DE2907198A1 - Verfahren zum nachweisen von viralen, erythrozytaeren oder zellulaeren antigenen oder von antikoerpern in einem biologischen medium - Google Patents
Verfahren zum nachweisen von viralen, erythrozytaeren oder zellulaeren antigenen oder von antikoerpern in einem biologischen mediumInfo
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Description
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WUESTHOFF-v. PECHMANN - BEI IREMS- GOET2
PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE MANDATAIRES AGREES PRES !.'OFFICE EUROPEEN DES BREVETS
D-8000 MÜNCHEN 9Ö SCHWEIGERSTRASSE
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1A-51820
Patentanmeldung
Anmelder : CENTRE WATIOUAL DE TRANSSPUSION SANGUINE
6, rue Alexandre Catanel, Par is, Frankreich.
Titel : Verfahren zum Nachweisen von viralen, erythrozytären oder zellulären Antigenen
oder von Antikörpern in einem "biologischen
Medium.
909835/0796
PATENTANWÄLTE
"WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ
PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE MANDATAIRES AGRiES PRES l'oFFICE EUROPEEN DES BREVETS
1ZWTTSTCT
D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2
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1A-51820
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren
eines flüssigen biologischen Mediums, wie menschliches Blut, um in.diesem Medium Viren mit Antigeneigenschaften bzwi virale
Antigene, erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper nachzuweisen oder zu identifizieren.
Bei medizinischen Analysen stellt sich häufig das Problem der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen, die
von einer Zelle oder Teilchen getragen werden sowie der Beschaffenheit von Antikörpern oder der viralen Antigene, die
in einem serologischen Medium enthalten sind.
Dies trifft vor allem auf das Gebiet der Bluttransfusion zu, wo unbedingt festgestellt werden muß, daß das Blut des Spenders
bzw. der Spender mit dem Blut des künftigen Empfängers verträglich ist.
Die gegebenenfalls vorhandene Unverträglichkeit von zwei
Blutproben beruht darauf, daß das Plasma der einen Blutprobe Moleküle enthalten kann, die als Antikörper bezeichnet werden
und die sich mit als Antigeneinheiten oder Antigen bezeichneten komplementären Struktureinheiten der Membran der roten Blutkörperchen
verbinden können. Ein solches Antigen wird erythrozytäres
Antigen genannt. Ein Antikörper, der in der Lage ist sich nur mit
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einem bestimmten Antigen zu verbinden, wird als der für dieses Antigen spezifische Antikörper bezeichnet. Die Verbindung von
Antikörpern mit Antigeneinheiten auf den roten Blutkörperchen kann zur Agglutinierung dieser roten Blutkörperchen, zu ihrer
Zerstörung oder dazu führen, daß sie in ihrer mechanischen Festigkeit stark beeinträchtigt werden, mit dem Risiko, daß
bei Bluttransfusionen Zwischenfälle auftreten.
Es muß weiterhin sichergestellt sein, daß mit dem Spenderblut nicht gewisse Krankheiten auf den Empfänger übertragen
werden, die über den Nachweis eines viralen Antigens oder eines Yirus mit Antigeneigenschaften oder, eines diesem spezifisch
entsprechenden Antikörpers festgestellt werden. Ein Beispiel für eine solche Kran kheit ist die nach Blutübertragungen auftretende
Hepatitis, die beim Empfänger auftreten kann, wenn das Spenderblut einen bestimmten Virus und zwar HB-Virus enthält
, der Träger des HB -Antigens ist.
Dies zeigt wie außerordentlich wichtig es ist, Spenderblut und Empfängerblut daraufhin zu untersuchen, ob irgendwelche
Antikörper, zelluläre Antigene und Viren mit Antigeneigenschaften
bzw. virale Antigene enthalten sind, die bei den Empfängern die Reaktionen der Unverträglichkeit oder das Auftreten einer
Krankheit auslösen können.
Im Falle von Transfusionen muß daher sichergestellt sein, daß das Nachweisverfahren a.us._.reichend empfindlich ist. Außerdem
muß das Fehlerrisiko bei der Bestimmung der Spezifität der erythrozytären oder zellulären Antigenen, von Antikörpern oder
Viren bzw. viralen Antigenen praktisch Null sein.
Nachfolgend werden die in dieser Beschreibung verwendeten Begriffe näher definiert.
"Virus mit Antigeneigenschaften" im Sinne der Beschreibung ist ein Virus, für den man den mit ihm reagierenden spezifischen
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Antikörper kennt. Im folgenden Beschreibungstext werden hierfür gleichermaßen die Bezeichnung Virus mit Antigeneigenschaften,
Yirus oder auch virales Antigen verwendet.
Immunoglobuline sind proteinartige Moleküle tierischer Herkunft, die entweder eine einfache Antigenaktivität oder
eine einfache Antikörperaktivitat oder auch beide Aktivitäten gleichzeitig, d.h. sowohl Antigenaktivität als auch Antikörperaktivitat
aufweisen. JPür jede Tierart, unabhängig davon.ob es
sich um den Menschen oder ein anderes Lebewesen (beispielsweise Ziege, Meerschweinchen, Kaninchen und anderes mehr) handelt,
existieren Immunoglobuline, die verschiedenen immunochemischen Klassen zugehören, d.h. Immunoglobuline einer Klasse A, die
kurz mit IgA. bezeichnet werden, Immunoglobuline einer Klasse G, in der Kurzbezeichnung IgG- usw. Allgemein wird ein Immunoglobulin
der immunochemischen Klasse X und der Tierart I mit IgX I. bezeichnet.
Testserum ist im Sinne der Beschreibung ein Serum (oder eine Lösung) das (die) Immunoglobuline einer bestimmten Tierart
und einer bestimmten immunochemischen Klasse enthält, beispielsweis· Immunoglobuline des Menschen der Klasse G, oder IgG, die eine
Antikörperaktivitat aufweisen welche spezifisch ist gegenüber einem besteimmten erythrozytären oder zellulären Antigen einer
Gruppe von Individuen der betreffenden Tierart, im gegebenen Beispiel einer Gruppe von Personen, Vorzugsweise wird van einer
Gruppe Individuen gesprochen weil, wie für jeden Serologen klar, ein gleiches bestimmtes erythrozytäres oder zelluläresAntigen
nicht bei allen Individuen der gleichen Tierart vorhanden sein muß sondern, meist nur bei bestimmten dieser Individuen, die eine
Gruppe ausmachen.
In analoger Weise werden als Testkörperchen, Testzellen
oder Testteilchen solcher Körperchen, Zellen oder Teilchen
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bezeichnet, die Antigeneiniieiten oder -gruppen einer bestimmten
Tierart tragen, mit denen sich, die Immunoglobuline verbinden können, die die spezifisch entsprechenden Antikörpergruppen zu
den Antigeneinheiten tragen.
Als Antiglobulin wird ein Immunserum einer von der Art I verschiedenen Tierart II bezeichnet welches Immunoglobuline
einer artspezifischen Antikörperaktivität gegenüber IgX I liefert. Das Antiglobulin wird als Ig II A.nti-IgX I bezeichnet
oder, wenn keinerlei Verwechslung möglich ist, kurz als Anti-IgX I.
Zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern(oder von
erythrozytären Antigenen) im Plasma oder Serum einer Blutprobe
(oder auf roten Blutkörperchen) kennt ma.n die Reaktionen nach Ooombs. Bei diesem bekannten Verfahren bzw.Coombs-Test
wird folgendermaßen gearbeitet, wenn beispielsweise bestimmt werden soll, ob das Plasma einer Humanblutprobe einen bestimmten
Antikörper enthält, beispielsweise einen spezifischen Anti-D-Antikörper; anders gesagt ob es für das Antigen D spezifische
Immunoglobuline enthält, von denen einige der immunοchemischen
Klasse G- zugehören und infolgedessen IgG bezeichnet werden;
In einem Röhrchen wird das Pla.sma7 das analysiert werden soll
mit den roten Blutkörperchen inkubiert, die Antigeneinheiten D tragen, d.h. Einheiten mit einer Antigenaktivität spezifisch
für den Antikörper, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit na.chgewiesen werden soll; die Immunoglobuline des im Pla.sma gegebenenfalls
vorhandenen spezifischen Antikörpers verbinden sich während diesem in-Berührung~miteina.nder-bringen mit den korrespondierenden
Antigeneinheiten der roten Blutkörperchen. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsmedium wird gewaschen und dann mit einem
Antiglobulin inkubiert, beispielsweise mit Ziegenserum, das Anti-Huma.n IgG Immunoglobuline liefert. Im Verla.uf dieser Inkubation
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kuppelt ein Immunoglobulin der Ziege,bereitgestellt von dem
Antiglobulin aufgrund seiner spezifischen Anti-Humanfunktion
mit einem menschlichen Immunoglobulin das gegebenenfalls mit einer spezifischen Antigeneinheit eines roten Blutkörperchens
verbunden ist. Ua.ch beendeter Inkubation wird das Reaktionsgemisch
zentrifugiert und hierdurch, wenn der gesuchte spezifische Anti-D Antikörper tatsächlich im Plasma vorhanden wa,r, eine
Agglutinierung der roten Blutkörperchen untereinander hervorgerufen unter Mitwirkung der von dem Antiglobulin gelieferten
Immunoglobuline und zwar aufgrund der Ausbildung von folgenden Bindungsketten:
rotes Blutkörperchen (Antigen D) - spezifisches menschliches Immunoglobulin Anti-D - menschliche Anti-Human-Immunoglobulin
spezifisches menschliches Anti-D Immunoglobulin - (Antigen D)
rote3 Blutkörperchen.
Diese Agglutinierung ist an einem Bodensatz von agglutinierten
roten Blutkörperchen a.m Boden des Röhrchens zu erkennen, wobei dieser Bodensatz aber nicht in allen Fallen gut von einem
Bodansa.tz aus nicht-agglutinierten roten Blutkörperchen unterschieden
werden kann. Um sicher zu gehen , ob es sich um einen Bodensatz aus agglutinierten roten Blutkörperchen oder a.us nicht
agglutinierten roten Blutkörperchen handelt, wird der Röhrcheninhalt
leicht bewegt · .. Bei negativen Reaktionen, d.h. bei Reaktionen mit einem Blutplasma, das nicht den spezifischen
Anti-D Antikörper enthielt, werden die nicht agglutinierten roten Blutkörperchen wieder homogen suspendiert; im Falle der
positiven Reaktionen hingegen bleiben die roten Blutkörperchen in mehr oder weniger großen Gruppen miteinander verbunden.
Dieses Verfahren beruht a.uf rela,tiv langen und delikaten
Reaktionen, die über dies manchmal nicht ausreichend empfindlich sind, was sich als Gefahr erweisen kann.
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Das gleiche Problem der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen auf einer Zelle stellt sich auch
im Falle der Transplantation von Organen. Bekanntlich tragen die Lymphozyten eine bestimmte Anzahl von Antigenen, bezeichnet
als Antigene des Systems HLA. Vor irgendeinem chirurgischen Eingriff zum Zwecke der Transplantation muß festgestellt
werden, welches die HLA-Antigene auf den Lymphozyten des Spenders und auf denen des Empfängers sind, damit die zumindest
theoretische Gewebsverträglichkext zwischen den Lymphozyten der beiden verschiedenen Individuen festgestellt wird;
ohne diese zumindest theoretische Verträglichkeit kann eine Organtransplantation überhaupt nicht in Betracht gezogen werden.
Aufgrund der hohen Anzahl von verschiedenen Antigenen des Systems HLA, die auf den Lymphozyten vorhanden sein können,
muß eine beträchtliche Anzahl von Elementarreaktxonen durchgeführt werden, um die jeweilige Spezifität der vorhandenen
HLA-Antigene festzustellen; es können z.B. 100 Reaktionen notwendig sein, Maßnahmen, die noch dadurch erheblich erschwert
werden, daß die Lymphozytenzellen nur in sehr kleinen Mengen zur Verfügung stehen und infolgedessen nur für Mikroreaktionen
verwendet werden können.
Außerdem werden beim Nachweisen oder Aufspüren bestimmter Viren oder viraler Antigene, beispielsweise des Antigens HB0,
derzeit radio-immunologische Arbeitsweisen angewandt, die sehr
kostspielig und umweltbelastend sind und deshalb einer Sondergenehmigung bedürfen.
Die Erfindung hat zum Ziel, ein Verfahren zum Analysieren eines biologischen Mediums, beispielsweise einer Humanblutprobe
bereitzustellen, um virale Antigene, erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper in diesem Medium nachzuweisen oder
zu identifizieren, das sich allgemein anwenden läßt und den
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Nachweis beliebiger Arten viraler Antigene in einem flüssigen biologischen Medium sowie aller Arten erythrozytärer oder
zellulärer Antigene und Antikörper, die in einer Blutprobe enthalten sind, ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines solchen Verfahrens, das eine hoch empfindliche Analyse
ermöglicht, die denjenigen der bekannten Verfahren weit überlegen ist und das dennoch ausgezeichnet spezifisch gegenüber
dem viralen Antigen? dem erythrozytären oder zellulären Antigen
oder dem gesuchten Antikörper bleibt. In diesem Zusammenhang wird das Analyseverfahren als umso empfindlicher bezeichnet,
je geringer die Menge eines vLralen Antigens, eines erythrozytären oder zellulären Antigens oder eines Antikörpers einer
bestimmten Spezifität ist, die mit seiner Hilfe nachgewiesen werden kann? das Verfahren wird als umso spezifischer angesehen,
je besser es ermöglicht, ohne Fehler, d.h. ohne Verwechslung, alle diese Antigene oder Antikörper mit unterschiedlicher
Spezifität nachzuweisen. Mit anderen Worten f ein virales Antigen
einer bestimmten Spezifität darf nicht verwechselt werden mit einem viralen Antigen einer anderen Spezifität und das
gleiche gilt beim Nachweis von erythrozytären oder zellulären Antigenen und von Antikörpern.
Die Erfindung soll weiterhin ein Analyseverfahren bereitstellen, das nicht umweltbelastend ist, mit dessen Hilfe
die Zeitspanne beträchtlich verkürzt werden kann, die zum Erhalt der Analyseergebnisse notwendig ist und das zudem auf
Reaktionen beruht, die einen sehr sparsamen Umgang mit Reaktionspartnern ermöglichen.
Um zu bestimmen, ob ein biologisches Medium virale, ,
erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper enthält, wird erfindungsgemäß ein Analyseverfahren angewandt/
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das Gebrauch macht von Reaktionen immunologischer Beschaffenheit zwischen den Zellen oder Teilchen und einem Serum, sodann
zwischen den auf diese Weise behandelten Zellen und Teilchen und einem Antiglobulin; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Reaktionsmedium, welches die Zellen oder Teilchen und das Antiglobulin enthält, in einen Behälter eingebracht
wird, dessen Wandung einen auf der Symmetrieachse des Behälters gelegenen Konvergenzpunkt oder Scheitelpunkt aufweist
und auf dessen Wandung Moleküle fixiert worden sind, die immunologisch mit dem Antiglobulin reagieren können, daß
man dieses Reaktionsmedium oder Reaktionsgemisch der Einwirkung einer im wesentlichen achsparallelen zentrifugalen Kraft unterwirft
und/unter solchen Bedingungen, daß zumindest die Zellen, die eine positive Reaktion kennzeichnen, d.h. eine Analysereaktion,
durchgeführt an einer Probe des biologischen Mediums, enthaltend das Antigen oder den Antikörper, das bzw. der identifiziert
werden soll, fortschreitend an der Wand des Behälters haften und haften bleiben, aufgrund von Bindungskräften einer
ersten Art, d.h. von Bindungskräften immunologischer Art/ an denen das Antiglobulin beteiligt ist, und zu denen sich die
Bindungskräfte einer zweiten Art addieren, während die Zellen, die eine negative Reaktion kennzeichnen, am Ende des Zentrifugierens
an die Wand nur über Bindungskräfte der zweiten Art gebunden werden. Diese Zellen werden dann im Scheitelpunkt
oder der Kuppe des Behälters gesammelt durch Anwendung einer zentrifugalen Kraft, die ausreichend stark ist, um die Bindungskräfte des zweiten Typus, durch die eine negative Zelle an die
Behälterwand gebunden ist, zu zerstören, die aber nicht ausreichend stark ist, um die Summe der Bindungskräfte des ersten
Typus und der Bindungskräfte d§s zweiten Typus, durch die
eine positive Zelle an die Behälterwand gebunden ist, zu zerstören.
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Das soeben definierte erfindungsgemäße Verfahren macht
Gebrauch von einer besonderen Art von Reaktionen, nämlich von Reaktionen der "Immuno-Adhärenz" oder Immuno-Haftung. Diese
Reaktionen werden so tezeichnet, weil der die Reaktion anzeigende
Vorgang in einer Haftung oder Adhärenz besteht zwischen einerseits Zellen, Körperchen oder Teilchen und andererseits dem
Boden eines Behälters ,überzogen mit einer Schicht oder Haut aus Molekülen, die Antigen- oder Äntikörpereigenschaft aufweisen.
Diese Haftung ist von immunologischer Beschaffenheit, weil sie durch die Entstehung von Antigen-Antikörper-Bindungen zwischen
den Körperchen, Zellen oder Teilchen einerseits und dem Behälter andererseits hervorgerufen wird.
