CH643068A5

CH643068A5 - Bestimmung von antigenen oder antikoerpern.

Info

Publication number: CH643068A5
Application number: CH124579A
Authority: CH
Inventors: Claude Matte
Original assignee: Centre Nat Transfusion
Priority date: 1978-02-28
Filing date: 1979-02-08
Publication date: 1984-05-15
Also published as: FR2418463B1; JPS6231299B2; US4297104A; DE2907198C2; NL7901536A; FR2418463A1; DE2907198A1; IT1114209B; CA1113858A; GB2015156A; GB2015156B; IT7920592A0; SE7901771L; SE447933B; JPS54126596A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren eines flüssigen biologischen Mediums, wie menschliches Blut, um in diesem Medium Viren mit Antigeneigenschaften bzw. virale Antigene, erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper nachzuweisen oder zu identifizieren.

Bei medizinischen Analysen stellt sich häufig das Problem 5 der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen, die von einer Zelle oder Teilchen getragen werden sowie der Beschaffenheit von Antikörpern oder der viralen Antigene, die in einem serologischen Medium enthalten sind.

Dies trifft vor allem auf das Gebiet der Bluttransfusion zu, io wo unbedingt festgestellt werden muss, dass das Blut des Spenders bzw. der Spender mit dem Blut des künftigen Empfängers verträglich ist.

Die gegebenenfalls vorhandene Unverträglichkeit von zwei Blutproben beruht darauf, dass das Plasma der einen Blutprobe is Moleküle enthalten kann, die als Antikörper bezeichnet werden und die sich mit als Antigeneinheiten oder Antigen bezeichneten komplementären Struktureinheiten der Membran der roten Blutkörperchen verbinden können. Ein solches Antigen wird erythrozytäres Antigen genannt. Ein Antikörper, der in der La-20 ge ist sich nur mit einem bestimmten Antigen zu verbinden,

wird als der für dieses Antigen spezifische Antikörper bezeichnet. Die Verbindung von Antikörpern mit Antigeneinheiten auf den roten Blutkörperchen kann zur Agglutinierung dieser roten Blutkörperchen, zu ihrer Zerstörung oder dazu führen, dass sie 25 in ihrer mechanischen Festigkeit stark beeinträchtigt werden, mit dem Risiko, dass bei Bluttransfusionen Zwischenfälle auftreten.

Es muss weiterhin sichergestellt sein, dass mit dem Spenderblut nicht gewisse Krankheiten auf den Empfänger übertragen 30 werden, die über den Nachweis eines viralen Antigens oder eines Virus mit Antigeneigenschaften oder eines diesem spezifisch entsprechenden Antikörpers festgestellt werden. Ein Beispiel für eine solche Krankheit ist die nach Blutübertragungen auftretende Hepatitis, die beim Empfänger auftreten kann, 35 wenn das Spenderblut einen bestimmten Virus und zwar HB-Virus enthält, der Träger des HBS-Antigens ist.

Dies zeigt wie ausserordentlich wichtig es ist, Spenderblut und Empfängerblut daraufhin zu untersuchen, ob irgendwelche Antikörper, zelluläre Antigene und Viren mit Antigeneigen-40 schatten bzw. virale Antigene enthalten sind, die bei den Empfängern die Reaktionen der Unverträglichkeit oder das Auftreten einer Krankheit auslösen können.

Im Falle von Transfusionen muss daher sichergestellt sein, dass das Nachweisverfahren ausreichend empfindlich ist. Aus-45 serdem muss das Fehlerrisiko bei der Bestimmung der Spezifität der erythrozytären oder zellulären Antigenen, von Antikörpern oder Viren bzw. viralen Antigenen praktisch Null sein.

Nachfolgend werden die in dieser Beschreibung verwendeten Begriffe näher definiert.

50 «Virus mit Antigeneigenschaften» im Sinne der Beschreibung ist ein Virus, für den man den mit ihm reagierenden spezifischen Antikörper kennt. Im folgenden Beschreibungstext werden hierfür gleichermassen die Bezeichnung Virus mit Antigeneigenschaften, Virus oder auch virales Antigen verwendet. 55 Immunoglobuline sind proteinartige Moleküle tierischer Herkunft, die entweder eine einfache Antigenaktivität oder eine einfache Antikörperaktivität oder auch beide Aktivitäten gleichzeitig, d.h. sowohl Antigenaktivität als auch Antikörperaktivität aufweisen. Für jede Tierart, unabhängig davon, ob es 60 sich um den Menschen oder ein anderes Lebewesen (beispielsweise Ziege, Meerschweinchen, Kaninchen und anderes mehr) handelt, existieren Immunoglobuline, die verschiedenen immu-nochemischen Klassen zugehören, d.h. Immunoglobuline einer Klasse A, die kurz mit IgA bezeichnet werden, Immunoglobuli-65 ne einer Klasse G, in der Kurzbezeichnung IgG usw. Allgemein wird ein Immunoglobulin der immunochemischen Klasse X und der Tierart I mit IgX I bezeichnet.

Testserum ist im Sinne der Beschreibung ein Serum (oder

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eine Lösung) das (die) Immunoglobuline einer bestimmten Tierart und einer bestimmten immunochemischen Klasse enthält, beispielsweise Immunoglobuline des Menschen der Klasse G, oder IgG, die eine Antikörperaktivität aufweisen, welche spezifisch ist gegenüber einem bestimmten erythrozytären oder zellulären Antigen einer Gruppe von Individuen der betreffenden Tierart, im gegebenen Beispiel einer Gruppe von Personen. Vorzugsweise wird von einer Gruppe Individuen gesprochen weil, wie für jeden Serologen klar, ein gleiches bestimmtes erythrozytäres oder zelluläres Antigen nicht bei allen Individuen der gleichen Tierart vorhanden sein muss sondern, meist nur bei bestimmten dieser Individuen, die eine Gruppe ausmachen.

In analoger Weise werden als Testkörperchen, Testzellen oder Testteilchen solcher Körperchen, Zellen oder Teilchen bezeichnet, die Antigeneinheiten oder -gruppen einer bestimmten Tierart tragen, mit denen sich die Immunoglobuline verbinden können, die die spezifisch entsprechenden Antikörpergruppen zu den Antigeneinheiten tragen.

Als Antiglobulin wird ein Immunserum einer von der Art I verschiedenen Tierart II bezeichnet, welches Immunoglobuline einer artspezifischen Antikörperaktivität gegenüber IgX I liefert. Das Antiglobulin wird als Ig II Anti-IgX I bezeichnet oder, wenn keinerlei Verwechslung möglich ist, kurz als Anti-IgX I.

Zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern (oder von erythrozytären Antigenen) im Plasma oder Serum einer Blutprobe (oder auf roten Blutkörperchen) kennt man die Reaktionen nach Coombs. Bei diesem bekannten Verfahren bzw. Coombs-Test wird folgendermassen gearbeitet, wenn beispielsweise bestimmt werden soll, ob das Plasma einer Humanblutprobe einen bestimmten Antikörper enthält, beispielsweise einen spezifischen Anti-D-Antikörper; anders gesagt ob es für das Antigen D spezifische Immunoglobuline enthält, von denen einige der immunochemischen Klasse G zugehören und infolgedessen IgG bezeichnet werden:

In einem Röhrchen wird das Plasma, das analysiert werden soll mit den roten Blutkörperchen inkubiert, die Antigeneinheiten D tragen, d.h. Einheiten mit einer Antigenaktivität spezifisch für den Antikörper, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit nachgewiesen werden soll; die Immunoglobuline des im Plasma gegebenenfalls vorhandenen spezifischen Antikörpers verbinden sich während diesem in-Berührung-miteinander-bringen mit den korrespondierenden Antigeneinheiten der roten Blutkörperchen. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsmedium wird gewaschen und dann mit einem Antiglobulin inkubiert, beispielsweise mit Ziegenserum, das Anti-Human IgG Immunoglobuline liefert. Im Verlauf dieser Inkubation kuppelt ein Immunoglobulin der Ziege, bereitgestellt von dem Antiglobulin, aufgrund seiner spezifischen Anti-Humanfunktion mit einem menschlichen Immunoglobulin das gegebenenfalls mit einer spezifischen Antigeneinheit eines roten Blutkörperchens verbunden ist. Nach beendeter Inkubation wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert und hierdurch, wenn der gesuchte spezifische Anti-D Antikörper tatsächlich im Plasma vorhanden war, eine Agglutinierung der roten Blutkörperchen untereinander hervorgerufen unter Mitwirkung der von dem Antiglobulin gelieferten Immunoglobuline und zwar aufgrund der Ausbildung von folgenden Bindungsketten:

rotes Blutkörperchen (Antigen D) - spezifisches menschliches Immunoglobulin Anti-D - menschliche Anti-Human-Immuno-globulin spezifisches menschliches Anti-D Immunoglobulin -(Antigen D) rotes Blutkörperchen.

Diese Agglutinierung ist an einem Bodensatz von aggluti-nierten roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens zu erkennen, wobei dieser Bodensatz aber nicht in allen Fällen gut von einem Bodensatz aus nicht-agglutinierten roten Blutkörperchen unterschieden werden kann. Um sicher zu gehen, ob es sich um einen Bodensatz aus agglutinierten roten Blutkörperchen oder aus nicht agglutinierten roten Blutkörperchen handelt, wird der Röhrcheninhalt leicht bewegt. Bei negativen Reaktionen, d.h. bei Reaktionen mit einem Blutplasma, das nicht den spezifischen Anti-D Antikörper enthielt, werden die nicht 5 agglutinierten roten Blutkörperchen wieder homogen suspendiert; im Falle der positiven Reaktionen hingegen bleiben die roten Blutkörperchen in mehr oder weniger grossen Gruppen miteinander verbunden.

Dieses Verfahren beruht auf relativ langen und delikaten io Reaktionen, die überdies manchmal nicht ausreichend empfindlich sind, was sich als Gefahr erweisen kann.

Das gleiche Problem der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen auf einer Zelle stellt sich auch im Falle der Transplantation von Organen. Bekanntlich tragen die Lym-15 phozyten eine bestimmte Anzahl von Antigenen, bezeichnet als Antigene des Systems HLA. Vor irgendeinem chirurgischen Eingriff zum Zwecke der Transplantation muss festgestellt werden, welches die HLA-Antigene auf den Lymphozyten des Spenders und auf denen des Empfängers sind, damit die zumin-20 dest theoretische Gewebsverträglichkeit zwischen den Lymphozyten der beiden verschiedenen Individuen festgestellt wird; ohne diese zumindest theoretische Verträglichkeit kann eine Organtransplantation überhaupt nicht in Betracht gezogen werden. Aufgrund der hohen Anzahl von verschiedenen Antigenen 25 des Systems HLA, die auf den Lymphozyten vorhanden sein können, muss eine beträchtliche Anzahl von Elementarreaktionen durchgeführt werden, um die jeweilige Spezifität der vorhandenen HLA-Antigene festzustellen; es können z.B. 100 Reaktionen notwendig sein, Massnahmen, die noch dadurch er-30 heblich erschwert werden, dass die Lymphozytenzellen nur in sehr kleinen Mengen zur Verfügung stehen und infolgedessen nur für Mikroreaktionen verwendet werden können.

Ausserdem werden beim Nachweisen oder Aufspüren bestimmter Viren oder viraler Antigene, beispielsweise des Anti-35 gens HBS, derzeit radio-immunologische Arbeitsweisen angewandt, die sehr kostspielig und umweltbelastend sind und deshalb einer Sondergenehmigung bedürfen.

Die Erfindung hat zum Ziel, ein Verfahren zum Analysieren eines biologischen Mediums, beispielsweise einer Humanblut-40 probe bereitzustellen, um virale Antigene, erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper in diesem Medium nachzuweisen oder zu identifizieren, das sich allgemein anwenden lässt und den Nachweis beliebiger Arten viraler Antigene in einem flüssigen biologischen Medium sowie aller Arten erythrozytärer 45 oder zellulärer Antigene und Antikörper, die in einer Blutprobe enthalten sind, ermöglicht.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines solchen Verfahrens, das eine hoch empfindliche Analyse ermöglicht, die denjenigen der bekannten Verfahren weit überlegen ist 50 und das dennoch ausgezeichnet spezifisch gegenüber dem viralen Antigen, dem erythrozytären oder zellulären Antigen oder dem gesuchten Antikörper bleibt. In diesem Zusammenhang wird das Analyseverfahren als umso emfindlicher bezeichnet, je geringer die Menge eines viralen Antigens, eines erythrozytären 55 oder zellulären Antigens oder eines Antikörpers einer bestimmten Spezifität ist, die mit seiner Hilfe nachgewiesen werden kann; das Verfahren wird als umso spezifischer angesehen, je besser es ermöglicht, ohne Fehler, d.h. ohne Verwechslung, alle diese Antigene oder Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität 60 nachzuweisen. Mit anderen Worten, ein virales Antigen einer bestimmten Spezifität darf nicht verwechselt werden mit einem viralen Antigen einer anderen Spezifität und das gleiche gilt beim Nachweis von erythrozytären oder zellulären Antigenen und von Antikörpern.

65 Die Erfindung soll weiterhin ein Analyseverfahren bereitstellen, das nicht umweltbelastend ist, mit dessen Hilfe die Zeitspanne beträchtlich verkürzt werden kann, die zum Erhalt der Analyseergebnisse notwendig ist und das zudem auf Reaktionen

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beruht, die einen sehr sparsamen Umgang mit Reaktionspartnern ermöglichen.

Um zu bestimmen, ob ein biologisches Medium virale, erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper enthält, wird erfindungsgemäss ein Analyseverfahren angewandt, das Gebrauch macht von Reaktionen immunologischer Beschaffenheit zwischen den Zellen oder Teilchen und einem Serum, sodann zwischen den auf diese Weise behandelten Zellen und Teilchen und einem Antiglobulin; das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium, welches die Zellen oder Teilchen und das Antiglobulin enthält, in einen Behälter eingebracht wird, dessen Wandung einen auf der Symmetrieachse des Behälters gelegenen Konvergenzpunkt oder Scheitelpunkt aufweist und auf dessen Wandung Moleküle fixiert worden sind, die immunologisch mit dem Antiglobulin reagieren können, dass man dieses Reaktionsmedium oder Reaktionsgemisch der Einwirkung einer im wesentlichen achsparallelen zentrifugalen Kraft unterwirft und zwar unter solchen Bedingungen, dass zumindest die Zellen, die eine positive Reaktion kennzeichnen, d.h. eine Analysereaktion, durchgeführt an einer Probe des biologischen Mediums, enthaltend das Antigen oder den Antikörper, das bzw. der identifiziert werden soll, fortschreitend an der Wand des Behälters haften und haften bleiben, aufgrund von Bindungskräften einer ersten Art, d.h. von Bindungskräften immunologischer Art, an denen das Antiglobulin beteiligt ist, und zu denen sich die Bindungskräfte einer zweiten Art addieren, während die Zellen, die eine negative Reaktion kennzeichnen, am Ende des Zentrifugierens an die Wand nur über Bindungskräfte der zweiten Art gebunden werden. Diese Zellen werden dann im Scheitelpunkt oder der Kuppe des Behälters gesammelt durch Anwendung einer zentrifugalen Kraft, die ausreichend stark ist, um die Bindungskräfte des zweiten Typus, durch die eine negative Zelle an die Behälterwand gebunden ist, zu zerstören, die aber nicht ausreichend stark ist, um die Summe der Bindungskräfte des ersten Typus und der Bindungskräfte des zweiten Typus, durch die eine positive Zelle an die Behälterwand gebunden ist, zu zerstören.

