DE602005000249T2 - Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben - Google Patents

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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Description

  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben, vor allem aus Blutproben. Diese Verfahren eignen sich zur Probenvorbereitung biologischer Proben für auf Nukleinsäure beruhende oder immundiagnostische Verfahren zum Nachweis von Bakterien. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso die Verwendung spezifischer Antikörper bei Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben sowie Kits zur Ausführung dieser Verfahren.
  • Stand der Technik
  • Bei der Bestimmung und Isolierung von in biologischen Proben vorhandenen Bakterien handelt es sich um eine übliche Aufgabe bei biotechnologischen Anwendungen. So spielt beispielsweise bei medizinischen Anwendungen die Charakterisierung von in aus Mensch oder Tier gewonnenen biologischen Proben vorhandenen Bakterien eine wichtige Rolle bei der Diagnose von Infektionskrankheiten. So stellt die Septikämie nach wie vor ein Hauptproblem in der Intensivpflege dar, und zwar mit einer hohen Sterbeziffer sowie enormen Kosten für das Gesundheitssystem. Heutzutage werden in den meisten Fällen für die Sepsisdiagnose Blutkulturverfahren verwendet (Weinstein, M.P., et al., Clin. Infect. Dis. 24 (1997) 584-602), was den spezifischen Nachweis von Bakterien in solchen Proben gestattet. Allerdings sind derartige Verfahren sehr zeitaufwendig und erlauben sehr häufig keine rechtzeitige Versorgung des Patienten mit der angemessenen Therapie. Alternative Verfahren gestatten die Diagnose von Bakterien, indem spezifische Proteine und/oder Nukleinsäuresequenzen dieser Organismen nachgewiesen werden. Dabei werden vor allem Nukleinsäurenachweisverfahren angesichts des auf diesem Gebiet während der letzten Jahre gemachten Fortschritts immer wichtiger. Durch die Nukleinsäureamplifikationsverfahren, vor allem die Polymerasekettenreaktion wird ein sehr spezifischer, empfindlicher und schneller Nachweis von in einer Probe vorhandenen Nukleinsäuresequenzen gestattet und damit eine Alternative zu gegenwärtigen Kulturtests zur Diagnose von Infektionskrankheiten, wie etwa Sepsis, zur Verfügung gestellt (Martineau, F., et al., J. Clin. Microbiol. 36 (1998) 618-623; Reischl, U., et al., J. Clin. Microbiol. 38 (2000) 2429-2433; Rantakokko-Jalava, K. und Jalava, J., J. Clin. Microbiol. 40 (2002) 4211-4217).
  • Allerdings ist bei derartigen Nachweisverfahren häufig die Vorbereitung einer Probe vor dem Nachweis der spezifischen Proteine und/oder Nukleinsäuren erforderlich.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung verbesserter Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben. Solche Verfahren können bei der Probenvorbereitung in diagnostischen Verfahren zum Nachweis von Bakterien und biologischen Proben, vor allen in Blutproben, eingesetzt werden.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Die Hauptaufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus einer biologischen Probe unter Verwendung spezifischer Antikörper für in der Probe enthaltene eukaryontische Zellen, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus einer biologischen Probe, bei dem man in den folgenden Schritten
    • – spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen bindende Antikörper bereitstellt, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und
    • – die Antikörper und die biologische Probe mischt und
    • – die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von dem Gemisch trennt.
  • Dabei ist es wichtig, Antikörper, denen bakterienbindende Fc-Termini fehlen, bei solchen Verfahren zu verwenden, denn diese Antikörper binden zumindest nicht an diejenigen Bakterien, die anschließend nachgewiesen werden sollen. Der Fc-Terminus von üblicherweise in biotechnologischen Anwendungen eingesetzten Antikörpern ist meistens in der Lage, an fast alle Bakterien über Immunglobulin bindende Proteine, wie etwa Protein A, Protein G und Protein L, zu binden (Navarre, W.W. und Schneewind, O., Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63 (1999) 174-229; Reeves, H.C., et al., Anal. Biochem. 115 (1981) 194-196); Nilson, B., et al., J. Immunol. Methods 99 (1987) 39-45); Åkerström, B., et al., J. Biol. Chem. 264 (1989) 19740-19746). Allerdings führt die Verwendung solcher Antikörper in einem wie oben beschriebenen Isolierungsverfahren nicht nur zur Verarmung an eukaryontischen Zellen, sondern auch zur Verarmung an Bakterien in der Probe. Dies würde notwendigerweise zu einer Unterschätzung der Bakterienlast in der Probe oder im schlimmsten Fall zu falschnegativen Ergebnissen in den nachfolgenden Verfahren zum Nachweis bakterieller Nukleinsäuren oder Proteine führen. Daher ist es sehr wichtig, Antikörper zu verwenden, denen bakterienbindende Fc-Termini fehlen. Für diesen Zweck sind vor allem tetramere Antikörper (US 2003/0092078), Fab-Fragmente sowie Antikörper mit einem maskierten Fc-Terminus geeignet.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Extraktion von Nukleinsäure und/oder Proteinen aus der biologischen Probe nach Verarmung der Probe an eukaryontischen Zellen. Das aus der Probe stammende extrahierte Protein bzw. die aus der der Probe stammenden extrahierten Nukleinsäuren können anschließend in Verfahren zum Nachweis bakterienspezi fischer Proteine und/oder Nukleinsäuren eingesetzt werden.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben durch Verarmung der Proben an darin vorhandenen eukaryontischen Zellen.
  • An eukaryontischen Zellen verarmte Proben weisen einige vorteilhafte Eigenschaften, beispielsweise beim Nachweis von Bakterien unter Verwendung immundiagnostischer oder Nukleinsäurenachweisverfahren, auf. Der normalerweise in einer biologischen Probe, vor allem in Blutproben, vorliegende Spiegel eukaryontischer Proteine und Nukleinsäuren ist nämlich verglichen mit dem Spiegel bakterieller Nukleinsäuren und Proteine sehr hoch. Dadurch könnte der Nachweis bakterieller Nukleinsäuren und/oder Proteine in solchen Proben gestört werden. Dies ist von besonderer Bedeutung bei der Extraktion von Gesamtnukleinsäuren und/oder -proteinen aus diesen Proben vor dem Nachweis spezifischer Nukleinsäuren und/oder Proteine.
  • Dies läßt sich anhand des Nachweises bakterieller Nukleinsäuren in solchen Proben unter Verwendung des PCR-Verfahrens beispielhaft darstellen. Die PCR gestattet die Amplifikation und den Nachweis von theoretisch einem einzigen in einer Probe vorhandenen Ziel (allerdings ist in der Praxis diese Empfindlichkeit nur sehr schwer zu erzielen). Neben der Optimierung von Primer und Sonde wird die Empfindlichkeit eines PCR-Tests durch das Verhältnis von Ziel-DNA zu Hintergrund-DNA stark beeinflußt. Dabei ist allgemein bekannt, daß mit zunehmender Menge an Hintergrund-DNA die Empfindlichkeit eines PCR-Tests für die Ziel-DNA vermindert werden kann.