Es wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren
wesentlich empfindlicher ist als die bekannten Verfahren,und zwar um das Einhundertfache bis zum Eintausendfachen. Außerdem
ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine beträchtliche Verkürzung der Zeit, die zum Erhalt der Analysenergebnxsse notwendig
ist,und ermöglicht auf diese Weise die Durchführung von
Eildiagnosen, die jetzt beispielsweise im Falle des Nachweises von erythrozytären Äntigenen oder bekannten Antikörpern im Blut
innerhalb von sechs Minuten anstatt bisher einer Stunde durchgeführt werden können. Das neue Verfahren ermöglicht außerdem
auch eine erhebliche Einsparung an Reaktionsparinem;. dies ist
sehr wichtig, beispielsweise wenn so kostbare Reaktionspartner benötigt werden wie lymphozytäre Zellen oder Testsera einer
seltenen Spezifität.
Ein weiterer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, daß keinerlei Radioaktivität beteiligt ist; es ist- wesentlich
billiger als die radio-immunologischen Verfahren und belastet im Gegensatz zu diesen Verfahren nicht die Umwelt.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügte.Zeichnung
und die nachfolgenden Anwendungsbeispiele näher erläutert.
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Die Fig. 1 bis 9b erläutern schematisch die verschiedenen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens, angewandt aif die
Untersuchung einer Blutprobe daraufhin,- ob Antigen HB3 enthalten
ist.
Fig. 10 erläutert schematisch die Kräfte, denen eine Zelle beim Zentrifugieren unterworfen ist.
Die Fig. 11 bis 14b zeigen schematisch die verschiedenen
Stufen des Verfahrens nach der ErfLrdung, angewandt auf den Nachweis der Anwesenheit von Antigen D auf den roten Blutkörperchen
einer Humanblutprobe;
die Fig. 15 bis 18 sind Diagramme von Zentrifugiervorgängen.
Erstes Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung:
Diese erste Ausführungsform des Verfahrens wird mit Bezug auf die Fig. 1 bis 9b erläutert. Das Verfahren wurde hierbei
angewandt, um nachzuweisen, ob das Serum, oder Plasma, einer Humanblutprobe virales Antigen HB „ enthielt, das nachfolgend
zur Vereinfachung Antigen HB3 bezeichnet wird.
a) Die erste Stufe des Verfahrens besteht darin, daß die Oberfläche des Bodens eines Behälters vorbereitet wird, der zum
Nachweis der Haftung oder der Nichthaftung von Zellen oder Teilchen dient.
Der Behälter,dessen Boden einen auf einer Symmetrieachse
des Behälters gelegenen unteren Konvergenzpunkt aufweisen soll, ist im vorliegenden Falle ein Becher 1 aus Kunststoff, beispielsweise
aus Polyvinyl chlorid (PVC) mit einem im Schnitt V-förmigen Boden 2. Dieser Boden 2 ist mit einer Schicht oder
einem Häutchen aus Immunoglobulinen 3 oder IgX I überzogen,
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die im vorliegenden Falle Immunoglobuline der Ziege der
immunochemischen Klasse G sind, d.h. Ziegen IgG (Fig.1).
Diese Ziegen IgG 3 sind in der Figur als weiße Rechtecke wiedergegeben.
Die Fixierung der IgG auf dem Kunststoff des Bechers kann mit Hilfe verschiedener chemischer Verfahren erfolgen,
beispielsweise durch Erzeugung von Carbodiimid-Bindungen zwischen dem Kunststoff und den IgG-Molekülen oder durch einfache
Adsorption der IgG durch den Kunststoff.
Die IgG-Konzentration ist dabei nicht kritisch. Da jedoch
die Sensibilität oder Empfindlichkeit der Reaktionen
von der Oberflächendichte der fixierten Immunoglobuline abhängt, wird eine an Immunoglobulinen ausreichend konzentrierte
Lösung verwendet, damit der Becherboden mit Immunoglobulinen
ge^ttigt und auf diese Weise eine größtmögliche Empfindlichkeit erreicht wird.
Nach der Fixierung des Ziegen-IgG am Becherboden wird
der mit IgG überzogene Becher mit einer physiologischen Lösung gewaschen, beispielsve.se mit physiologischer Kochsalzlösung
(9% KaCl); um alle nicht am Becher fixierten IgG zu entfernen, wird mehrere Male gewaschen.
Die auf dem Kunststoff-Becherboden fixierte Schicht aus IgG soll nicht trocken werden; daher wird im Boden des Bechers
eine kleine Menge der physiologischen Kochsalzlösung zurückbehalten und die IgG-Schicht behält auf diese Weise ihre Aktivität
für einige Stunden.
b) Anschließend werden die Zellen oder Teilchen (nachfolgend Reaktionspartner-Zellen oder - "teilchen bezeichnet) vorbereitet,
mit deren Hilfe der Vorgang der Adhärenz oder Nichtadhärenz nachgexdesen wird, je nachdem, ob die Reaktion positiv
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oder negativ verläuft, d.h. ob das Serum, das analysiert werden soll, HB3-Antigen enthält oder es nicht enthält.
Im hier beschriebenen Beispiel sind diese Zellen rote Blutkörperchen vom Schaf, schematisch mit 4 bezeichnet.
An diese roten Blutkörperchen 4 werden Immunoglobuline gekuppelt, die zwingend der gleichen Tierart und der gleichen
immunochemischen Klasse zugehören wie die im Becher fixierten IgX I; einige dieser Immunoglobuline müssen darüber hinaus
eine Antikörperaktivität gegenüber dem HBS-Antigen aufweisen.
Die Kupplung dieser Immunoglobuline erfolgt vorteilhafterweise gleichzeitig mit einer Behandlung der roten Blutkörperchen
mit Chromichlorid, damit die roten Blutkörperchen Eiweißmoleküle
fixieren bzw. binden können. Im vorliegenden Falle werden somit auf den roten Blutkörperchen vom Schaf Ziegen-Anti-HBS
IgG gekuppelt, die schematisch als gestrichelte Rechtecke wiedergegeben und mit 5 bezeichnet sind. Diese Stufe
der Kupplung von IgG auf den roten Blutkörperchen wird schematisch in Fig.2 gezeigt.
Diese Ziegen-IgG mit Anti-HB -Wirkung werden aus dem
einer Ziege
ziert worden ist.
ziert worden ist.
Serum einer Ziege gewonnen, der gereinigtes Antigen-HB^, inji-
Die auf diese Weise vorbereiteten roten Blutkörperchen werden als "Reaktionspartner-Blutkörperchen" bezeichnet. Natürlich
können anstelle der roten Blutkörperchen beliebige andere Zellen oder Teilchen verwendet werden, an die Immunoglobuline
gekuppelt werden können.
c) Die so vorbereiteten bzw. vorbehandelten und in physiologischer (Kochsalzlösung suspendierten roten Blutkörperchen
4 des Schafes werden mit dem Serum oder Plasma der Blutprobe inkubiert, die untersucht werden soll, um festzustellen,
ob sie Antigen-HBg enthält oder nicht. In der Praxis wird
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beispielsweise ein 1:50 oder 1:100 verdünntes Plasma verwendet.
Bei dieser Inkubation, die außerhalb des zuvor vorbereiteten Bechers durchgeführt wird, wird eine Suspension von
vorbereiteten roten Blutkörperchen des Schafes, wie oben beschrieben,
mit dem Serum der Blutprobe in Berührung gebracht und das Ganze bei Umgebungstemperatur inkubiert, während
einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen zehn Minuten. Diese Inkubationsstufe wird schematisch in Fig. 3 gezeigt,
wobei die eiförmigen oder ovalen, feingestrichelten Moleküle 6 das Antigen-HB„ wiedergeben.
Ist in der Serumprobe,die analysiert werden soll, Antigen-HB5
vorhanden, so kuppeln die Moleküle 6 des Antigens mit den Anti-HBg-IgG 5, die bereits auf den roten Blutkörperchen 4
gebunden sind. Wie schematisch in Fig. 3 gezeigt, ordnen sich
die Antigen-Moleküle um die an ein rotes Blutkörperchen gebundenen Anti-HBg-IgG Moleküle herum an und erzeugen auf diese Weise
eine sterische Hinderung in den intermolekularen Zwischenräumen,,
die bisher zwischen den Anti-HBs-IgG Molekülen vorhanden waren.
Enthält das Serum, das analysiert werden soll, kein Antigen-HBg,
so findet keinerlei Reaktion statt und die roten Blutkörperchen bleiben in dem Zustand, in welchem sie sich am Ende
der vorhergehenden Stufe befunden haben, d.h. am Ende der Stufe, in der sie die Anti-HBs-IgG der Ziege fixiert oder gebunden hatten;
infolgedessen findet keinerlei sterische Hinderung um diese
Anti-HBs-IgG Moleküle herum statt.
Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen werden vorteilhafterweise mehrmals mit physiologischer(Kochsalz) lösung
gewaschen (Zugabe der Lösung, wieder-in-Suspension-bringen,
Zentrifugieren, Dekantieren, Abgießen der überstehenden Flüssigkeit usw.) und zwar in dem Behälter, in welchem inkubiert worden
ist.
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d) Dann werden in den Becher 1, dessen Boden 2 mit einer Schicht aus Ziegen IgG 3 überzogen ist, gleichzeitig
eingebracht: Zum einen die,wie oben beschrieben, inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen vom Schaf und zum anderen
ein Antiglobulin, d.h. ein Immunserum bzw. Antiserum, das Immunoglobuline mit einer spezifischen Antikörperaktivität
gegenüber den Immunoglobulinen enthält, die zum einen an den Becher fixiert und zum anderen an die roten Blutkörperchen
gebunden sind, d.h. Ig II Anti-IgX I. Im vorliegenden Beispiel
wird ein Anti-Ziegen Antiglobulin des Kaninchens zugegeben, das die Antiziegen-IgG Immunoglobuline G oder IgG des Kaninchens
enthält; diese Immunoglobuline sind schematisch in den Fig.4a und 4b durch kleine schwarze Rechtecke 7 wiedergegeben; die
Fig. 4a entspricht dan Falle einer positiven Reaktion und die Fig.4b zeigt den Fall einer negativen Reaktion.
Gemäß einer Variante kann zunächst die Suspension der roten Blutkörperchen in den Becher gegeben werden und dann
das Antiglobulin.
Die Immunoglobuline des Antiglobulins sind Immunoglobuline mit einer zumindest divalenten Antikörperfunktion gegenüber
den Ziegen-IgG; ein Kaninchen-IgG mit Antiziegen-IgG-Wirkung
kann somit mit einer dieser Antikörperfunktionen (oder Gruppen) mit einem am Becherboden fixierten Molekül Ziegen-IgG reagieren
und mit der anderen Funktion mit einem an das rote Blutkörperchen gebundenen Molekül Anti-HBS Ziegen-IgG. Diese Immunoglobuline
mit spezifischer Antikörperaktivität gegenüber den Ziegen-IgG werden aus dem Serum eines Tieres von unterschiedlicher Art
erhalten, im vorliegenden Falle aus dem Serum eines Kaninchens dem Ziegen-IgG, vorteilhafterweise in gereinigter Form, injiziert
worden ist.
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Wie weiter unten noch erklärt, wird hier das Äntiglobulin in relativ hoher Konzentration verwendet, beispielsweise ein
Antiziegen-IgG Äntiglobulin, das mindestens einem Titer von aufweist gemäß der Arbeitsweise von Coombs, und zwar rein
oder wenig verdünnt (Verdünnungsverhältnis 1:2 oder 1:4).
Während der Gesamtdauer dieser Inkubation, die als Antiglobulin-Inkubation bezeichnet wird und die aus weiter unten
noch angegebenen Gründen sehr kurz sein muß, wird der Becher vorteilhafterwexse ständig in Bewegung gehalten, um auf diese
Weise das Gemisch aus Suspension von roten Blutkörperchen und dem Äntiglobulin zu homogenisieren.
e) Nach der Antiglobulin-Inkubation wird zentrifugiert, wozu genaue Bedingungen eingehalten werden müssen; durch das
Zentrifugieren wird nachgewiesen, ob der Vorgang der Adhärenz eintritt oder nicht, je nachdem, ob die Serumprobe, mit welcher
die vorbehandelten roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert worden sind, Antigen-HB_ enthält oder nicht.
Beim Zentrifugieren rotiert der Becher um eine Achse 1a, die senkrecht steht zur Rotationsachse 1b des Bechers 1;
die erste Phase, Anlagerungsphase bezeichnet, wird nach einer ausreichend kurzen Zeit nach Beginn der Antiglobulin-Inkubation
in Gang gesetzt, d.h. ausreichend kurz nach dem Einbringen der Blutkörperchen-Suspension und des Antiglobulins in den Becher,
damit noch sehr xvenig IgG 3, das am Becher fixiert ist oder
IgG 5, das an die Blutkörperchen gebunden ist, mit einem IgG des Antiglobulins mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung reagiert hat.
Vorteilhafterwexse wird diese erste Zentrifugierphase nach einer Zeitspanne in Gang gesetzt, die maximal gleich ist der Zeitspanne
innerhalb derer 10% des Ziegen-IgG mit den Anti-Ziegen-IgG
Immunoglobulinen des Antiglobulins reagiert haben. In der Praxis
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bedeutet dies, daß mit dem Zentrifugieren einige Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden nach Beginn der Antiglobulin-Inkubation
begonnen wird.
Während dieser ersten Zentrifugierphase wird d as Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension der Blutkörperchen
vom Schaf und Antiglobulin( an die Oberfläche des Becherbodens
2 angelagert bzw. dieser Boden damit ausgekleidet, so daß die Anti-HBS IgG der Ziege 5, die mit den behandelten und
inkubierten roten Blutkörperchen vom Schaf verbunden sind und die Ziegen-IgG 3, die auf dem Kunststoff fixiert sind, einander
gegenüber stehen und auf diese Weise eine schnelle anfängliche Haftung oder Adhärenz der roten Blutkörperchen an den Becherboden
hervorgerufen wird, und zwar über die Immunoglobuline 7 des Antiglobulins, die einerseits mit den IgG 5 und andererseits
mit den IgG 3 kuppeln; diese schnelle Anfangshaftung erfolgt unabhängig davon, ob die Reaktion positiv oder negativ
verläuft, d.h. ob auf den roten Blutkörperchen Antigen-HB Moleküle über Anti-HBS IgG der Ziege gebunden sind oder nicht.
Hierzu wird eine erste mäßige Zentrifugiergeschwindigkeit V* angewandt; wie diese Geschwindigkeit bestimmt wird, wird
weiter unten erklärt.
Die Fig. 5a und 5b zeigen stark vergrößert die einander
gegenüberliegenden Flächen eines roten Blutkörperchens 4 und des Becherbodens 2 im Verlauf dieser Anlagerungsphase;
Fig. 5a entspricht dem Fall einer positiven Reaktion; Fig. 5b entspricht dem Fall einer negativen Reaktion.
In beiden Fällen ordnen sich die Immunoglobuline Ig 7 des Antiglobulins aufgrund ihrer speziellen Antikörperspezifität
gegenüber den Ziegen-IgG zwischen einerseits den an die roten Blutkörperchen gebundenen Ziegen IgG 5 und andererseits
den am Becherboden fixierten Ziegen IgG 3 an. Man nimmt an, daß während dieser Anlagerung oder diesem Auskleiden, das zu einer
mäßig starken Haftung der roten Blutkörperchen an der Oberfläche des Becherbodens 2 führt* sich Gänge oder Freiräume zwischen
dem Kunststoff und den roten Blutkörperchen ausbilden, die beet 09835/0796 ' --ι 7_
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grenzt sind von den Molekülketten IgG 5/Ig 7/IgG 3, welche
sich gebildet haben; diese Gänge wirken als Filter gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Molekülen Ig 7.
Wie oben gesagt, bilden sich diese Gänge sowohl bei einer positiven Reaktion aus, d.h. wenn die roten Blutkörperchen
4 vom Schaf die Antigen-HB„ Moleküle 6 über die IgG 5 gebunden haben, wie/im Falle einer negativen Reaktion, bei
der die roten Blutkörperchen 4 die Moleküle des viralen Antigens nicht gebunden haben. Jedoch sind im Falle einer
positiven Reaktion (Fig.6a) diese Gänge mit Molekülen des viralen Antigens gefüllt, im Falle einer negativen Reaktion
(Fig. 6b) hingegen nicht.
In der Praxis wird in dieser ersten Zentrifugierstufe oder -phase auf etwa 200 g beschleunigt (g = Erdbeschleunigung),
während etwa 40 bis 60 Sekunden. Die Reaktion wird in einem Becher ausgeführt, der einen öffnungswinkel des Konus von 120*
aufweist.
f) Darauf wird das Zentrifugieren während mehrerer Minuten unterbrochen. Während dieser Unterbrechung zirkulieren
die freien Moleküle Ig 7 in den zuvor während der Anlagerungsphase gebildeten Gängen und haben die Möglichkeit, mit den noch
freien IgG 5 der roten Blutkörperchen oder den noch freien IgG 3 des Trägers zu kuppeln. Diese Phase, in der das Zentrifugieren
unterbrochen wird, stellt in der Tat eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar.