Das soeben definierte erfindungsgemässe Verfahren macht Gebrauch von einer besonderen Art von Reaktionen, nämlich von Reaktionen der «Immuno-Adhärenz» oder Immuno-Haf-tung. Diese Reaktionen werden so bezeichnet, weil der die Reaktionen anzeigende Vorgang in einer Haftung oder Adhärenz besteht zwischen einerseits Zellen, Körperchen oder Teilchen und andererseits dem Boden eines Behälters, überzogen mit einer Schicht oder Haut aus Molekülen, die Antigen- oder Antikörpereigenschaften aufweisen. Diese Haftung ist von immunologischer Beschaffenheit, weil sie durch die Entstehung von Antigen-Antikörper-Bindungen zwischen den Körperchen, Zellen oder Teilchen einerseits und dem Behälter andererseits hervorgerufen wird.

Es wurde beobachtet, dass das erfindungsgemässe Verfahren wesentlich empfindlicher ist als die bekannten Verfahren, und zwar um das Einhundertfache bis zum Eintausendfachen. Ausserdem ermöglicht das erfindungsgemässe Verfahren eine beträchtliche Verkürzung der Zeit, die zum Erhalt der Analysenergebnisse notwendig ist, und ermöglicht auf diese Weise die Durchführung von Eildiagnosen, die jetzt beispielsweise im Falle des Nachweises von erythrozytären Antigenen oder bekannten Antikörpern im Blut innerhalb von sechs Minuten anstatt bisher einer Stunde durchgeführt werden können. Das neue Verfahren ermöglicht ausserdem auch eine erhebliche Einsparung an Reaktionspartnern; dies ist sehr wichtig, beispielsweise wenn so kostbare Reaktionspartner benötigt werden wie lym-phozytäre Zellen oder Testsera einer seltenen Spezifität.

Ein weiterer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, dass keinerlei Radioaktivität beteiligt ist; es ist wesentlich billiger als die radio-immunologischen Verfahren und belastet im Gegensatz zu diesen Verfahren nicht die Umwelt.

Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung und die nachfolgenden Anwendungsbeispiele näher erläutert.

Die Fig. 1 bis 9b erläutern schematisch die verschiedenen 5 Stufen des erfindungsgemässen Verfahrens, angewandt auf die Untersuchung einer Blutprobe daraufhin, ob Antigen HBS enthalten ist.

Fig. 10 erläutert schematisch die Kräfte, denen eine Zelle beim Zentrifugieren unterworfen ist.

io Die Fig. 11 bis 14b zeigen schematisch die verschiedenen Stufen des Verfahrens nach der Erfindung, angewandt auf den Nachweis der Anwesenheit von Antigen D auf den roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe;

die Fig. 15 bis 18 sind Diagramme von Zentrifugiervorgän-15 gen.

Erstes Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung:

Diese erste Ausführungsform des Verfahrens wird mit Be-20 zug auf die Fig. 1 bis 9b erläutert. Das Verfahren wurde hierbei angewandt, um nachzuweisen, ob das Serum, oder Plasma, einer Humanblutprobe virales Antigen HBS enthielt, das nachfolgend zur Vereinfachung Antigen HBS bezeichnet wird.

a) Die erste Stufe des Verfahrens besteht darin, dass die 25 Oberfläche des Bodens eines Behälters vorbereitet wird, der zum Nachweis der Haftung oder der Nichthaftung von Zellen oder Teilchen dient.

Der Behälter, dessen Boden einen auf einer Symmetrieachse des Behälters gelegenen unteren Konvergenzpunkt aufweisen 30 soll, ist im vorliegenden Falle ein Becher 1 aus Kunststoff, beispielsweise aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem im Schnitt V-förmigen Boden 2. Dieser Boden 2 ist mit einer Schicht oder einem Häutchen aus Immunoglobulin 3 oder IgX I überzogen, die im vorliegenden Falle Immunoglobuline der Ziege der immu-35 nochemischen Klasse G sind, d.h. Ziegen IgG (Fig. 1). Diese Ziegen IgG 3 sind in der Figur als weisse Rechtecke wiedergegeben.

Die Fixierung der IgG auf dem Kunststoff des Bechers kann mit Hilfe verschiedener chemischer Verfahren erfolgen, beispielweise durch Erzeugung von Carbodiimid-Bindungen zwi-40 sehen dem Kunststoff und den IgG-Molekülen oder durch einfache Absorption der IgG durch den Kunststoff.

Die IgG-Konzentration ist dabei nicht kritisch. Da jedoch die Sensibilität oder Empfindlichkeit der Reaktionen von der Oberflächendichte der fixierten Immunoglubuline abhängt, 45 wird eine an Immunoglobulin ausreichend konzentrierte Lösung verwendet, damit der Becherboden mit Immunoglobulinen gesättigt und auf diese Weise eine grösstmögliche Empfindlichkeit erreicht wird.

Nach der Fixierung des Ziegen-IgG am Becherboden wird 50 der mit IgG überzogene Becher mit einer physiologischen Lösung gewaschen, beispielsweise mit physiologischer Kochsalzlösung (9% NaCl); um alle nicht am Becher fixierten IgG zu entfernen, wird mehrere Male gewaschen.

Die auf dem Kunststoff-Becherboden fixierte Schicht aus 55 IgG soll nicht trocken werden; daher wird im Boden des Bechers eine kleine Menge der physiologischen Kochsalzlösung zurückbehalten und die IgG-Schicht behält auf diese Weise ihre Aktivität für einige Stunden.

b) Anschliessend werden die Zellen oder Teilchen (nachfol-60 gend Reaktionspartner-Zellen oder -Teilchen bezeichnet) vorbereitet, mit deren Hilfe der Vorgang der Adhärenz oder Nicht-adhärenz nachgewiesen wird, je nachdem, ob die Reaktion positiv oder negativ verläuft, d.h. ob das Serum, das analysiert werden soll, HBS-Antigen enthält oder es nicht enthält. Im hier

65 beschriebenen Beispiel sind diese Zellen rote Blutkörperchen vom Schaf, schematisch mit 4 bezeichnet.

An diese roten Blutkörperchen 4 werden Immunoglobuline gekuppelt, die zwingend der gleichen Tierat und der gleichen

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immunologischen Klasse zugehören wie die im Becher fixierten IgX I; einige dieser Immunoglobuline müssen darüber hinaus eine Antikörperaktivität gegenüber dem HBS-Antigen aufweisen. Die Kupplung dieser Immunoglobuline erfolgt vorteilhafterweise gleichzeitig mit einer Behandlung der roten Blutkörperchen mit Chromichlorid, damit die roten Blutkörperchen Ei-weissmoleküle fixieren bzw. binden können. Im vorliegenden Falle werden somit auf den roten Blutkörperchen vom Schaf Ziegen-Anti-HBS IgG gekuppelt, die schematisch als gestrichelte Rechtecke wiedergegeben und mit 5 bezeichnet sind. Diese Stufe der Kupplung von IgG auf den roten Blutkörperchen wird schematisch in Fig. 2 gezeigt.

Diese Ziegen-IgG mit Anti-HBS-Wirkung werden aus dem Serum einer Ziege gewonnen, der gereinigtes Antigen-HBS injiziert worden ist.

Die auf diese Weise vorbereiteten roten Blutkörperchen werden als «Reaktionspartner-Blutkörperchen» bezeichnet. Natürlich können anstelle der roten Blutkörperchen beliebige andere Zellen oder Teilchen verwendet werden, an die Immunoglobuline gekuppelt werden können.

c) Die so vorbereiteten bzw. vorbehandelten und in physiologischer (Kochsalzlösung suspendierten roten Blutkörperchen 4 des Schafes werden mit dem Serum oder Plasma der Blutprobe inkubiert, die untersucht werden soll, um festzustellen, ob sie Antigen-HBS enthält oder nicht. In der Praxis wird beispielsweise ein 1 : 50 oder 1 : 100 verdünntes Plasma verwendet.

Bei dieser Inkubation, die ausserhalb des zuvor vorbereiteten Bechers durchgeführt wird, wird eine Suspension von vorbereiteten roten Blutkörperchen des Schafes, wie oben beschrieben, mit dem Serum der Blutprobe in Berührung gebracht und das Ganze bei Umgebungstemperatur inkubiert, während einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen zehn Minuten. Diese Inkubationsstufe wird schematisch in Fig. 3 gezeigt, wobei die eiförmigen oder ovalen, feingestrichelten Moleküle 6 das Antigen-HBS wiedergeben.

Ist in der Serumprobe, die analysiert werden soll, Antigen-HBS vorhanden, so kuppeln die Moleküle 6 das Antigen mit den Anti-HBs-IgG 5, die bereits auf den roten Blutkörperchen 4 gebunden sind. Wie schematisch in Fig. 3 gezeigt, ordnen sich die Antigen-Moleküle um die an ein rotes Blutkörperchen gebundenen Anti-HBs-IgG Moleküle herum an und erzeugen auf diese Weise eine sterische Hinderung in den intermolekularen Zwischenräumen, dis bisher zwischen den Anti-HBs-IgG Molekülen vorhanden waren.

Enthält das Serum, das analysiert werden soll, kein Antigen-HBS, so findet keinerlei Reaktion statt und die roten Blutkörperchen bleiben in dem Zustand, in welchem sie sich am Ende der vorhergehenden Stufe befunden haben, d.h. am Ende der Stufe, in der sie die Anti-HBs-IgG der Ziege fixiert oder gebunden haben, infolgedessen findet keinerlei sterische Hinderung um diese Anti-HBs-IgG Moleküle herum statt.

Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen werden vorteilhafterweise mehrmals mit physiologischer (Kochsalzlösung gewaschen (Zugabe der Lösung, wieder-in-Suspen-sion-bringen, Zentrifugieren, Dekantieren, Abgiessen der überstehenden Flüssigkeit usw.) und zwar in dem Behälter, in welchem inkubiert worden ist.

d) Dann werden in den Becher 1, dessen Boden 2 mit einer Schicht aus Ziegen IgG 3 überzogen ist, gleichzeitig eingebracht: zum einen die, wie oben beschrieben, inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen vom Schaf und zum anderen ein Antiglobulin, d.h. ein Immunserum bzw. Antiserum, das Immunoglobuline mit einer spezifischen Antikörperaktivität gegenüber den Immunoglobulinen enthält, die zum einen an den Becher fixiert und zum anderen an die roten Blutkörperchen gebunden sind, d.h. Ig II Anti-IgX I. Im vorliegenden Beispiel wird ein Anti-Ziegen Antiglobulin des Kaninchens zugegeben, das die Antiziegen-IgG Immunoglobuline G oder IgG des

Kaninchens enthält; diese Immunoglobuline sind schematisch in den Fig. 4a und 4b durch kleine schwarze Rechtecke 7 wiedergegeben; die Fig. 4a entspricht dem Falle einer positiven Reaktion und die Fig. 4b zeigt den Fall einer negativen Reaktion.

Gemäss einer Variante kann zunächst die Suspension der roten Blutkörperchen in den Becher gegeben werden und dann das Antiglobulin.

Die Immunoglobuline des Antiglobulins sind Immunoglobuline mit einer zumindest divalenten Antikörperfunktion gegenüber den Ziegen-IgG; ein Kaninchen-IgG mit Antiziegen-IgG-Wirkung kann somit mit einer dieser Antikörperfunktionen (oder Gruppen) mit einem am Becherboden fixierten Molekül Ziegen-IgG reagieren und mit der anderen Funktion mit einem an das rote Blutkörperchen gebundenen Molekül Anti-HBS Ziegen-IgG. Diese Immunoglobuline mit spezifischer Antikörperaktivität gegenüber den Ziegen-IgG werden aus dem Serum eines Tieres von unterschiedlicher Art erhalten, im vorliegenden Falle aus dem Serum eines Kaninchens dem Ziegen-IgG, vorteilhafterweise in gereinigter Form, injiziert worden ist.

Wie weiter unten noch erklärt, wird hier das Antiglobulin in relativ hoher Konzentration verwendet, beispielsweise ein Antiziegen-IgG Antiglobulin, das mindestens einen Titer von ( 128 aufweist gemäss der Arbeitsweise von Coombs, und zwar rein oder wenig verdünnt (Verdünnungsverhältnis 1 : 2 oder 1:4).

Während der Gesamtdauer dieser Inkubation, die als Antiglobulin-Inkubation bezeichnet wird und die aus weiter unten noch angegebenen Gründen sehr kurz sein muss, wird der Becher vorteilhafterweise ständig in Bewegung gehalten, um auf diese Weise das Gemisch aus Suspension von roten Blutkörperchen und dem Antiglobulin zu homogenisieren.

e) Nach der Antiglobulin-Inkubation wird zentrifugiert, wozu genaue Bedingungen eingehalten werden müssen; durch das Zentrifugierenn wird nachgewiesen, ob der Vorgang der Adhärenz eintritt oder nicht, je nachdem, ob die Serumprobe, mit welcher die vorbehandelten roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert worden sind, Antigen-HBS enthält oder nicht.

Beim Zentrifugieren rotiert der Becher um eine Achse la, die senkrecht steht zur Rotationsachse lb des Bechers 1; die erste Phase, Anlagerungsphase bezeichnet, wird nach einer ausreichend kurzen Zeit nach Beginn der Antiglobulin-Inkubation in Gang gesetzt, d.h. ausreichend kurz nach dem Einbringen der Blutkörperchen-Suspension und des Antiglobulins in den Becher, damit noch sehr wenig IgG 3, das am Becher fixiert ist, oder IgG 5, das an die Blutkörperchen gebunden ist, mit einem IgG 7 des Antiglobulins mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung reagiert hat. Vorteilhafterweise wird diese erste Zentrifugierphase nach einer Zeitspanne in Gang gesetzt, die maximal gleich ist der Zeitspanne innerhalb derer 10% des Ziegen-IgG mit den Anti-Ziegen-IgG Immunoglobulinen des Antiglobulins reagiert haben. In der Praxis bedeutet dies, dass mit dem Zentrifugieren einige Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden nach Beginn der Antiglobulin-Inkubation begonnen wird.