  • In Proben aus Mensch oder Tier stammen die meisten Nukleinsäuren aus in diesen Proben vorhandenen eukaryontischen Blutzellen und nicht aus den nachzuweisenden Bakterien. Das Verhältnis bakterieller Nukleinsäuren gegenüber menschlichen Nukleinsäuren läßt sich leicht berechnen. 1 ml Vollblut aus einem gesunden menschlichen Spender enthält zwischen 3 × 106 und 10 × 106 Leukozyten. Bei Sepsispatienten sind die Leukozytenspiegel um bis zu 30 × 106/ml erhöht. Es darf angenommen werden, daß ein "typischer" Sepsispatient einen Leukozytengehalt von 10 × 106/ml sowie eine Bakterienlast von 100/ml aufweist. Unter Berücksichtigung der Tatsache, daß die Größe des menschlichen Genoms im Bereich von 3 × 109 Basenpaaren (haploid; diploid: 6 × 109 Basenpaaren) pro Leukozyt sowie die Größe des Bakteriengenoms im Bereich von 6 × 106 Basenpaaren liegt, erhält man daraus ein Verhältnis von bakterieller Ziel-DNA zu menschlicher Hintergrund-DNA von 1:108.
  • Eine übliche Maßnahme zur Überwindung des Problems der Hemmung durch Hintergrundnukleinsäuren besteht in der Verwendung interner Kontrollen während der Amplifikation und in der Verdünnung gehemmter Proben in anschließenden PCR-Läufen. Allerdings führt die Verdünnung von Proben normalerweise zu einem Empfindlichkeitsverlust, was vermieden werden sollte. Ebenso sind zusätzliche Verdünnungsschritte und PCR-Amplifikationsreaktionen bei diagnostischen Standardverfahren nicht bevorzugt. Sollen Bakterien in einer typischen, aus einem Patienten stammenden Blutprobe nachgewiesen werden, so wäre daher die Überwindung des Problems, das nämlich die meisten der gesamten, aus diesen Proben extrahierten Nukleinsäuren aus dem Spender stammen, vorteilhaft. Darüber hinaus ist es vor allem im Hinblick auf Proben aus Sepsispatienten nicht möglich, großvolumige Proben zu erhalten, mit denen Empfindlichkeitsprobleme bei Nukleinsäurenachweisverfahren umgangen werden könnten.
  • Durch die vorliegende Erfindung wird eine Lösung dieses Problems bereitgestellt, indem die selektive Abreicherung eukaryontischer Zellen aus der Probe gestattet wird. Diese Probe enthält keine hohen Konzentrationen an Spendernukleinsäuren und läßt sich zur Präparation von Nukleinsäuren aus dem Krankheitserreger, vor allem aus den in der Probe vorhandenen Bakterien, verwenden.
  • Zwar wird in diesem Beispiel vor allem das Problem beim Nachweis von Nukleinsäuren dargestellt, doch sollte angemerkt werden, daß es ähnliche Probleme beim Nachweis bakterieller Proteine gibt. Bei derartigen Verfahren können Proteine aus dem Spender beträchtliche Störungen hervorrufen. Darüber hinaus können solche Verfahren auch zur Verbesserung von Verfahren zum Nachweis anderer Krankheitserreger, wie beispielsweise Viren, verwendet werden.
  • Die biologische Probe kann aus einem Menschen, einem Tier oder anderswo aus der Natur gewonnen werden. Dabei sind als Proben Blut, Serum, Plasma, Knochenmark, Gewebe, Speichel, pleurale und peritoneale Ergüsse und Suspensionen, Urin, Sperma und Stuhl bevorzugt.
  • Bakterien können sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auf alle bekannten Bakterien, vor allem auf Bakterien, die an Krankheitszuständen, beispielsweise Infektionskrankheiten, beteiligt sind, beziehen.
  • Von besonderem Interesse sind an Sepsis beteiligte Bakterien, wie etwa Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Enterococcus spp, Enterobacter spp, Klebsiella spp, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas spp, Haemophilus influenzae und andere. Die vorliegende Erfindung gestattet den Nachweis mehrerer an derartigen Krankheiten beteiligter Bakterien durch Ausführung lediglich eines Isolierungsverfahrens, bei dem man eukaryontische Zellen aus der Probe abreichert, Proteine und/oder Nukleinsäuren extrahiert und anschließend für eines oder mehrere der beteiligten Bakterien spezifische Nukleinsäuren und/oder Proteine nachweist. Derartige Multiplexnachweisverfahren sind mit den im Fachgebiet bekannten Probenvorbereitungsverfahren schwer auszuführen.
  • Sehr häufig ist es nicht notwendig, alle in einer biologischen Probe vorhandenen eukaryontischen Zellen abzureichern, um die gewünschte Wirkung zu erzielen. Beispielsweise kann es bei immundiagnostischen Verfahren ausreichen, bestimmte eukaryontische Zellen mit einer größeren Kreuzreaktivität bei Verwendung eines bestimmten Antikörpers abzureichern oder den Gehalt an eukaryontischen Proteinen durch Abreichern der am häufigsten vorkommenden Zellen zu verringern. Bei Nukleinsäurenachweisverfahren reicht es in den meisten Fällen aus, kernhaltige eukaryontische Zellen, die eine genomische DNA besitzen, abzureichern. Die Abreicherung von Erythrozyten ist in den meisten Fällen nicht notwendig, da diese Zellen keine genomische DNA besitzen und in diesen Zellen enthaltene Inhibitoren sich leicht während des anschließenden Probevorbereitungsverfahrens wegwaschen lassen. Ebenso ist es vor allem bei der Ausführung von Nukleinsäureamplifikationsverfahren in erster Linie gewünscht, den relativen Gehalt an bakteriellen Nukleinsäuren gegenüber eukaryontischer genomischer DNA signifikant zu erhöhen. Daher reicht die Abreicherung des größten Teils dieser Zellen aus, doch ist es nicht notwendig, daß die verarmte biologische Probe frei von allen eukaryontischen Zellen ist.
  • Die im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper müssen zwei wesentliche Eigenschaften erfüllen. Erstens binden sie an eukaryontische Zellen, die aus einer biologischen Probe abgereichert werden sollten, vorzugsweise über die spezifischen antigenbindenden Domänen dieser Antikörper. So sind dem Fachmann beispielsweise für Blutproben geeignete Antikörper be kannt, die spezifisch an Zelloberflächenantigene von Leukozyten, Erythrozyten, Monozyten binden (z. B. CD2/CD3 für T-Zellen, CD14 für Monozyten, CD15 für Granulozyten und Monozyten, CD16 für Makrophagen, CD36 für Blutplättchen, Monozyten und Makrophagen, CD45 für Leukozyten).
  • Zweitens fehlt den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus, oder der Fc-Terminus des Antikörpers ist blockiert (z. B. bei Verwendung tetramerer Antikörper). Antikörper mit Fc-Termini, die Bakterien binden, würden zu Komplexen aus eukaryontischer Zelle und Antikörper führen, die auch Bakterien enthalten. Dabei würde die Abtrennung der Komplexe aus der Probe unbeabsichtigterweise zu einer Probe führen, die auch an den Bakterien verarmt ist. Dies würde zu falsch-negativen Ergebnissen in nachfolgenden, an der Probe ausgeführten Bakteriennachweisverfahren führen. Vor allem die Fc-Termini von IgG-Antikörpern, die üblicherweise bei biotechnologischen Verfahren verwendet werden, binden Bakterien mit hoher Affinität.
  • Bei Antikörpern, die keine Bakterien an die Fc-Termini binden, und die sich in Verfahren der vorliegenden Erfindung verwenden lassen, handelt es sich beispielsweise um tetramere Antikörper oder Antikörperfragmente ohne den Fc-Teil, wie etwa durch Verdauung mit Papain oder Pepsin erzeugte Fab- oder F(ab')2-Fragmente, wobei es sich bei der Verdauung für den Fachmann um eine Vorgehensweise nach dem Stand der Technik handelt.