Während der in der ersten Phase des Zentrifugierens
erhaltenen mäßigen Anlagerung oder Auskleidung haben sich zwischen Behälter (Wand) und den roten Blutkörperchen Bindungsketten ausgebildet, die bestehen aus: einem IgG fixiert an den
Behälter, einem Anti-IgG Molekül und einem IgG gebunden an ein rotes Blutkörperchen. Erfindungsgemäß wurde im Verlauf von
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Versuchen festgestellt, daß diese Konfiguration energetisch
weniger beständig ist in Anwesenheit eines Überschusses von Anti-IgG Molekülen als die Konfiguration bestehend aus:
einem IgG fixiert an dem Behälter, einem Molekül-Anti-IgG...
einem Molekül Anti-IgG,einemIgG gebunden an ein rotes Blutkörperchen.
Man konnte hieraus schließen, daß durch Verlängerung der Dauer der Antiglobulin-Inkubation schließlich die
Konfigurationen IgG/Anti-IgG ... Anti-IgG/IgG in größerer
Anzahl gebildet werden als die Konfigurationen IgG/Anti-IgG/IgG,
was dann die "Enthaftung" bzw. Auflösung der Haftung zwischen den roten Blutkörperchen und dem Behälter hervorrufen würde.
Diese Annahme hat sich bestätigt und hiervon wird vorteilhafterweise Gebrauch gemacht.
Da das Reaktionsgemisch sich in Ruhe befindet, verlängert sich die Antiglobulin-Inkubation und die Ziegen-Anti-IgG 7 reagieren
mit den Ziegen IgG 3 oder 5 in der Weise, daß sich die beständigsten Konfigurationen ausbilden.
Da aber,wie oben erläutert, im Falle einer positiven Reaktion
die zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff entstandenen Gänge wesentlich gedrängter angefüllt sind als im Falle einer
negativen Reaktion, sind im Falle einer negativen Reaktion (Fig.6b) wesentlich mehr freie Moleküle Ig 7 vorhanden, die
in den entstandenen Gängen zirkulieren als im Falle einer positiven Reaktion (Fig. 6a). Dies hat zur Folge, daß die einander
gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des Kunststoffes in den Gängen im Falle einer negativen Reaktion
sehr viel schneller mit Ig 7 gesättigt werden, die mit den IgG 5 der roten Blutkörperchen oder mit den IgG 3 des Kunststoffes
kuppeln, als im Falle einer positiven Reaktion. Nach Ablauf einer gewissen Zeit weisen im Falle einer negativen Reaktion
(Fig. 7b) die einander gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des Kunststoffes einen überwiegenden
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Anteil an Konfigurationen folgender Art auf: Kunststoff + IgG 3 der Ziege/Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen.
Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen;
diese Konfiguration kann, da zwei Moleküle gleicher Beschaffenheit
einander gegenüberliegen, nicht zur Ausbildung einer vollständigen Molekülbrücke Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig 7 vom
Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung /Ziegen-IgG 5 + rote=Blutkörperchen
führen.
Da sich diese Konfigurationen während der verlängerten
Antiglobulin-Inkubationen/überwiegender Anzahl bilden, sind
die Molekülbrücken, die sich zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen während der ursprünglichen schnellen Haftung in der
Anlagerungsstufe gebildet haben, nicht, mehr in ausreichender
Zahl vorhanden, um die Haftung aufrechtzerhalten. Es findet
daher eine Ablösung statt.
Im Falle einer positiven Reaktion hingegen (Fig. 7a)
tritt dieser Effekt der Absättigung der gegenüberliegenden Oberflächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch
Ig 7 sehr viel langsamer ein, so daß die Anzahl der mit den IgG gekuppelten Änti-IgG Moleküle noch nicht zur Aufhebung
der Haftung der roten Blutkörperchen in dem Zeitpunkt führt, zu dem im Falle einer negativen Reaktion bereits eine Ablösung
stattfindet.
Die Dauer dieser Unterbrechung beim Zentrifugieren bzw.
der verlängerten Antiglobulin-Inkubation wird also so geregelt oder gesteuert, daß das Ausmaß der Sättigung der einander gegenüberliegenden
Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Ig 7 Moleküle, das im Falle einer negativen Reaktion zur
Ablösung führt, erreicht wird, das aber andererseits der Effekt
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der Sättigung, der im Falle einer positiven Reaktion zur Ablösung (Aufhebung der Haftung) führt, nicht erreicht wird.
g) Es folgt die letzte Stufe, in der zentrifugiert wird und zwar bei einer Geschwindigkeit V2, die größer ist als
die Geschwindigkeit V-] . Mit Hilfe dieser Zentrifugierphase
kann nun unterschieden werden zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion. Die Geschwindigkeit V^ wird
so gewählt, daß die erzeugte Zentrifugalkraft die stärker mit Ig 7 gesättigten roten Blutkörperchen, d.h. die Blutkörperchen,
welche die negative Reaktion anzeigen, in die Kuppe bzw. den Scheitelpunkt 10 des Bechers mitnimmt un<^ dort sammelt
(Fig. 8b), während die roten Blutkörperchen, welche die positive Reaktion anzeigen oder kennzeichnen und die an der
Becherwand haften bleiben aufgrund der stehen gebliebenen Molekülbrücken, nicht mitgenommen werden. Diese Molekülbrücken:
Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig vom Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung/Ziegen-IgG
5 + rotes Blutkörperchen (Fig. 8a)bleiben erhalten, weil die Phase oder Stufe der verlängerten Antiglobulin-Inkubation
abgebrochen wird, bevor der Sättigungsgrad an Ig des Antiglobulins erreicht ist, welcher zur Ablösung führt.
In der Praxis wird bei Verwendung eines Bechers mit einem öffnungswinkel des Konus von 120° beim zweiten Mal, d.h. in
der letzten phase mit einer Beschleunigung von etwa 500g während einer Zeitspanne von etwa 40 Sekunden zentrifugiert.
Die Analysenergebnisse können dann unmittelbar nach Abstoppen dieser zweiten Zentrifugierphase beobachtet werden.
Im Falle einer positiven Reaktion, d.h. in dem Fall, in dem die Serumprobe, mit welcher die roten Blutkörperchen vom
Schaf inkubiert worden sind, tatsächlich Antigen HBg enthält,
bleiben die roten Blutkörperchen am Becherboden haften bzw. fixiert und zwar über die IgG 3, die Ig 7 und die IgG 5.
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Man beobachtet dann beim Betrachten des Bechers entlang seiner Achse 1b (Fig. 9a) eine homogene Monoschicht von
roten Blutkörperchen, die über die gesamte Oberfläche des Becherbodens verteilt ist: es liegt Haftung vor.
Wenn andererseits die analysierte Serumprobe kein Antigen HB s enthält, werden die roten Blutkörperchen^ wie oben
beschriebe^ zur Kuppe des Bechers hin mitgenommen und dort gesammelt. Betrachtet man den Becher entlang seiner Achse,
so beobachtet man hier, daß sich ein Mikrosediment aus roten Blutkörperchen gebildet hat (Fig. 9b): es liegt keine Haftung
vor.
Die Mengen der eingesetzten Reaktionspartner sind nicht kritisch. Als Beispiel sei angegeben, daß in einem Becher mit
einem Durchmesser von 1 bis 7 mm das Volumen der eingebrachten Flüssigkeit 15 bis 250 μΐ beträgt, wobei die Blutkörperchen-Suspension
und das Antiglobulin vorteilhafterweise in gleichen Volumina eingesetzt werden.
Wie sich aus der bisherigen Beschreibung ergibt, müssen bestimmte Stufen unter genauen Bedingungen durchgeführt werden.
Die verwendete Antiglobulin-Konzentration hängt ab von der Oberflächendichte an IgG, die die im Verlauf der Stufe b)
erhaltenen vorbehandelten und als Reaktionspartner dienenden roten Blutkörperchen aufweisen; dies wird nachfolgend mit Bezug
auf das zweite Anwendungsbeispiel des Verfahrens noch näher erläutert.
Die Antiglobulinkonzentration muß ausreichend hoch sein, damit einerseits eine schnelle Änfangshaftung zwischen roten
Blutkörperchen und Behälterwand im Verlauf der ersten Zentrifugierstufe stattfindet und damit andererseits ein Überschuß an
Anti-IgG Molekülen vorhanden ist, die ggf. zum Vorgang der Ablösung
der roten Blutkörperchen führen können, Kennzeichen der negativen Reaktion, wie weiter oben unter f) erläutert. Die
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1A-51 820
Äntiglobulxnkonzentratxon soll andererseits nicht zu hoch sein,
damit im Verlauf der Anlagerungsphase nicht zuviel Molekülbrücken zwischen roten Blutkörperchen und Behälterwand ausgebildet
werden, da sonst selbst im Falle einer negativen Reaktion kleine Gänge entstehen, die den Umlauf oder die Zirkulation
der Anti-IgG Moleküle beim Abstoppen des Zentrifugieren stören
würden.
Bei der Ausführung dieser Reaktionen der Immuno-Haftung wurde zusätzlich zu einer von der Äntiglobulxnkonzentratxon
abhängigen '!Zonen-Erscheinung" bzw. einem "Zonen-Vorgang", d.h. einer starken Schwankung der Sensibilität der Reaktion der
Immuno-Haftung um ein Maximum,entsprechend einer bestimmten Äntiglobulxnkonzentratxon noch eine weitere Zonen-Erscheinung
bzw. ein weiterer Zonen-Vorgang nachgewiesen, der von der Zeit abhängt, während welcher dieses Antiglobulin mit den IgG vor
dem Zentrifugieren in Berührung steht. Diese von der Berührungszeit abhängige Zonen-Erscheinung, die einen stärkeren Einfluß auf
die Empfindlichkeit der Reaktion hat als die von der Äntiglobulxnkonzentratxon
abhängige Zonen-Erscheinung, kann folgendermaßen erklärt werden:
Im Verlauf der Antiglobulin-Inkubation kuppeln die vom
Antiglobulin beigesteuerten Anti-IgG Moleküle einerseits mit den an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG und andererseits
mit den an den Kunststoff des Bechers gebundenen IgG, wobei die Anzahl der gekuppelten Anti-IgG Moleküle von der
Inkubationszeit abhängt. Wie schon gesagt, folgt auf die Phase der Antiglobulin-Inkubation eine erste Zentrifugierphase, die
auch als Anlagerungsphase bezeichnet wird. Je länger die Inkubation dauert, umso häufiger wird sich ein bereits an ein rotes
Blutkörperchen gebundenes Anti-IgG Molekül während der Anlagerungsphase gegenüber einem Molekül gleicher Beschaffenheit finden,
d.h. gegenüber einem Anti-IgG Molekül, das seinerseits an den Kunststoff fixiert ist. Diese Konfiguration: rotes Blutkörperchen+IgG/Anti-IgG
... Anti-IgG/IgG+Kunststoff, die während der
Anlagerung des roten Blutkörperchens an den Becherboden ausgebildet wird, wirkt sich ungünstig auf die Möglichkeit einer
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Haftung des roten Blutkörperchens am Kunststoff aus. Hieraus ist leicht zu ersehen, daß die Häufigkeit der Ausbildung derartiger
für die Haftung ungünstiger Konfigurationen mit der Dauer der Antiglobulin-Inkubation zunimmt und daß infolgedessen
die Chancen der Haftung, d.h. die Höhe oder das Ausmaß der Sensibilität dieser Reaktion umso geringer ist, je länger
die Antiglobulin-Inkubation dauert.
Die Sensibilität erreicht jedoch für eine Inkubationszeit Null kein Maximum. Es müssen nämlich, damit die Haftung
tatsächlich realisierbar und wahrnehmbar ist, in dem Moment, in dem die Anlagerung stattfindet, einige Anti-IgG Moleküle
bereits an einen der Kupplungspartner gebunden sein, d.h. entweder an die IgG, die ihrerseits mit einem roten Blutkörperchen
verbunden sind;oder an die IgG, die auf dem Kunststoff fixiert sind. Einige Sekunden oder Bruchteile von Sekunden
reichen aus, damit diese einigen Anti-IgG Moleküle sich binden oder kuppeln können.
Diese außerordentlich kurze Inkubationszeit wird vorteilhafterweise
experimentell bestimmt,derart, daß in der
unmittelbar auf die Antiglobulininkübation folgenden Stufe,
d.h. in der Anlagerungsphase alle Reaktionen zur Anlagerung führen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ sind.
Es werden also die verschiedenen Stufen des Verfahrens beschrieben
für eine negative Reaktion ausgeführt, d.h. im vorliegenden Falle unter Verwendung einer Serumprobe, die
kein HBS-Antigen enthält, wobei die geeignete Dauer der Inkubation
so beschaffen ist, daß man in der Anlagerungsphase 100 %
Anlagerung oder Bindung erzielt.
Weiterhin sei bemerkt, daß die Immuno-Haftung oder Immuno-Adhärenz
im Verlauf der Entwicklung der Antiglobulin-Inkubation außerordentlich empfindlich ist für die schwachen oder geringfügigen
Verringerungen der Oberflächendichte der an den Kunststoff fixierten IgG, die noch frei sind von Anti-IgG Molekülen.
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Der Zentrifugiervorgang insgesamt ist, wie oben beschrieben, komplex und läuft in mehreren Phasen ab, von denen
jede einen besonderen mechanischen Effekt auf die Reaktionen ausübt. Bevor die genauen Bedingungen, die im Verlauf dieser
Zentrifugierphasen eingehalten werden müssen, weiter erklärt " werden, seien die bei einer Zentrifugation auftretenden
oder eingreifenden Kräfte mit Bezug auf Fig.10 betrachtet.
Das Zentrifugieren, erzeugt durch eine Rotation um eine Achse 1a, die senkrecht steht zur Rotationsachse Ib des Bechers,
hat den Effekt, daß ein rotes Blutkörperchen H oder eine andere Zelle oder ein anderes Teilchen, das zum Nachweis des Vorgangs
der Haftung oder der Nichthaftung verwendet wird, einer Zentrifugalkraft Fc unterworfen ist, die parallel gerichtet ist der
Achse 1b des Bechers. Außerdem spielen noch eine Reihe weiterer Parameter eine Rolle, die wie folgt definiert werden:
Der Winkel et, der von einer Mantellinie des Konus des Bechers mit ihrer Projektion in eine Ebene senkrecht zur Richtung der
Zentrifugalkraft gebildet wird und der "Neigungs"-Winkel bezeichnet
wird;
die Masse m eines roten Blutkörperchens;
der Zahlenwert η für die Beschleunigung g, die angewandt wird, wenn bei einer Geschwindigkeit von V UpM zentrifugiert
wird;
die Zeitspanne t, während welcher die Geschwindigkeit angewandt wird;
die summe der als nicht spezifisch bezeichneten Kräfte (PNS), welche ein rotes Blutkörperchen am
Kunststoff zurückhalten; diese Summe umfaßt die elektrostatischen Kräfte der Anziehung eines roten
Blutkörperchens an den Kunststoff; die immunochemischen Bindungen"parasitäre"Spezifität mit Bezug auf die Hauptspezifität,
auf welcher die Reaktion beruht, die Widerstandskräfte gegenüber dem Abrutschen oder Abschleudern
909835/0796 " -25-
(Α-5Ί 820
.37.
mittels Unterstützung durch die lokalen Hindernisse (Rauheit des Bechers, Anlehnung oder Abstützen auf
der benachbarten Zelle oder den benachbarten Teilchen in geneigter (schräger) Stellung);
die Summe der spezifischen Bindungskräfte, die ein rotes
Blutkörperchen auf der Neigung oder geneigten Wand des Bechers zurückhalten, bezeichnet mit FS,und die bestehen
aus der Kette der Bindungen zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen, nämlich:
IgG(fixiert an einen Kunststoff)/Molekül Änti-IgG/
(IgG gebunden an das rote Blutkörperchen)
die Anlagerungskraft, die auf das rote Blutkörperchen
ausgeübt wird, bei einer Geschwindigkeit von V UpM, d.h. die Kraft der Auflage des roten Blutkörperchens auf dem
Kunststoff entsprechend der Teilkraft der Zentrifugalkraft senkrecht zu einer Mantellinie des Konus. Diese Anlagerungskraft
wird mit Pp bezeichnet und ist gleich η χ m χ cos«(;
die Kraft zum Abschleudern, die auf ein rotes Blutkörperchen bei einer Geschwindigkeit von V UpM ausgeübt wird, d.h.
die Kraft,mit der das rote Blutkörperchen abgelöst oder
abgerissen werden soll, durch die Teilkraft der Zentrifugalkraft parallel zu einer Mantellinie des Konus. Diese Abschleuder-Kraft
wird als F^ bezeichnet und ist gleich η χ m χ sin 0\.
Nach diesen allgemeinen Betrachtungen sollen nun die Vorgänge im einzelnen erläutert werden, die sich im Verlauf der verschiedenen
Zentrifugxerphasen abspielen.
Im hier beschriebenen Beispiel wird angestrebt, daß in der ersten Zentrifugierphase, d.h. in der Anlagerungsstufe, eine
schnelle Haftung der roten Blutkörperchen eintritt und infolgedessen eine schnelle Ausbildung von Gängen zwischen den ein-
8O9635/07ii
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ander gegenüberliegenden Oberflächen von Kunststoff und roten Blutkörperchen; diese Gänge spielen die Rolle von
Filtern gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Anti-IgG Molekülen, wie weiter oben bereits erläutert.