Während dieser ersten Zentrifugierphase wird das Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension der Blutkörperchen vom Schaf und Antiglobulin, an die Oberfläche des Becherbodens 2 angelagert bzw. dieser Boden damit ausgekleidet, so dass die Anti-HBS IgG der Ziege 5, die mit den behandelten und inkubierten roten Blutkörperchen vom Schaf verbunden sind und die Ziegen-IgG 3, die auf dem Kunststoff fixiert sind, einander gegenüber stehen und auf diese Weise eine schnelle anfängliche Haftung oder Adhärenz der roten Blutkörperchen an den Becherboden hervorgerufen wird, und zwar über die Immunoglobuline 7 des Antiglobulins, die einerseits mit den IgG 5 und andererseits mit den IgG 3 kuppeln; diese schnelle Anfangshaftung erfolgt unabhängig davon, ob die Reaktion positiv oder negativ verläuft, d.h. ob auf den roten Blutkörperchen Antigen-HBS Moleküle über Anti-HBS IgG der Ziege gebunden

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sind oder nicht. Hierzu wird eine erste massige Zentrifugierge-schwindigkeit Vi angewandt; wie diese Geschwindigkeit bestimmt wird, wird weiter unten erklärt.

Die Fig. 5a und 5b zeigen stark vergrössert die einander gegenüberliegenden Flächen eines roten Blutkörperchens 4 und des Becherbodens 2 im Verlauf dieser Anlagerungsphase; Fig. 5a entspricht dem Fall einer positiven Reaktion; Fig. 5b entspricht dem Fall einer negativen Reaktion.

In beiden Fällen ordnen sich die Immunoglobuline Ig 7 des Antiglobulins aufgrund ihrer speziellen Antikörperspezifität gegenüber den Ziegen-IgG zwischen einerseits den an die roten Blutkörperchen gebundenen Ziegen IgG 5 und andererseits den am Becherboden fixierten Ziegen IgG 3 an. Man nimmt an,

dass während dieser Anlagerung oder diesem Auskleiden, das zu einer mässig starken Haftung der roten Blutkörperchen an der Oberfläche des Becherbodens 2 führt, sich Gänge oder Freiräume zwischen dem Kunststoff und den roten Blutkörperchen ausbilden, die begrenzt sind von den Molekülketten IgG 5/Ig 7/IgG 3, welche sich gebildet haben; diese Gänge wirken als Filter gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Molekülen Ig 7.

Wie oben gesagt, bilden sich diese Gänge sowohl bei einer positiven Reaktion aus, d.h. wenn die roten Blutkörperchen 4 vom Schaf die Antigen-HBS Moleküle 6 über die IgG 5 gebunden haben, wie auch im Falle einer negativen Reaktion, bei der die roten Blutkörperchen 4 die Moleküle des viralen Antigens nicht gebunden haben. Jedoch sind im Falle einer positiven Reaktion (Fig. 6a) die Gänge mit Molekülen des viralen Antigens gefüllt, im Falle einer negativen Reaktion (Fig. 6b) hingegen nicht.

In der Praxis wird in dieser ersten Zentrifugierstufe oder -phase auf etwa 200 g beschleunigt (g = Erdbeschleunigung), während etwa 40 bis 60 Sekunden. Die Reaktion wird in einem Becher ausgeführt, der einen Öffnungswinkel des Konus von 120° aufweist.

f) Darauf wird das Zentrifugieren während mehrerer Minuten unterbrochen. Während dieser Unterbrechung zirkulieren die freien Moleküle Ig 7 in den zuvor während der Anlagerungsphase gebildeten Gängen und haben die Möglichkeit, mit den noch freien IgG 5 der roten Blutkörperchen oder den noch freien IgG 3 des Trägers zu kuppeln. Diese Phase, in der das Zentrifugieren unterbrochen wird, stellt in der Tat eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar.

Während der in der ersten Phase des Zentrifugierens erhaltenen mässigen Anlagerung oder Auskleidung haben sich zwischen Behälter (Wand) und den roten Blutkörperchen Bindungsketten ausgebildet, die bestehen aus: einem IgG fixiert an den Behälter, einem Anti-IgG Molekül und einem IgG gebunden an ein rotes Blutkörperchen. Erfindungsgemäss wurde im Verlauf von Versuchen festgestellt, dass diese Konfiguration energetisch weniger beständig ist in Anwesenheit eines Überschusses von Anti-IgG Molekülen als die Konfiguration bestehend aus: einem IgG fixiert an dem Behälter, einem Molekül-Anti-lgG... einem Molekül Anti-IgG, einem IgG gebunden an ein rotes Blutkörperchen. Man konnte hieraus schliessen, dass durch Verlängerung der Dauer der Antiglobulin-Inkubation schliesslich die Konfigurationen IgG/Anti-IgG ... Anti-IgG/ IgG in grösserer Anzahl gebildet werden als die Konfigurationen IgG/Anti-IgG/IgG, was dann die «Enthaftung» bzw. Auslösung der Haftung zwischen den roten Blutkörperchen und dem Behälter hervorrufenn würde. Diese Annahme hat sich bestätigt und hiervon wird vorteilhafterweise Gebrauch gemacht.

Da das Reaktionsgemisch sich in Ruhe befindet, verlängert sich die Antiglobulin-Inkubation und die Ziegen-Anti-lgG 7 reagieren mit den Zigen IgG 3 oder 5 in der Weise, dass sich die beständigsten Konfigurationen ausbilden.

Da aber, wie oben erläutert, im Falle einer positiven Reaktion die zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff entstandenen Gänge wesentlich gedrängter angefüllt sind als im Falle einer negativen Reaktion, sind im Falle einer negativen Reaktion (Fig. 6b) wesentlich mehr freie Moleküle Ig 7 vorhanden, die in den entstandenen Gängen zirkulieren als im Falle einer positi-5 ven Reaktion (Fig. 6a). Dies hat zur Folge, dass die einander gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des Kunststoffes in den Gängen im Falle einer negativen Reaktion sehr viel schneller mit Ig 7 gesättigt werden, die mit den IgG 5 der roten Blutkörperchen oder mit den IgG 3 des Kunststoffes io kuppeln, als im Falle einer positiven Reaktion. Nach Ablauf einer gewissen Zeit weisen im Falle einer negativenn Reaktion (Fig. 7b) die einander gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des Kunststoffes einen überwiegenden Anteil an Konfigurationen folgender Art auf: Kunststoff + IgG 3 15 der Ziege/Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen... Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen; diese Konfiguration kann, da zwei Moleküle gleicher Beschaffenheit einander gegenüberliegen, nicht zur Ausbildung einer vollständigen Molekülbrücke Kunststoff + Ziegen-IgG 20 3/lg 7 vom Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen führen.

Da sich diese Konfigurationen während der verlängerten Antiglobulin-Inkubationen in überwiegender Anzahl bilden,

sind die Molekülbrücken, die sich zwischenn Kunststoff und ro-25 ten Blutkörperchen während der ursprüngUchen schnellen Haftung in der Anlagerungsstufe gebildet haben, nicht mehr in ausreichender Zahl vorhanden, um die Haftung aufrechtzuerhalten. Es findet daher eine Ablösung statt.

Im Falle einer positiven Reaktion hingegen (Fig. 7a) tritt 30 dieser Effekt der Absättigung der gegenüberliegenden Oberflächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Ig 7 sehr viel langsamer ein, so dass die Anzahl der mit den IgG gekuppelten Anti-IgG Moleküle noch nicht zur Aufhebung der Haftung der roten Blutkörperchen in dem Zeitpunkt führt, zu dem 35 im Falle einer negativen Reaktion bereits eine Ablösung stattfindet.

Die Dauer dieser Unterbrechung beim Zentrifugieren bzw. der verlängerten Antiglobulin-Inkubation wird also so geregelt oder gesteuert, dass das Ausmass der Sättigung der einander ge-40 genüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Ig 7 Moleküle, das im Falle einer negativen Reaktion zur Ablösung führt, erreicht wird, dass aber andererseits der Effekt der Sättigung, der im Falle einer positiven Reaktion zur Ablösung (Aufhebung der Haftung) führt, nicht er-45 reicht wird.

g) Es folgt die letzte Stufe, in der zentrifugiert wird und zwar bei einer Geschwindigkeit V2, die grösser ist als die Geschwindigkeit Vi. Mit Hilfe dieser Zentrifugierphase kann nun unterschieden werden zwischen einer positiven Reaktion und ei-50 ner negativen Reaktion. Die Geschwindigkeit Vi wird so gewählt, dass die erzeugte Zentrifugalkraft die stärker mit Ig 7 gesättigten roten Blutkörperchen, d.h. die Blutkörperchen, welche die negative Reaktion anzeigen, in die Kuppe bzw. den Scheitelpunkt 10 des Bechers mitnimmt und dort sammelt (Fig. 8b), 55 während die roten Blutkörperchen, welche die positive Reaktion anzeigen oder kennzeichnen und die an der Becherwand haften bleiben aufgrund der stehen gebliebenen Molekülbrücken, nicht mitgenommen werden. Diese Molekülbrücken: Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig vom Kaninchen mit Anti-60 Ziegen-IgG-Wirkung/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen (Fig. 8a) bleiben erhalten, weil die Phase oder Stufe der verlängerten Antiglobulin-Inkubation abgebrochen wird, bevor der Sättigungsgrad an Ig 7 des Antiglobulins erreicht ist, welcher zur Ablösung führt.

65 In der Praxis wird bei Verwendung eines Bechers mit einem Öffnungswinkel des Konus von 120° beim zweiten Mal, d.h. in der letzten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 500 g während einer Zeitspanne von 40 Sekunden zentrifugiert.

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Die Analysenergebnisse können dann unmittelbar nach Abstoppen dieser zweiten Zentrifugierphase beobachtet werden.

Im Falle einer positiven Reaktion, d.h. in dem Fall, in dem die Serumprobe, mit welcher die roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert worden sind, tatsächlich Antigen HBS enthält, bleiben die roten Blutkörperchen am Becherboden haften bzw. fixiert und zwar über die IgG 3, die Ig 7 und die IgG 5. Man beobachtet dann beim Betrachten des Bechers entlang seiner Achse lb (Fig. 9a) eine homogene Monoschicht von roten Blutkörperchen, die über die gesamte Oberfläche des Becherbodens verteilt ist: es liegt Haftung vor.

Wenn andererseits die analysierte Serumprobe kein Antigen HBS enthält, werden die roten Blutkörperchen, wie oben beschrieben, zur Kuppe des Bechers hin mitgenommen und dort gesammelt. Betrachtet man den Becher entlang seiner Achse, so beobachtet man hier, dass sich ein Mikrosediment aus roten Blutkörperchen gebildet hat (Fig. 9b): es liegt keine Haftung vor.

Die Mengen der eingesetzten Reaktionspartner sind nicht kritisch. Als Beispiel sei angegeben, dass in einem Becher mit einem Durchmesser von 1 bis 7 mm das Volumen der eingebrachten Flüssigkeit 15 bis 250 /tl beträgt, wobei die Blutkörperchen-Suspension und das Antiglobulin vorteilhafterweise in gleichen Volumina eingesetzt werden.

Wie sich aus der bisherigen Beschreibung ergibt, müssen bestimmte Stufen unter genauen Bedingungen durchgeführt werden.

Die verwendete Antiglobulin-Konzentration hängt ab von der Oberflächendichte an IgG, die die im Verlauf der Stufe b) erhaltenen vorbehandelten und als Reaktionspartner dienenden roten Blutkörperchen aufweisen; dies wird nachfolgend mit Bezug auf das zweite Anwendungsbeispiel des Verfahrens noch näher erläutert.

Die Antiglobulinkonzentration muss ausreichend hoch sein, damit einerseits eine schnelle Anfangshaftung zwischen roten Blutkörperchen und Behälterwand im Verlauf der ersten Zentri-fugierstufe stattfindet und damit andererseits ein Überschuss an Anti-IgG Molekülen vorhanden ist, die ggf. zum Vorgang der Ablösung der roten Blutkörperchen führen können, Kennzeichnen der negativen Reaktion, wie weiter oben unter f) erläutert. Die Antiglobulinkonzentration soll andererseits nicht zu hoch sein, damit im Verlauf der Anlagerungsphase nicht zuviel Molekülbrücken zwischen roten Blutkörperchen und Behälterwand ausgebildet werden, da sonst selbst im Falle einer negativen Reaktion keine Gänge entstehen, die den Umlauf oder die Zirkulation der Anti-IgG Moleküle beim Abstoppen des Zentrifugie-rens stören würden.

Bei der Ausführung dieser Reaktionen der Immuno-Haf-tung wurde zusätzlich zu einer von der Antiglobulinkonzentration abhängigen «Zonen-Erscheinung» bzw. einem «Zonen-Vorgang», d.h. einer starken Schwankung der Sensibilität der Reaktion der Immuno-Haftung um ein Maximum, entsprechend einer bestimmten Antiglobulinkonzentration, noch eine weitere Zonen-Erscheinung bzw. ein weiterer Zonen-Vorgang nachgewiesen, der von der Zeit abhängt, während welcher dieses Antiglobulin mit den IgG vor dem Zentrifugieren in Berührung steht. Diese von der Berührungszeit abhängige Zonen-Erscheinung, die einen stärkeren Einfluss auf die Empfindlichkeit der Reaktion hat als die von der Antiglobulinkonzentration abhängige Zonen-Erscheinung, kann folgendermassen erklärt werden:

Im Verlauf der Antiglobulin-Inkubation kuppeln die vom Antiglobulin beigesteuerten Anti-IgG Moleküle einerseits mit den an die rotenn Blutkörperchen gebundenen IgG und andererseits mit den an den Kunststoff des Bechers gebundenen IgG, wobei die Anzahl der gekuppelten Anti-IgG Moleküle von der Inkubationszeit abhängt. Wie schon gesagt, folgt auf die Phase der Antiglobulin-Inkubation eine erste Zentrifugierphase,

die auch als Anlagerungsphase bezeichnet wird. Je länger die Inkubation dauert, um so häufiger wird sich ein bereits an ein rotes Blutkörperchen gebundenes Anti-IgG Molekül während der Anlagerungsphase gegenüber einem Molekül gleicher Beschaffenheit finden, d.h. gegenüber einem Anti-IgG Molekül, das seinerseits an den Kunststoff fixiert ist. Diese Konfiguration: rotes Blutkörperchen + IgG/Anti-IgG ... Anti-IgG/lgG + Kunststoff, die während der Anlagerung des roten Blutkörperchens an den Becherboden ausgebildet wird, wirkt sich ungünstig auf die Möglichkeit einer Haftung des roten Blutkörperchens am Kunststoff aus. Hieraus ist leicht zu ersehen, dass die Häufigkeit der Ausbildung derartiger für die Haftung ungünstiger Konfigurationen mit der Dauer der Antiglobulin-Inkubation zunimmt und dass infolgedessen die Chancen der Haftung, d.h. die Höhe oder das Ausmass der Sensibilität dieser Reaktion um so geringer ist, je länger die Antiglobulin-Inkubation dauert.

