimmt. Überschüssiges AHTL wurde in den zweiten Peak eluiert.

2. Einführung von Maleimid (MI) in ALP unter Verwendung von Sulfo-SMCC

(1) Zu 14,4 mg (102,5 nmol) ALP (0,1 M Tris/0,15 M NaCl), wurden 10 mg/ml einer Sulfo-SMCC-Lösung tropfenweise unter Rühren zugegeben. Die Sulfo-SMCC-Lösung war 1,5 mg (etwa 30 nmol) überschüssig in Bezug auf das ALP. Anschließend ließ man eine Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren.
(2) Nach Beendigung der Reaktion wurde die Probe auf eine Sephadex-G 50-Säule aufgebracht und mit einem PBS/1,0 mM- EDTA-Puffer entsalzt. Das auf eine leere Säule mit Maleimid übertragene ALP (ALP-MI) wurde gepoolt und die Menge des Proteins wurde bestimmt. Überschüssiges Sulfo-SMCC wurde in den zweiten Peak eluiert.

3. Reaktion des Antikörpers und des Enzyms
Die Lösung des mit einem Thiol versehenen Antikörpers (364 μg/ml) wurde gerührt, wobei eine ALP-MI-Lösung (306 μg/ml) tropfenweise zugesetzt wurde. Es wurde zwei Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur reagieren gelassen.
4. Blockierung aktiver Gruppen mit β-Mercaptoethanol (β-ME)
Zu 100 Volumeneinheiten der Lösung der Antikörper-Enzym-Verbindung wurde eine Volumeneinheit β-ME zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten, und anschließend wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert.
5. Abtrennung der freien Antikörper und freien Enzyme von der Antikörper-Enzym-Verbindung durch Gelfiltration
Die Lösung der Antikörper-Enzym-Verbindung wurde auf eine Gel-SW 3000-Säule (Produkt von Tosoh) aufgebracht. Unter Verwendung von 0,1 M Tris/0,15 M NaCl (pH 7,0) als Puffer zur Elution wurde die Lösung fraktioniert, bis freie Antikörper und freies ALP eluiert wurden.
B. Herstellung einer Lösung der ALP-AFP-Verbindung

1. Herstellung eines Puffers 4 verschiedene, in Tabelle 1a gezeigte Puffer wurden in ähnlicher Weise wie in Stufe 1(1) von Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
2. Die in A. oben beschriebene hergestellte ALP-AFP-Verbindung mit hoher Konzentration wurde auf eine Konzentration von 1 μg/ml unter Verwendung der 4 Puffer verdünnt.