Die Geschwindigkeit V-j dieser ersten Zentrifugierphase
wird somit so gewählt, daß die Anlagerungskraft Fp^ bewirkt,
daß 100 % der roten Blutkörperchen haften und zwar bei allen Reaktionen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ
verlaufen. Diese Geschwindigkeit V-\ muß somit so gewählt
werden, daß die Abschleudergeschwindigkeit F^., nicht so stark
ist, daß die Bindungskräfte, welche die roten Blutkörperchen am Boden des Bechers halten, aufgehoben werden.
Damit die durch Haftung der roten Blutkörperchen am Kunststoff gebildeten Gänge als Filter wirken können im Verlauf
der nachfolgenden Phase, wenn das Zentrifugieren unterbrochen wird oder wenn mit sehr geringer Geschwindigkeit zentrifugiert
wird, muß außerdem die Geschwindigkeit V-) ausreichend
schwach sein, damit bei der Anlagerung der roten Blutkörperchen an den Boden des Bechers diese roten Blutkörperchen nicht
zerdrückt werden. Wenn nämlich die Anlagerung zu stark ist und die roten Blutkörperchen auf dem Kunststoff dabei zerdrückt
werden, werden auch die Gänge zerdrückt und sind nachfolgend nicht mehr vorhanden, und zwar auch im Falle der negativen Reaktionen.
Die freien Anti-IgG Moleküle könnten dann nicht mehr zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen zirkulieren, so daß
der Vorgang der Absättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Anti-IgG
Moleküle, der weiter oben bei der Beschreibung der verschiedenen Stufen des Verfahrens näher erläutert ist, nicht mehr ablaufen
könnte.
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§09835/0711
1A-51 820
. 39.
Andererseits darf aber die Geschwindigkeit V-j in dieser
Anlagerungsstufe nicht zu gering sein. Eins zu schwache Anlagerung oder zu geringe Anlagerung würde eine ungenügende
Annäherung der reaktionsfähigen Enden zur Folge haben, d.h.
eine ungenügende Annäherung der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG und der an den Kunststoff fixierten IgG, so daß
sich die Haftung schlecht ausbilden könnte und die Gänge nicht recht Form annehmen könnten.
Die zweite Zentrifugierphase setzt nicht unmittelbar nach der Anlagerungsstufe ein, sondern nach einer gewissen
Pause oder Unterbrechungszeit, in der - wie bereits erläutert eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation stattfindet. Die
zweite Zentrifugierphase wird mit einer Geschwindigkeit V2
durchgeführt, die größer ist als die Geschwindigkeit V-j. Diese
Zentrxfugiergeschwxndigkeit V2 muß die Wirkung haben, daß die
roten Blutkörperchen, welche am meisten Anti-IgG Moleküle während der verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden haben,
d.h. die roten Blutkörperchen, die für eine negative Reaktion charakteristisch sind, zum Scheitelpunkt bzw. Kuppe 10 des
Becherbodens hin mitgenommen werden, daß aber andererseits die roten Blutkörperchen nicht mitgenommen werden, die eine
positive Reaktion kennzeichnen und die,wie oben näher erläutert, infolge der Haftung an den Wändeides Becherbodens auch nach der
verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden bleiben, d.h. nachdem das Zentrifugieren unterbrochen worden ist.
Die Geschwindigkeit V2 wird daher so gewählt, daß die erzeugte
Abschleuderkraft F^/ die auf ein rotes Blutkörperchen einwirkt,
stärker ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte, die dann alleine ein rotes Blutkörperchen zurückhalten, das
am Becherboden eine negative Reaktion kennzeichnet; andererseits muß die Abschleuderkraft kleiner sein als die Summe
aus FNS + FS, d.h. der unspezifischen und der spezifischen Bindungskräfte, durch die mittels Haftung die roten Blutkörperchen,
welche eine positive Reaktion kennzeichnen, am Becherboden zurückgehalten werden.
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In diesem Falle werden nur die roten Blutkörperchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen, abgeschleudert
und sammeln sich in der Kuppe des Bechers, während die Blutkörperchen,die eine positive Reaktion kennzeichnen,
haften bleiben. Die Unterscheidung zwischen positiver und negativer Reaktion ist dann sehr deutlich.
Für jedes untersuchtes System, d.h. für eine besondere Beschaffenheit der als Reaktionspartner verwendeten Zellen
oder Teilchen, des viralen Antigens, das nachgewiesen werden soll, und der an der Reaktion beteiligten Moleküle IgX I und
Anti-IgX I können somit die optimalen Werte für die oben definierten
Parameter festgelegt werden, welche beim Zentrifugieren
beteiligt sind und für die die Reaktion die besten Ergebnisse liefert. Man kann dann feststellen, daß das Verhältnis von
Abschleuderkraft F<j zur Anlagerungskraft F , das eine mögliche
Ablösung bzw. ein mögliches Abschleudern anzeigt, gleich ist: d.h. tanoC. Der Zahlenwert
Ii. Λ IU X COS OS·
hängt also nur von dem Neigungswinkel^ ab.
d.h. tanoC. Der Zahlenwert für dieses Verhältnis
Λ IU X COS OS·
für Für einen Winkel o< = 0 beträgt somit der Wert/tan o(
ebenfalls 0 und die Möglichkeit, daß das Teilchen abgeschleudert wird, ist gleich O. Für einen Winkel Λ. = 90° hingegen ist der
Zahlenwert für tan ck unendlich, so daß ebenfalls die Möglichkeit,
daß die Teilchen abgeschleudert werden, unendlich ist, mit anderen Worten ein Nichtabschleudern bzw. Haftenbleiben
ist unmöglich.
Die Zwischenwerte für den WinkelK. ermöglichen somit eine
Dosierung oder mengenmäßige Festlegung des Verhältnisses von Abschleuderkraft zu Anlagerungskraft und die Anpassung dieses
Verhältnisses an die Beschaffenheit der Zellen oder als Reaktionspartner
verwendeten Teilchen, des viralen Antigens und der beteiligten Moleküle IgG I und Anti-IgG I, so daß man ein
spezifisches Abschleudern oder Ablösen von Zellen oder Reaktionspartner-Teilchen,
welche eine negative Reaktion kennzeichnen, im Verlauf der zweiten Zentrifugierphase erhält.
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Um unter den bestmöglichen Bedingungen arbeiten zu können, soll daher vorteilhafterweise ein Satz Becher mit
unterschiedlicher Neigung vorhanden sein, so daß der Becher mit der Neigung oC gewählt werden kann, die am besten der Beschaffenheit
der in Rede stehenden Reaktion entspricht.
Man kann auf diese Weise gleichzeitig unter den gleichen Bedingungen beim Zentrifugieren, d.h. mit den gleichen Werten
für die angewandte Zentrifugalkraft, Analysen von mehreren unterschiedlichen Proben durchführen, in denen virale Antigene
unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen, indem für jede dieser verschiedenen
Analyseproben der Becher gewählt wird, dessen Boden einen Neigungswinkelot mit einem solchen Wert aufweist, daß
die für eine negative Reaktion charakteristischen Zellen oder Reaktionspartner-Teilchen abgeschleudert werden, wenn die
für die zweite Zentrifugierphase gewählte verfügbare Zentrifugalkraft
angewandt wird.
Erfindungsgemäß ist somit auch ein Satz von Bechern mit
V-förmigem Boden vorgesehen, deren öffnungswinkel für den
Konus unterschiedlich sind und beispielsweise den Bereich von 80 bis 140° umfassen und jareils um 10° voneinander verschieden
sind.
Für das oben beschriebene Beispiel zum Nachweisen von viralem Antigen HB3 in einer Blutprobe werden vorteilhafterwexse
Becher mit konischem Boden und einem öffnungswinkel des Konus
von 120° verwendet.
Ipig. 15 zeigt beispielhaft ein Diagramm der verschiedenen
Zentrifugierphasen, die im Verlauf einer Reaktion zum Nachweisen
von Antigen HBg in einer Humanblutprobe durchgeführt werden,
wobei die Reaktion der Immuno-Haftung in einem Becher mit konischem Boden und einem öffnungswinkel des Konus von 120°
vorgenommen wird. Auf der Ordinate ist die Zentrifugalkraft, angegeben in ' ' g, aufgetragen und auf der Abszisse die Zeit
in Sekunden.
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Das Reaktionsmedium, welches die zuvor mit der Serumprobe und dem Antiglobulin inkubierten Blutkörperchen enthält,
wird in den Becher eingebracht, dessen Boden mit einer Schicht oder Haut aus Ziegen-IgG überzogen ist und dort einer Antiglobulin-Inkubation
unterworfen. Wie bereits angegeben, wird der Becher während dieser Inkubation ständig in Bewegung gehalten,
beispielsweise hin- und hergehenden Bewegungen in einer Richtung parallel zur Umdrehungsachse. Diese Phase der Antiglobulin-Inkubation
und des Schütteins ist in Fig.15 mit I bezeichnet. Diese Phase wurde hier mit einer Beschleunigung von 4g durchgeführt,
einem Wert, der keine Auswirkung hat auf das Absinken oder die Anlagerung der roten Blutkörperchen an den Becherboden.
Mit der Beschleunigung 4g wurde während fünfzehn Sekunden zentrifugiert.
Dann wurde die Beschleunigung schnell erhöht bis zu einem Wert von 20Og und dieser Wert bis zur sechzigsten Sekunde
nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Becher beibehalten, In der fünfzehnten Sekunde begann somit eine Phase II, in der die
roten Blutkörperchen absanken, wobei die Gesamtmenge der roten Blutkörperchen in der dreißigsten Sekunde am Becherboden versammelt
war. Auf diese Phase II folgt die Anlagerungsphase III, in der alle roten Blutkörperchen an dem Becherboden angelagert
wurden und zwar sowohl im Falle der positiven Reaktionen wie im Falle der negativen Reaktionen; gleichzeitig begann die Bildung
der "Filtergänge" zwischen der Oberfläche des Becherbodens und den daran anliegenden roten Blutkörperchen.
In der sechzigsten Sekunde begann die Phase der Diffusion der noch frei im Reaktionsmedium zirkulierenden Antiziegen-IgG
Moleküle zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen (Phase IV im Diagramm gemäß Fig. 15); diese Phase stellt, wie bereits oben
erläutert, eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar. Sie wurde ausgeführt, indem mit einer Beschleunigung von 8g
zentrifugiert wurde, einem Beschleunigungswert, der keinen ausreichend
starken Zentrifugal- oder Zentrifugiereffekt erzeugte^
damit die zuvor während der Phase III gebildeten Gänge zerdrückt worden wären. Im Verlauf der Phase IV fand fortschreitend die
■' -η μ 8 3 5 / 0 7 9 6
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Sättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Becherboden durch Antiziegen-IgG Moleküle
statt; die Schwelle, bei der die Ablösung der roten Blutkörperchen
charakteristisch für die negative Reaktio^ im Anschluß
an die Sättigung stattfand, wurde in der dreihundertsten Sekunde erreicht.
Die letzte. Phase, während welcher die gegebenenfalls vorhandenen roten Blutkörperchen, die eine negative Reaktion
kennzeichnen, sich in der Kuppe des Becherbodens sammeln, wurde durchgeführt, indem die Zentrifugxerbeschleunxgung-schnell auf
50Og angehoben wurde; dieser Wert reicht aus, um die für die negative Reaktion kennzeichnenden roten Blutkörperchen mitzureißen,
da sie am Ende der Phase IV, in der die Absättigung mit dem Antiglobulin stattfand, praktisch nicht mehr hafteten.
In dieser letzten Phase V wurden die roten Blutkörperchen, die ihre Haftung im Verlauf der vorangehenden Phase IV verloren
hatten, schnell gesammelt .JDiese letzte Zentrif ugierphase wird in dem Moment abgebrochen, in welchem man einen Prozentsatz
von abgeschleuderten roten Blutkörperchen erhält, der gerade kennzeichnend ist für eine wirkliche oder tatsächliche negative
Reaktion. Im hier gegebenen Beispiel wurde die letzte Zentrifugierphase in der 340-sten Sekunde abgebrochen.
Die Zahlenwerte für die Parameter·jeder dieser Phasen Zentrifugiergeschwindigkeit,
Dauer - können im vornhinein im Verlauf von Versuchen' festgelegt werden, die anhand einer
typischen negativen Reaktion mit den gleichen Reaktionspartnern vorgenommen wurden, wobei der Versuch mit den besten Ergebnissen
die Werte für die Parameter liefert, die dann für die eigentliche Analysereaktion angewandt werden.
Gemäß einer Variante wird das Zentrifugieren entsprechend der
Entwicklung der im Gang befindlichen Reaktionen gesteuert; das Verfahren wird dabei gleichzeitig einerseits in einem Becher
ausgeführt, in welchem die Analysereaktion der Probe vorgenommen wird und andererseits in einem Becher, in welchem eine
negative Kontrollreaktion vorgenommen wird; bei jeder Umdrehung
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während des Zentrifugierens wird mit einem Stroboskop- Blitz
beleuchtet.
Das vergrößerte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera
aufgenommen und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde: die Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosementes,
das sich bildet, werden gemessen und die Wachstumskurve dieses Mikrosementes wird mit der Wachstumskurve des Mikrosementes verglichen,
das bei einer negativen Bezugsreaktion der gleichen Art erhalten wird. Die Geschwindigkeiten und die Zeitdauer beim
Zentrifugieren werden dann so gesteuert, daß die Wachstumskurve des Mikrosementes der negativen Kontrollreaktion der Wachstumskurve der Bezugsreaktion entspricht.
Das Zentrifugieren wird endgültig abgebrochen, wenn die Oberfläche des analysierten Mikrosementes einer Menge abgeschleuderter
roter Blutkörperchen entspricht, die zumindest gleich ist der Menge, welche die Unterscheidungsschwelle für
eine wahre negative Reaktion darstellt und die folgendermaßen definiert wird:
Im Verlauf von Vorversuchen f durchgeführt an negativen
Kontrollreaktionen wird festgelegt, welchen Prozentsatz an roten Blutkörperchen ein Mikrosediment enthält, das eine wahre
negative Reaktion bezeichnet, d.h., daß unterschieden und gemessen werden kann und reproduzierbar ist und das dabei so klein
wie möglich ist. Anschließend wird die Standardabweichung 6"
bestimmt, die für diese negativen Reaktionen erhalten wird. Die Schwelle der Unterscheidung einer negativen Reaktion entspricht
dann einem Prozentsatz roter Blutkörperchen o in einem Mikrosediment, der gleich ist dem für die negative
Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz + 2mal die Standardabweichung. In analoger Weise entspricht die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion einem Prozentsatz roter
Blutkörperchen in einem Mikrosediment, der gleich ist
dem für eine negative Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz, vermindert
um 2mal die Standardabweichung.
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Wenn beispielsweise im Falle einer negativen Reaktion die im Sediment zusammengefaßten roten Blutkörperchen im Mittel
12% ausmachen und die Standardabweichung zu 3% bestimmt wurde, liegt die Unterscheidungsschwelle für eine negative Reaktion
bei 12% + 2mal 3% = 18 %. Entspricht die Oberfläche des Mikrosediments der Analysereaktion einem Prozentsatz an abgeschleuderten
und im Sediment zusammengesammelten roten Blutkörperchen am Becherboden, der gleich oder größer ist als 18 %, so wird
die Reaktion als sicher negativ angesehen. Die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion beträgt in diesem Falle
12 % - 2mal 3% = 6 % : wenn also die Oberfläche des Mikrosedimentes der Analysereaktion einem Prozentsatz an roten Blutkörperchen,
die im Mikrosediment versammelt sind, von 6 % oder weniger entspricht, wird die Reaktion als sicher positiv angesehen.
Entspricht die Oberfläche des entstandenen Mikrosediments einem Prozentsatz von roten Blutkörperchen zwischen 6 und 18 %,
so wird die Reaktion als zweifelhaft bewertet und sollte wiederholt werden. Das soeben beschriebene Ausführungsbeispiel des
erfindungsgemäßen Verfahrens wurde mit Bezug auf den Nachweis des viralen Antigens HB3 in einer Humanblutprobe gegeben. Selbstverständlich
kann dieses Verfahren auch für den Nachweis beliebiger anderer viraler Antigene in einer Blutprobe angewandt
werden, indem dann in entsprechender Weise die Beschaffenheit der Zellen oder Teilchen, die als Reaktionspartner dienen,
die Beschaffenheit der IgX, die am Boden des Bechers fixiert und anbesagten Zellen oder Teilchen gebunden werden, sowie die
Beschaffenheit der Anti-IgX I Moleküle festgelegt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch auf andere biologische Flüssigkeiten als Blut anwenden, beispielsweise
auf Speichel oder Urin, um dort ggf. vorhandene virale Antigene nachzuweisen oder ganz allgemein zum Nachweis von Antigenen,
die als "molekular" bezeichnet werden können, d.h. freie Moleküle,
die nicht an eine Zelle gebunden sind und die Antigen-Eigenschaften
aufweisen, mit der Maßgabe selbstverständlich, daß die verschiedenen Reaktionspartner in entsprechender Weise
modifiziert werden, d.h. die Zellen oder Teilchen, die als Ffeaktions-
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partner dienen, die Immunoglobuline, die mit diesen Zellen oder Teilchen gekuppelt und am Becher fixiert werden sollen, das
Antiglobulin und die verschiedenen anderen Parameter der Reaktion.
Zweites Beispiel für die Ausführung des Verfahrens nach der Erfindung. .