  • Soll jedoch nur eine Spezies von Mikroorganismen aus der biologischen Probe nachgewiesen werden, so können zur Abreicherung der eukaryontischen Zellen aus der Probe Antikörper vom IgM-Typ eingesetzt werden, da einige Mikroorganismen, wie etwa Staphylococcus aureus oder Streptococcus spp lediglich immunoglobulinbindende Proteine, wie etwa Protein A oder Protein G, die eine starke Bindung an den Fcγ-Teil der IgGs, jedoch (fast) keine Bindung an IgM zeigen, exprimieren, wohingegen andere Mikroorganismen, wie etwa Peptostreptococcus magnus, Protein L, das sowohl IgG als auch IgM stark bindet, exprimieren.
  • Daher stellt die Verwendung von Antikörpern vom IgM-Typ eine alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, da dieser Ansatz nicht universell wäre, sondern auf den Nachweis bestimmter Mikroorganismen, wie etwa Staphylococcus aureus und Streptococcus spp., beschränkt wäre.
  • Je nach den Eigenschaften der Antikörper lassen sich die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von der biologischen Probe mit im Fachgebiet bekannten Standardverfahren trennen.
  • Solche Komplexe können beispielsweise von der Probe unter Verwendung von zur Bindung der Antikörper fähigen Matrizes getrennt werden. Falls die Komplexe hinsichtlich ihrer Auftriebsdichte im Vergleich mit den Bakterien unterschiedlich sind, so können die Komplexe beispielsweise durch Dichtegradientenzentrifugation der Probe leicht abgetrennt werden. Bei der Verwendung quervernetzter Antikörper, wie etwa IgM oder tetramerer Antikörper, liegen sehr dichte Komplexe vor, die sich sehr leicht mittels eines einstufigen Dichtegradienten unter Verwendung von z. B. Fc-Zellen (ρ~1,080 g/ml)Zentrifugation, sehr leicht sedimentieren lassen. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Verwendung von direkt oder indirekt an eine Festphase, wie beispielsweise Magnetteilchen, gekoppelten Antikörpern. Die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle lassen sich dann sehr leicht durch Anlegen einer magnetischen Kraft abtrennen. Bei direkter Verknüpfung mit der Festphase werden die Antikörper über eine kovalente Bindung an die Festphase mit im Fachgebiet bekannten Techniken gekoppelt. Ebenso sind im Fachgebiet indirekte Verknüpfungen bekannt, beispielswei se Streptavidin-Biotin- und Antikörper-Antigen- (wie Digoxygenin-anti-Digoxygenin-Antikörper-)Paare.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden Bakterien nicht nur aus biologischen Proben unter Verwendung von für eukaryontische Zellen spezifischen Antikörpern, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, zur Abreicherung eukaryontischer Zellen aus den biologischen Proben isoliert, sondern ferner aus den behandelten Proben Nukleinsäuren und/oder Proteine extrahiert. Zu diesem Zweck lassen sich im Fachgebiet bekannte Standardextraktionsverfahren verwenden (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • So können Nukleinsäuren beispielsweise durch Lyse dieser Zellen, Verdauung mit Proteinase K, gegebenenfalls Durchführung einer Phenol/Chlorform-Extraktion und Ausfällen der Nukleinsäuren unter Verwendung von Aceton oder Propanol, wie im Fachgebiet allgemein bekannt (Sambrook et al., supra) präpariert werden. Allerdings können auch viele alternative Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise "Easy-to-use"-Extraktionskits, die kommerziell erhältlich sind und beispielsweise auf der Glas-Nukleinsäure-Bindungstechnik beruhen (z. B. MagNAPure®, vertrieben von der Firma Roche Diagnostics).
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Isolierung von Bakterien aus biologischen Proben durch Abreicherung eukaryontischer Zellen unter Verwendung von für eukaryontische Zellen spezifischen Antikörpern, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, Extraktion von Nukleinsäuren und/oder Proteinen aus den Proben sowie Nachweisen spezifischer bakterieller Nukleinsäuresequenzen und/oder Proteine in der Probe. Dabei sind geeignete Nachweisverfahren nicht auf bestimmte, im Fachgebiet bekannte Verfahren beschränkt (siehe z. B. Sambrook et al., supra).
  • Bakterienspezifische Nukleinsäuresequenzen lassen sich mit dem Fachmann bekannten Verfahren, beispielsweise mit Sondenhybridisierungsverfahren unter Verwendung von Southern-Blot-Techniken, nachweisen. Zu weiteren Nachweisverfahren zählen die Sequenzierung der nachzuweisenden Nukleinsäuresequenzen oder die Klonierung der gewünschten Nukleinsäuresequenzen in Plasmidvektoren. Eine Übersicht findet sich bei Sambrook et al., supra.
  • Falls die Zielnukleinsäure nur in sehr geringen Konzentrationen in der Probe vorliegt, kann der Nachweis mittels Amplifikationsverfahren ermöglicht werden. Geeignete Amplifikationsverfahren sind beispielsweise LCR (US-Patente Nr. 5,185,243, 5,679,524 und 5,573,907; EP 0 320 308 B1 ; WO 90/01069; WO 89/12696 und WO 89/09835), die "Cycling probe" (etwa: Sondenkreislauf)-Technologie (US-Patente Nr. 5,011,769, 5,403,711, 5,660,988 und 4,876,187 sowie veröffentlichte PCT-Anmeldungen WO 95/05480 und WO 95/00667), die "Invader TM"-Technologie (US-Patente Nr. 5,846,717; 5,614, 402; 5,719,028; 5,541,311 und 5,843,669), die Q-Beta-Replikase-Technologie (US-Patente Nr. 4,786,600), NASBA (US-Patent Nr. 5,409,818; EP-0 329 822), TMA (US-Patente Nr. 5,399,491, 5,888,779, 5,705,365, 5,710,029), SDA (US-Patente Nr. 5, 455,166 und 5,130,238) und PCR (US-A-4,683,202).
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Kits, die sich in den oben beschriebenen Verfahren einsetzen lasen.
  • Bevorzugte Kits zur Extraktion bakterieller Nukleinsäuren und/oder bakterieller Proteine aus einer biologischen Probe umfassen:
    • – in einem oder mehreren Behältern Antikörper, die spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen binden, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und
    • – in einem oder mehreren Behältern Mittel zur Extraktion von Nukleinsäuren und/oder Proteinen.
  • Bei Mitteln zur Extraktion von Nukleinsäuren und/oder Proteinen handelt es sich um Reagentien oder Vorrichtungen zur Extraktion von Nukleinsäuren oder Proteinen, wie etwa Proteinase K, (Nukleinsäure-)Bindungspuffer, (Nukleinsäure-)Waschpuffer, (Nukleinsäure-)Elutionspuffer, wobei, falls notwendig, auch andere Reagentien in diesen Kits enthalten sein können.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung richtete sich auf Kits, die auch Mittel zum Nachweis von Nukleinsäuren und/oder Proteinen enthalten. Solche Kits lassen sich ebenso zum Nachweis einsetzten. bei den Nachweismitteln kann es sich beispielsweise um einen für bakterielle Proteine spezifischen Antikörper handeln. Sollte es sich bei dem Ziel um bakterielle Nukleinsäuren handeln, so stellen bakterienspezifische Oligonukleotidsonden und geeignete Hybridisierungspuffer geeignete Mittel dar. Sollte die Zielnukleinsäure amplifiziert werden, so können die genannten Kits auch Amplifikationsmittel enthalten, beispielsweise Primer, Amplifikationspuffer, Sonden und/oder Amplifikationsenzyme.