C. Assay-Verfahren
Eine gewisse Menge von jeder der 4 Lösungen der ALP-AFP-Verbindung wurde entnommen und einem Hitzebelastungstest (50°C, 10 Minuten) unterworfen. Die restliche Lösung wurde 10 Minuten lang bei 4°C gelagert (Vergleich). Nach 10 Minuten wurden 50 μl der Lösung aus jeder Probe entnommen und mit 50 μl einer festen, an Anti-AFP-Antikörper gebundenen Phase, 10 μl einer AFP-Antigen-Probe und 50 μl einer Verdünnungsflüssigkeit kombiniert. Anschließend ließ man 5 Minuten lang reagieren. Danach wurde das Reaktionsgemisch dreimal gewaschen. Amadatylmethoxyphenylphosphoryldioxotan (AMPPD), das das Substrat für ALP ist, wurde zugesetzt, und die Aktivitäten der ALP-AFP-Verbindung vor und nach dem Belastungstest gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1b gezeigt.
Tabelle 1b
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde nicht weniger als 94% der Aktivität der ALP-AFP-Verbindung selbst nach dem Hitzebelastungstest erhalten. Im Gegensatz dazu wurde die Aktivität bei herkömmlichen Verfahren auf weniger als 75% verringert.
Beispiel 3:
ALP-Stabilitätstest, wenn der pH von Puffern die ein Stabilisierungsmittel enthielten, verändert wurde:
1. Herstellung der Puffer
Zu 100 ml von 5 verschiedenen Puffern, welche 2 erfindungsgemäße, stabilisierende Puffer (K₂HPO₄/KH₂PO₄, HEPES/Natriumphytat) und 3 verschiedene herkömmliche Puffer (MES, HEPES, TEA) umfaßten, wobei die Konzentration jeweils 100 mM in den fünf Puffern betrug, wurde folgendes zugesetzt: Natriumchlorid (150 mM), BSA (1%), Magnesiumchlorid (2 mM), Zinkchlorid (0,2 mM) und Natriumazid (0,1%). Anschließend wurde 6N HCl verwendet, um den pH wie folgt einzustellen:
K₂HPO₄/KH₂PO₄: 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5
HEPES/Natriumphytat: 7,0, 7,5, 8,0
MES: 5,5, 6,0, 6,5
HEPES: 7,0, 7,5, 8,0, 8,8 und
TEA: 7,6.
2. Assay-Verfahren
Unter Verwendung der oben beschriebenen Puffer wurden in einer ähnlichen Weise wie in Stufe 1(2) von Beispiel 1 beschrieben 10 μg/ml Enzymlösungen hergestellt. Anschließend wurde der unter Punkt 2 von Beispiel 1 beschriebene Hitzebelastungstest durchgeführt. Die Enzymaktivitäten wurden gemessen.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 und 3 gezeigt.
Tabelle 3
Beispiel 4:
Stabilitätstest an einer ALP-AFP-Verbindung wenn der pH von ein Stabilisierungsmittel enthaltenden Puffern geändert wurde:
1. Herstellung einer ALP-AFP-Verbindung
Eine ALP-AFP-Verbindung wurde in ähnlicher Weise wie unter Punkt A in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
2. Herstellung von Puffern
Zu 100 ml von jeweils 5 verschiedenen Puffern, welche 2 erfindungsgemäße stabilisierende Puffer (K₂HPO₄/KH₂PO₄, HEPES/Natriumphytat) und 3 verschiedene, herkömmliche Puffer (MES, HEPES, TFA) umfaßten, wobei die Konzentration in den fünf Puffern jeweils 100 mM betrug, wurde folgendes zugesetzt: Natriumchlorid (150 mM), BSA (1% ), Magnesiumchlorid (2 mM), Zinkchlorid (0,2 mM) und Natriumazid (0,1 %). Anschließend wurde 6N HCl verwendet, um den pH wie folgt einzustellen:
K₂HPO₄/KH₂PO₄: 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5
HEPES/Natriumphytat: 7,0, 7,5, 8,0
MES: 5,5, 6,0, 6,5
HEPES: 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 und
TEA: 7,6.
3. Assay-Verfahren
Unter Verwendung der oben beschriebenen Puffer wurden 1 μg/ml Lösungen aus der ALP-AFP-Verbindung mit einer hohen Konzentration, wie in 1 oben hergestellt, bereitet. Anschließend wurde der unter Punkt C in Beispiel 2 beschriebene Hitzebelastungstest durchgeführt. Die Aktivitäten der Verbindung wurden gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabellen 4 und 5 gezeigt.
Tabelle 5
Wie aus den Tabellen 4 und 5 ersichtlich, wurde die Stabilität des Enzyms oder des Enzym-markierten Antikörpers in den die stabilisierenden Mittel enthaltenden zwei Puffern bei jedem pH von 5,5 bis einschließlich 8,5 erhöht. Diese Effekte waren besonders ausgeprägt in dem pH-Bereich von 5,5 bis 7,5.
Im Gegensatz dazu konnte die Stabilitätsverbesserung in den Puffern, die keine Stabilisierungsmittel enthielten, nicht bei jedem pH beobachtet werden.
Beispiel 5:
Wirkungen variierender Konzentrationen der Stabilisierungsmittel, Natriumphytat und eines Phosphats auf eine ALP-AFP-Verbindung:
1. Herstellung einer ALP-AFP-Verbindung
Eine ALP-AFP-Verbindung wurde in ähnlicher Weise wie unter Punkt A in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
2. Herstellung von Puffern
3 verschiedene Puffer sind in Tabelle 4 gezeigt:

1) ein Tris-Puffer, hergestellt aus 130 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% BSA, 2 mM MgCl, 0,2 mM Zinkchlorid, 0,1% Natriumazid.
2) Tris/Natriumphytat-Puffer, erhalten durch Zugabe eines Stabilisierungsmittels Natriumphytat in den Mengen von 1, 2,5, 5,0, 10,0 oder 40,0 mM zu einem Tris-Puffer.
3) KH₂PO₄/K₂HPO₄ -Puffer, enthaltend 10 mM bis 250 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄, 150 mM NaCl, 1% BSA, 2 mM MgCl, 0,2 mM Zinkchlorid, 0,1% Natriumazid. Alle wurden auf einen pH von 7,4 eingestellt.