Mit Bezug auf die Fig. 11 bis 14b sei nun ein anderes
Beispiel der Anwendung oder Ausführung des Verfahrens beschrieben, wodurch bestimmt werden kann, ob die roten Blutkörperchen
einer Humanblutprobe die Antigenaktivltät D aufweisen. Die Blutkörperchen, die diese Aktivität aufweisen, entsprechen
einem Individuum mit positivem Rhesusfaktor. Wenn die roten
Blutkörperchen hingegen diese · Aktivitäten nicht aufweisen, ist die entsprechende Versuchsperson Rhesus-negativ. Zunächst
sei eine erste Ausführung dieses zweiten Beispiels beschrieben:
a) Die erste Stufe besteht, wie im ersten Beispiel,darin,
daß die Oberfläche des Trägers vorbereitet wird, auf welcher die Haftung oder Nichthaftung der Zellen bewiesen werden soll
(Fig. 11 und 12) .
Der Träger ist ein Becher 21 aus Kunststoff, beispielsweise
aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem V-förmigen Boden Dieser Boden 22 ist mit einer Schicht oder einem Häutchen
aus Immunoglobulinen 23 überzogen, die der gleichen Tierart und der gleichen immunochemischen Klasse zugehören müssen, wie
die Globuline mit spezifischer Antikorperwirkung des Antigens, dessen evtl. Vorhandensein auf den roten Blutkörperchen untersucht
werden soll. Im vorliegenden Beispiel soll nachgewiesen werden, ob das Antigen D auf der Oberfläche der Membran der
menschlichen roten Blutkörperchen vorhanden ist. Der spezifische Antikörper dieses Antigens ist ein Human-Immunoglobulin, vor
allem vom Typus G mit Antikorperwirkung oder -funktion Anti-D.
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Am Boden des Bechers werden somit Human-Immunoglobuline vom
Typ G fixiert, die man Human-IgG bezeichnet, und die durch
weiße Rechtecke 23 angegeben sind.
Die Fixierung oder Bindung der IgG an den Kunststoff, aus
welchem der Becher besteht, wird unter den gleichen Bedingungen vorgenommen,wie sie oben im ersten Beispiel angegeben wurden.
Nach der Fixierung der IgG an den Becherboden wird mit physiologischer 9%-iger Kochsalzlösung gewaschen, um alle nicht
fixierten IgG zu entfernen.
Die Konzentration an IgG, die eingebracht wird, ist nicht
kritisch. Sie werden vorzugsweise im Überschuß eingebracht, bezogen auf die Menge, welche sich fixieren kann, indem beispielsweise
eine Lösung enthaltend 1mg/ml verwendet wird.
Damit die am Kunststoff gebundene IgG-Schicht nicht trocken wird, beläßt man im Becherboden eine kleine Menge
an physiologischer Kochsalzlösung.
b) Die Zellen, die in diesem Beispiel untersucht oder analysiert werden sollen, sind rote Blutkörperchen einer Humanblutprobe,
die in physiologischer Kochsalzlösung schwimmen; sie werden außerhalb des Bechers bei Umgebungstemperatur und
während einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen 10 Minuten mit einem für die gesuchte Antigenaktivität spezifischen
Testserum in Berührung gebracht, d.h. mit einem Serum, das IgG Moleküle der bekannten Antikörperspezifität Anti-D
enthält, die spezifisch mit den Antigen-D Einheiten kuppeln können, die ggf. auf den roten Blutkörperchen vorhanden sind.
Dieses Serum wird Anti-D Testserum genannt. In der Praxis wird beispielsweise eine Suspension von roten Blutkörperchen aus
einer Blutprobe f verdünnt 1:50 oder 1:10Öfverwendet.
Fig. 13a zeigt auf der rechten Seite schematisch diese Stufe der Inkubation für den Fall, daß die analysierten roten
Blutkörperchen "positiv" sind, d.h., daß sie Anti-D Einheiten tragen; diese Einheiten werden durch Punkte gekennzeichnet,
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LtQ
die auf der Membran der roten Blutkörperchen 24 vorhanden sind. Diese roten Blutkörperchen kuppeln über ihre Antigen Einheiten mit
Antikörper Anti-D IgG Molekülen 25 des verwendeten Testserums, wobei diese IgG Moleküle 25 mit Antikörperaktivität durch gestrichelte
Rechtecke wiedergegeben sind; es entsteht ein Komplex, wie er bei 26 gezeigt ist.
In analoger Weise zeigt Fig. 13b schematisch diese Stufe für den Fall, daß die roten Blutkörperchen 24' "negativ"
sind, d.h. keine Antigen-D-Einheiten tragen. In diesem Falle kuppeln die roten Blutkörperchen 24' keine Anti-D IgG 25.
Nach beendeter Inkubation wird vorteilhafterweise mehrere
Male gewaschen, beispielsweise 3mal mit physiologischer Lösung, wobei jeder Waschgang folgende ArMtsschritte umfaßt:
Einbringen der physiologischen Lösung, erneut in-Suspensionbringen,
Zentrifugieren, Dekantieren, Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit. Gewaschen wird in dem Behälter, in dem
inkubiert worden ist. Man erhält auf diese Weise eine Suspension von inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen, d.h. von
roten Blutkörperchen, die in einem Medium frei von IgG 25 schwimmen.
c) Dann werden gleichzeitig in dem Becher 21, dessen Boden mit Human-IgG 23 beschichtet ist, die Suspension der inkubierten
und gewaschenen roten Blutkörperchen und ein Antiglobulin eingebracht, d.h. eine Lösung von tierischen Antiglobulinen 27,
die Antikörperwirkung gegenüber den Human-IgG aufweisen. Diese Immunoglobuline 27 des Antiglobulins sind im Bild schematisch
mit schwarzen Rechtecken wiedergegeben.
Gemäß einer Variante kann in einen Becher zunächst die Suspension der roten Blutkörperchen und dann das Antiglobulin
eingebracht werden.
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Als Ant!globulin wurde hier ein Immunserum einer Ziege
verwendet, der man die Human-IgG injiziert hatte. Dieses Immunserum liefert Immunoglobuline, bezeichnet als Ziegen-Ig
mit Antihuman-IgG-Wirkung, die eine zumindest divalente Antikörperwirkung
gegenüber den Human-IgG aufweisen; ein Antihuman-IgG Ziegen-Ig kann somit über seine eine Antikörperfunktion
mit einem Human-IgG kuppeln, das am Becherboden fixiert ist und über die andere Funktion oder Gruppe mit einem Human-IgG, das
an ein rotes Blutkörperchen gebunden ist.
Das Antiglobulin wird hier in starker Konzentration verwendet. Die Sensibilität der Immuno-Haftungsreaktion hängt
nämlich von der Antiglobulinkonzentration ab. Eine mögliche Erklärung dieser Erscheinung kann folgendermaßen lauten:
gleichgültig wielange praktisch die Antiglobulin-Inkubation gedauert hat, wird eine 100 %-ige Absättigung der IgG bei
weitem nicht erreicht und zwar sowohl bei den IgG,gebunden an
die roten Blutkörperchen, wie auch bei den an den Becherboden fixierten IgG. Die Auskleidung mittels der Abscheidung von
roten Blutkörperchen bewirkt somit, daß sich eine beträchtliche Anzahl von heterologen IgG Molekülen nähern, d.h. von IgG, die
am Becherboden fixiert sind und von IgG, die an die roten Blutkörperchen gebunden sind. Solange jedoch das rote Blutkörperchen
nicht durch Haftung immobilisiert worden ist, d.h. solange die Moleküle des Antiglobulins keine Brücke gebildet haben-zwischen
den an das rote Blutkörperchen gebundenen und den am Kunststoff fixierten IgG rollt oder gleitet das rote Blutkörperchen auf
der Neigung des Becherbodens, der mit IgG überzogen ist, so daß die Zeitdauer der maximalen Annäherung der beiden gegebenen
heterologen IgG Moleküle sehr kurz ist und dies umso mehr, je weniger die roten Blutkörperchen mit IgG besetzt sind. Die
Zeitspanne,während welcher die Entfernung günstig bleibt für
eine Doppelreaktion mit einem Molekül des Antiglobulins,ist somit sehr kurz. Ist der kürzeste mittlere Abstand zwischen einem
Antiglobulin-Molekül und zwei heterologen IgG-Molekülen zu groß,
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damit die mittlere Zeit des Zutrittes dieses Antiglobulin-Moleküls
kleiner ist als die wirksame Zeit der Annäherung von zwei heterologen IgG-Molekülen auf günstige Entfernung, so wird
keine Reaktion stattfinden. Man erkennt sofort, daß durch Erhöhen der Antiglobulin-Konzentration diese mittlere Zutritt-Zeit
verringert wird.
Außerdem muß, da man nicht im voraus die IgG-Oberflächendichte
der roten Blutkörperchen kennen kann, das Antiglobulin in starker Konzentration verwendet werden, um sicherzustellen,
daß selbst im Falle einer sehr geringen Oberflächendichte an
IgG der roten Blutkörperchen die Anti-IgG-Moleküle mit den
wenigen auf den roten Blutkörperchen vorhandenen IgG reagieren können, um sie auf diese Weise an den Behälter anzulagern. In
diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß der Einfluß der Antiglobulinkonzentration auf die Empfindlichkeit der Reaktion weniger
stark ist im Falle des Nachweises eines viralen Antigens, wie HBS-Antigen, da in diesem Falle die Oberflächendichte an IgG
der roten Blutkörperchen, welche als Reaktionspartner dienen, relativ hoch angesetzt wird.
Man verwendet beispielsweise ein Antiglobulin mit Antihuman-IgG-Wirkung,das
einen Titer von mindestens 128 gemäß Coombs aufweist, rein oder wenig verdünnt. In der Praxis
wird eine Verdünnung des Antiglobulins verwendet, die die als optimal bestimmte Konzentration aufweist mit Bezug auf die
Empfindlichkeit der anderen bekannten Analyseverfahren, insbesondere
im Hinblick auf den Coombs-Test, der auf einer Hämagglutination beruht.
Im Becher wird dann die nach der Stufe b) erhaltene Suspension von Blutkörperchen mit dem Antiglobulin inkubiert#
wobei der Becher ggf. im Verlauf dieser Antiglobulin-Inkubation
in Bewegung gehalten wird.
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d) Anschließend an diese Inkubation wird sitrifugiert;
dies muß unter genau bestimmten Bedingungen erfolgen, weil bei diesem Zentrifugieren der Vorgang der Haftung eintritt oder nicht,
je nachdem, ob die roten Blutkörperchen positiv oder negativ sind.
Wie oben mit Bezug auf das erste Beispiel erklärt, soll die Antiglobulin-Inkubation sehr kurz sein. Man beginnt daher
mit dem Zentrifugieren wenige Sekunden bis zu wenigen 10 Sekunden nach dem Einbringen des Reaktionsmediums, bestehend ais Suspension
der roten Blutkörperchen und Antiglobulin in den Becher, d.h. nach einer Zeitspanne,die ausreichend kurz ist, damit noch sehr wenige
an den Becherboden fixierte IgG (IgG 23) oder an die Blutkörperchen gebundene IgG (IgG 25) mit den Antihuman-IgG Ig-MoIekülen
des Antiglobulins besetzt bzw. gekuppelt sind, wenn die entsprechenden Voraussetzungen gegeben sind.
Bei diesem Zentrifugieren wird um eine Achse 21a rotiert,
die senkrecht verläuft zur Rotationsachse 21b des Bechers, und zwar in zwei Stufen oder Zeitabschnitten bzw. Phasen:
In der ersten Stufe wird das Reaktionsmedium gegen die Fläche des Becherbodens 22 verteilt und daran angelagert, so
daß alle Komplexe aus roten Blutkörperchen und IgG, wenn solche gebildet worden sind, oder alle durch die Inkubation mit dem
Anti-D-Testserum nicht veränderten roten Blutkörperchen den IgG gegenüberliegen oder -stehen, die an den Kunststoff fixiert
sind, in/dem eine erste Zentrifugiergeschwindigkeit V-] angewandt
wird, deren Zahlenwert nicht ausreicht, um die roten Blutkörperchen in die Kuppe 30 des Becherbodens mitzunehmen bzw.
mitzuziehen.
Wie sich aus den oben dargelegten allgemeinen Betrachtungen ergibt, wird die Geschwindigkeit V-j dieser ersten Zentrifugierphase
so gewählt, daß die hierdurch erzeugte Abschleuder-Geschwindigkeit
F^-j nicht stark genug ist, um die unspezifischen
Bindungskräfte FNS aufzuheben oder zu zerreißen, die die roten
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Blutkörperchen am Becherboden festhalten. Die roten Blutkörperchen
werden somit a n9"elagert und befinden sich in einer Stellung,
die es ggf. ermöglicht, daß Antihuman-IgG Moleküle des Antiglobulins eine Brücke ausbilden zwischen den am Kunststoffboden
fixierten Human-IgG und den an den roten Blutkörperchen gebundenen Human-IgG. Diese Anlagerungsphase ermöglicht auch, daß
Antihuman-IgG Moleküle, die bereits fest mit den Komplexen aus positiven roten Blutkörperchen und IgG gebunden sind, den noch
verfügbaren IgG-Stellen auf dem Kunststoff gegenüber angeordnet
werden, d.h. in eine günstige Stellung, um vollständige Molekülbrücken zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen auszubilden.
Die erste Zentrifugiergeschwindigkeit V^ wird außerdem
ausreichend lang beibehalten, damit, wenn erforderlich, diese
Molekülbrücken zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen sich ausbilden und vervollständigt werden; diese Brücken bestehen
aus einer Kette folgender Bindungen:
Kunststoff + IgG 23/Antiglobulin 27/IgG 25/positive Blutkörperchen
24.
In der Praxis wird die Reaktion ^n einem Becher ausgeführt,
der einen öffnungswinkel des Konus von 120° aufweist; die erste Zentrifugierphase wird mit einer Beschleunigung von
etwa 200g während etwa einer Minute vorgenommen.
e) Hierauf folgt eine zweite Zentrifugierphase die bei einger Geschwindigkeit V"2 durchgeführt wird, welche größer ist
als die Geschwindigkeit V-j. Durch diese zweite Zentrifugierphase
kann zwischen positiver und negativer Reaktion unterschieden werden. Die Geschwindigkeit \Λ>
wird so gewählt, daß die erzeugte Zentrifugalkraft die negativen roten Blutkörperchen, sofern vorhanden,
in die Kuppe 30 des Becherbodens zieht und sie hier versammelt bzw. zusammenballt (Fig.14b). Sie reicht hingegen nicht
aus, um die positiven roten Blutkörperchen mitzunehmen, die
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an die Becherwand gebunden bleiben, und zwar mit Hilfe der IgG 23, der Antihuman-IgG Moleküle 27 und der IgG 25 (Fig. 14a.).
Die Geschwindigkeit V^ wird also so gewählt, daß die durch
dieses Zentrifugieren erzeugte Abschleudergeschwindigkeit F^2
eine Intensität aufweist, die größer ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte FNS, die ein negatives rotes
Blutkörperchen am Becherboden halten, jedoch kleiner als die Summe aus unspezifischen Bindungskräften und spezifischen
Bindungskräften FNS + FS, die ein positives rotes Blutkörperchen
am Becherboden festhalten.
In der Praxis wird, wenn diese Reaktion in einem Becher mit einem Scheitelwinkel von 120° ausgeführc wird, in dieser
zweiten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 1600g zentrifugiert,
und zwar während einiger Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden.
Die Analyseergebnisse erscheinen unmittelbar nach Ende der Reaktion.
Im Falle einer positiven Reaktion, d.h. wenn die analysierten roten Blutkörperchen tatsächlich Antigen D Aktivität
aufweisen, bleiben alle Komplexe 26 aus roten Blutkörperchen
und IgG am Becherboden gebunden und zwar über die Antihuman-IgG Moleküle 27 (Fig. 14a) und die Human-IgG 23. Man beobachtet dann
beim Betrachten des Bechers entlang seiner. Achse 21b (rechte Seite der Fig.14a) eine homogene Monoschicht aus roten. Blutkörperchen,
die über die gesamte Fläche des Becherbodens verteilt sind: es liegt Haftung vor.
Wenn die analysierten roten Blutkörperchen hingegen keine Antigen D Aktivität aufweisen, werden sie im Verlauf der zweiten
Zentrifugierphase in die Kuppe 30 des Becherbodens mitgenommen und hier zusammengeb3Lit..Betrachtet man den Becher entlang seiner
Achse, so beobachtet man in diesem Falle die Bildung eines Mikrosedimentes
31, das aus roten Blutkörperchen besteht (rechte Seite
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.Sk.
der Fig. 14b): Es ist nicht zur Haftung gekommen.
Die angewandten Mengen der Reaktionspartner sind nicht kritisch. In einem Becher mit Durchmesser 1 bis 7 mm wird
beispielsweise ein Flüssigkeitsvolumen von 15 bis 250 μΐ eingebracht,
wobei vorteilhafterweise gleiche Volumina an Suspension der roten Blutkörperchen und an Äntiglobulin eingesetzt werden.