  • Zur Vereinfachung des Nachweises könnten Nachweismittel, wie etwa Antikörper, Oligonukleotide, wie z. B. Primer und Sonden, gegebenenfalls markiert werden. Geeignete Markierungen sind im Fachgebiet bekannt.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele beispielhaft veranschaulicht:
  • Beispiele
  • Beispiel 1
  • Isolierung von Bakterien aus Blutproben durch Abreicherung von Leukozyten unter Verwendung von Dichtegradientenzentrifugation
  • Hintergrund des Ansatzes
  • Die Verwendung von Dichtegradientenmedien stellt einen in der klinischen Chemie üblichen Weg dar, um Blutzellen mittels Zentrifugation in unterschiedliche Populationen zu trennen. Am weitesten verbreitet ist dabei die Verwendung der Medien Percoll® und Ficoll®. Bei Percoll® handelt es sich um ein polydisperses kolloidales Siliciumdioxidsol im Bereich von 15 bis 30 nm, das mit nichtdialysierbarem Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschichtet ist. Im Handel erhältliches Percoll® (z. B. von Amersham) besteht aus etwa 23 Gew.-% Siliciumdioxidpartikeln, die eine Dichte von 1,130 ± 0,005 g/ml ergeben. Bei Ficoll-Paque Plus® von Amersham handelt es sich um eine wäßrige Lösung von 5,7 g Ficoll® 400 (einem synthetischen, hochmolekularem Polymer aus Saccarose und Epichlorhydrin) sowie 9,0 g Natriumdiatrizoat pro 100 ml, was eine Dichte von 1,077 ± 0,001 g/ml ergibt.
  • Im Prinzip werden für die Zelltrennung zwei Techniken verwendet: kontinuierliche und diskontinuierliche (stufenweise) Dichtegradienten. Bei einem kontinuierlichen Gradienten wird eine Suspension von Partikeln (z. B. Zellen) zentrifugiert, wobei die Zellen zu derjenigen Position des Gradienten sedimentieren, bei der die Dichte der Zellen und die Dichte des Gradienten im Gleichgewicht stehen (Auftriebsdichte der Zellen). Mit dieser Technik lassen sich selbst Zellen, die sich in ihrer Dichte nur um 0,01 g/ml unterscheiden, trennen. Bei der Verwendung diskontinuierlicher Gradienten sedimentieren Zellen an die Grenzfläche zwischen zwei unterschiedlich dichten Medien, wobei das obere Medium eine geringere und das untere Medium eine höhere Dichte als die sedimentierten Zellen aufweist.
  • Die Sedimentationsgeschwindigkeit v (hierbei handelt es sich um eine Geschwindigkeit) eines Partikels ergibt sich aus dem Stokes'schen Gesetz
    Figure 00140001
    • • daß die Sedimentationsgeschwindigkeit mit zunehmender Zentrifugalkraft (g) ansteigt.
    • • daß die Sedimentationsgeschwindigkeit zum Quadrat der Partikelgröße (d) proportional ist.
    • • daß die Sedimentationsgeschwindigkeit zum Unterschied zwischen der Dichte des Partikels (ρp) und der umgebenden Medien (pi) proportional ist, was bedeutet, daß die Sedimentationsgeschwindigkeit gleich null wird, wenn sich die Dichte des Partikels und der Medien im Gleichgewicht befinden.
    • • daß die Sedimentationsgeschwindigkeit mit zunehmender Viskosität der Medien (η) abnimmt.
  • Da die Ausbildung kontinuierlicher Percoll®-Gradienten zeitraubend ist und hohe g-Kräfte benötigt (20 000-35 000 g), wurden die unten beschriebenen Experimente mit diskontinuierlichen ein- oder zweistufigen Gradienten durchgeführt, wobei sich die Dichte der Medien durch Verdünnen des Percoll® mit isotonischer NaCl-Lösung ergibt.
  • In diesem Fall werden die Dichtestufen im Zentrifugenröhrchen einfach dadurch hergestellt, daß man ein Medium nach dem anderen durch Pipettieren übereinanderschichtet, wobei die Vollblutprobe, die die geringste Dichte aufweist, am oberen Ende des Röhrchens liegt.
  • Die folgende Tabelle zeigt die Auftriebsdichten unterschiedlicher Blutzellen sowie von E. coli, die einer technischen Anweisung von Amersham/Pharmacia zur Verwendung von Percoll® entnommen wurden. Tabelle 1:
    Figure 00150001
  • Aufgrund dieser Liste wurde angenommen, daß Bakterien eine Dichte aufweisen, die deutlich höher liegt als die Dichte weißer Blutzellen und daß daher Routinevorschriften, mit denen Lymphozyten und Monozyten (PBMCs) von Granulozyten und von Erythrozyten getrennt werden können, an die Trennung intakter Bakterien von weißen Blutzellen anpaßbar sein sollten.
  • Versuchsaufbau
  • In einem 15-ml-Falcon-Röhrchen wurde ein zweistufiger Percoll®-Gradient hergestellt, indem zunächst 4 ml einer 74%igen isotonischen Percoll®-Lösung (ρ~1,095 g/ml) in das Röhrchen pipettiert wurden, dieses Medium mit 4 ml einer 55%igen isotonischen Percoll®-Lösung (ρ~1,075 g/ml) überschichtet wurde und diese beiden Dichtemedien dann mit 4 ml mit Bakterien versetztem Vollblut überschichtet wurden.
  • Dieser die Probe enthaltende zweistufige Gradient wurde 20 Minuten bei 350 g und Raumtemperatur in einer Heraeus Variofuge 3.0 R mit Ausschwingrotor (Typ 05315) zentrifugiert, und die Menge an Blutzellen in den Fraktionen und/oder in den zwischen den Medien gebildeten zellulären Zwischenphasen wurde durch Messen von Portionen dieser Fraktionen im Beckman Coulter AcT Diff. bestimmt.
  • Die Menge an menschlicher genomischer DNA in den Fraktionen wurde durch Amplifizieren des β-Globin-Gens im LightCycler® 1.2 unter Verwendung von LightCycler-Control Kit® DNA, die Menge an bakterieller DNA (Staph. aureus und P. aeruginosa) unter Verwendung von Ein-Parameter-Tests der Firma Roche Diagnostics bestimmt.
  • Zu diesem Zweck wurden Portionen der Fraktionen am MagNA-Pure® nach den im Handbuch angegebenen Anweisungen prozessiert.
  • Die Wiedergewinnung menschlicher genomischer DNA und bakterieller DNA in den Fraktionen wurde berechnet, indem eine "unbehandelte" Portion der Blutprobe am MagNA-Pure® prozessiert und die Konzentration dieser nichtzentrifugierten Probe auf 100% gesetzt wurde.
  • Die Volumenverhältnisse zwischen den Zellfraktionen und dem ursprünglichen Probevolumen wurden bei der Berechnung der aus den zentrifugierten Proben gewonnenen Mengen berücksichtigt.
  • Modifikationen dieser Vorschrift, wie etwa Variation der g-Kräfte, Zentrifugationszeit und Änderungen der Dichte der Medien, sind unten erörtert.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Unter Verwendung des zweistufigen Gradienten, wie oben beschrieben (20 Minuten, 350 g), wird eine Vollblutprobe fast quantitativ in drei Fraktionen getrennt.
  • Bei der ersten Fraktion handelt es sich um eine kompakte weiße Zellschicht, die an der Grenzfläche zwischen dem "Plasma" und dem 55%igen Percoll® liegt und aus konzentrierten Blutplättchen sowie peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC = Lymphozyten und Monozyten) besteht.
