CN112680502A - 一种碱性磷酸酶质控物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及质控技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶质控物及其制备方法。该碱性磷酸酶质控物的原辅料包含：碱性磷酸酶40～6000U/L、缓冲液10～200mmol/L、稳定剂1wt％～15wt％、防腐剂0.01wt％～1wt％、氯化锰1～1000mg/L、基质余量。本发明除常规的糖类/醇类/氨基酸类稳定剂外，添加活性稳定剂氯化锰，可使碱性磷酸酶产品液态下稳定时间长。
Description
技术领域
本发明涉及质控技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶质控物及其制备方法。
背景技术
碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)是一种广泛存在于各种生物体内，参加细胞磷代谢的重要酶类。碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。碱性磷酸酶在碱性环境有最大活力，对来源于细菌中的ALP来说，其最适pH是8.0，而对来源于牛的ALP则是8.5。在医学上，血清中ALP的检测是骨骼、肝脏等多种器官病变的重要诊断指标。
目前已知人类ALP同工酶包括：
①组织非特异ALP，来源于肝脏、肾脏、骨及其它脏器和组织，其中骨型ALP是成骨细胞的一种细胞外酶，能被释放到血液循环中，在机体的生理功能主要是在成骨过程中水解磷酸酯，为羟磷灰石的沉积提供必需的磷酸，同时水解焦磷酸盐，解除其对骨盐形成的抑制作用，有利于成骨过程。
②肠型ALP：又分胎儿ALP和成人ALP，由肠黏膜上皮微绒毛、肾近曲小管远侧端和子宫分泌，胎儿ALP又称笠原同工酶，它作为肿瘤标志物，出现于肝癌及其它器官发生肿瘤的病人血清中。
③胎盘型ALP：又分早期ALP和末期ALP两种形式，主要由孕8周后的胎盘合胞体滋养层细胞微绒毛分泌，肺脏、卵巢、子宫、胃肠道及其它脏器也分泌少量的ALP，ALP在人体的生理功能主要是参与细胞膜对物质的主动运输及钙、磷代谢，提供胎儿生长发育所需营养，对胎儿的生长发育起着重要作用，动态观察胎盘型碱性磷酸酶活性可作为妊娠的一项指标。
④类ALP：又称Nagao同工酶，本质是精原细胞ALP，是一种肿瘤标记物，出现于多种癌症中，如精原细胞瘤、卵巢癌等。现在认为，人类ALP的同工酶至少来源于4种不同的基因：PLAP基因、类PLAP基因、IAP基因和TNAP基因，其中TNAP基因表达后经过不同的修饰形成肝脏、肾脏、骨等次级同工酶，PLAP基因也被认为是类PLAP基因复制与突变的产物。
在医学上，碱性磷酸酶是重要且常见的检测指标，主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断。为保证检验质量，提高检验水平，临床检验需要进行内部质量质控，临床检验中可采用商品化的对照血清、质控物作为其质量控制的对照物，监测本实验室常规工作的精密度及检测其准确度的改变，以提高本实验室常规工作中标本检测的一致性。因此，质控品通常需要在较长的时间内保持稳定。
碱性磷酸酶质控物获取容易，且原料获得渠道多样；但是，对于临床实验室常用的质控品，厂家多数声明ALP活性在4℃放置稳定期间会增强，可能导致室内质控失控，增加工作量。目前，含有碱性磷酸酶且能够在重构后或使用过程中保持稳定、活性不增加的产品仍很难获得。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种碱性磷酸酶质控物及其制备方法。该发明方法简易，能够保持所制备的包含碱性磷酸酶产品在重构或使用过程中保持稳定，活性不增加。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种碱性磷酸酶质控物，原辅料包含：
作为优选，原辅料包含：
优选地，原辅料包含：
在本发明提供的具体实施例中，原辅料包含：
在本发明提供的另一具体实施例中，原辅料包含：
在本发明中，碱性磷酸酶为人源碱性磷酸酶或动物源碱性磷酸酶。