Das saben mit Bezug auf die Untersuchung, ob Antigen-D-Einheiten
auf roten Blutkörperchen vorhanden sind oder nicht, beschriebene Verfahren kann unter den gleichen Bedingungen
angewandt werden, um zu untersuchen, ob Serum oder Plasma einer Humanblutprobe Anti-D spezifische Antikörper enthalten. In diesem
Falle wird das Serum, welches analysiert werden soll, mit Test-Blutkörperchen inkubiert, die bekannte Antigen-D-Spezifität
aufweisen: wenn das Serum, welches analysiert werden soll, Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält, kuppeln die von
diesem Serum gelieferten Immunoglobuline mit Anti-D spezifischer Antikörperwirkung mit den Antigen D Einheiten der roten Blutkörperchen.
Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen werden dann vorteilhafterweise gewaschen, und in den Behälter
eingebracht, wie oben beschrieben, und zwar gleichzeitig mit dem Antiglobulin; anschließend werden die gleichen Zentrifugierstufen
durchgeführt,wie oben erwähnt.
Ist die Reaktion positiv, d.h. enthält das Serum, das analysiert werden soll, in der Tat Anti-D spezifische Antikörper,
so bildet sich eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen
aus, die an der Oberfläche des Becherbodens haften aufgnnd
der Ausbildung·von Molekülbrücken der Konfiguration Kunststoff +
IgG/Anti-IgG/Ig^rote Blutkörperchen. Enthält hingegen das Serum,
das analysiert werden soll, keine Anti-D spezifischen Antikörper, so ist die Reaktion negativ und die Blutkörperchen, die nicht
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am Becherboden zur Haftung gebracht werden konnten, finden sich am Ende der Reaktion in Form eines Mikrosedimentes in der
Kuppe des Bechers.
Das Verfahren wurde bisher beschrieben mit Bezug auf die Untersuchung, ob rote Blutkörperchen Antigeneinheiten D
tragen oder ob im Plasma oder Serum einer Blutprobe Antikörper mit Anti-D-Spezifität vorhanden sind; es kann auch für die
Untersuchung oder den Nachweis beliebiger anderer erythrozytärer Antigene oder beliebiger anderer Antikörper im Plasma einer
Blutprobe angewandt werden. Wild die Untersuchung im Hinblick auf ein bestimmtes erythrozytäres Antigen geführt, so werden
die Blutkörperchen, für die bestimmt werden soll, ob sie in der Tat Antigenaktivität aufweisen, mit einem Testserum inkubiert,
das den bekannten spezifischen Antikörper des gesuchten Antigens enthält. Umgekehrt wird, wenn man wissen will, ob das
Plasma einer Blutprobe einen bestimmten Antikörper enthält, dieses Serum mit bekannten Test-Blutkörperchen inkubiert, die
die dem, gesuchten Antikörper entsprechende Antigen-Aktivität
aufweisen.
Diese Test-Blutkörperchen können rote Blutkörperchen sein, die Antigeneinheiten tragen, welche für den gesuchten Antikörper
spezifisch sind. Es können stattdessen auch Zellen anderer Beschaffenheit oder geeignete Teilchen eingesetzt werden, beispielsweise
Kunststoffteilchen, Zellen oder solche Teilchen, auf denen die für den gesuchten Antikörper spezifischen Antigeneinheiten
vorher gebunden worden sind.
Anschließend werden dann die verschiedenen weiteren Stufen durchgeführt, wie sie oben beschrieben wurden, indem ggf.
die verschiedenen Arbeits-Parameter verändert werden, beispielsweise
die Parameter für das Zentrifugieren, so daß die Haftung oder Nichthaftung nachgewiesen werden können.
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Das zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach
der Erfindung kann auch angewandt werden für Untersuchungen beliebiger Arten von zellulären Antigenen, beispielsweise Antigen,
das von den Lymphozyten getragen wird oder auch Plättchen-Antigen,
indem in entsprechender Weise die Beschaffenheit der
verschiedenen Reaktionspartner, d.h. Testserum, Immunoglobuline, die am Becherboden fixiert werden und Antiglobulin ausgewählt
werden.
Dieses zweite Beispiel des Verfahrens nach der Erfindung kann gemäß einer Variante oder Abänderung durchgeführt werden,
die nachfolgend beschrieben wird. Es handelt sich wiederum um äan Nachweis, ob die roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe
Antigen-D-Aktivität aufweisen oder nicht.
a) Wie in der zuvor beschriebenen Variante besteht die erste Stufe darin, daß der konische Boden des Bechers aus Kunststoff
so vorbereitet wird, daß er mit Human-IgG beschichtet oder überzogen ist, d.h. mit Immunoglobulinen der gleichen Tierart
und der gleichen immunochemisehen Klasse, denen die in der
nächsten Stufe verwendeten Antigen D spezifischen Antikörper zugehören.
b) Anschließend wird, wie zuvor, in einem anderen Becher als dem Analysebecher eine Inkubation vorgenommen,der roten
Blutkörperchen, welche analysiert werden sollen und in einer geeigneten physiologischen Lösung schwimmen, mit einem Testserum,
das Antikörper bekannter Anti-D-Spezifität enthält (Anti-D-Testserum). Die mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen
werden dann zweckmäßigerweise mit physiologischer Lösung gewaschen.
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c) Anschließend werden, immer noch außerhalb des Analysebechers, die so vorbehandelten roten Blutkörperchen mit einem
Antiglobulin inkubiert, d.h. mit einem tierischen Immunserum, das Anti-Human-IgG-Immunogluline liefert. Diese Inkuabtion
wird unter den üblichen Temperaturbedingungen vorgenommen, beispielsweise bei 2O°C und während ausreichend langer Zeit, damit
die größtmögliche Anzahl oder zumindest ein hoher Prozentsatz der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG-Moleküle (im Falle,
daß die roten Blutkörpeirhen positiv sind) mit den Antihuman-IgG-Molekülen
kuppeln. Vorteilhafterweise dauert eine solche Inkubation
20 Minuten.
Das verwendete Antiglobulin wird vorteilhafterweise in höherer Konzentration eingesetzt, aus den gleichen Gründen,
wie sie oben bereits erläutert wurden. Im vorliegenden Falle wird mit einem Antiglobulin gearbeitet, das einen Coombs-Titer
von mindestens 128 aufweist, verdünnt oder wenig verdünnt, d.h. in einem Verdünnungsverhältnis von 1:2 oder 1:4.
d) Am Ende dieser Inkubationszeit wird das Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin,
in den Becher gegeben, dessen Boden mit Human-IgG beschichtet bzw.
überzogen ist.
e) Dann wird sofort ein erstes Mal zentrifugiert, wobei der Becher um eine Achse rotiert, die senkrecht steht zu seiner
Rotationsachse. Diese Zentrifugierphase' wird bei einer Geschwindigkeit
V.] ausgeführt, die ausreichend groß ist, damit die Blutkörperchen
sich an der Oberfläche des Becherbodens anlagern, die aber nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte
aufzuheben, durch die die roten Blutkörperchen, sowohl die negativen
wie die positiven, an die Becherwand gebunden sind. Die Geschwindigkeit V1 wird somit so bemessen, daß die Intensität
der erzeugten Abschleuderkraft kleiner ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte FNS. Diese erste Zentrifugierge-
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schwindigkeit wird während einer ausreichenden Zeit beibehalten, damit die Molekülketten, bestehend aus einem am
Becherboden fixierten Human-IgG, einem Anti-Human-IgG-Molekül
und einem Human-IgG, das spezifisch an eine Antigen-D-Einheit eines roten Blutkörperchens gekuppelt ist, sich ausbilden
können; diese Zeit wird entsprechend der Beschaffenheit des untersuchten Antigens oder Antikörpers im voraus bestimmt.
Im vorliegenden Falle wird mit einer Beschleunigung von etwa 20Og während etwa einer Minute zentrifugiert.
f) Anschließend wird - wie bei der ersten Ausführungsform - ein zweites Mal zentrifugiert.
Genauer gesagt, die Zentrifugiergeschwindigkeit wird auf
einen Wert V^ gesteigert, der so bemessen ist, wie bereits erklärt,
daß die Intensität der erzeugten Abschleuderkraft ausreicht, um die Blutkörperchen, die nur über unspezifische
Bindungskräfte an den Becher gebunden sind, d.h. die negativen Blutkörperchen in die Kuppe des Bechers mitzunehmen, daß die
Intensität hingegen nicht ausreicht, um die Blutkörperchen mit Antigen D Funktion in die Kuppe mitzunehmen; d.h. die Intensität
reicht nicht aus, um die Summe aus unspezifischen Bindungskräften FNS einerseits und spezifischen Bindungskräften FS
andererseits aufzuheben, durch die die positiven roten Blutkörperchen an der Neigung des Bechers gehalten werden, und zwar
dank der ausgebildeten Molekülbrücken, Kunststoff + Human-IgG/ Antihuman-IgG/Anti-D-Human-IgG/Antigen D eines Blutkörperchens.
Man beobachtet die gleichen Ergebnisse, wie sie zuvor erhalten wurden: wenn die Reaktion positiv ist, tritt Haftung
ein und man beobachtet beim Betrachten des Bechers entlang seiner Rotationsachse eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen,
die über den Becherboden verteilt sind. Ist hingegen die Reaktion negativ, so findet keine Haftung statt und man beob-
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achtet in der Kuppe des Becherbodens ein Mikrosediment.
Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich von
der ersten oben beschriebenen vor allem darin,, daß die Antiglobulin-Inkubation,
d.h. die Inkubation der roten Blutkörperchen, die zuvor mit dem Testserum inkubiert worden sind,
und der Antihuman-IgG-Moleküle nicht in dem mit Human-IgG
ausgekleideten Becher unmittelbar vor der ersten Zentrifugierphase vorgenommen wird, sondern außerhalb dieses Bechers und
daß das dabei erhaltene Reaktionsmedium dann erst in den Becher eingebracht und hier zentrifugiert wird. Was hierbei
angestrebt wird, ist eine maximale Asymmetrie zwischen dem Prozentsatz an Antihuman-IgG-Molekülen, die mit den an den
Kunststoff gebundenen oder fixierten Human-IgG-Molekülen
reagiert haben.und dem Prozentsatz Antihuman-IgG-Moleküle, die mit den an die roten Blutkörperchen gebundenen Human-IgG-Molekülen
reagiert haben. Die ideale Bedingung wird erreicht, wenn 0 % der am Kunststoff fixierten Human-IgG-Moleküle
durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt sind bzw. mit diesen gekuppelt haben und wenn der größtmögliche prozentuale Anteil
an Human-IgG-Molekülen,die an die roten Blutkörperchen gebunden sind, durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt ist bzw.
mit diesen gekuppelt hat, vorausgesetzt, daß dieses Maximum unterhalb des Wertes liegt, der^Sfrekte Agglutinierung der
roten Blutkörperchen miteinander über die Anti-IgG-Moleküle
hervorruft.
Es ist nämlich wahrscheinlich, daß die maximale Empfindlichkeit der Haftungsreaktion erreicht wird, wenn zu Beginn
der Anlagerung der roten Blutkörperchen an die Fläche des Becherbodens, d.h. zu Beginn der ersten Zentrxfugierphase,
eine maximale Asymmetrie erreicht /der Verteilungen der an die beiden möglichen Kupplungsstellen gebundenen Anit-IgG-Moleküle,
d.h. der an den Kunststoff fixierten IgG und der an die roten
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. GO·
Blutkörperchen gebundenen IgG; diese Asymmetrie ist so gerichtet oder beschaffen, daß die' KupplungssiElLe mit der geringeren
Oberflächendichte an IgG den. größeren Prozentsatz an Anti-IgG-Moleküle gebunden hat. In dem Fall, der hier als
Beispiel dient, ist die Kupplungssbele (oder Kupplungsende) mit
der geringeren Oberflächendichte an IgG das rote Blutkörperchen und der Kunststoff weist eine höhere Oberflächendichte
an IgG auf, weil diese Immunoglobuline hier bis zum Sättigungsgrad fixiert oder gebunden worden sind.
Eine solche Antiglobulin-Inkubation wird als "asymmetrisch"
bezeichnet, während die in der ersten Ausführungsform oben beschriebene Antiglobulin-Inkubation als symmetrisch bezeichnet
wird, da dort jede der beiden IgG-Kupplungsstellen gleichzeitig mit dem Antiglobulin in Berührung gebracht
wird.
Im Falle der Identifizierung von erythrozytären oder zellulären
Antigenen oder von Antikörpern k-ann mit Hilfe einer
asymmetrischen Antiglobulin-Inkubation außerhalb des Analysebechers, in welchem die Reaktion der Immuno-Haftung stattfindet,
eine um das 10- bis 100-fache höhere Empfindlichkeit erreicht werden als in den Fällen, in denen eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation
vorgenommen wird.
Diese zweite Ausführungsform, bei der mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird, wird somit vorzugsweise
vor allem für solche Reaktionen angewandt, die als schwierig qualifiziert werden können, d.h. für Reaktionen, die charakterisiert
sind durch eine sehr kleine Anzahl von Immunoglobulinen-Ig,
beispielsweise IgG, welche an die Blutkörperchen gebunden sind; dies kann das Ergebnis sein, von einer sehr kleinen Menge eines
bestimmten Antikörpers, welcher im analysierten Serum identifiziert
werden soll, oder einer sehr geringen Oberflächendichte eines zellulären Antigens auf den Blutkörperchen, welche analysiert
werden sollen.
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Das Verfahren mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation kann auch angewandt werden, um zu bestimmen, ob ein Serum den
Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält. In diesem Falle läßt man das Serum, das analysiert werden soll, mit roten
Test-Blutkörperchen, die die bekannte Antigen-Aktivität D aufweisen, inkubieren und verfährt dann weiter, wie oben beschrieben.
Das Verfahren kann auch angewandt werden, um andere erythrozytäre Antigene als Antigen D zu identifizieren und ganz
allgemein,um alle Arten von zellulären Antigenen zu identifizieren,
beispielsweise lymphozytäre Antigene oder Plättchen-Antigene; die Reaktionspartner beteiligen sich an der Reaktion
der Immuno-Haftung und die Parameter für das Zentrifugieren werden
dann in geeigneter Weise dem analysierten serologischen System angepaßt. In analoger Weise kann dieses Verfahren auch für die
Identifizierung aller Arten von Antikörpern angewandt werden,
die im Plasma oder Serum einer Blutprobe enthalten sind.
In dem oben beschriebenen Beispiel des erfindungsgemäßen
Verfahrens,angewandt auf die Identifizierung von erythrozytären
oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern, die im Plasma einer Blutprobe enthalten sind, umfaßte das Zentrifugieren, mit
welchem die Erscheinung der Haftung oder der Nichthaftung aufgezeigt wird, zwei Phasen , wobei die zweite Phase bei höherer
Zentrifugiergeschwindigkeit durchgeführt wurde als die erste Phase.
Gemäß einer Variante kann beim Zentrifugieren mit einer einzigen Beschleunigung gearbeitet werden, die geeignet ist zumindest
momentan,alle Körperchen, beispielsweise rote Blutkörperchen an die Wand des Behälterbodens anzulagern, wobei der
Zahlenwert dieser Beschleunigung so ist, daß unter diesen Teilchen nur solche, falls vorhanden, langsam und zunehmend von der
Wand abgerissen oder abgeschleudert und in der Kuppe des Behälter-
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bodens gesammelt werden, die an der Wand des Behälterbodens nicht haften können, weil sich keine Molekularketten, bestehend
aus einem mit dem Kunststoff verbundenen Immunoglobulin,
einem Molekül des Antiglobulins und einem Immunoglobulin gebunden an ein Blutkörperchen ausbilden können. In diesem
Falle wird die Beschleunigung der einzigen Zentrxfugxerphase ein wenig oberhalb des Wertes gehalten, der dem mittleren
Niveau der Auflösung der unspezifischen Bindungskräfte entspricht, welche sowohl die eine negative
Reaktion kennzeichnenden Körperchen als auch die eine positive Reaktion kennzeichnenden Körperchen binden, wobei
diese unspezifischen Bindungskräfte die einzigen Kräfte sind,
welche die für eine negative Reaktion charakteristischen Körperchen zurückhalten. Da die Beschleunigung bzw. Geschwindigkeit
beim Zentrifugieren gering ist, werden alle Körperchen an den Becherboden angelagert während einer ausreichenden Zeit,
damit die Molekülbrücken, die sich ausbilden können, fertiggestellt werden; die Entwicklung und die Fertigstellung dieser
Molekülbrücken verläuft schneller als das Abreißen oder Abschleudern der Körperchen, das für eine negative Reaktion
charakteristisch ist. Wenn diese Zentrifugiergeschwindigkeit ausreichend lang beibehalten wird, werden alle die Körperchen,
sofern vorhanden, die am Becherboden nicht haften können, weil sich keine Molekülbrücken ausbilden können, allmählich von
der Wand des Becherbodens abgelöst und in der Kuppe versammelt, während alle Blutkörperchen, die eine positive Reaktion kennzeichnen,
an der Wand des Behälterbodens haften bleiben, weil sich die Molekülbrücken gebildet haben, die entstehen konnten.
Im Falle des Nachweises von Antigen D Aktivität der roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe beträgt die Beschleunigung
dieser einzigen Zentrxfugxerphase etwa 25Og und wird während etwa 400 Sekunden beibehalten, wenn die Analyse in einem Becher
mit einem Scheitelwinkel von 120° des Konus ausgeführt wird.