  • Die zweite Fraktion besteht aus konzentrierten Granulozyten (polymorphe nukleäre Zellen), die an der Grenzfläche zwischen dem 55%igem und dem 74%igen Percoll® liegen, und bei der dritten Fraktion handelt es sich um ein rotes Sediment aus Erythrozyten am Boden des Röhrchens, da die roten Blutzellen eine etwas höhere Dichte als die 74%ige Percoll®-Lösung aufweisen. (In einigen Fällen ergaben die Erythrozyten ein wolkiges Sediment, das über das gesamte Volumen der 74%igen Percoll®-Fraktion verteilt war und durch Proben verursacht wurde, die geringere Mengen an Hämoglobin pro Erythrozyt und damit eine geringere Auftriebsdichte aufwiesen.)
  • Unter Annahme einer höheren Auftriebsdichte der Bakterien im Vergleich mit Blutzellen sollten die Bakterien zusammen mit den Erythrozyten auf dem Boden des Röhrchens sedimentieren und daher von den weißen Blutzellen getrennt werden.
  • Da Bakterien im Bereich von etwa 1 μm liegen, während Blutzellen im Bereich von etwa 10 μm liegen, und da die Sedimentationsgeschwindigkeit v vom Quadrat des Zelldurchmessers (d2) abhängt, sollten Bakterien im Vergleich zu Blutzellen bei mäßigen g-Kräften extrem langsam sedimentieren.
  • Modellberechnungen gemäß der Stokes-Gleichung ergaben Sedimentationszeiten von etwa sechs Stunden für die oben beschriebenen Zentrifugationsbedingungen, um die Bakterien am Boden des Röhrchens anzureichern, wobei dies nicht nur durch die kleine Partikelgröße, sondern gleichfalls durch den geringen Unterschied in der Dichte zwischen dem 74%igen Percoll® und den Bakterien hervorgerufen wird.
  • Daher wurde in einem weiteren Satz von Experimenten die Vorschrift an höhere g-Kräfte angepaßt, was zu höheren Sedimentationsgeschwindigkeiten führte, wobei dies durch das Phänomen eingeschränkt wird, daß nämlich bei zu hohen g-Kräften die Siliciumdioxidpartikel des Percoll® zu sedimentieren beginnen (einen kontinuierlichen Gradienten ausbilden) und das System "instabil" wird.
  • Eine Zentrifugation von bis zu zwei Stunden bei 2300 g war möglich, ohne daß dabei die Stufen des Dichtegradienten zerstört wurden und wobei die Blutzellen noch in die drei oben beschriebenen Fraktionen getrennt wurden.
  • Weiterhin wurde der zweistufige Gradient zu einem einstufigen Gradienten vereinfacht, der nur noch 4 ml Vollblut und 4 ml 74%iges Percoll® enthielt. In diesem Fall enthielt die Zellfraktion an der Grenzfläche Plasma/Percoll® alle Subpopulationen der weißen Blutzellen (und der Thrombozyten), wobei die roten Blutzellen am Boden des Röhrchens sedimentiert waren.
  • Der Vorteil dieses einstufigen Gradienten liegt darin, daß der Abstand der Bakterien zum Sediment am Boden des Röhrchens deutlich kürzer ist, so daß die Bakterien (in Kombination mit den höheren g-Kräften) in etwa einer Stunde auf den Boden des Röhrchens sedimentieren sollten.
  • Mit dieser optimierten Vorschrift wurde mit Bakterien versetztes Vollblut aus zehn verschiedenen Spendern zentrifugiert und analysiert.
  • Der Überstand, einschließlich der Zellfraktion an der Grenzfläche Plasma/Percoll®, enthielt etwa 90% der menschlichen genomischen DNA, was mit der entsprechenden Menge an Leukozyten, wie sie mit dem Coulter Counter festgestellt wurde, in Einklang stand.
  • Überraschenderweise wurden etwa 80% der Bakterien ebenfalls in dieser Fraktion und nicht, wie erwartet, in der 74%igen Percoll®-Phase gefunden (siehe Tabelle unten), was bedeutet, daß es nicht möglich ist, die weißen Blutzellen und die Bakterien in die beiden unterschiedlichen Phasen zu trennen.
  • Weiterhin gab es fast keinen Unterschied zwischen einer "soft-spin" (30 Minuten bei 350 g) und einer "hard spin" (100 Minuten bei 2300 g)-Zentrifugation, was darauf hindeutet, daß die Auftriebsdichte der Bakterien geringer sein muß als die Dichte der 74%igen Percoll®-Lösung (ρ = 1,095 g/ml).
  • Daher wurde in einem letzten Satz von Experimenten die Dichte der Percoll®-Lösung unter Verwendung von 65% bzw. 55% Percoll® herabgesetzt, um den Bakterien gemeinsam mit Erythrozyten das Eindringen in die Percoll®-Fraktion zu ermöglichen.
  • In diesem Fall wanderten die Granulozyten, bei denen es sich um die dichtesten weißen Blutzellen handelt, bereits in die Percoll®-Phase, wohingegen etwa 70% der Bakterien sowie alle Lymphozyten und Monozyten noch an der Zwischenphase/im Überstand verblieben.
  • Dies bedeutet, daß die Dichte des Percoll® immer noch höher ist als die Auftriebsdichte der meisten Bakterienzellen.
    Figure 00200001
  • Da diese Ergebnisse der ursprünglichen Annahme, daß Bakterien eine Auftriebsdichte von mehr als 1,10 g/ml aufweisen (wie in der technischen Anweisung von Amersham/Pharmacia zur Verwendung von Percoll® angegeben) eindeutig widersprachen, wurde eine eigene Literatursuche durchgeführt.
  • Von Bakken, L.R. und Olsen, R.A. (Appl. Environ. Microbiol. 45 (1983) 1188-1195) wurden Werte zwischen 1,035 g/ml und 1,093 g/ml für die Auftriebsdichten mehrerer Bakterien veröffentlicht. Dabei variieren jedoch für eine einzige Spezies (E. coli) die Werte für die Auftriebsdichte zwischen 1,05 g/ml und 1,10 g/ml (siehe z. B. Woldringh, C. L., et al., J. Bacteriol. 148 (1981) 58-63).
  • Der Unterschied in den angegebenen Werten ist teilweise auf die Verwendung unterschiedlicher Techniken/Medien zurückzuführen, was unterschiedliche osmotische Effekte und Unterschiede beim Eindringen von Salz in die Zellen verursacht, wodurch die Auftriebsdichte der Zellen beeinflußt wird.
  • Weiterhin wird in der Literatur angegeben, daß Wachstumsbedingungen die Auftriebsdichte von Bakterienzellen beeinflussen (siehe z. B. Martinez-Salas, E., et al., J. Bacteriol. 147 (1981) 97-100).
  • Schlußfolgerungen
  • Die Verwendung von Dichtegradientenmedien stellt einen in der klinischen Chemie üblichen Weg dar, um Blutzellen mittels Zentrifugation in unterschiedliche Populationen zu trennen. Aufgrund der relativ dichten Hämoglobinmoleküle in roten Blutzellen sedimentieren die Erythrozyten während der Zentrifugation auf dem Boden des Röhrchens. Da es sich bei den weißen Blutzellen vom morphologischen Gesichtspunkt aus um heterogene Klassen von Zellen handelt, liegt die Auftriebsdichte dieser Zellen im Bereich von 1,06 g/ml für mononukleäre Zellen (Lymphozyten und Monozyten) bis zu 1,09 g/ml für polymorphe nukleäre Zellen (Granulozyten).