Die Sensibilität erreicht jedoch für eine Inkubationszeit Null kein Maximum. Es müssen nämlich, damit die Haftung tatsächlich realisierbar und wahrnehmbar ist, in dem Moment, in dem die Anlagerung stattfindet, einige Anti-IgG Moleküle bereits an einen der Kupplungspartner gebunden sein, d.h. entweder an die IgG, die ihrerseits mit einem roten Blutkörperchen verbunden sind, oder an die IgG, die auf dem Kunststoff fixiert sind. Einige Sekunden oder Bruchteile von Sekunden reichen aus, damit diese einigen Anti-IgG Moleküle sich binden oder kuppeln können.

Diese ausserordentlich kurze Inkubationszeit wird vorteilhafterweise experimentell bestimmt, derart, dass in der unmittelbar auf die Antiglobulin-Inkubation folgenden Stufe, d.h. in der Anlagerungsphase alle Reaktionen zur Anlagerung führen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ sind. Es werden also die verschiedenen Stufen des Verfahrens, beschrieben für eine negative Reaktion, ausgeführt, d.h. im vorliegenden Falle unter Verwendung einer Serumprobe, die kein HBS-Antigen enthält, wobei die geeignete Dauer der Inkubation so beschaffen ist, dass man in der Anlagerungsphase 100% Anlagerung oder Bindung erzielt.

Weiterhin sei bemerkt, dass die Immuno-Haftung oder Immuno-Adhärenz im Verlauf der Entwicklung der Antiglobulin-Inkubation ausserordentlich empfindlich ist für die schwachen oder geringfügigen Verringerungen der Oberflächendichte der an den Kunststoff fixierten IgG, die noch frei sind von Anti-IgG Molekülen.

Der Zentrifugiervorgang insgesamt ist, wie oben beschrieben, komplex und läuft in mehreren Phasen ab, von denen jede einen besonderen mechanischen Effekt auf die Reaktionen ausübt. Bevor die genauen Bedingungen, die im Verlauf dieser Zentrifugierphasen eingehalten werden müssen, weiter erklärt werden, seien die bei einer Zentrifugation auftretenden oder eingreifenden Kräfte mit Bezug auf Fig. 10 betrachtet.

Das Zentrifugieren, erzeugt durch eine Rotation um eine Achse 1 a, die senkrecht steht zur Rotationsachse 1 b des Bechers, hat den Effekt, dass ein rotes Blutkörperchen H oder eine andere Zelle oder ein anderes Teilchen, das zum Nachweis des Vorgangs der Haftung oder der Nichthaftung verwendet wird, einer Zentrifugalkraft Fc unterworfen ist, die parallel gerichtet ist der Achse 1 b des Bechers. Ausserdem spielen noch eine Reihe weiterer Parameter eine Rolle, die wie folgt definiert werden:

Der Winkel a, der von einer Mantellinie des Konus des Bechers mit ihrer Projektion in eine Ebene senkrecht zur Richtung der Zentrifugalkraft gebildet wird und der «Neigungs»-Winkel bezeichnet wird;

die Masse m eines roten Blutkörperchens;

der Zahlenwert n für die Beschleunigung g, die angewandt wird, wenn bei einer Geschwindigkeit von V UpM zentrifugiert wird;

s io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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die Zeitspanne t, während welcher die Geschwindigkeit an- bei der Beschreibung der verschiedenen Stufen des Verfahrens gewandt wird; näher erläutert ist, nicht mehr ablaufen könnte.

die Summe der als nicht spezifisch bezeichneten Kräfte Andererseits darf aber die Geschwindigkeit Vi in dieser An-(FNS), welche ein rotes Blutkörperchen am Kunststoff zurück- lagerungsstufe nicht zu gering sein. Eine zu schwache Anlagehalten; diese Summe umfasst die elektrostatischen Kräfte der 5 rung oder zu geringe Anlagerung würde eine ungenügende AnAnziehung eines roten Blutkörperchens an den Kunststoff; die näherung der reaktionsfähigen Enden zur Folge haben, d.h. ei-immunochemischen Bindungen «parasitäre» Spezifität mit Be- ne ungenügende Annäherung der an die roten Blutkörperchen zug auf die Hauptspezifität, auf welcher die Reaktion beruht, gebundenen IgG und der an den Kunststoff fixierten IgG, so die Widerstandskräfte gegenüber dem Abrutschen oder Ab- dass sich die Haftung schlecht ausbilden könnte und die Gänge schleudern mittels Unterstützung durch die lokalen Hindernisse io nicht recht Form annehmen könnten.

[Rauheit des Bechers, Anlehnung oder Abstützen auf der be- Die zweite Zentrifugierphase setzt sich nicht unmittelbar nachbarten Zelle oder den benachbarten Teilchen in geneigter nach der Anlagerungsstufe ein, sondern nach einer gewissen

(schräger) Stellung]; Pause oder Unterbrechungszeit, in der — wie bereits erläutert die Summe der spezifischen Bindungskräfte, die ein rotes — eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation stattfindet.

Blutkörperchen auf der Neigung oder geneigten Wand des Be- 15 Die zweite Zentrifugierphase wird mit einer Geschwindigkeit V2

chers zurückhalten, bezeichnet mit FS, und die bestehen aus der durchgeführt, die grösser ist als die Geschwindigkeit Vi- Diese

Kette der Bindungen zwischen Kunststoff und roten Blutkör- Zentrifugiergeschwindigkeit V2 muss die Wirkung haben, dass perchen, nämlich: die roten Blutkörperchen, welche am meisten Anti-IgG Molekü-

IgG (fixiert an einen Kunststoff)/Molekül Anti-IgG/(IgG le während der verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden gebunden an das rote Blutkörperchen) 20 haben, d.h. die roten Blutkörperchen, die für eine negative Re-

die Anlagerungskraft, die auf das rote Blutkörperchen aus- aktion charakteristisch sind, zum Scheitelpunkt bzw. Kuppe 10

geübt wird, bei einer Geschwindigkeit von V UpM, d.h. die des Becherbodens hin mitgenommen werden, dass aber anderer-

Kraft der Auflage des roten Blutkörperchens auf dem Kunst- seits die roten Blutkörperchen nicht mitgenommen werden, die stoff, entsprechend der Teilkraft der Zentrifugalkraft senkrecht eine positive Reaktion kennzeichnen und die, wie oben näher zu einer Mantellinie des Konus. Diese Anlagerungskraft wird 25 erläutert, infolge der Haftung an den Wänden des Becherbo-

mit Fp bezeichnet und ist gleich n x m x cos a; dens auch nach der verlängerten Antiglobulin-Inkubation ge-

die Kraft zum Abschleudern, die auf ein rotes Blutkörper- bunden bleiben, d.h. nachdem das Zentrifugieren unterbrochen chen bei einer Geschwindigkeit von V UpM ausgeübt wird, d.h. worden ist. Die Geschwindigkeit V2 wird daher so gewählt, dass die Kraft, mit der das rote Blutkörperchen abgelöst oder abge- die erzeugte Abschleuderkraft Fd2, die auf ein rotes Blutkörperrissen werden soll, durch die Teilkraft der Zentrifugalkraft 30 chen einwirkt, stärker ist als die Summe der unspezifischen Bin-parallel zu einer Mantellinie des Konus. Diese Abschleuder- dungskräfte, die dann alleine ein rotes Blutkörperchen zurück-Kraft wird als Fd bezeichnet und ist gleich n X m X sin a. halten, das am Becherboden eine negative Reaktion kennzeich-Nach diesen allgemeinen Betrachtungen sollen nun die Vor- net; andererseits muss die Abschleuderkraft kleiner sein als die gänge im einzelnen erläutert werden, die sich im Verlauf der Summe aus FNS + FS, d.h. der unspezifischen und der spezifi-verschiedenen Zentrifugierphasen abspielen. 35 sehen Bindungskräfte, durch die mittels Haftung die roten Blut-

Im hier beschriebenen Beispiel wird angestrebt, dass in der körperchen, welche eine positive Reaktion kennzeichnen, am ersten Zentrifugierphase, d.h. in der Anlagerungsstufe, eine Becherboden zurückgehalten werden.

schnelle Haftung der roten Blutkörperchen eintritt und infolge- In diesem Falle werden nur die roten Blutkörperchen, weidessen eine schnelle Ausbildung von Gängen zwischen den ein- che eine negative Reaktion kennzeichnen, abgeschleudert und ander gegenüberliegenden Oberflächen von Kunststoff und ro- 40 sammeln sich in der Kuppe des Bechers, während die Blutkörten Blutkörperchen; diese Gänge spielen die Rolle von Filtern perchen, die eine positive Reaktion kennzeichnen, haften blei-gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Anti-IgG Molekü- ben. Die Unterscheidung zwischen positiver und negativer Re-len, wie weiter oben bereits erläutert. aktion ist dann sehr deutlich.

, Für jedes untersuchte System, d.h. für eine besondere Be-

Die Geschwindigkeit Vi dieser ersten Zentrifugierphase wird . , .. , , „ , .. . , . „ ,, ,

... .^ ~ t- if -t. j 45 schaffenheit der als Reaktionspartner verwendeten Zellen oder somit so gewählt, dass die Anlagerungskraft FDl bewirkt, dass „ , , . , . . , , , „

Inn«. Diiifirnmofniian hafìati ^ Teilchen, des viralen Antigens, das nachgewiesen werden soll,

und der an der Reaktion beteiligtenn Moleküle IgX I und Anti-IgX I können somit die optimalen Werte für die oben definierten Parameter festgelegt werden, welche beim Zentrifugieren

100% der roten Blutkörperchen haften und zwar bei allen Reaktionen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ verlaufen. Diese Geschwindigkeit Vi muss somit so gewählt werden,

dass die Abschleudergeschwindigkeit Fdi nicht so stark ist, dass . . , , ... n .■ . . „ . .

. , .. , , .. ° . .. , ' , 50 beteiligt sind, und fur die die Reaktion die besten Ergebnisse die Bindungskrafte, welche die roten Blutkörperchen am Boden ... ° r . . „ , , ,, ,

. . liefert. Man kann dann feststellen, dass das Verhältnis von Ab-

des Bechers halten, aufgehoben werden. ,, , , , , .. „ , . .. ,

Schleuderkraft Fd zur Anlagerungskraft Fp, das eine mögliche

Damit die durch Haftung der roten Blutkörperchen am Ablösung bzw. ein mögliches Abschleudernn anzeigt, gleich ist:

Kunststoff gebildeten Gänge als Filter wirken können im Ver- w w .

n X m X sin ex lauf der nachfolgenden Phase, wenn das Zentrifugieren unter- 55 , d.h. tan a. Der Zahlenwert für dieses Verhält-

brochen wird oder wenn mit sehr geringer Geschwindigkeit zen- n X m X cos a trifugiert wird, muss ausserdem die Geschwindigkeit Vi ausrei- nis hängt also nur von dem Neigungswinkel a ab.

chend schwach sein, damit bei der Anlagerung der roten Blut- Für einen Winkel a = 0 beträgt somit der Wert für tan a körperchen an den Boden des Bechers diese roten Blutkörper- ebenfalls 0 und die Möglichkeit, dass das Teilchen abgeschleu-chen nicht zerdrückt werden. Wenn nämlich die Anlagerung zu 60 dert wird, ist gleich 0. Für einen Winkel a = 90° hingegen ist stark ist und die roten Blutkörperchen auf dem Kunststoff da- der Zahlenwert für tan a unendlich, so dass ebenfalls die Mög-bei zerdrückt werden, werden auch die Gänge zerdrückt und lichkeit, dass die Teilchen abgeschleudert werden, unendlich ist, sind nachfolgend nicht mehr vorhanden, und zwar auch im Fai- mit anderen Worten ein Nichtabschleudern bzw. Haftenbleiben le der negativen Reaktionen. Die freien Anti-IgG Moleküle ist unmöglich.

könnten dann nicht mehr zwischen Kunststoff und roten Blut- 65 Die Zwischenwerte für den Winkel a ermöglichen somit eine körperchen zirkulieren, so dass der Vorgang der Absättigung Dosierung oder mengenmässige Festlegung des Verhältnisses der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörper- von Abschleuderkraft zu Anlagerungskraft und die Anpassung chen und Kunststoff durch Anti-IgG Moleküle, der weiter oben dieses Verhältnisses an die Beschaffenheit der Zellen oder als

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Reaktionspartner verwendeten Teilchen, des viralen Antigens und der beteiligten Moleküle IgG I und Anti-IgG I, so dass man ein spezifisches Abschleudern oder Ablösen von Zellen oder Reaktionspartner-Teilchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen, im Verlauf der zweiten Zentrifugierphase erhält. 5

Um unter den bestmöglichen Bedingungen arbeiten zu können, soll daher vorteilhafterweise ein Satz Becher mit unterschiedlicher Neigung vorhanden sein, so dass der Becher mit der Neigung a gewählt werden kann, die am besten der Beschaffenheit der in Rede stehenden Reaktion entspricht. ^

Man kann auf diese Weise gleichzeitig unter den gleichen Bedingungen beim Zentrifugieren, d.h. mit den gleichen Werten für die angewandte Zentrifugalkraft, Analysen von mehreren unterschiedlichen Proben durchführen, in denen virale Antigene unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaf- 15 fenheit nachgewiesen werden sollen, indem für jede dieser verschiedenen Analysenproben der Becher gewählt wird, dessen Boden einen Neigungswinkel a mit einem solchen Wert aufweist, dass die für eine negative Reaktion charakteristischen Zellen oder Reaktionspartner-Teilchen abgeschleudert werden, 20 wenn die für die zweite Zentrifugierphase gewählte verfügbare Zentrifugalkraft angewandt wird.

Erfindungsgemäss ist somit auch ein Satz von Bechern mit V-förmigem Boden vorgesehen, deren Öffnungswinkel für den Konus unterschiedlich sind und beispielsweise den Bereich von 25 80 bis 140° umfassen und jeweils um 10° voneinander verschieden sind.

Für das oben beschriebene Beispiel zum Nachweisen von viralem Antigen HBsin einer Blutprobe werden vorteilhafterweise Becher mit konischem Boden und einem Öffnungswinkel des 30 Konus von 120° verwendet.

Fig. 15 zeigt beispielhaft ein Diagramm der verschiedenen Zentrifugierphasen, die im Verlauf einer Reaktion zum Nachweisen von Antigen HBS in einer Humanblutprobe durchgeführt werden, wobei die Reaktion der Immuno-Haftung in ei- 35 nem Becher mit konischem Boden und einem Öffnungswinkel des Konus von 120° vorgenommen wird. Auf der Ordinate ist die Zentrifugalkraft, angegeben in g, aufgetragen und auf der Abszisse die Zeit in Sekunden.