作为优选，动物源碱性磷酸酶包括但不限于牛碱性磷酸酶。
作为优选，稳定剂为糖类稳定剂、醇类稳定剂、氨基酸类稳定剂中的一种或几种。
作为优选，糖类稳定剂包括但不限于海藻糖、蔗糖、半乳、果糖、乳糖、葡萄糖；
作为优选，醇类稳定剂不限于甘露醇、季戊四醇；
作为优选，氨基酸类稳定剂包括但不限于白蛋白、BSA、酪蛋白。
作为优选，缓冲液为Tris缓冲液、GOODS缓冲液、磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液，缓冲液的pH值为6.8～9。
优选地，缓冲液的pH值为7.4。
作为优选，防腐剂包括但不限于叠氮钠、proclin系列防腐剂。
作为优选，基质为血清或水。
优选地，基质为人血清。
本发明还提供了该碱性磷酸酶质控物的制备方法，包括如下步骤：
将缓冲液、稳定剂、防腐剂、氯化锰与基质混合，加入碱性磷酸酶，得到碱性磷酸酶质控液；
将碱性磷酸酶质控液冷冻干燥，得到碱性磷酸酶质控物。
本发明提供了一种碱性磷酸酶质控物及其制备方法。该碱性磷酸酶质控物的原辅料包含：碱性磷酸酶40～6000U/L、缓冲液10～200mmol/L、稳定剂1wt％～15wt％、防腐剂0.01wt％～1wt％、氯化锰1～1000mg/L、基质余量。本发明具有的技术效果为：
除常规的糖类/醇类/氨基酸类稳定剂外，添加活性稳定剂氯化锰，可使碱性磷酸酶产品液态下稳定时间长；
该发明碱性磷酸酶质控物组分简单，制备方法简易，能够保持所制备的包含碱性磷酸酶产品在重构或使用过程中保持稳定，活性不增加，并能够长期保存。
具体实施方式
本发明公开了一种碱性磷酸酶质控物及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，碱性磷酸酶优先选用人源酶，但从传染性、难易程度及成本等方面的考虑可选用动物来源，如来自小牛肠提取、或者是微生物提取以及其他方法获得的碱性磷酸酶，可以是商品化的或者实验室自制。
基质采用商品化的正常人血清、或者混合人血清。
本发明中的冷冻干燥技术是常用的技术，能够提高本产品的稳定性并保持其长期稳定性。
本发明碱性磷酸酶质控物及其制备方法中所用原料或辅料均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：碱性磷酸酶质控物的制备
一、配方：
二、制备方法：
第1步：制备基质液：在人血清中加入50mmol/L HEPES缓冲液(pH7.4)、5％海藻糖、0.2％叠氮化钠，搅拌均匀使其完全溶解；
第2步：加入活性稳定剂氯化锰10mg/L，搅拌使其完全溶解；
第3步：加入碱性磷酸酶，添加不同的浓度(100、200、325U/L)；
第4步：将配制好的碱性磷酸酶产品进行分装冻干；
第5步：放置于2～8℃保存。
三、稳定性验证
将产品复溶后，检测碱性磷酸酶的活性，使用美康生物康生物科技股份有限公司的碱性磷酸酶检测试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法)进行检测。
稳定性验证数据如下：
表1稳定性验证数据
| 水平(U/L) | 4℃0周 | 4℃1周 | 4℃2周 | 4℃3周 | 4℃4周 |
| Q1 | 100.2 | 102.0 | 98.2 | 101.2 | 100.2 |
| Q2 | 201.5 | 210.5 | 201.5 | 194.6 | 207.4 |
| Q3 | 325.4 | 332.2 | 319.2 | 328.2 | 322.7 |
上述数据显示，碱性磷酸酶产品复溶后2-8℃放置4周，其活性没有上升。
实施例2：碱性磷酸酶质控物的制备
一、配方：
二、制备方法：
第1步：制备基质液：在3％BSA溶液中加入8％蔗糖、0.1mol/LTris缓冲液(pH7.4)、0.2％Proclin 300，搅拌均匀使其完全溶解；
第2步：加入活性稳定剂氯化锰20mg/L，搅拌使其完全溶解；
第3步：加入碱性磷酸酶，添加不同的浓度(100、150、400U/L)；
第4步：将配制好的碱性磷酸酶产品进行分装冷冻干燥；
第5步：放置于2～8℃保存。
三、稳定性验证
将产品复溶后，检测碱性磷酸酶的活性，使用美康生物康生物科技股份有限公司的碱性磷酸酶检测试剂盒(NPP底物-AMP缓冲液法)进行检测。