  • Demzufolge lassen sich weiße Blutzellen in unterschiedliche Fraktionen je nach Dichte der für die Zentrifugation verwendeten Medien trennen.
  • Von Bakken und Olsen (1983, siehe oben) wurden für die Auftriebsdichte mehrerer Bakterien mit Percoll® Werte zwischen 1,035 und 1,093 g/ml veröffentlicht.
  • Nach den obigen Ergebnissen scheint die Auftriebsdichte mehrerer Bakterien (Experimente mit Staph, aureus und P. aeruginosa) im gleichen Bereich wie die Auftriebsdichte mononukleärer weißer Blutzellen (~1,06-1,07 g/ml) zu liegen. Demzufolge scheint die Trennung aller weißen Blutzellen und Bakterien in zwei unterschiedlich dichte Medien nicht möglich zu sein.
  • Bei Verwendung von 74% Percoll® (ρ~1,095 g/ml) dringen lediglich die Erythrozyten in das Percoll® ein, wobei die Bakterien zusammen mit den Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten im Überstand verbleiben.
  • Wird die Dichte des Percoll® auf ≤ 1,085 (= ≤ 65%) verringert, so sedimentieren die Granulozyten zusammen mit den Erythrozyten auf dem Boden des Röhrchens, wohingegen die Bakterien zusammen mit den mononukleären weißen Blutzellen immer noch im Überstand verbleiben.
  • Daher sollte ein Ansatz, bei dem die "weniger dichten" weißen Blutzellen mit den "dichteren" Erythrozyten copräzipitieren, mit einem anschließenden Zentrifugationsschritt unter Verwendung eines Mediums mit einer höheren Dichte als die Auftriebsdichte der Bakterien zur Trennung der Bakterienzellen von allen weißen Blutzellen führen. Dieser Ansatz ist in Beispiel 3 beschrieben.
  • Beispiel 2
  • Isolierung von Bakterien aus Blutproben unter Verwendung von Dynal®-Kügelchen
  • Hintergrund des Ansatzes
  • Die Abreicherung von Leukozyten (sowie Subpopulationen davon) durch immunologisches Einfangen ("Immunocapturing") stellt einen etablierten Weg zur Anreicherung seltener Zellen (z. B. Tumorzellen) aus Blutproben dar. Da unterschiedliche Arten von weißen Blutzellen unterschiedliche Arten von CD-Oberflächenantigenen exprimieren, werden Magnetkügelchengemische verwendet und die Leukozyten über magnetische Trennung abgereichert.
  • Versuchsaufbau
  • 1 ml Vollblut wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur mit 70 μl Dynabeads® M-450<CD45> (Dynal Prod.-Nr. 111.19) und/oder 70 μl Dynabeads M-450<CD15> (Dynal Prod.-Nr. 111.17) auf einem Rolleninkubator inkubiert. Da Lymphozyten vorwiegend CD45 auf der Zelloberfläche exprimieren, wohingegen Monozyten und Granulozyten vorwiegend CD15 exprimieren, wird ein Gemisch aus beiden Magnetkügelchen benötigt, um eine akzeptierbare Abreichungsrate für alle weißen Blutzellen zu erzielen. Nach der magnetischen Abtrennung der Kügelchen wurde die Abreicherungsrate im Überstand durch Messen der verbliebenen Blutzellen im Beckman Coulter AcT Diff. bestimmt. Anschließend wurde der Überstand mit lytischen Enzymen oder durch Zerschlagen mit Kügelchen am Ribolyzer unter Verwendung von "blue beads" verdaut und die Probe am MagNA Pure® gemäß der im Handbuch/Beipackzettel beschriebenen Vorschrift prozessiert.
  • Die Menge an menschlicher genomischer DNA im Eluat wurde durch Amplifizieren des β-Globin-Gens am Light-Cycler 1.2 (Roche Diagnostics) unter Verwendung der LightCycler-Control Kit DNA (Roche Kat-Nr. 2 158 833) und die Menge an bakterieller DNA unter Verwendung von Einzelparameter-Tests für Staph. aureus und P. aeruginosa quantifiziert.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Bei Verwendung eines Gemisches aus <CD45-> und <CD15-> Kügelchen, wie oben beschrieben, erhöhte sich die Abreicherungsrate für Leukozyten und die entsprechende menschliche genomische DNA auf 90%.
  • In der nachfolgenden Tabelle ist die Wiedergewinnung eines gram-positiven und eines gram-negativen Bakteriums im Überstand von versetztem Vollblut (100 Bakterien/PCR) nach immunologischem Einfangen der Leukozyten dargestellt.
  • Die Wiedergewinnung der bakteriellen DNA wurde berechnet, indem eine unbehandelte Blutprobenportion am MagNA Pure® prozessiert und die Konzentration der Probe auf 100% gesetzt wurde. Tabelle 3:
    Figure 00240001
  • Die Wiedergewinnungsrate für die Bakterien liegt im Bereich von 100%, wenn die versetzten Proben nur mit <CD15>-Kügelchen inkubiert werden. Bei Verwendung der gleichen Menge an <CD45>-Kügelchen bzw. Zugabe der <CD45>-Kügelchen zu den <CD15>-Kügelchen nimmt die Wiedergewinnung der Bakterien auf einen Wert im Bereich von etwa 40% ab, was bedeutet, daß neben den Leukozyten die Mehrzahl der Bakterien an die <CD45>-Kügelchen bindet.
  • Es konnte gezeigt werden, daß die Bindung der Bakterien an die <CD45>-Kügelchen nicht durch weiße Blutzellen vermittelt wird, indem das Experiment mit mit Bakterien versetztem Plasma als Probematerial wiederholt wurde.
  • Weiterhin ist es unwahrscheinlich, daß die Bakterien unspezifisch an die <CD45>-IgG-beschichteten Kügelchen binden, da durch die Zugabe unterschiedlicher Tenside (NP-40, Na-Laurylsarcosin, Zwittergent 3-12®) zu der Blutprobe in einem Konzentrationsbereich, bei dem die Leukozyten noch nicht lysiert werden (0,05% bis 0,5%), die unerwünschte Bindung der Bakterien an die Kügelchen nicht verringert wird.
  • Die wahrscheinlichste Erklärung liegt darin, daß die Bakterien über Immunglobulin bindende Proteine an den Fcγ-Teil des als Beschichtung auf den <CD45>-Kügelchen vorliegenden IgG binden. So exprimiert beispielsweise Staphylococcus aureus Protein A als Immunglobulin bindendes Protein auf der Zelloberfläche.
  • Dies würde erklären, warum fast keine Bindung der Bakterien an die <CD15>-Kügelchen stattfindet, da es sich bei den <CD15>-Ak auf diesen Kügelchen um ein IgM handelt und Protein A keine Affinität zu IgMs aufweist.
  • Schlußfolgerungen
  • Bei der Abreicherung von Leukozyten über <CD45>/<CD15>-Magnetkügelchen handelt es sich um ein etabliertes Werkzeug bei der Zelltrennung (z. B. Anreicherung von Tumorzellen).
  • Es stellte sich heraus, daß Bakterien an die <CD45>-Kügelchen binden, und zwar möglicherweise über auf der Zelloberfläche der Bakterien exprimierte Immunglobulin bindende Proteine für den als Beschichtung auf der Oberfläche der Kügelchen vorliegenden Maus-IgG-Antikörper. Bei Verwendung von <CD15>-Kügelchen, die einen Maus-IgM-Antikörper enthalten, wurde keine Bindung der Bakterien an die Kügelchen festgestellt.