Das Reaktionsmedium, welches die zuvor mit der Serum- 40 probe und dem Antiglobulin inkubierten Blutkörperchen enthält, wird in den Becher eingebracht, dessen Boden mit einer Schicht oder Haut aus Ziegen-IgG überzogen ist und dort einer Antiglobulin-Inkubation unterworfen. Wie bereits angegeben,

wird der Becher während dieser Inkubation ständig in Bewe- 45 gung gehalten, beispielsweise hin- und hergehenden Bewegungen in einer Richtung parallel zur Umdrehungsachse. Diese Phase der Antiglobulin-Inkubation und des Schütteins ist in Fig. 15 mit I bezeichnet. Diese Phase wurde hier mit einer Beschleunigung von 4g durchgeführt, einem Wert, der keine Aus- 50 Wirkung hat auf das Absinken oder die Anlagerung der roten Blutkörperchen an den Becherboden. Mit der Beschleunigung 4g wurde während fünfzehn Sekunden zentrifugiert.

Dann wurde die Beschleunigung schnell erhöht bis zu einem Wert von 200 g und dieser Wert bis zur sechzigsten Sekunde 55 nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Becher beibehalten. In der fünfzehnten Sekunde begann somit eine Phase II, in der die roten Blutkörperchen absanken, wobei die Gesamtmenge der roten Blutkörperchen in der dreissigsten Sekunde am Becherboden versammelt war. Auf diese Phase II folgte 60 die Anlagerungsphase III, in der alle roten Blutkörperchen an dem Becherboden angelagert wurden und zwar sowohl im Falle der positiven Reaktionen wie im Falle der negativen Reaktionen; gleichzeitig begann die Bildung der «Filtergänge» zwischen der Oberfläche des Becherbodens und den daran anliegenden 65 roten Blutkörperchen.

In der sechzigsten Sekunde begann die Phase der Diffusion der noch frei im Reaktionsmedium zirkulierenden Antiziegen-

IgG Moleküle zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen (Phase IV im Diagramm gemäss Fig. 15); diese Phase stellt, wie bereits oben erläutert, eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar. Sie wurde ausgeführt, indem mit einer Beschleunigung von 8 g zentrifugiert wurde, einem Beschleunigungswert, der keinen ausreichend starken Zentrifugal- oder Zentri-fugiereffekt erzeugte, damit die zuvor während der Phase III gebildeten Gänge zerdrückt worden wären. Im Verlauf der Phase IV fand fortschreitend die Sättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Becherboden durch Antiziegen-IgG Moleküle statt; die Schwelle, bei der die Ablösung der roten Blutkörperchen, charakteristisch für die negative Reaktion, im Anschluss an die Sättigung stattfand, wurde in der dreihundertsten Sekunde erreicht.

Die letzte Phase, während welcher die gegebenenfalls vorhandenen roten Blutkörperchen, die eine negative Reaktion kennzeichnen, sich in der Kuppe des Becherbodens sammeln, wurde durchgeführt, indem die Zentrifugierbeschleunigung schnell auf 500 g angehoben wurde; dieser Wert reicht aus, um die für die negative Reaktion kennzeichnenden roten Blutkörperchen mitzureissen, da sie am Ende der Phase IV, in der die Absättigung mit dem Antiglobulin stattfand, praktisch nicht mehr hafteten. In dieser letzten Phase V wurden die roten Blutkörperchen, die ihre Haftung im Verlauf der vorangehenden Phase IV verloren hatten, schnell gesammelt.

Diese letzte Zentrifugierphase wird in dem Moment abgebrochen, in welchem man einen Prozentsatz von abgeschleuderten roten Blutkörperchen erhält, der gerade kennzeichnend ist für eine wirkliche oder tatsächliche negative Reaktion. Im hier gegebenen Beispiel wurde die letzte Zentrifugierphase in der 340sten Sekunde abgebrochen.

Die Zahlenwerte für die Parameter jeder dieser Phasen — Zentrifugiergeschwindigkeit, Dauer — können im vornhinein im Verlauf von Versuchen festgelegt werden, die anhand einer typischen negativen Reaktion mit den gleichen Reaktionspartnern vorgenommen wurden, wobei der Versuch mit den besten Ergebnissen die Werte für die Parameter liefert, die dann für die eigentliche Analysereaktion angewandt werden.

Gemäss einer Variante wird das Zentrifugieren entsprechend der Entwicklung der im Gang befindlichen Reaktionen gesteuert; das Verfahren wird dabei gleichzeitig einerseits in einem Becher ausgeführt, in welchem die Analysereaktion der Probe vorgenommen wird und andererseits in einem Becher, in welchem eine negative Kontrollreaktion vorgenommen wird; bei jeder Umdrehung während des Zentrifugierens wird mit einem Stroboskop-Blitz beleuchtet.

Das vergrösserte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera aufgenommen und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde: die Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosedimentes, das sich bildet, werden gemessen und die Wachstumskurve dieses Mikrosedimentes wird mit der Wachstumskurve des Mikrosedimentes verglichen, das bei einer negativen Bezugsreaktion der gleichen Art erhalten wird. Die Geschwindigkeiten und die Zeitdauer beim Zentrifugieren werden dann so gesteuert, dass die Wachstumskurve des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion der Wachstumskurve der Bezugsreaktion entspricht.

Das Zentrifugieren wird endgültig abgebrochen, wenn die Oberfläche des analysierten Mikrosedimentes einer Menge abgeschleuderter roter Blutkörperchen entspricht, die zumindest gleich ist der Menge, welche die Unterscheidungsschwelle für eine wahre negative Reaktion darstellt und die folgendermassen definiert wird:

Im Verlauf von Vorversuchen, durchgeführt an negativen Kontrollreaktionen, wird festgelegt, welchen Prozentsatz an roten Blutkörperchen ein Mikrosediment enthält, das eine wahre negative Reaktion bezeichnet, d.h., das unterschieden und ge

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messen werden kann und reproduzierbar ist und das dabei so klein wie möglich ist. Anschliessend wird die Standardabweichung a bestimmt, die für diese negativen Reaktionen erhalten wird. Die Schwelle der Unterscheidung einer negativen Reaktion entspricht dann einem Prozentsatz roter Blutkörperchen in s einem Mikrosediment, der gleich ist dem für die negative Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz + 2mal die Standardabweichung. In analoger Weise entspricht die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion einem Prozentsatz roter Blutkörperchen in einem Mikrosediment, der gleich ist dem für io eine negative Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz, vermindert um 2mal die Standardabweichung.

Wenn beispielsweise im Falle einer negativen Reaktion die im Sediment zusammengefassten roten Blutkörperchen im Mittel 12% ausmachen und die Standardabweichung zu 3% bestimmt wurde, liegt die Unterscheidungsschwelle für eine negative Reaktion bei 12% + 2mal 3¥o = 18%. Entspricht die Oberfläche des Mikrosedimentes der Analysereaktion einem Prozentsatz an abgeschleuderten und im Sediment zusammengesammelten roten Blutkörperchen am Becherboden, der gleich oder grösser ist als 18%, so wird die Reaktion als sicher negativ angesehen. Die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion beträgt in diesem Falle 12% — 2mal 3% = 6%: wenn also die Oberfläche des Mikrosedimentes der Analysereaktion einem Prozentsatz an roten Blutkörperchen, die im Mikrosediment versammelt sind, von 6% oder weniger entspricht, wird die Reaktion als sicher positiv angesehen. Entspricht die Oberfläche des entstandenen Mikrosedimentes einem Prozentsatz von roten Blutkörperchen zwischen 6 und 18%, so wird die Reaktion als zweifelhaft bewertet und sollte wiederholt werden. Das soeben beschriebene Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens wurde mit Bezug auf den Nachweis des viralen Antigens HBS in einer Humanblutprobe gegeben. Selbstverständlich kann dieses Verfahren auch für den Nachweis beliebiger ande-rer viraler Antigene in einer Blutprobe angewandt werden, indem dann in entsprechender Weise die Beschaffenheit der Zellen oder Teilchen, die als Reaktionspartner dienen, die Beschaffenheit der IgX, die am Boden des Bechers fixiert und an besagten Zellen oder Teilchen gebunden werden, sowie sowie die Beschaffenheit der Anti-IgX I Moleküle festgelegt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich auch auf andere biologische Flüssigkeiten als Blut anwenden, beispielsweise auf Speichel oder Urin, um dort ggf. vorhandene virale Antigene nachzuweisen oder ganz allgemein zum Nachweis von Antige- 45 nen, die als «molekular» bezeichnet werden können, d.h. freie Moleküle, die nicht an eine Zelle gebunden sind und die Anti-gen-Eigenschaften aufweisen, mit der Massgabe selbstverständlich, dass die verschiedenen Reaktionspartner in entsprechender Weise modifiziert werden, d.h. die Zellen oder Teilchen, die als 50 Reaktionspartner dienen, die Immunoglobuline, die mit diesen Zellen oder Teilchen gekuppelt und am Becher fixiert werden sollen, das Antiglobulin und die verschiedenen anderen Parameter der Raktion.

Zweites Beispiel für die Ausführung des Verfahrens nach 55 der Erfindung:

Mit Bezug auf die Fig. 11 bis 14b sei nun ein anderes Beispiel der Anwendung oder Ausführung des Verfahrens beschrieben, wodurch bestimmt werden kann, ob die roten Blutkörper- 60 chen einer Humanblutprobe die Antigenaktivität D aufweisen. Die Blutkörperchen, die diese Aktivität aufweisen, entsprechen einem Individuum mit positivem Rhesusfaktor. Wenn die roten Blutkörperchen hingegen diese Aktivitäten nicht aufweisen, ist die entsprechende Versuchsperson Rhesus-negativ. Zunächst sei 65 eine erste Ausführung dieses zweiten Beispiels beschrieben:

a) Die erste Stufe besteht, wie im ersten Beispiel, darin,

dass die Oberfläche des Trägers vorbereitet wird, auf welcher die Haftung oder Nichthaftung der Zellen bewiesen werden soll (Fig. 11 und 12).

Der Träger ist ein Becher 21 aus Kunststoff, beispielsweise aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem V-förmigen Boden 22. Dieser Boden 22 ist mit einer Schicht oder einem Häutchen aus Immunoglobulinen 23 überzogen, die der gleichen Tierart und der gleichen immunochemischen Klasse zugehören müssen, wie die Globuline mit spezifischer Antikörperwirkung des Antigens, dessen evtl. Vorhandensein auf den roten Blutkörperchen untersucht werden soll. Im vorliegenden Beispiel soll nachgewiesen werden, ob das Antigen D auf der Oberfläche der Membran der menschlichen roten Blutkörperchen vorhanden ist. Der spezifische Antikörper dieses Antigens ist ein Human-Immuno-globulin, vor allem vom Typus G mit Antikörperwirkung oder -funktion Anti-D. Am Boden des Bechers werden somit Human-Immunoglobuline vom Typ G fixiert, die man Human-IgG bezeichnet und die durch weisse Rechtecke 23 angegeben sind.

Die Fixierung oder Bindung der IgG an den Kunststoff, aus welchem der Becher besteht, wird unter den gleichen Bedingungen vorgenommen, wie sie oben im ersten Beispiel angegeben wurden. Nach der Fixierung der IgG an den Becherboden wird mit physiologischer 9%iger Kochsalzlösung gewaschen, um alle nicht fixierten IgG zu entfernen.

Die Konzentration an IgG, die eingebracht wird, ist nicht kritisch. Sie werden vorzugsweise im Überschuss eingebracht, bezogen auf die Menge, welche sich fixieren kann, indem beispielsweise eine Lösung enthaltend 1 mg/ml verwendet wird.

Damit die am Kunststoff gebundene IgG-Schicht nicht trocken wird, belässt man im Becherboden eine kleine Menge an physiologischer Kochsalzlösung.

b) Die Zellen, die in diesem Beispiel untersucht oder analysiert werden sollen, sind rote Blutkörperchen einer Humanblutprobe, die in physiologischer Kochsalzlösung schwimmen; sie werden ausserhalb des Bechers bei Umgebungstemperatur und während einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen 10 Minuten mit einem für die gesuchte Antigenaktivität spezifischen Testserum in Berührung gebracht, d.h. mit einem Serum, das IgG Moleküle der bekannten Antikörperspezifität Anti-D enthält, die spezifisch mit den Antigen-D Einheiten kuppeln können, die ggf. auf den roten Blutkörperchen vorhanden sind. Dieses Serum wird Anti-D Testserum genannt. In der Praxis wird beispielsweise eine Suspension von roten Blutkörperchen aus einer Blutprobe, verdünnt 1 : 50 oder 1 : 100, verwendet.

Fig. 13a zeigt auf der rechten Seite schematisch diese Stufe der Inkubation für den Fall, dass die analysierten roten Blutkörperchen «positiv» sind, d.h., dass sie Anti-D Einheiten tragen; diese Einheiten werden durch Punkte gekennzeichnet, die auf der Membran der roten Blutkörperchen 24 vorhanden sind. Diese roten Blutkörperchen kuppeln über ihre Antigen Einheiten mit Antikörper Anti-D IgG Molekülen 25 des verwendeten Testserums, wobei diese IgG Moleküle 25 mit Antikörperaktivität durch gestrichelte Rechtecke wiedergegeben sind; es entsteht ein Komplex, wie er bei 26 gezeigt ist.

In analoger Weise zeigt Fig. 13b schematisch diese Stufe für den Fall, dass die roten Blutkörperchen 24' «negativ» sind, d.h. keine Antigen-D-Einheiten tragen. In diesem Falle kuppeln die roten Blutkörperchen 24' keine Anti-D IgG 25.

Nach beendeter Inkubation wird vorteilhafterweise mehrere Male gewaschen, beispielsweise 3mal mit physiologischer Lösung, wobei jeder Waschgang folgende Arbeitsschritte umfasst:

Einbringen der physiologischen Lösung, erneut in-Suspen-sion-bringen, Zentrifugieren, Dekantieren, Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit. Gewaschen wird in dem Behälter, in dem inkubiert worden ist. Man erhält auf diese Weise eine Suspension von inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen,

5:

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d.h. von roten Blutkörperchen, die in einem Medium frei von Coombs aufweist, rein oder wenig verdünnt. In der Praxis wird IgG 25 schwimmen. eine Verdünnung des Antiglobulins verwendet, die die als opti-

c) Dann werden gleichzeitig in dem Becher 21, dessen Bo- mal bestimmte Konzentration aufweist mit Bezug auf die Emp-den mit Human-IgG 23 beschichtet ist, die Suspension der in- findlichkeit der anderen bekannten Analyseverfahren, insbeson-kubierten und gewaschen roten Blutkörperchen und ein Anti- 5 dere im Hinblick auf den Coombs-Test, der auf einer Hämag-globulin eingebracht, d.h. eine Lösung von tierischen Antiglo- glutination beruht.

bulinen 27, die Antikörperwirkung gegenüber den Human-IgG Im Becher wird dann die nach der Stufe b) erhaltene Sus aufweisen. Diese Immunoglobuline 27 des Antiglobulins sind pension von Blukörperchen mit dem Antiglobulin inkubiert, im Bild schematisch mit schwarzen Rechtecken wiedergegeben. wobei der Becher ggf. im Verlauf dieser Antiglobulin-Inkuba-

Gemäss einer Variante kann in einen Becher zunächst die 10 tion in Bewegung gehalten wird.