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Mit Bezug auf die Fig. 16 bis 18 seien nun drei verschiedene
Zentrifugier-Diagramme beschrieben, die bei den •oben beschriebenen Reaktionen zum Identifizieren von erythrozytären
Antigenen oder Antikörpern angewandt werden können. Auf jedem dieser Diagramme ist auf der Ordinate die angewandte
Zentrifugalkraft in Anzahl g angegeben und auf der Abszisse die Dauer des Zentrxfugxervorganges in Sekunden,
wobei die Reaktion der Immunohaftung in einem Becher ausgeführt wurde, dessen konischer Boden einen Scheitelwinkel von
120° aufwies.
Das erste Diagramm (Fig. 16) entspricht dem Fall, bei welchem eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation· vorgenommen
wurde. Im Zeitpunkt 0, nach beendetem Einbringen des Reaktionsmediums aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobu-
ei χ θ s ©in
lin in den Becher, wurcte/exne schwache Zentrifugiergeschwindigkeit, im vorliegenden Fall von 4g, erteilt, indem der Becher um eine Achse senkrecht zu seiner Rotationsachse rotierte. Diese Phase I umfaßt die ersten 15 Sekunden und ist eine Phase der Antiglobulin-Inkubation; die Geschwindigkeit reicht nicht aus, um in irgendeiner Weise ein schnelles Absinken und Anlagern der roten Blutkörperchen am Becherboden zu bewirken. Ggf. kann hierbei gleichzeitig das im Becher enthaltene Reaktionsmedium in Bewegung gehalten werden.
lin in den Becher, wurcte/exne schwache Zentrifugiergeschwindigkeit, im vorliegenden Fall von 4g, erteilt, indem der Becher um eine Achse senkrecht zu seiner Rotationsachse rotierte. Diese Phase I umfaßt die ersten 15 Sekunden und ist eine Phase der Antiglobulin-Inkubation; die Geschwindigkeit reicht nicht aus, um in irgendeiner Weise ein schnelles Absinken und Anlagern der roten Blutkörperchen am Becherboden zu bewirken. Ggf. kann hierbei gleichzeitig das im Becher enthaltene Reaktionsmedium in Bewegung gehalten werden.
Dann wird die Zentrxfugierbeschleunxgung schnell erhöht bis zu einem Wert unterhalb des mittleren Wertes, bei welchem lediglich
die unspezifischen Bindungskräfte FNS aufgehoben werden.
Wird dieses mittlere Niveau mit 23Og bewertet, wie im Falle des vorliegenden Beispieles, in welchem eine Humanblutprobe daraufhin
untersucht wird, ob auf den roten Blutkörperchen Antigen D Aktivität vorhanden ist, so wild die Beschleunigung auf 200g gebracht.
Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde läuft eine Phase II ab,
in der die roten Blutkörperchen zum Becherboden hin wandern, wobei in der 30sten Sekunde alle Blutkörperchen den Becherboden erreicht
haben.
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Die Zentrifugierbeschleunxgung wird bis zur 6Osten Sekunde
bei 10Og gehalten. Hierdurch wird von der 30sten bis zur 60sten Sekunde eine Phase III begrenzt, in welcher die roten
Blutkörperchen am Becherboden angelagert werden; in dieser Phase können die Molekülbrücken entstehen, welche sich zwischen
Kunststoff und roten Blutkörperchen ausbilden können und in der 60sten Sekunde sind praktisch alle möglichen Molekülbrücken
vorhanden.
Dann wird die Zentrifugxergeschwindigkeit schnell erhöht bis auf einen solchen Wert, daß die Summe der unspezifischen
Bindungskräfte, durch die alleine die negativen roten Blutkörperchen
am Becher festgehalten werden, aufgehoben oder zerrissen wird; selbstverständlich muß die Zentrifugierbeschleunxgung
unterhalb des Wertes bleiben, bei welchem ein Aufbrechen oder Auflösen der Summe der spezifischen Bindungskräfte und der
unspezifischen Bindungskräfte, durch die die positiven Blutkörperchen
am Kunststoff gehalten werden, stattfinden würde. Im vorliegenden Fall wird die Beschleunigung auf 1600g gebracht.
Die letzte Phase IV ist somit eine Phase, in welcher die unspezifischen Bindungskräfte aufgehoben werden, wenn nur diese
die roten Blutkörperchen am Kunststoff festhalten; gleichzeitig werden in dieser Phase die abgelösten oder abgeschleuderten
roten Blutkörperchen schnell gesammelt oder zusammengeballt. Der Zentrifugiervorgang wird definitiv in der 84sten Sekunde
abgebrochen.
Das gleiche Zentrifugier-Diagramm kann mit nur einer kleinen Modifizierung auf das Verfahen angewandt werden, wenn
mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird. In diesem Falle entfällt die Phase oder Stufe I der Antiglobulin-Inkubation
im Becher unter Bewegung, weil die Antiglobulin-Inkubation außerhalb des Bechers vorgenommen wird zwischen zuvor
mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen - oder mit Test-Blutkörperchen inkubierten Serum', das analysiert werden
soll - und dem Antiglobulin. Nach beendeter aiymraetrischer Anti-
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globulin-Inkubation wird das Reaktionsmedium in den Becher
verbracht und dann unmittelbar ein erstes Mal mit einer Beschleunigung von 20Og zentrifugiert.
Eine zweite Art zu zentrifugieren, die sich auf die Reaktion zum Identifizieren von erythrozytären Antigenen
oder von Antikörpern anwenden läßt, wird im Diagramm gemäß Fig, 17 gezeigt.
Wie beim Diagramm gemäß Fig. 16, wird bis zur 15ten
Sekunde mit ganz geringer Beschleunigung zentrifugiert, im vorliegenden Falle mit 4g, während einer Phase oder Stufe I
der symmetrischen Antiglobulin-Inkubation; ggf. wird der
Becher gleichzeitig während dieser Inkubation zusätzlich in Bewegung gehalten.
In der 15ten Sekunde wird die Zentrifugierbeschleunigung
schnell erhöht, in diesem Falle aber auf einen Wert, der ganz leicht oberhalb des Wertes liegt, welcher dem mittleasi Niveau
der Aufhebung der unspezifischen Bindungskräfte alleine entspricht.
Dieses mittlere Niveau bzw. diese mittlere Ebene wird hieridt 23Og bewertet und die Geschwindigkeit daher auf
25Og gebracht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde läuft die
Phase II, in welcher die roten Blutkörperchen absinken; in der 30sten Sekunde haben alle Blutkörperchen den Becherboden erreicht.
Da die Beschleunigung hier bei 25Og gehalten wird, d.h. ein wenig oberhalb des mittleren Wertes, bei welchem die unspezifischen
Bindungskräfte aufgehoben werden, folgt hia: unmittelbar auf die Phase II, in der die Blutkörperchen absinken, eine Phase
III, in welcher die unspezifischen Bindungskräfte langsam und
vorsichtig gelöst werden, wenn nur durch diese Bindungskräfte ein rotes Blutkörperchen an den Kunststoff gebunden ist und dieses
rote Blutkörperchen zu dem Teil der Blutkörperchen gehört, welche die negative Reaktion kennzeichnen und die am wenigsten
unspezifische Bindungskräfte haben. In dieser Phase werden somit gleichzeitig die abgelösten oder abgeschleuderten Zellen
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zunehmend langsam gesammelt. Die Geschwindigkeit dieser Sammlung ist außerordentlich gering, so daß unmittelbar
nach der Stufe, in welcher die roten Blutkörperchen absinken, diese noch ausreichend lange an den Becherboden angelagert
bleiben, damit die Molekülbrücken, welche sich ausbilden können, entstehen; die Entwicklung der Molekülbrücken verläuft schneller
als das Ablösen oder Abreißen der Zellen. Da die Zentrifugierbeschleunigung durchgehend bei 25Og gehalten wird, sind nach
Ablauf einer g*?issen Zeit alle Molekülbrücken entstanden, die sich ausbilden konnten, während die nicht spezifisch an den
Becherboden gebundenen roten Blutkörperchen weiterhin allmählich abgeschleudert werden. Diese Phase III dauert relativ lange und
wird beispielsweise in der 4loten Sekunde abgebrochen.
Die hier angewandte Methode des Ablösens ist so vorsichtig,
daß die erzielten Ergebnisse außerordentlich empfindlich sind. Dies ist besonders gut geeignet für Reaktionen, bei denen schwache
Bindungen zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff eine Rolle spielen.
Das Diagramm gemäß Fig. 18 entspricht einem Zentrifugiervorgang, der entsprechend der Entwicklung der ablaufenden Reaktionen
geregelt oder gesteuert wird. Das Verfahren wird gleichzeitig in einem Becher ausgeführt, in welchem die Analyse der Probe
vorgenommen wird und andererseits in einem Becher, in welchem eine negative Kontrollreaktion ausgeführt wird; dieser Kontrollbecher
wird bei jeder Umdrehung beim Zentrifugieren mit einem Stroboskop-Blitz beleuchtet.
Das Prinzip dieser Steuerung ist analog dem oben mit Bezug auf den Nachweis von Antigen HB3 dargelegten Prinzip.
Das vergrößerte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die negative Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera
gefilmt und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde. Die Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosediments, das
sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet, werden mit der
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Oberfläche und der Opazität des MikroSedimentes einer negativen
Bezugsreaktion gleicher Art, die zuvor ausgeführt worden ist, verglichen.
Das Diagramm der Fig. 18 entspricht einem Zentrifugierprogramm,
das angewandt wird auf eine Reaktion zum Identifizieren von erythrozytärem oder zellulärem Antigen oder von
Antikörpern, bei welchem das mittlere Niveau der Aufhebung der unspezifischen Bindungskräfte alleine einer Beschleunigung
von 45Og entspricht. Dieses Diagramm eines gesteuerten Zentrifugierprogrammes kann auf ein serologisches System angewandt
werden, dessen Merkmale im voraui'/'ffeKannt sind, vor allem nicht
das mittlere Niveau der Aufhebung oder Auflösung der unspezifischen Bindungskräfte.
Es sei bei diesem Verfahren eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation
angenommen. In diesem Falle wird die Zentrifugierbeshleunigung
bis zur 15ten Sekunde bei 4g gehalten, d.h. bei einem zu geringen Wert als daß irgendein schnelles Absinken
und Anlagern von Blutkörperchen oder Zellen am Becherboden erfolgen kann. Dies ist die Phase I der Antiglobulin-Inkubation,
während veLcher ggf. der Becher zusätzlich bewegt wird.
In der 15ten Sekunde wird die Beschleunigung schnell auf
200 g erhöht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde sinken die
Zellen oder Blutkörperchen zum Becherboden.hin ab (Phase II)
und bis zur 60sten Sekunde erfolgt dann die Anlagerung der Zellen oder Blutkörperchen an den Becherboden (Phase III),
während welcher Molekülbrücken entstehen, die sich zwischen dem Becherboden und den Zellen oder Blutkörperchen ausbilden
können.
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• 6?·
Am Ende der Anlagerungsphase, d.h. in der 6Osten Sekunde
wiid die Beschleunigung um 10Og erhöhtund 30 Sekunden bei 300g
gehalten (Phase IV). In der Sekunde 90 erfolgt eine Messung von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion
und diese Messungen werden mit den Werten für das Mikrosediment der negativen Bezugsreaktion verglichen:
liegen die Mßßdaten für Oberfläche und Opazität des Kontroll-Mikrosedimentes
unterhalb der entsprechenden Daten für das Bezugs-Mikrosediment, so bedeutet dies, daß die Beschleunigung
von 300g nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte aufzuheben bzw. zu brechen.
Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100g
erhöht und die Beschleunigung von 400g während 30 Sekunden beibehalten (Phase V). In der 120sten Sekunde werden erneut
Oberfläche und Opazität des Kontroll-Mikrosediments gemessen und die erhaltenen Meßdaten mit denjenigen des Bezugs-Mikrosedimentes
verglichen: im vorliegenden Falle, bei welchem das mittlere Niveau zum Aufbrechen oder Aufheben der unspezifischen
Bindungskräfte bei 45Og liegt, liegen die Meßdaten
für die Oberfläche und die Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion nach dem Zentrifugieren bei 400g
noch unterhalb der entsprechenden Meßdaten für das Bezugs-Mikrosediment, weil die roten Blutkörperchen der negativen
Kontrollreaktion, die durch unspezifische Bindungskräfte
an den Becher gebunden sind, nicht abgelöst bzw. abgeschleudert werden konnten.
Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100g erhöht und erreicht nun den Wert 500g (Phase VI). Nach 30
Sekunden, d.h. in der 150sten Sekunde, wird eine weitere Messung
von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion vorgenommen; die Meßdaten werden
mit den entsprechenden Meßdaten des Bezugs-Mikrosedimentes verglichen. Im vorliegenden Falle ist nun das mittlere Niveau
für das Aufheben oder Aufbrechen der unspezifischen Bindungskräfte überschritten, so daß bei der negativen Kontrollreaktion
ein Mikrosediment erhalten wird, dessen Oberfläche und Opazität zumindest gleich sind der Oberfläche und Opazität des Bezugs-
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Mikrosedimentes. Die Phase oder Stufe, in der die unspezifischen
Bindungskräfte alleine aufgehoben werden und gleichzeitig die abgelösten oder abgeschleuderten Blutkörperchen gesammelt werden,
beginnt somit mit der 120sten Sekunde. Die Zentrifugierbeschleunigung
wird weiter bei 500g gehalten und das Zentrifugieren endgültig abgebrochen, wenn Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes
der negativen Kontrollreaktion einer Menge an abgeschleuderten roten Blutkörperchen entspricht, die gerade repräsentativ
ist für eine tatsächliche oder wahre negative Reaktion: im vorliegenden Falle wird der Zentrifugiervorgang endgültig
in der 33Osten Sekunde abgebrochen.
Die Unterscheidungsschwellen für eine positive Reaktion und eine negative Reaktion werden auf die gleiche Weise bestimmt
wie vorstehend mit Bezug auf das Verfahren zum Nachweisen von HB3 Antigen erläutert.
Macht also der Anteil an roten Blutkörperchen in einem Mikrosediment, das eine echte negative Reaktion anzeigt, wie
in Vorversuchen ermittelt, 12% aus und beträgt die Standardabweichung
3%, so liegt die Unterscheidungsschwelle für eine
echte negative Reaktion, wie oben angegeben, bei 18% roten Blutkörperchen, die in eiern Mikrosediment zusammengefaßt sind,
während die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion einem Anteil von 6 % roten Blutkörperchen, versammelt zum Mikrosediment,
entspricht.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet, schließlich
die quantitative Bestimmung eines bestimmten erythrozytären oder zellulären Antigens oder eines bestimmten Antikörpers, der
bzw. das nachgewiesen soll. Die Oberfläche und/oder Opazität des entstandenen Mikrosedimentes hängt nämlich von der Menge an
Antigen oder Antikörper ab, die in dem analysierten Medium vorhanden ist. Es genügt somit, die gemessene Oberfläche und/oder
Opazität des in einer positiven Reaktion gebildeten Sedimentes mit den entsprechenden Werten zu vergleichen, die für eine Reihe
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von Eich-Produkten erhalten wurden oder mit einer zuvor aufgestellten
Eichkurve, um die im Medium vorhandene Menge Antigen oder Antikörper zu erhalten.
Dieses zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens kann auch analog wie beim ersten Beispiel unter den gleichen Zentrifugierbedingungen
mit Proben durchgeführt werden, in denen erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper mit unterschiedlicher
Spezifität und von unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen.
Wie oben erklärt, hängt nämlich die Möglichkeit,daß
die roten Blutkörperchen abgeschleudert oder abgelöst werden, nur von der Neigung des Becherbodens ab. Man wird daher für
jede Reaktionsart den Becher auswählen, der die für die in Betracht gezogene Reaktion am besten geeignete Neigung aufweist,
mit dem Wert, daß bei einer gewählten Beschleunigung nur die Zellen oder Teilchen abgeschleudert werden, die eine negative
Reaktion kennzeichnen.