稳定性验证数据如下：
表2稳定性验证数据
| 水平(U/L) | 4℃0周 | 4℃1周 | 4℃2周 | 4℃3周 | 4℃4周 |
| Q1 | 89.2 | 92.0 | 88.4 | 91.0 | 90.5 |
| Q2 | 151.5 | 152.5 | 160.7 | 153.2 | 145.8 |
| Q3 | 400.4 | 400.7 | 397.7 | 404.0 | 402.5 |
上述数据显示，碱性磷酸酶产品复溶后2-8℃放置4周，其活性没有上升。
实施例3：实施例1配方与公开专利配方的效果比较
实施例1配方：人血清包含50mmol/LHEPES(pH7.4)、5％海藻糖、0.2％叠氮化钠及10mg/L氯化锰；碱性磷酸酶100、200、400U/L；
对比例1(CN102115737B实施例1)配方：50mM Tris(pH7.4)包含1％的BSA、1mM氯化镁、0.05％Proclin 300；分别投入碱性磷酸酶至100U/L、200U/L、400U/L。
对比例2(CN1522298A实施例5)配方：40mM BES-NaOH溶液中包含5％半乳糖、1％的BSA、3％的葡聚糖、0.5mM氯化镁、10uM氯化锌；分别投入碱性磷酸酶至100U/L、200U/L、400U/L。
对比例3配方：与实施例1配方相比，不添加氯化锰。
将上述质控品分别放置在4℃及37℃考核，评价其稳定性。
对比验证数据如下：
表3稳定性对比数据
数据分析发现：
对比例1中使用缓冲液为基质，4℃放置过程中，碱性磷酸酶的活性4℃14天的升幅明显；
对比例2中使用缓冲液为基质，4℃放置过程中，碱性磷酸酶的活性4℃14天的升幅仍在10％以内，存在缓慢的上升情况；
对比例3中使用人血清为基质，4℃放置过程中，碱性磷酸酶的活性4℃14天的升幅明显。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种碱性磷酸酶质控物，其特征在于，原辅料包含：
2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，原辅料包含：
3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，原辅料包含：
4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，所述碱性磷酸酶为人源碱性磷酸酶或动物源碱性磷酸酶。
5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，所述稳定剂为糖类稳定剂、醇类稳定剂、氨基酸类稳定剂中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，所述糖类稳定剂包括但不限于海藻糖、蔗糖、半乳、果糖、乳糖、葡萄糖；
醇类稳定剂不限于甘露醇、季戊四醇；
氨基酸类稳定剂包括但不限于白蛋白、BSA、酪蛋白。
7.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，所述缓冲液为Tris缓冲液、GOODS缓冲液、磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液，缓冲液的pH值为6.8～9。
8.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，所述防腐剂包括但不限于叠氮钠、proclin系列防腐剂。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的碱性磷酸酶质控物，其特征在于，所述基质为血清或水。
10.权利要求1至9中任一项所述碱性磷酸酶质控物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将缓冲液、稳定剂、防腐剂、氯化锰与基质混合，加入碱性磷酸酶，得到碱性磷酸酶质控液；
将碱性磷酸酶质控液冷冻干燥，得到碱性磷酸酶质控物。
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