Suspension der roten Blutkörperchen und dann das Antiglobu- d) Anschliessend an diese Inkubation wird zentrifugiert;

lin eingebracht werden. dies muss unter genau bestimmten Bedingungen erfolgen, weil

Als Antiglobulin wurde hier ein Immunserum einer Ziege bei diesem Zentrifugieren der Vorgang der Haftung eintritt verwendet, der man die Human-IgG injiziert hatte. Dieses Im- oder nicht, je nachdem, ob die roten Blutkörperchen positiv munserum liefert Immunoglobuline, bezeichnet als Ziegen-Ig 15 oder negativ sind.

mit Antihuman-IgG-Wirkung, die eine zumindest divalente An- Wie oben mit Bezug auf das erste Beispiel erklärt, soll die tikörperwirkung gegenüber den Human-IgG aufweisen; ein Antiglobulin-Inkubation sehr kurz sein. Man beginnt daher mit

Antihuman-IgG Ziegen-Ig kann somit über seine eine Antikör- dem Zentrifugieren wenige Sekunden bis zu wenigen 10 Sekun-perfunktion mit einem Human-IgG kuppeln, das am Becherbo- den nach dem Einbringen des Reaktionsmediums, bestehend den fixiert ist und über die andere Funktion oder Gruppe mit 20 aus Suspension der roten Blutkörperchen und Antiglobulin in einem Human-IgG, das an ein rotes Blutkörperchen gebunden den Becher, d.h. nach einer Zeitspanne, die ausreichend kurz ist. ist, damit noch sehr wenige an den Becherboden fixierte IgG

Das Antiglobulin wird hier in starker Konzentration verwen- (IgG 23) oder an die Blutkörperchen gebundene IgG (IgG 25) det. Die Sensibilität der Immuno-Haftungsreaktion hängt näm- mit den Antihuman-IgG Ig-Molekülen des Antiglobulins besetzt lieh von der Antiglobulinkonzentration ab. Eine mögliche Er- 25 bzw. gekuppelt sind, wenn die entsprechenden Voraussetzungen klärung dieser Erscheinung kann folgendermassen lauten: gegeben sind.

Gleichgültig wie lange praktisch die Antiglobulin-Inkubation ge- Bei diesem Zentrifugieren wird um eine Achse 21a rotiert, dauert hat, wird eine 100%ige Absättigung der IgG bei weitem die senkrecht verläuft zur Rotationsachse 21b des Bechers, und nicht erreicht und zwar sowohl bei den IgG, gebunden an die zwar in zwei Stufen oder Zeitabschnitten bzw. Phasen:

roten Blutkörperchen, wie auch bei den an den Becherboden fi- 30 In der ersten Stufe wird das Reaktionsmedium gegen die xierten IgG. Die Auskleidung mittels der Abscheidung von ro- Fläche des Becherbodens 22 verteilt und daran angelagert, so ten Blutkörperchen bewirkt somit, dass sich eine beträchtliche dass alle Komplexe aus roten Blutkörperchen und IgG, wenn Anzahl von heterologen IgG Molekülen nähern, d.h. von IgG, solche gebildet worden sind, oder alle durch die Inkubation mit die am Becherboden fixiert sind und von IgG, die an die roten dem Anti-D-Testserum nicht veränderten roten Blutkörperchen Blutkörperchen gebunden sind. Solange jedoch das rote Blut- 35 den IgG gegenüberliegen oder -stehen, die an den Kunststoff fi-körperchen nicht durch Haftung immobilisiert worden ist, d.h. xiert sind, indem eine erste Zentrifugiergeschwindigkeit Vi an-solange die Moleküle des Antiglobulins keine Brücke gebildet gewandt wird, deren Zahlenwert nicht ausreicht, um die roten haben zwischen den an das rote Blutkörperchen gebundenen Blutkörperchen in die Kuppe 30 des Becherbodens mitzuneh-und den am Kunststoff fixierten IgG rollt oder gleitet das rote men bzw. mitzuziehen.

Blutkörperchen auf der Neigung des Becherbodens, der mit IgG 40 Wie sich aus den oben dargelegten allgemeinen Betrachtun-überzogen ist, so dass die Zeitdauer der maximalen Annähe- gen ergibt, wird die Geschwindigkeit Vi dieser ersten Zentrifu-rung der beiden gegebenen heterologen IgG Moleküle sehr kurz gierphase so gewählt, dass die hierdurch erzeugte Abschleuderist und dies um so mehr, je weniger die roten Blutkörperchen Geschwindigkeit Fdi nicht stark genug ist, um die unspezifi-mit IgG besetzt sind. Die Zeitspanne, während welcher die Ent- sehen Bindungskräfte FNS aufzuheben oder zu zerreissen, die fernung günstig bleibt für eine Doppelreaktion mit einem Mole- 45 die roten Blutkörperchen am Becherboden festhalten. Die roten kül des Antiglobulin, ist somit sehr kurz. Ist der kürzeste mitt- Blutkörperchen werden somit angelagert und befinden sich in lere Abstand zwischen einem Antiglobulin-Molekül und zwei einer Stellung, die es ggf. ermöglicht, dass Antihuman-IgG Mo-heterologen IgG-Molekülen zu gross, damit die mittlere Zeit des leküle des Antiglobulins eine Brücke ausbilden zwischen den am Zutrittes dieses Antiglobulin-Moleküls kleiner ist als die wirksa- Kunststoffboden fixierten Human-IgG und den an den roten me Zeit der Annäherung von zwei heterologen IgG-Molekülen 50 Blutkörperchen gebundenen Human-IgG. Diese Anlagerungsauf günstige Entfernung, so wird keine Reaktion stattfinden. phase ermöglicht auch, dass Antihuman-IgG Moleküle, die be-Man erkennt sofort, dass durch Erhöhen der Antiglobulin-Kon- reits fest mit den Komplexen aus positiven roten Blutkörper-zentration diese mittlere Zutritt-Zeit verringert wird. chen und IgG gebunden sind, den noch verfügbaren IgG-Stellen

Ausserdem muss, da man nicht im voraus die IgG-Oberflä- auf dem Kunststoff gegenüber angeordnet werden, d.h. in eine chendichte der roten Blutkörperchen kennen kann, das Antiglo-55 günstige Stellung, um vollständige Molekülbrücken zwischen bulin in starker Konzentration verwendet werden, um sicherzu- Kunststoff und roten Blutkörperchen auszubilden.

stellen, dass selbst im Falle einer sehr geringen Oberflächen- Die erste Zentrifugiergeschwindigkeit Vi wird ausserdem dichte an IgG der roten Blutkörperchen die Anti-IgG-Moleküle ausreichend lang beibehalten, damit, wenn erforderlich, diese mit den wenigen auf den roten Blutkörperchen vorhandenen Molekülbrücken zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen IgG reagieren können, um sie auf diese Weise an den Behälter 60 sich ausbilden und vervollständigt werden; diese Brücken beste-anzulagern. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, dass der hen aus einer Kette folgender Bedingungen:

Einfluss der Antiglobulinkonzentration auf die Empfindlichkeit der Reaktion weniger stark ist im Falle des Nachweises eines viralen Antigens, wie HBS-Antigen, da in diesem Falle die Oberflächendichte an IgG der roten Blutkörperchen, welche als Re- 65 In der Praxis wird die Reaktion in einem Becher ausgeführt, aktionspartner dienen, relativ hoch angesetzt wird. der einen Öffnungswinkel des Konus von 120° aufweist; die er-

Man verwendet beispielsweise ein Antiglobulin mit Antihu- ste Zentrifugierphase wird mit einer Beschleunigung von etwa man-IgG-Wirkung, das einen Titer von mindestens 128 gemäss 200 g während etwa einer Minute vorgenommen.

Kunststoff + IgG 23/Antiglobulin 27/IgG 25/positive Blutkörperchen 24.

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e) Hierauf folgt eine zweite Zentrifuglerphase die bei einer Geschwindigkeit V2 durchgeführt wird, welche grösser ist als die Geschwindigkeit Vi. Durch diese zweite Zentrifugierphase kann zwischen positiver und negativer Reaktion unterschieden werden. Die Geschwindigkeit V2 wird so gewählt, dass die erzeugte Zentrifugalkraft die negativen roten Blutkörperchen, sofern vorhanden, in die Kuppe 30 des Becherbodens zieht und sie hier versammelt bzw. zusammenballt (Fig. 14b). Sie reicht hingegen nicht aus,; um die positiven roten Blutkörperchen mitzunehmen, die an die Becherwand gebunden bleiben, und zwar mit Hilfe der IgG 23, der Antihuman-IgG Moleküle 27 und der IgG 25 (Fig. I4a). Die Geschwindigkeit V2 wird also so gewählt, dass die durch dieses Zentrifugieren erzeugte Abschleudergeschwindigkeit Fd2 eine Intensität aufweist, die grösser ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte FNS, die ein negatives rotes Blutkörperchen am Becherboden halten, jedoch kleiner als die Summe aus unspezifischen Bindungskräften und spezifischen Bindungskräften FNS + FS, die ein positives rotes Blutkörperchen am Becherboden festhalten.

In der Praxis wird, wenn diese Reaktion in einem Becher mit einem Scheitelwinkel von 120° ausgeführt wird, in dieser zweiten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 1600 g zentrifugiert, und zwar während einiger Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden.

Die Analysenergebnisse erscheinen unmittelbar nach Ende der Reaktion.

Im Falle einer positiven Reaktion, d.h. wenn die analysierten roten Blutkörperchen tatsächlich Antigen D Aktivität aufweisen, bleiben alle Komplexe 26 aus roten Blutkörperchen und IgG am Becherboden gebunden und zwar über die Antihuman-IgG Moleküle 27 (Fig. I4a) und die Human-IgG 23. Man beobachtet dann beim Betrachten des Bechers entlang seiner Achse 21b (rechte Seite der Fig. 14a) eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen, die über die gesamte Fläche des Becherbodens verteilt sind: es liegt Haftung vor.

Wenn die analysierten roten Blutkörperchen hingegen keine Antigen D Aktivität aufweisen, werden sie im Verlauf der zweiten Zentrifugierphase in die Kuppe 30 des Becherbodens mitgenommen und hier zusammengeballt. Betrachtet man den Becher entlang seiner Achse, so beobachtet man in diesem Falle die Bildung eines Mikrosedimentes 31, das aus roten Blutkörperchen besteht (rechte Seite der Fig. 14b): es ist nicht zur Haftung gekommen.

Die angewandten Mengen der Reaktionspartner sind nicht kritisch. In einem Becher mit Durchmesser I bis 7 mm wird beispielsweise ein Flüssigkeitsvolumen von 15 bis 250 /tl eingebracht, wobei vorteilhafterweise gleiche Volumina an Suspension der roten Blutkörperchen und an Antiglobulin eingesetzt werden.

Das soeben mit Bezug auf die Untersuchung, ob Antigen-D-Einheiten auf roten Blutkörperchen vorhanden sind oder nicht, beschriebene Verfahren kann unter den gleichen Bedingungen angewandt werden, um zu untersuchen, ob Serum oder Plasma einer Humanblutprobe Anti-D spezifische Antikörper enthalten. In diesem Falle wird das Serum, welches analysiert werden soll, mit Test-Blutkörperchen inkubiert, die bekannte Antigen-D-Spezifität aufweisen: wenn das Serum, welches analysiert werden soll, Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält, kuppeln die von diesem Serum gelieferten Immunoglobuline mit Anti-D spezifischer Antikörperwirkung mit den Antigen D Einheiten der roten Blutkörperchen.

Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen werden dann vorteilhafterweise gewaschen, und in den Behälter eingebracht, wie oben beschrieben, und zwar gleichzeitig mit dem Antiglobulin; anschliessend werden die gleichen Zentrifu-gierstufen durchgeführt, wie oben erwähnt.

Ist die Reaktion positiv, d.h. enthält das Serum, das analysiert werden soll, in der Tat Anti-D spezifische Antikörper, so bildet sich eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen aus, die an der Oberfläche des Becherbodens haften aufgrund der Ausbildung von Molekülbrücken der Konfiguration Kunststoff + IgG/Anti-IgG/IgG/rote Blutkörperchen. Enthält 5 hingegen das Serum, das analysiert werden soll, keine Anti-D spezifischenn Antikörper, so ist die Reaktion negativ und die Blutkörperchen, die nicht am Becherboden zur Haftung gebracht werden konnten, finden sich am Ende der Reaktion in Form eines Mikrosedimentes in der Kuppe des Bechers, io Das Verfahren wurde bisher beschrieben mit Bezug auf die Untersuchung, ob rote Blutkörperchen Antigeneinheiten D tragen oder ob im Plasma oder Serum einer Blutprobe Antikörper mit Anti-D-Spezifität vorhanden sind; es kann auch für die Untersuchung oder den Nachweis beliebiger anderer erythrozytärer is Antigene oder beliebiger anderer Antikörper im Plasma einer Blutprobe angewandt werden. Wird die Untersuchung im Hinblick auf ein bestimmtes erythrozytäres Antigen geführt, so werden die Blutkörperchen, für die bestimmt werden soll, ob sie in der Tat Antigenaktivität aufweisen, mit einem Testserum 20 inkubiert, das den bekannten spezifischen Antikörper des gesuchten Antigens enthält. Umgekehrt wird, wenn man wissen will, ob das Plasma einer Blutprobe einen bestimmten Antikörper enthält, dieses Serum mit bekannten Test-Blutkörperchen inkubiert, die die dem gesuchten Antikörper entsprechende An-25tigen-Aktivität aufweisen.

Diese Test-Blutkörperchen können rote Blutkörperchen sein, die Antigeneinheiten tragen, welche für den gesuchten Antikörper spezifisch sind. Es können statt dessen auch Zellen anderer Beschaffenheit oder geeignete Teilchen eingesetzt werden, 30 beispielsweise Kunststoffteilchen, Zellen oder solche Teilchen, auf denen die für den gesuchten Antikörper spezifischen Antigeneinheiten vorher gebunden worden sind.

Anschliessend werden dann die verschiedenen weiteren Stufen durchgeführt, wie sie oben beschrieben wurden, indem ggf. 35 die verschiedenen Arbeits-Parameter verändert werden, beispielsweise die Parameter für das Zentrifugieren, so dass die Haftung oder Nichthaftung nachgewiesen werden können.

Das zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung kann auch angewandt werden für Untersuchungen 40 beliebiger Arten von zellulären Antigenen, beispielsweise Antigen, das von den Lymphozyten getragen wird oder auch Plätt-chen-Antigen, indem in entsprechender Weise die Beschaffenheit der verschiedenen Reaktionspartner, d.h. Testserum, Immunoglobuline, die am Becherboden fixiert werden, und Anti-45 globulin ausgewählt werden.