  • Beispiel 3
  • Isolierung von Bakterien aus Blutproben durch Abreicherung von Leukozyten mittels tetramerer Antikörper und Zentrifugation
  • Hintergrund des Ansatzes
  • Die Firma Stemcell (Vancouver Kanada) bietet in ihrer Produktlinie RosetteSep® mehrere Antikörper-Cocktails für die Abreicherung von Blutzellen an. Diese Rosette-Sep®-Reagentien quervernetzen unerwünschte Zellen (z. B. Leukozyten) mit mehreren roten Blutzellen unter Bildung von Rosetten. Bei der Zentrifugation über einem Auftriebsdichtemedium wie etwa Ficoll® (ρ~1,080 g/ml) sedimentieren die unerwünschten, (als Rosetten vorliegenden) Zellen zusammen mit den freien RBCs (roten Blutzellen) (ρ~1,09-1,10 g/ml), ohne daß davon die gewünschten Zellen (z. B. Tumorzellen) berührt werden, die im Plasmaüberstand oder je nach den Zentrifugationsbedingungen an der Ficoll®/Plasma-Zwischenphase verbleiben.
  • Die tetrameren Antikörperkomplexe des Cocktails bestehen aus zwei Maus-IgG-Antikörpern, wobei der eine gegen Oberflächenantigene der Leukozyten (CDxx) und der andere gegen Glycophorin A als auf Erythrozyten exprimiertes Oberflächenantigen gerichtet ist, sowie zwei Maus-Fcγ-Ratte-IgM-Antikörpern, die eine Brücke zwischen den beiden Maus-Antikörpern über den Fcγ-Teil bilden, so daß ein tetramerer Komplex entsteht.
  • Diese Reagentien werden routinemäßig für die Abreicherung von Tumorzellen verwendet und ergeben (nach Herstellerangaben) eine Abreicherungsrate für die als Rosette vorliegenden Zellen im Bereich von zwei bis drei Größenordnungen bei einer Wiedergewinnungsrate der Tumorzellen von etwa 30%.
  • Hinsichtlich des Immunpräzipitationsschritts wurde keine signifikante unspezifische Bindung der Bakterien an die Antikörper des Cocktails erwartet (wie sie bei der Verwendung von Dynabeads M 450 <CD45> beobachtet wurde, siehe Beispiel 2), da bei diesem Ansatz der Fcγ-Teil des verwendeten Maus-IgGs durch die überbrückenden Ratte-IgM-Antikörper verborgen ist und von Bakterien exprimierte Immunglobulin bindende Proteine keine oder nur eine sehr schwache Wechselwirkung mit Ratte-IgM zeigen.
  • In früheren Experimenten mit Dichtegradientenmedien (siehe Beispiel 1) wurde beobachtet, daß Bakterien nicht in Dichtemedien mit Auftriebsdichten von ≥ 1,070 (55-74% Percoll) eindringen können.
  • Daher wird erwartet, daß Bakterien während der "Soft spin"-Zentrifugation im Überstand verbleiben sollten, wohingegen die relativ dichten Erythrozyten sowie die Leuko-Copräzipitate unter Ausbildung eines Sediments in der Ficoll-Phase abgetrennt würden.
  • Versuchsaufbau
  • Den Ausgangspunkt für die Experimente mit bakterienversetzten Blutproben bildete eine Vorschrift, die einer technischen Anweisung der Firma Stemcell für die Abreicherung von Leukozyten entnommen wurde.
  • In der Vorschrift wird der Antikörper-Cocktail mit dem Namen "CD45 Depletion for Enrichment of Circulating Epithelial Tumor Cells", Kat-Nr. 15 122 (2 ml für die Markierung von 40 ml Vollblut), der neben <CD45> gegen <CD66b> und <CD36> gerichtet ist, verwendet.
  • Weiterhin wird ein spezielles Dichtemedium mit dem Namen DM-L (Kat.Nr. 15 705, 100 ml; ρ = 1,081 g/ml) verwendet. Stemcell gibt an, daß das üblicherweise verwendete Ficoll (ρ = 1,077 g/ml) gleichfalls verwendet werden kann, wobei sich eine etwas geringere Wiedergewinnungsrate für die Tumorzellen im Überstand ergibt.
  • Gemäß dieser Vorschrift wurden 2,0 ml Vollblut mit 100 μl CD45-Abreicherungscocktail 20 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln in einem Eppendorf-Mischgerät inkubiert. Die Probe wurde mit 2,0 ml PBS mit 2% RPLA-4 (Rinderplasma Albumin) verdünnt. 3,0 ml DM-L-Dichtemedium wurden in ein 15-ml-Sarstedt-Röhrchen mit spitz zulaufendem Boden (Kat.-Nr. 62.554.502 PP) pipettiert und die verdünnte Probe über das Ficoll-ähnliche Medium beschichtet. Die Probe wurde 20 Minuten in der Heraeus Variofuge 3.0 R unter Verwendung eines Ausschwingrotors (Typ 05315) bei 2700 Upm (= 1200 g) zentrifugiert.
  • Nach der Zentrifugation war die Zwischenphase zwischen dem erzeugten "Plasma" und dem die sedimentierten Blutzellen enthaltenden Ficoll-ähnlichen Medium deutlich sichtbar. Die beiden Phasen wurden durch Pipettieren getrennt und Portionen davon am Beckman Coulter Counter gemessen und mit der ursprünglichen Zellzahl der Probe verglichen, um das Abreicherungsverhältnis für die Leukozyten zu bestimmen.
  • Die Menge an menschlicher genomischer DNA und bakterieller DNA wurde bestimmt, indem 750 μl-Portionen der beiden Phasen an MagNA Pure der Firma Roche Diagnostics gemäß der im Handbuch/Beipackzettel beschriebenen Vorschrift prozessiert wurden. Die DNA in den Eluaten wurde mittels LightCycler®-PCR, wie weiter oben beschrieben, quantifiziert und als Wiedergewinnungsraten für Bakterien bzw. Abreicherungsraten für menschliche genomische DNA ausgedrückt, wobei der DNA-Gehalt der MagNA Pure-prozessierten Proben ohne einen vorherigen Immunpräzipitationsschritt als 100%-Wert angenommen wurde.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Bei Verwendung der originalen Stemcell-Vorschrift, wie oben beschrieben, wurden keine Leukozyten und Erythrozyten durch Bestimmung der Zellzahl in der Plasmaphase nach der Zentrifugation nachgewiesen. Selbst die Ficoll-ähnliche Phase war außer einem kompakten Zellsediment frei von Blutzellen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Werten für den Gehalt an menschlicher genomischer DNA in den beiden Phasen.
  • Da bei dieser Vorschrift relativ harte Zentrifugationsbedingungen (20 Minuten 1200 g) verwendet werden, wurden die g-Kräfte und die Zentrifugationszeit in einem ersten Satz von Experimenten verringert, um eine gute Wiedergewinnungsrate für die Bakterien im Überstand zu erhalten.
  • Es stellte sich heraus, daß eine fünfminütige Zentrifugation bei 130 bzw. 350 g (= 800 Upm bzw. 1500 Upm) eine Wiedergewinnungsrate für Staph. aureus und P. aeruginosa im Bereich von etwa 80 bis 90% in der Plasmaphase ergab.
  • Dabei gab es keinen Unterschied in der Wiedergewinnungsrate zwischen 130 g und 350 g, was darauf hindeutet, daß die Bakterien nicht in der Lage sind, in signifikanter Weise in das dichte Ficoll-ähnliche Medium einzudringen.