3. Assay-Verfahren
Unter Verwendung der oben beschriebenen 11 verschiedenen Puff er wurde die ALP-AFP-Verbindung mit hoher Konzentration verdünnt, um Lösungen der Verbindung mit einer Konzentration von 1 μg/ml von ALP-AFP herzustellen. Die Verbindung wurde einem Hitzebelastungstest (37°C, 2 Wochen) unterworfen. Vergleichsgruppen wurden bei –80°C aufbewahrt. Nach Beendigung des Hitzebelastungstests wurden die Restaktivitäten wie in Beispiel 2 gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
Sowohl das Natriumphytat als auch das Phosphat wurden bei sämtlichen getesteten pH-Werten als wirksam befunden.
Beispiel 6:
Wirkungen von Stabilisierungsmitteln auf die Stabilität einer ALP-AFP-Verbindung bei Raumtemperatur:
1. Herstellung einer ALP-AFP-Verbindung
Eine ALP-AFP-Verbindung wurde in ähnlicher Weise wie unter Punkt A in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
2. Herstellung von Puffern
3 verschiedene Puffer wurden hergestellt: 130 mM Tris-Puffer (150 mM Tris, 1% BSA, 2 mM MgCl, 0,2 mM Zinkchlorid, 0,1% Natriumazid) kombiniert mit Stabilisatoren (10,0 mM Natriumphytat, KH₂PO₄/K₂HPO₄), und ohne Zusatz von Stabilisatoren (Vergleich). Sie wurden sämtlich auf einen pH von 7,0 eingestellt.
3. Assay-Verfahren
Unter Verwendung der oben beschriebenen 3 verschiedenen Puffer wurde die in Punkt 1 hergestellte ALP-AFP-Verbindung hoher Konzentration verdünnt, um Lösungen der Verbindung herzustellen, wobei jede eine Konzentration von 1 μg/ml an ALP-AFP aufwies. Die 3 Lösungen der Verbindung wurden bei Raumtemperatur (25°C) stehengelassen. Jede Woche wurde aus den Lösungen eine Probe entnommen, wobei mit Woche 0 begonnen wurde, und die Restaktivitäten wurden in einer ähnlichen Weise, wie unter Punlct C im Beispiel 2 beschrieben, bestimmt.
Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Wie sich aus 1 entnehmen läßt, verbesserte die Verwendung von Natriumphytat oder KH₂PO₄ die Stabilität bei Raumtemperatur.
Beispiel 7:
Wirkungen von Stabilisatoren auf die Stabilität einer ALP-AFP-Verbindung bei verschiedenen Temperaturen
1. Herstellung einer ALP-AFP-Verbindung
Eine ALP-RFP-Verbindung wurde in ähnlicher Weise wie unter Punkt A in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
2. Herstellung von Puffern
Puffer wurden in ähnlicher Weise, wie unter Punkt 2 in Beispiel 6 beschrieben, hergestellt.
3. Assay-Verfahren
Unter Verwendung der oben beschriebenen 3 verschiedenen Puffer wurde die in Punkt 1 oben hergestellte ALP-AFP-Verbindung hoher Konzentration verdünnt, um Lösungen der Verbindung herzustellen, welche jeweils eine Konzentration von 1 μg/ml an ALP-AFP aufwiesen. Die Lösungen wurden 10 Minuten lang bei 10°C, 20°C, 25°C, 30°C und 40°C stehengelassen. 50 μl jeder Lösung wurden entnommen und die Restaktivitäten wurden in ähnlicher Weise, wie unter Punkt C in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Wie sich aus 2 entnehmen läßt, wurden, nachdem die erf indungsgemäß verwendeten Stabilisierungsmittel zugesetzt worden waren, die Beständigkeit gegenüber Hitze im Vergleich zu Fällen, in denen die Stabilisierungsmittel den das Enzym enthaltenden Puffern nicht zugesetzt wurden, verbessert.

Claims

Enzymatische Lösung umfassend alkalische Phosphatase oder ein Derivat davon und eine Verbindung, die gegenüber der alkalischen Phosphatase eine reversible Bindungsaktivität aufweist, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphorsäureester, einem Alkalimetallsalz von Phosphorsäure oder einem Phosphorsäureester und einem Gemisch davon.
Enzymatische Lösung nach Anspruch 1, worin die alkalische Phosphatase oder das Derivat davon eine alkalische Phosphatase oder eine Verbindung von alkalischer Phosphatase und einem Antigen, Antikörper, Avidin, Peptid, Hapten, Coenzym, Zucker oder einer Nukleinsäure ist.