Dieses zweite Beispiel des Verfahrens nach der Erfindung kann gemäss einer Variante oder Abänderung durchgeführt werden, die nachfolgend beschrieben wird. Es handelt sich wiederum um den Nachweis, ob die roten Blutkörperchen einer so Humanblutprobe Antigen-D-Aktivität aufweisen oder nicht.

a) Wie in der zuvor beschriebenen Variante besteht die erste Stufe darin, dass der konische Boden des Bechers aus Kunststoff so vorbereitet wird, dass er mit Human-IgG beschichtet oder überzogen ist, d.h. mit Immunoglobulinen der gleichen

55 Tierart und der gleichen immunochemischen Klasse, denen die in der nächsten Stufe verwendeten Antigen D spezifischen Antikörper zugehören.

b) Anschliessend wird, wie zuvor, in einem anderen Becher als dem Analysebecher eine Inkubation vorgenommen, der ro-

60 ten Blutkörperchen, welche analysiert werden sollen und in einer geeigneten physiologischen Lösung schwimmen, mit einem Testserum, das Antikörper bekannter Anti-D-Spezifität enthält (Anti-D-Testserum). Die mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen werden dann zweckmässigerweise mit physiolo-65 gischer Lösung gewaschen.

c) Anschliessend werden, immer noch ausserhalb des Analysebechers, die so vorbehandelten roten Blutkörperchen mit ein^m Antiglobulin inkubiert, d.h. mit einem tierischen Immun

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serum, das Anti-Human-IgG-ImmunoglobuIine liefert. Diese Inkubation wird unter den üblichen Temperaturbedingungen vorgenommen, beispielsweise bei 20° C und während ausreichend langer Zeit, damit die grösstmögliche Anzahl oder zumindest ein hoher Prozentsatz der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG-MoIeküle (im Falle, dass die roten Blutkörperchen positiv sind) mit den Antihuman-IgG-Molekülen kuppeln. Vorteilhafterweise dauert eine solche Inkubation 20 Minuten.

Das verwendete Antiglobulin wird vorteilhafterweise in höherer Konzentration eingesetzt, aus den gleichen Gründen, wie sie oben bereits erläutert wurden. Im vorliegenden Falle wird mit einem Antiglobulin gearbeitet, das einen Coombs-Titer von mindestens 128 aufweist, verdünnt oder wenig verdünnt, d.h. in einem VerdünnungsVerhältnis von I : 2 oder 1:4.

d) Am Ende dieser Inkubationszeit wird das Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin, in den Becher gegeben, dessen Boden mit Human-IgG beschichtet bzw. überzogen ist.

e) Dann wird sofort ein erstes Mal zentrifugiert, wobei der Becher um eine Achse rotiert, die senkrecht steht zu seiner Rotationsachse. Diese Zentrifugierphase wird bei einer Geschwindigkeit Vi ausgeführt, die ausreichend gross ist, damit die Blutkörperchen sich an der Oberfläche des Becherbodens anlagern, die aber nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte aufzuheben, durch die die roten Blutkörperchen, sowohl die negativen wie die positiven, an die Becherwand gebunden sind. Die Geschwindigkeit Vi wird somit so bemessen, dass die Intensität der erzeugten Abschleuderkraft kleiner ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte FNS. Diese ersten Zentrifugiergeschwindigkeit wird während einer ausreichenden Zeit beibehalten, damit die Molekülketten, bestehend aus einem am Becherboden fixierten Human-IgG, einem Anti-Human-IgG-Molekül und einem Human-IgG, das spezifisch an eine Anti-gen-D-Einheit eines roten Blutkörperchens gekuppelt ist, sich ausbilden können; diese Zeit wird entsprechend der Beschaffenheit des untersuchten Antigens oder Antikörpers im voraus bestimmt. Im vorliegenden Falle wird mit einer Beschleunigung von etwa 200 g während etwa einer Minute zentrifugiert.

f) Anschliessend wird — wie bei der ersten Ausführungsform — ein zweites Mal zentrifugiert.

Genauer gesagt, die Zentrifugiergeschwindigkeit wird auf einen Wert V2 gesteigert, der so bemessen ist, wie bereits erklärt, dass die Intensität der erzeugten Abschleuderkraft ausreicht, um die Blutkörperchen, die nur über unspezifische Bindungskräfte an den Becher gebunden sind, d.h. die negativen Blutkörperchen in die Kuppe des Bechers mitzunehmen, dass die Intensität hingegen nicht ausreicht, um die Blutkörperchen mit Antigen D Funktion in die Kuppe mitzunehmen; d.h. die Intensität reicht nicht aus, um die Summe aus unspezifischen Bindungskräften FNS einerseits und spezifischen Bindungskräften FS andererseits aufzuheben, durch die die positiven roten Blutkörperchen an der Neigung des Bechers gehalten werden, und zwar dank der ausgebildeten Molekülbrücken, Kunststoff + Human-IgG/Antihuman-IgG/Anti-D-Human-IgG/Antigen D eines Blutkörperchens.

Man beobachtet die gleichen Ergebnisse, wie sie zuvor erhal ten wurden: wenn die Reaktion positiv ist, tritt Haftung ein und man beobachtet beim Betrachten des Bechers entlang seine: Rotationsachse eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen, die über den Becherboden verteilt sind. Ist hingegen die Reaktion negativ, so findet keine Haftung statt und man beobachtet in der Kuppe des Becherbodens ein Mikrosediment.

Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten oben beschriebenen vor allem darin, dass die Antiglobu-lin-Inkubation, d.h. die Inkubation der roten Blutkörperchen, die zuvor mit dem Testserum inkubiert worden sind, und der Antihuman-IgG-Moleküle nicht in dem mit Human-IgG ausgekleideten Becher unmittelbar vor der ersten Zentrifugierphase vorgenommen wird, sondern ausserhalb dieses Bechers und dass das dabei erhaltene Reaktionsmedium dann erst in den Becher eingebracht und hier zentrifugiert wird. Was hierbei angestrebt wird, ist eine maximale Asymmetrie zwischen dem Pro-5 zentsatz an Antihuman-IgG-Molekülen, die mit den an den Kunststoff gebundenen oder fixierten Human-IgG-Molekülen reagiert haben, und dem Prozentsatz Antihuman-IgG-Moleküle, die mit den an die roten Blutkörperchen gebundenen Hu-man-IgG-Molekülen reagiert haben. Die ideale Bedingung wird io erreicht, wenn 0% der am Kunststoff fixierten Human-IgG-Moleküle durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt sind bzw. mit diesen gekuppelt haben und wenn der grösstmögliche prozentuale Anteil an Human-IgG-Molekülen, die an die roten Blutkörperchen gebunden sind, durch Antihuman-IgG-15 Moleküle besetzt ist bzw. mit diesen gekuppelt hat, vorausgesetzt, dass dieses Maximum unterhalb des Wertes liegt, der eine direkte Agglutinierung der roten Blutkörperchen miteinander über die Anti-IgG-Moleküle hervorruft.

Es ist nämlich wahrscheinlich, dass die maximale Empfind-20 lichkeit der Haftungsreaktion erreicht wird, wenn zu Beginn der Anlagerung der roten Blutkörperchen an die Fläche des Becherbodens, d.h. zu Beginn der ersten Zentrifugierphase, eine maximale Asymmetrie erreicht wird der Verteilung der an die beiden möglichen Kupplungsstellen gebundenen Anti-IgG-Moleküle, 25 d.h. der an den Kunststoff fixierten IgG und der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG; diese Asymmetrie ist so gerichtet oder beschaffen, dass die Kupplungsstelle mit der geringeren Oberflächendichte an IgG den grösseren Prozentsatz an Anti-IgG-Moleküle gebunden hat. In dem Fall, der hier als Bei-30 spiel dient, ist die Kupplungsstelle (oder Kupplungsende) mit der geringeren Oberflächendichte an IgG das rote Blutkörperchen und der Kunststoff weist eine höhere Oberflächendichte an IgG auf, weil diese Immunoglobuline hier bis zum Sättigungsgrad fixiert oder gebunden worden sind.

35 Eine solche Antiglobulin-Inkubation wird als «asymmetrisch» bezeichnet, während die in der ersten Ausführungsform oben beschriebene Antiglobulin-Inkubation als symmetrisch bezeichnet wird, da dort jede der beiden IgG-Kupplungsstellen gleichzeitig mit dem Antiglobulin in Berührung gebracht wird. 40 Im Falle der Identifizierung von erythrozytären oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern kann mit Hilfe einer asymmetrischen Antiglobulin-Inkubation ausserhalb des Analysebechers, in welchem die Reaktion der Immuno-Haftung stattfindet, eine um das 10- bis lOOfache höhere Empfindlichkeit er-45 reicht werden als in den Fällen, in denen eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation vorgenommen wird.

Diese zweite Ausführungsform, bei der mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird, wird somit vorzugsweise vor allem für solche Reaktionen angewandt, die als 50 schwierig qualifiziert werden können, d.h. für Reaktionen, die charakterisiert sind durch eine sehr kleine Anzahl vom Immu-noglobulinen-lg, beispielsweise IgG, welche an die Blutkörperchen gebunden sind; dies kann das Ergebnis sein, von einer sehr kleinen Menge eines bestimmtenn Antikörpers, welcher im ana-55 Iysierten Serum identifiziert werden soll, oder einer sehr geringen Oberflächendichte eines zellulären Antigens auf den Blutkörperchen, welche analysiert werden sollen.

Das Verfahren mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation kann auch angewandt werden, um zu bestimmen, ob ein Serum 60 den Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält. In diesem Falle lässt man das Serum, das analysiert werden soll, mit roten Test-Blutkörperchen, die die bekannte Antigen-Aktivität D aufweisen, inkubieren und verfährt dann weiter, wie oben beschrieben.

65 Das Verfahren kann auch angewandt werden, um andere ery-throzytäre Antigene als Antigen D zu identifizieren und ganz allgemein, um alle Arten von zellulären Antigenen zu identifizieren, beispielsweise lymphozytäre Antigene oder Plättchen-

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Antigene; die Reaktionspartner beteiligen sich an der Reaktion der Immuno-Haftung und die Parameter für das Zentrifugieren werden dann in geeigneter Weise dem analysierten serologischen System angepasst. In analoger Weise kann dieses Verfahren auch für die Identifizierung aller Arten von Antikörpern s angewandt werden, die im Plasma oder Serum einer Blutprobe enthalten sind.

In dem oben beschriebenen Beispiel des erfindungsgemässen Verfahrens, angewandt auf die Identifizierung von erythrozytären oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern, die im io Plasma einer Blutprobe enthalten sind, umfasste das Zentrifugieren, mit welchem die Erscheinung der Haftung oder der Nichthaftung aufgezeigt wird, zwei Phasen, wobei die zweite Phase bei höherer Zentrifugiergeschwindigkeit durchgeführt wurde als die erste Phase. 15

Gemäss einer Variante kann beim Zentrifugieren mit einer einzigen Beschleunigung gearbeitet werden, die geeignet ist zumindest momentan, alle Körperchen, beispielsweise rote Blutkörperchen an die Wand des Behälterbodens anzulagern, wobei der Zahlenwert dieser Beschleunigung so ist, dass unter diesen 20 Teilchen nur solche, falls vorhanden, langsam und zunehmend von der Wand abgerissen oder abgeschleudert und in der Kuppe des Behälterbodens gesammelt werden, die an der Wand des Behälterbodens nicht haften können, weil sich keine Molekularketten, bestehend aus einem mit dem Kunststoff verbundenen 25 Immunoglobulin, einem Molekül des Antiglobulins und einem Immunoglobulin gebunden an ein Blutkörperchen ausbilden können. In diesem Falle wird die Beschleunigung der einzigen Zentrifugierphase ein wenig oberhalb des Wertes gehalten, der dem mittleren Niveau der Auflösung der unspezifischen 30

Bindungskräfte entspricht, welche sowohl die eine negative Reaktion kennzeichnenden Körperchen als auch die eine positive Reaktion kennzeichnenden Körperchen binden, wobei diese unspezifischen Bindungskräfte die einzigen Kräfte sind, welche die für eine negative Reaktion charakteristischen Körperchen zu- 35 rückhalten. Da die Beschleunigung bzw. Geschwindigkeit beim Zentrifugieren gering ist, werden alle Körperchen an den Becherboden angelagert während einer ausreichenden Zeit, damit die Molekülbrücken, die sich ausbilden können, fertiggestellt werden; die Entwicklung und die Fertigstellung dieser Molekül- 40 brücken verläuft schneller als das Abreissen oder Abschleudern der Körperchen, das für eine negative Reaktion charakteristisch ist. Wenn diese Zentrifugiergeschwindigkeit ausreichend lang beibehalten wird, werden alle die Körperchen, sofern vorhanden, die am Becherboden nicht haften können, weil sich keine 45 Molekülbrücken ausbilden können, allmählich von der Wand des Becherbodens abgelöst und in der Kuppe versammelt, während alle Blutkörperchen, die eine positive Reaktion kennzeichnen, an der Wand des Behälterbodens haften bleiben, weil sich die Molekülbrücken gebildet haben, die entstehen konnten. 50

Im Falle des Nachweises von Antigen D Aktivität der roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe beträgt die Beschleunigung dieser einzigen Zentrifugierphase etwa 250 g und wird während etwa 400 Sekunden beibehalten, wenn die Anlayse in einem Becher mit einem Scheitelwinkel von 120° des Konus 55 ausgeführt wird.

Mit Bezug auf die Fig. 16 bis 18 seien nun drei verschiedene Zentrifugier-Diagramme beschrieben, die bei den oben beschriebenen Reaktionen zum Identifizieren von erythrozytären Antigenen oder Antikörpern angewandt werden können. Auf 60 jedem dieser Diagramme ist auf der Ordinate die angewandte Zentrifugalkraft in Anzahl g angegeben und auf der Abszisse die Dauer des Zentrifugiervorganges in Sekunden, wobei die Reaktion der Immunohaftung in einem Becher ausgeführt wurde, dessen konischer Boden einen Scheitelwinkel von 120° auf- 65 wies.

Das erste Diagramm (Fig. 16) entspricht dem Fall, bei welchem eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation vorgenommen wurde. Im Zeitpunkt 0, nach beendetem Einbringen des Reaktionsmediums aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin in den Becher, wurde diesem eine schwache Zentrifugiergeschwindigkeit, im vorliegenden Fall von 4 g, erteilt, indem der Becher um eine Achse senkrecht zu seiner Rotationsachse rotierte. Diese Phase I umfasst die ersten 15 Sekunden und ist eine Phase der Antiglobulin-Inkubation; die Geschwindigkeit reicht nicht aus, um in irgendeiner Weise ein schnelles Absinken und Anlagern der roten Blutkörperchen am Becherboden zu bewirken. Gegebenenfalls kann hierbei gleichzeitig das im Becher enthaltene Reaktionsmedium in Bewegung gehalten werden.