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Leerseire
Claims (1)
- DR.-ING. FRANZ WUESTHOFFPATENTANWÄLTEDR. PHIL. FREDA WUESTHOFF (192719CWUESTHOFF-v.PECHMANN -BEHRENS-GOETZ DIp,.ing.gerhard püls {i9SJ97"DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENSMANDATAIRES AGREES PRES !.'OFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL1-INCiDIPL1-WIRTSCH1-ING1RUPERTGOETZD-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2TElEFON: (089) 66 IO JItelegramm: protectpatent telex: $240701A-51 820Anmelder: Centre NationalPatentansprüche1 .J Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von viralen Antigenen, erythrozytären oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern in einem biologischen Medium unter Anwendung von immunologischen Reaktionen zwischen den Zellen oder leuchen und einem Serum, so dann zwischen den auf diese Weise behandelten Zellen oder Teilchen und einem Antiglobulin dadurch gekennzeichnet , daß man das Reaktionsmedium, welches die Zellen oder Teilchen und das Antiglobulin enthält, in einen Behälter einbringt dessen Wand einen auf der ^rametrieachse des Behälters gelegenen Konvergenz- oder Scheitelpunkt aufweist und auf dessen Wand Moleküle fixiert worden sind, die immunologisch mit dem Antiglobulin reagieren können und daß man dieses .Reaktionsmedium der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterwirft die im wesentlichen parallel zur Behälterachse gerichtet ist, unter solchen Bedingungen, daß zumindest die Zellen, welche eine positive Reaktion kennzeichnen, d.h. eine Analysereaktion durchgeführt mit einer Probe des biologischen Mediums, das das Antigen oder den Antikörper,welcher identifiziert werden soll, enthält, fortschreitend an der Wand haften und haften bleiben aufgrund von Bindungskräften einer ersten Art und zwar von immunologischen Bindungskraften, an denen das Antiglobulin beteiligt ist und die zu Bindungskräften einer zweiten Art hinzukommen-2-909835/0796- 2 - 1A-51 820während die Zellen welche am Ende des Zentrifugiervorganges eine negative Reaktion kennzeichnen nur über die Bindungskräfte der zweiten Art an die Wand gebunden sind und dann am Scheitelpunkt bzw. der Kuppe des Behälters gesammelt werden, indem man eine Zentrifugalkraft anwendet, die ausreichend stark ist um die Bindungskräfte der zweiten Art zu zerstören, aber nicht ausreicht, um die Summe aus Bindungskräften der ersten Art und Bindungskräften der zweiten Art zu zerstören.2. Verfahren zum Analysieren eines biologischen Mediums, wie Blutplasma, mittels Nachweis oder Identifizierung von viralen Antigenen in diesem Medium, dadurch gekennzeichnet , daß man auf der Wand eines Behälters, die einen auf einer Symmetrieachse des Behälters gelegenen Scheitelpunkt a.ufweist, Immunoglobulin Ig der immunochemischen Klasse X einer Tierart I, bezeichnet IgX I fixiert, außerhalb des Behälters eine Probe des biologischen Mediums das analysiert werden soll mit einer Suspension von Zellen oder Teilchen inkubiert, an die zuvor IgX I gekuppelt wurden,die ausgewählt wurden aufgrund ihrer Antikörperspezifität gegenüber dem viralen Antigen, das nachgewiesen werden soll, daß man in dem Behälter ein Rea.ktionsmedium, bestehend aus der inkubierten Suspension von Zellen oder Teilchen und einem Antiglobulin, vorzugsweise konzentriert, d.h. eine Lösung von Molekülen aus einer von der Tierart I verschiedenen Tierart II sowie Antikörpern gegenüber IgX I, bezeichnet Anti-IgX I der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterwirft, die der Behälterachse parallel gerichtet ist, unter Bedingungen welche die Bindung oder Kupplung von Molekülen Anti-IgX I und IgX I ermöglichen und damit die Ausbildung von Molekülbrücken zwischen der Behältervrand und den Zellen oder Teilchen unter Mitwirkung von Anti-IgX I Molekülen, das man mit einer ersten Beschleunigung zentrifugiert, die die Haftung von allen Zellen an der konisch verlaufenden Wa.nd des Behälters, die mit IgX I bedeckt ist, ermöglicht worauf man das Zentrifugieren unterbricht, um ein Ablösen der Zellen oder Teilchen, soferny0 9835/0796-3-vorhanden ermöglicht, welche für eine negative Reaktion charakteristisch sind( und daß man dann mit einer zweiten Beschleunigung erneut zentrifugiert und die Zellen oder leuchen, sofern vorhanden, im Scheitelpunkt bzw. der Kuppe des Behälters sammelt, die an der Behälterwand nicht haften können aufgrund der Unbeständigkeit der über die Anti-IgX I Moleküle gebildeten Molekülbrücken.3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugieren während einer solchen Zeitspanne unterbricht, daß ma.n im Falle einer negativen Reaktion, d,h. einer mit einer Probe, die kein virales Antigen enthält durchgeführten Reaktion eine Absättigung der a.uf den einander gegenüberliegenden Flächen von Behälterwand und Zellen oder leuchen gebundenen IgX I Moleküle durch die Anti-IgX I Moleküle erhält.4ο Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch g e k e η η a e ichn e t, daß man die Suspension von Zellen oder Teilchen nach der Inkubation außerhalb des Behälters mit dem biologischen Mediun^das analysiert werden soll, mit einer physiologischen Lösung wäscht.Ip. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4? dadurch gekennzeichnet , daß man eine lösung von Anti-IgX I Molekülen mit einem Titer von mindestens 128 Coombs rein oder verdünnt in einem Verhältnis von 1:2 oder 1:4 verwendet,6. Vorfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension von Zellen oder Teilchen, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll, inkubiert worden ist^und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I gleichseitig in den Behälter einbringt.- :■ 8 3 5 / 0 7 9 87. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß man in den Behälter zunächst die Suspension von Zellen oder Teilchen einbringt, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll, inkubiert worden ist und dann die Lösung von Molekülen Anti-IgX8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, da.ß ma.n vor der ersten Zentrifugierpha.se die Komponenten des Reaktionsmediums, d.h. die bereits mit der Probe inkubierte Suspension von Zellen oder Teilchen und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I während einer Zeitspanne inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, in der 10$ der a.n die Zellen oder Teilchen gebundenen oder a.n die Behälterwand fixierten Moleküle IgX I mit den Molekülen Anti-IgX I reagiert haben.9. Verfahren na.ch Anspruch 8, dadurch gekennnzeichnet, daß das Rea,ktionsmedium während dieser Inkubation bewegt wird.10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch g e k e η η zeichnet , daß ma.n während einigen Sekunden bis zu einigen 10 Sekunden inkubiert.11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Beschleunigung und Dauer jaäer Zentrifugierstufe, d.h. erste Phase, Unterbrechung und zweite Phase^im vora.us bestimmt werden und der Beschleunigung und Dauer entsprechen,für die unter den gleichen Bedingungen der Rea.ktionspartner bei einer nega.tiven Bezugsrealction die besten Ergebnisse erzielt worden sind, d.h. da.ß am Ende der ersten Zentrifugierstufe oder -phase praktisch 100 fo Zellen oder Teilchen an der Behälterwand hafteten, am Ende der Unterbrechung ein ausreichender Sättigungsgrad an Anti-IgX I Molekülen bei den IgX Molekülen erreicht wurde,.die an die einander gegenüberliegenden909835/0796Flächen der Zellen oder Teilchen und der Behälterwand gebunden sind, damit die Haftung der Zellen an der Behälterwand wieder aufgehoben wird und ein Ablösen und Sammeln der Zellen in der Kuppe des Behälters während der zweiten Zentrifugier phase stattgefunden ha.t.12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , da.ß der Zeitpunkt des Abbruchs der zweiten Zentrifugierphase automatisch bestimmt wird, indem das Verfahren gleichzeitig zum einen in einem Behälter durchgeführt wird, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird,und zum anderen in einem Behälter in welchem eine negative Kontrollreaktion durchgeführt wird, und wobei das Bild des Bodens des Kontrollbehälters in regelmäßigen Intervallen während der aweiten Zentrifugierphase a.ufgezeichnet und analysiert wird und die zweite Zentrifugierphase definitiv abgebrochen wird, wenn das Bild des Bodens des Kontrollbehälters etwa 18 0Jo Zellen oder Teilchen versammelt in der Kuppe des Behälters entspricht.13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß es zum Nachweis des viralen Antigens HB „ in einer Humanblutprobe angewandt wird.H. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekenn ze ich net, daß man die Analyse in einem Behälter vornimmt, dessen Boden konisch ist und einen Winkel am Scheitelpunkt bzw. an der Kuppe von 120° aufweist, daß man die erste Zentrifugierphase mit einer Beschleunigung von 200 g durchführt von der bis zur 60 Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediuras in den Behälter, das aus der zuvor mit der zu analysierenden Probe inkubierten Suspension von Zellen oder Teilchen und der Lösung der Anti-IgX I Moleküle besteht und daß man das Zentrifugieren von der 60. bis zur /nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Behälter unterbricht und daß man beim zweiten Zentrifugieren mit einer Beschleunigung von 500 g während 40 Sekunden arbeitet.-6-9 0 9835/07- 6 - 1A-15. Verfaliren zum Analysieren von Blut, um zelluläre Antigene (oder antizelluläre Antikörper) nachzuweisen oder zu identifizieren, dadurch gekennzeichnet , daß man auf der Wand eines Behälters, die einen auf der Symmetrieachse des Behälters gelegenen Konvergenzpunkt aufweist, Immunoglobuline Ig der immunochemischen Klasse X einer Tierart I, bezeichnet IgX I fixiert, außerhalb des Behälters eine Suspension von roten Blutkörperchen des Blutes.das analysiert werden soll^ mit einem Testserum (oder das Plasma des Blutes^as analysiert werden soll, mit einer Suspension aus Testkörperchen) unter Bedingungen inkubiert, die die Bindung der IgX I an die Körperchen gestatten, daß man in den Behälter ein Reaktionsmedium, bestehend aus der inkubierten Suspension von Blutkörperchen und einem vorzugsweise konzentrierten Antiglobulin, d.h. eine Lösung von Molekülen einer Tierart II, die verschieden ist von der Tierart I1 sowie Antikörper gegenüber IgX I,bezeichnet als Anti-IgX I, der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterwirft, die der Symmetrieachse des Behälters parallel gerichtet X3t, unter solchen Bedingungen, daß, wenn erforderlich die Moleküle Anti-IgX I mit den IgX I kuppeln und auf diese Weise Molekülbrücken zwischen der Behälterwand und den Blutkörperchen unter Mitwirkung der Moleküle Anti-IgXIentstehen, daß man in der Weise zentrifugiert, daß die Blutkörperchen momentan an der Behälterwand angelagert bleiben und die Ausbildung der Molekülbrücken zu Ende geführt wird und daß lediglich die Blutkörperchen, sofern vorhanden, die nicht an der Behälterwand haften können, weil keine Molekülbrücken unter Mithilfe der Moleküle Anti-IgX I ausgebildet werden können, in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß die Suspension von Blutkörperchen, die analysiert werden soll (oder die Suspension der Test-Blutkörperchen) nachdem sie außerhalb des Behälters mit einem Testserum-7-909835/07967 1A-51(oder mit dem Plasma des Blutes das analysiert werden soll) inkubiert worden ist, mit einer physiologischen lösung gewa.schen wird.17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Lösung von Molekülen Anti-IgX 1 verwendet, die einen Titer von mindestens 128 gemäß Coombs aufweist und zwar rein oder verdünnt in einem Verdünnungsverhältnis von 1:2 oder 1:4.18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17» dadurch gekennzeichnet , daß man die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d.h. die Suspension von Blutkörperchen und die Lösung der Anti-IgX I Moleküle getrennt voneinander und gleichzeitig in den Behälter einbringt.19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17» dadurch gekennzeichnet f daß man zunächst die zuvor inku^biertr Suspension der Blutkörperchen und danach die Lösung der Anti IgX I Moleküle in den Behälter einbringt.20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19» dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Znetrifugieren im Behälter die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d.h. die zuvor inkubierte Suspension von Blutkörperchen und die Lösung der Anti-IgX I Moleküle während einer Zeitspanne inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, bei der 10 fo der an die Blutkörperchen oder an die Behälterwand gebundenen IgX I Moleküle mit den Anti-IgX I Molekülen reagiert haben.21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsmedium während dieser Inkubation bewegt.-8-809835/0 79 S- 8 - 1A-51 82022. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet , daß man während einiger Sekunden bis zu einigen 10 Sekunden inkubiert.23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet , daß man das Reaktionsgemisch erst in den Behälter zum Zentrifugieren einbringt, nachdem die Suspension von Blutkörperchen außerhalb des Behälterö mit der Lösung von Anti-IgX I Molekülen inkubiert worden ist und daß ma.n unmittelbar nach dem Einbringen des Reaktionsgemisches in den Behälter zentrifugiert.24. Verfahren nach Anspruch 25, daüureh gekennzeichnet, daß man die Suspension von Blutkörperchen und die Lösung von Anti-IgX I Molekülen etwa 20 Minuten inkubiert,25. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man bei zwei unterschiedlichen Beschleunigungen zentrifugiert und zwar bei einer ersten Beschlenigung, bei der a.lle Blutkörperchen an die Behälterwand angelagert werden und bei einer zweiten, höheren Beschlenigung, bei welcher nur die Blutkörperchen, die nich.t an der Wand des Behälters haften bleiben können, in der Kuppe des Behälters gesammelt werden,26. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet , daß man so zentrifugiert, daß ma/n eine einzige Beschleunigung erreicht, die geeignet ist, zumindest momentan alle Blutkörperchen a.n die Wand des Behälters a.nzulagern und außerdem so, daß unter diesen Blutkörperchen nur diejenigen, sofern vorhanden, die nicht an der Wand des Behälterbodens haften können, langsam und zunehmend von dieser Wand abgelöst bzw. abgeschleudert und in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.909835/0796 . "9"- 9 - 1A-51 82027. Verfahret! nach. Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß man zur automatischen Bestimmung des endgültigen Abbruchs des Zentrifugierens das Verfahren gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem die Analysereaktion der zu untersuchenden Probe vorgenommen wird und andererseits in einem Behälter in welchem eine zur Kontrolle dienende negative Reaktion vorgenommen wird, daß man das bei der Kontrollreaktion sich bildende Mikrosediment in regelmäßigen Intervallen aufzeichnet und analysiert und das Zentrifugieren endgültig abbricht, wenn die Analyse des Mikrosediments der Kontrollrea.ktion a.nzeigt, daß etwa. 18 c/o Blutkörperchen in der Kuppe des Behälters gesammelt sind.28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet , daß man das Zentrifugieren im Hinblick auf die im Gang befindlichen Reaktionen steuert oder regelt, das Verfahren gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird^ und andererseits in einem Behälter^in welchem eine negative Kontrollreaktion ausgeführt wird, daß man in regelmäßigen Intervallen das Bild des Mikrosedimentes, das sich bei der nega.tiven Kontrollrea.ktion bildet, aufzeichnet und analysiert, daß man die Wachstumskurve für dieses Mikrosediment und für das Mikrosediment einer negativen Bezugsreaktion mitteinander vergleicht und daß man Zeit und Geschwindigkeit beim Zentrifugieren/Steuert, daß die Wachstums- ' ·- kurve des analysierten Mikrosedimentes der Wachstumskurve der Bezugsreaktion entspricht.29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man da.s Zentrifugieren definitiv abbricht, wenn die Analyse des Mikrosedimentes der negativen Kontrollrea.ktion anzeigt, daß in der Kuppe des Behälterbodens etwa 18$ Blutkörperchen gesammelt sind.-10-909835/0796- 10 - 1A-51 82030. Verfahren nach. Anspruch 28 oder 29, dadurch, gne k e η η -in einem Behälterzeichnet, da ß ma.n die Analyser eaktion/mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120° durchführt, nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX I zur Inkubation gebracht worden ist, daß man den Behälter der das Reaktionsgemisch enthält, um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist zur Konusachse, bei einer geringeren Beschleunigung a.ls derjenigen, bei der die Blutkörperchen welche eine negative Reaktion kennzeichnen, von der Wand des Behälterbodens abgeschleudert' werden, daß ma.n diese Beschleunigung 45 Sekunden beibehält, daß man ans chließend gleichmäßig die Zentrifugierbeschleunigung alle 30 Sekunden um einen Wert von 100g erhöht, daß ma.n a.m Ende jeder dieser Zeitspannen von 30 Sekunden das in der negativen Kontrollreaktion gebildete Mikrosediment analysiert- bis die Analyse einen Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters versammelt sind.entspricht, der zumindest gleich ist dem Prozentsatz wie er für die negative Bezugsreaktion erreicht worden ist.31. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet , daß man beim Ausführen der Ana.lysereaktion in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120°, nachdem die Suspension von Blutkörperchen mit der Lösung der Anti-IgX I Moleküle zum Inkubieren gebracht worden ist , zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist zur Achse des konischen Behälterbodens, mit einer Beschlenigung von 200g, die während 45 Sekunden beibehalten wird.und daß man anschließend die Zsntrifugierbeschlenigung schnell bis auf 1600 g erhöht und das Zentrifugieren endgültig abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht ist, bei welchem für eine unter gleichen Bedingungen durchgeführte nega.tive Kontrollreaktion der Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz.welcher die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.-11· 909835/0796- 11 - 1A-51 82032. Verfahren na.ch Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß man beim Ausführen der Analyse in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120°, nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX I Moleküle inkubiert worden ist , zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht läuft zur Achse des konischen Behälterbodens, mit einer Beschleunigung von 250g und daß man das Zentrifugieren abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht worden ist, bei welchem für eine unter gleichen Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion der Prozentsatz an roten Blutkörperchen,die in der Kuppe des Behälters gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz,welcher die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.33· Satz von Behältern mit konischem Boden, dadurch gekennzeichnet , daß zur Durchführung von Reaktionen der Immuno-Haftung mehrerer Proben, in denen virale Antigene oder zelluläre Antigene oder Antikörper unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit na.chgewiesen werden sollen, dieser Sa.tz so viel verschiedene Gruppen von Behältern umfaßt, wie unterschiedliche Typen oder Arten von Antigenen oder Antikörpern nachgewiesen werden sollen, wobeieinen
die Behälter jeder G-ruppe /anderen Scheitelwinkel des konischen Bodens aufweisen als die Behälter jeder der anderen Gruppen.34» Satz von Behältern nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichn et, da.ß er aus einer oder mehreren Gruppen von Behältern besteht, deren Scheitelwinkel im Konus der Behälter dieser verschiedenen Gruppen einen der folgenden Werte aufweist:80, 90, 100, 110, 120, 130 und HO.909835/0796
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