  • Bei Verwendung dieser Zentrifugationsbedingungen war das Blutzellensediment in der Ficoll-ähnlichen Phase eher wolkig als kompakt, doch lag der Gehalt an menschlicher genomischer DNA in der Bakterien enthaltenden Plasmaphase trotzdem noch immer im Bereich von etwa 1%.
  • Weiterhin war es möglich, die inkubierte Probe zu zentrifugieren, ohne daß diese dabei mit PBS/RPLA-4 verdünnt wurde, wodurch die Verdünnung des ursprüng lichen Gehalts an Bakterien im Überstand vermieden wurde.
  • Schlußfolgerungen
  • Bei Verwendung eines RosetteSep.-Antikörper-Cocktails für die Leukozytenabreicherung war es möglich, die Blutzellen durch einen 20minütigen Inkubationsschritt zu copräzipitieren und die Zellen durch einen kurzen Zentrifugationsschritt (fünf Minuten bei 130 bzw. 350 g) in ein Ficoll-ähnliches Medium zu sedimentieren. Da die Abreicherung der Leukozyten sehr effektiv war, sollte es sogar möglich sein, die Zeit des Inkubationsschritts zu verkürzen. Die Wiedergewinnung von Staph. aureus und P. aeruginosa in der Plasmafraktion lag im Bereich von etwa 80% bis 90%.
  • Daher können mit dieser Vorschrift Leukozyten aus Vollblutproben sehr effektiv abgereichert werden, ohne daß dabei eine signifikante Menge an Bakterien verloren geht, indem für eukaryontische Zellen spezifische Antikörper bereitgestellt werden, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt.
  • Beispiel 4
  • Isolierung von Bakterien aus Blutproben unter Verwendung von Magnetkügelchen und Antikörpern
  • Eine zweckmäßigere Vorschrift könnte ein Format darstellen, bei dem Antikörper, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt (beispielsweise der in Beispiel 3 beschriebene Ansatz mit tetramerem Antikörper/Immunpräzipitation) mit der Trennung mittels Magnetkügelchentechnologie kombiniert werden. Ein solches Format hat den Vorteil, daß es leicht in eine automatisierte Vorrichtung, wie beispielsweise das MagNA Pure®-System (Roche Diagnostics), integriert werden könnte.
  • Bei einem derartigen Ansatz würden die Leukozyten über Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle, die direkt oder indirekt an Magnetkügelchen gebunden sind, copräzipitiert werden (statt Erythrozyten, wie beim Ansatz mittels tetramerem Antikörper/Immunpräzipitation). In einem solchen Ansatz ließen sich beispielsweise mit Digoxigenin-Polyhapten beschichtete Kügelchen und <Dig>-Antikörper verwenden.
  • Unerwünschte Wechselwirkungen zwischen immunglobulinbindenden Proteinen der Bakterien und dem verwendeten Immunoreagens scheinen aufgrund der Blockierung des Fcγ-Teils der in den tetrameren Antikörperkomplexen vorliegenden IgGs ausgeschlossen zu sein.
  • Literaturliste

Claims (18)

  1. Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus einer biologischen Probe, bei dem man in den folgenden Schritten – spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen bindende Antikörper bereitstellt, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und – die Antikörper und die biologische Probe mischt und – die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von dem Gemisch trennt.
  2. Verfahren zur Extraktion bakterieller Nukleinsäuren und/oder bakterieller Proteine aus einer biologischen Probe, bei dem man in den folgenden Schritten – spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen bindende Antikörper bereitstellt, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und – die Antikörper und die biologische Probe mischt und – die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von dem Gemisch trennt und – in dem Gemisch, von dem die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle getrennt werden, enthaltene bakterielle Nukleinsäuren und/oder Proteine extrahiert.
  3. Verfahren zum Nachweis bakterieller Nukleinsäuren und/oder bakterieller Proteine in einer biologischen Probe, bei dem man in den folgenden Schritten – spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen bindende Antikörper bereitstellt, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und – die Antikörper und die biologische Probe mischt und – die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von dem Gemisch trennt und – in dem Gemisch, von dem die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle getrennt werden, enthaltene bakterielle Nukleinsäuren und/oder Proteine extrahiert und – in der biologischen Probe enthaltene bakterielle Nukleinsäuren und/oder bakterielle Proteine nachweist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3 zum Nachweis von bakteriellen Nukleinsäuren in einer biologischen Probe, wobei die bakteriellen Nukleinsäuren mit einer Nukleinsäureamplifikationsreaktion, die gegebenenfalls einen Sondenhybridisierungsschritt beinhaltet, nachgewiesen werden.
  5. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4, wodurch die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von der biologischen Probe mittels Zentrifugation getrennt werden.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zentrifugation in Gegenwart eines Dichtegradientenmediums durchgeführt wird.
  7. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4, wobei die Komplexe aus Antikörper und eukaryontischer Zelle von der biologischen Probe mittels Filtration getrennt werden.
  8. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 4, wobei magnetische Kügelchen direkt oder indirekt mit den Antikörpern beschichtet werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei den Antikörpern um "Tetrameric Antibody Complexes" [tetramere Antikörperkomplexe] handelt.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei den Antikörpern um Fab-Fragmente oder F(ab')2-Fragmente handelt.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Antikörper an den Fc-Termini maskiert sind.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei den Antikörpern um Antikörper vom Typ Ig M handelt.
  13. Verwendung von spezifisch an eukaryontische Zellen bindenden Antikörpern, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, zur Abreicherung eukaryontischer Zellen in einer biologischen Probe in einem Verfahren zur Isolierung von Bakterien aus einer biologischen Probe.
  14. Verwendung von spezifisch an eukaryontische Zellen bindenden Antikörpern, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, zur Abreicherung eukaryontischer Zellen in einer biologischen Probe in einem Verfahren zur Extraktion bakterieller Nukleinsäuren und/oder Proteinen aus einer biologischen Probe.
  15. Verwendung von spezifisch an eukaryontische Zellen bindenden Antikörpern, denen ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, zur Abreicherung eukaryontischer Zellen in einer biologischen Probe in einem Verfahren zum Nachweis bakterieller Nukleinsäuren und/oder Proteinen in einer biologischen Probe.
  16. Kit zur Extraktion bakterieller Nukleinsäuren und/oder bakterieller Proteine aus einer biologischen Probe, umfassend: – in einem oder mehreren Behältern Antikörper, die spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen binden, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und – in einem oder mehreren Behältern Mittel zur Extraktion von Nukleinsäuren und/oder Proteinen.
  17. Kit zum Nachweis bakterieller Nukleinsäuren und/oder bakterieller Proteine in einer biologischen Probe, ferner umfassend: – in einem oder mehreren Behältern Antikörper, die spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen binden, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und – in einem oder mehreren Behältern Mittel zur Extraktion von Nukleinsäuren und/oder Proteinen sowie – Mittel zum Nachweis von Nukleinsäuren und/oder Proteinen.
  18. Kit zum Nachweis bakterieller Nukleinsäuren in einer biologischen Probe, ferner umfassend: – in einem oder mehreren Behältern Antikörper, die spezifisch an in der biologischen Probe enthaltene eukaryontische Zellen binden, wodurch den Antikörpern ein bakterienbindender Fc-Terminus fehlt, und – in einem oder mehreren Behältern Mittel zur Extraktion von Nukleinsäuren und/oder Proteinen und – Mittel zum Nachweis von Nukleinsäuren und/oder Proteinen sowie – Mittel zur Amplifikation eines Zielbereichs einer bakteriellen Nukleinsäure, vorzugsweise durch PCR.
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