Dann wird die Zentrifugierbeschleunigung schnell erhöht bis zu einem Wert unterhalb des mittleren Wertes, bei welchem lediglich die unspezifischen Bindungskräfte FNS aufgehoben werden. Wird dieses mittlere Niveau mit 230 g bewertet, wie im Falle des vorliegenden Beispieles, in welchem eine Humanblutprobe daraufhin untersucht wird, ob auf den roten Blutkörperchen Antigen D Aktivität vorhanden ist, so wird die Beschleunigung auf 200 g gebracht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde läuft eine Phase II ab, in der die roten Blutkörperchen zum Becherboden hin wandern, wobei in der 30sten Sekunde alle Blutkörperchen den Becherboden erreicht haben.

Die Zentrifugierbeschleunigung wird bis zur 60sten Sekunde bei 100 g gehalten. Hierdurch wird von der 30sten bis zur 60sten Sekunde eine Phase III begrenzt, in welcher die roten Blutkörperchen am Becherboden angelagert werden; in dieser Phase können die Molekülbrücken entstehen, welche sich zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen ausbilden können und in der 60sten Sekunde sind praktisch alle möglichen Molekülbrücken vorhanden.

Dann wird die Zentrifugiergeschwindigkeit schnell erhöht bis auf einen solchen Wert, dass die Summe der unspezifischen Bindungskräfte, durch die alleine die negativen roten Blutkörperchen am Becher festgehalten werden, aufgehoben oder zerrissen wird; selbstverständlich muss die Zentrifugierbeschleunigung unterhalb des Wertes bleiben, bei welchem ein Aufbrechen oder Auflösen der Summe der spezifischen Bindungskräfte und der unspezifischen Bindungskräfte, durch die die positiven Blutkörperchen am Kunststoff gehalten werden, stattfinden würde. Im vorliegenden Falle wird die Beschleunigung auf 1600 g gebracht. Die letzte Phase IV ist somit eine Phase, in welcher die unspezifischen Bindungskräfte aufgehoben werden, wenn nur diese die roten. Blutkörperchen am Kunststoff festhalten; gleichzeitig werden in dieser Phase die abgelösten oder abgeschleuderten roten Blutkörperchen schnell gesammelt oder zusammengeballt. Der Zentrifugiervorgang wird definitiv in der 84sten Sekunde abgebrochen.

Das gleiche Zentrifugier-Diagramm kann mit nur einer kleinen Modifizierung auf das Verfahren angewandt werden, wenn mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird. In diesem Falle entfällt die Phase oder Stufe I der Antiglobulin-Inkubation im Becher unter Bewegung, weil die Antiglobulin-In-kubation ausserhalb des Bechers vorgenommen wird zwischen zuvor mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen — oder mit Test-Blutkörperchen inkubierten Serum, das analysiert werden soll — und dem Antiglobulin. Nach beendeter asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation wird das Reaktionsmedium in den Becher verbracht und dann unmittelbar ein erstes Mal mit einer Beschleunigung von 200 g zentrifugiert.

Eine zweite Art zu zentrifugieren, die sich auf die Reaktion zum Identifizieren von erythrozytären Antigenen oder von Antikörpern anwenden lässt, wird im Diagramm gemäss Fig. 17 gezeigt.

Wie beim Diagramm gemäss Fig. 16, wird bis zur 15ten Sekunde mit ganz geringer Beschleunigung zentrifugiert, im vorliegenden Falle mit 4 g, während einer Phase oder Stufe I der symmetrischen Antiglobulin-Inkubation; ggf. wird der Becher

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gleichzeitig während dieser Inkubation zusätzlich in Bewegung vor allem nicht das mittlere Niveau der Aufhebung oder Auflögehalten. sung der unspezifischen Bindungskräfte.

In der 15ten Sekunde wird die Zentrifugierbeschleunigung Es sei bei diesem Verfahren eine symmetrische Antiglobulin-

schnell erhöht, in diesem Falle aber auf einen Wert, der ganz Inkubation angenommen. In diesem Falle wird die Zentrifugier-leicht oberhalb des Wertes liegt, welcher dem mittleren Niveau 5 beschleunigung bis zur 15ten Sekunde bei 4 g gehalten, d.h. bei der Aufhebung der unspezifischen Bindungskräfte alleine ent- einem zu geringen Wert als dass irgendein schnelles Absinken spricht. Dieses mittlere Niveau bzw. diese mittlere Ebene wird und Anlagern von Blutkörperchen oder Zellen am Becherboden hier mit 230 g bewertet und die Geschwindigkeit daher auf 250 erfolgen kann. Dies ist die Phase I der Antiglobulin-Inkuba-g gebracht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde läuft die Pha- tion, während welcher ggf. der Becher zusätzlich bewegt wird, se II, in welcher die roten Blutkörperchen absinken; in der 10 In der 15ten Sekunde wird die Beschleunigung schnell auf 30sten Sekunde haben alle Blutkörperchen den Becherboden er- 200 g erhöht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde sinken die reicht. Da die Beschleunigung hier bei 259 g gehalten wird, d.h. Zellen oder Blutkörperchen zum Becherboden hin ab (Phase II) ein wenig oberhalb des mittleren Wertes, bei welchem die un- und bis zur 60sten Sekunde erfolgt dann die Anlagerung der spezifischen Bindungskräfte aufgehoben werden, folgt hier un- Zellen oder Blutkörperchen an den Becherboden (Phase III), mittelbar auf die Phase II, in der die Blutkörperchen absinken, 15 während welcher Molekülbrücken entstehen, die sich zwischen eine Phase III, in welcher die unspezifischen Bindungskräfte dem Becherboden und den Zellen oder Blutkörperchen ausbil-langsam und vorsichtig gelöst werden, wenn nur durch diese den können.

Bindungskräfte ein rotes Blutkörperchen an den Kunststoff ge- Am Ende der Anlagerungsphase, d.h. in der 60sten Sekunde bunden ist und dieses rote Blutkörperchen zu dem Teil der wird die Beschleunigung um 100 g erhöht und 30 Sekunden bei

Blutkörperchen gehört, welche die negative Reaktion kenn- 20 300 g gehalten (Phase IV). In der Sekunde 90 erfolgt eine Mes-zeichnen und die am wenigsten unspezifische Bindungskräfte sung von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der ne-haben. In dieser Phase werden somit gleichzeitig die abgelösten gativen Kontrollreaktion und diese Messungen werden mit den oder abgeschleuderten Zellen zunehmend langsam gesammelt. Werten für das Mikrosediment der negativen Bezugsreaktion Die Geschwindigkeit dieser Sammmlung ist ausserordentlich ge- verglichen: liegen die Messdaten für Oberfläche und Opazität ring, so dass unmittelbar nach der Stufe, in welcher die roten 25 des Kontroll-Mikrosedimentes unterhalb der entsprechenden Blutkörperchen absinken, diese noch ausreichend lange an den Daten für das Bezugs-Mikrosediment, so bedeutet dies, dass die Becherboden angelagert bleiben, damit die Molekülbrücken, Beschleunigung von 300 g nicht ausreicht, um die unspezifi-welche sich ausbilden können, entstehen; die Entwicklung der sehen Bindungskräfte aufzuheben bzw. zu brechen. Molekülbrücken verläuft schneller als das Ablösen oder Abreis- Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100 g er-sen der Zellen. Da die Zentrifugierbeschleunigung durchgehend 30 höht und die Beschleunigung von 400 g während 30 Sekunden bei 250 g gehalten wird, sind nach Ablauf einer gewissen Zeit beibehalten (Phase V). In der 120sten Sekunde werden erneut alle Molekülbrücken entstanden, die sich ausbilden konnten, Oberfläche und Opazität des Kontroll-Mikrosedimentes gemes-während die nicht spezifisch an den Becherboden gebundenen sen und die erhaltenen Messdaten mit denjenigen des Bezugsroten Blutkörperchen weiterhin allmählich abgeschleudert wer- Mikrosedimentes verglichen: im vorliegenden Falle, bei weiden. Diese Phase III dauert relativ lange und wird beispielswei- 35 chem das mittlere Niveau zum Aufbrechen oder Aufheben der se in der 410ten Sekunde abgebrochen. unspezifischen Bindungskräfte bei 450 g liegt, liegen die Mess-

Die hier angewandte Methode des Ablösens ist so vorsichtig, daten für die Oberfläche und die Opazität des Mikrosedimentes dass die erzielten Ergebnisse ausserordentlich empfindlich sind. der negativen Kontrollreaktion nach dem Zentrifugieren bei Dies ist besonders gut geeignet für Reaktionen, bei denen 400 g noch unterhalb der entsprechenden Messdaten für das Be schwache Bindungen zwischen roten Blutkörperchen und 40 zugs-Mikrosediment, weil die roten Blutkörperchen der negati-

Kunststoff eine Rolle spielen. ven Kontrollreaktion, die durch unspezifische Bindungskräfte

Das Diagramm gemäss Fig. 18 entspricht einem Zentrifu- an den Becher gebunden sind, nicht abgelöst bzw. abgeschleu-giervorgang, der entsprechend der Entwicklung der ablaufen- dert werden konnten.

den Reaktionen geregelt oder gesteuert wird. Das Verfahren Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100 g er wird gleichzeitig in einem Becher ausgeführt, in welchem die 45 höht und erreicht nun den Wert 500 g (Phase VI). Nach 30 Se-Analyse der Probe vorgenommen wird und andererseits in ei- künden, d.h. in der 150sten Sekunde, wird eine weitere Mesnern Becher, in welchem eine negative Kontrollreaktion ausge- sung von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der ne-führt wird; dieser Kontrollbecher wird bei jeder Umdrehung gativen Kontrollreaktion vorgenommen; die Messdaten werden beim Zentrifugieren mit einem Stroboskop-Blitz beleuchtet. mit den entsprechenden Messdaten des Bezugs-Mikrosedimentes

50 verglichen. Im vorliegenden Falle ist nun das mittlere Niveau für das Aufhebenn oder Aufbrechen der unspezifischen Bindungskräfte überschritten, so dass bei der negativen Kontrollreaktion ein Mikrosediment erhalten wird, dessen Oberfläche und Opazität zumindest gleich sind der Oberfläche und Opazität des 55 Bezugs-Mikrosedimentes. Die Phase oder Stufe, in der die un-

Das Prinzip dieser Steuerung ist analog dem oben mit Bezug auf den Nachweis von Antigen HBS dargelegten Prinzip. Das vergrösserte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die negative Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera gefilmt und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde. Die

Oberflache und die Opazitat des Bildes des Mikrosedimentes, ,, . „ , , , ,

. „ , . , 1 ^ , . spezifischen Bindungskrafte alleine aufgehoben werden und das sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet, werden mit der Oberfläche und der Opazität des Mikrosedimentes einer negativen Bezugsreaktion gleicher Art, die zuvor ausgeführt worden ist, verglichen.

gleichzeitig die abgelösten oder abgeschleuderten Blutkörperchen gesammelt Vierden, beginnt somit mit der 120sten Sekunde. Die Zentrifugierbeschleunigung wird weiter bei 500 g gehal-60 ten und das Zentrifugieren endgültig abgebrochen, wenn Ober-Das Diagramm der Fig. 18 entspricht einem Zentrifugier- fläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen Konprogramm, das angewandt wird auf eine Reaktion zum Identifi- trollreaktion einer Menge an abgeschleuderten roten Blutkör-zieren von erythrozytärem oder zellulärem Antigen oder von perchen entspricht, die gerade repräsentativ ist für eine tatsäch-Antikörpern, bei welchem das mittlere Niveau der Aufhebung liehe oder wahre negative Reaktion: im vorliegenden Falle wird der unspezifischen Bindungskräfte alleine einer Beschleunigung 65 der Zentrifugiervorgang endgültig in der 330sten Sekunde abge-von 450 g entspricht. Dieses Diagramm eines gesteuerten Zen- brochen.

trifugierprogrammes kann auf ein serologisches System ange- Die Unterscheidungsschwellen für eine positive Reaktion wandt werden, dessen Merkmale im voraus nicht bekannt sind, und eine negative Reaktion werden auf die gleiche Weise be-

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stimmt wie vorstehend mit Bezug auf das Verfahren zum Nachweisen von HBS Antigen erläutert.

Macht also der Anteil an roten Blutkörperchen in einem Mikrosediment, das eine echte negative Reaktion anzeigt, wie in Vor versuchen ermittelt, 12% aus und beträgt die Standardabweichung 3%, so liegt die Unterscheidungsschwelle für eine echte negative Reaktion, wie oben angegeben, bei 18% roten Blutkörperchen, die in einem Mikrosediment zusammengefasst sind, während die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion einem Anteil von 6% roten Blutkörperchen, versammelt zum Mikrosediment, entspricht.

Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet schliesslich die quantitative Bestimmung eines bestimmten erythrozytären oder zellulären Antigens oder eines bestimmten Antikörpers, der bzw. das nachgewiesen werden soll. Die Oberfläche und/oder Opazität des entstandenen Mikrosedimentes hängt nämlich von der Menge an Antigen oder Antikörper ab, die in dem analysierten Medium vorhanden ist. Es genügt somit, die gemessene Oberfläche und/oder Opazität des in einer positiven Reaktion gebildeten Sedimentes mit den entsprechenden Werten zu vergleichen, die für eine Reihe von Eich-Produkten erhalten wurden oder mit einer zuvor aufgestellten Eichkurve, um die im Medium vorhandene Menge Antigen oder Antikörper zu erhal-5 ten.

Dieses zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens kann auch analog wie beim ersten Beispiel unter den gleichen Zen-trifugierbedingungen mit Proben durchgeführt werden, in denen erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper mit io unterschiedlicher Spezifität und von unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen.

Wie oben erklärt, hängt nämlich die Möglichkeit, dass die roten Blutkörperchen abgeschleudert oder abgelöst werden, nur von der Neigung des Becherbodens ab. Man wird daher für je-i5 de Reaktionsart den Becher auswählen, der die für die in Betracht gezogene Reaktion am besten geeignete Neigung aufweist, mit dem Wert, dass bei einer gewählten Beschleunigung nur die Zellen oder Teilchen abgeschleudert werden, die eine negative Reaktion kennzeichnen.

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8 Blätter Zeichnungen

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von viralen Antigenen, erythrozytären oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern in einem biologischen Medium unter Anwendung von immunologischen Reaktionen zwischen den Zellen oder Teilchen und einem Serum, sodann zwischen den auf diese Weise behandelten Zellen oder Teilchen und einem Antiglobulin dadurch gekennzeichnet, dass man das Reaktionsmedium, welches die Zellen oder Teilchen und das Antiglobulin enthält, in einen Behälter einbringt dessen Wand einen auf der Symmetrieachse des Behälters gelegenen Konvergenz- oder Scheitelpunkt aufweist und auf dessen Wand Moleküle fixiert worden sind, die immunologisch mit dem Antiglobulin reagieren können und dass man dieses Reaktionsmedium der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterwirft, die im wesentlichen parallel zur Behälterachse gerichtet ist, unter solchen Bedingungen, dass zumindest die Zellen, welche eine positive Reaktion kennzeichnen, d.h. eine Analysereaktion durchgeführt mit einer Probe des biologischen Mediums, das das Antigen oder den Antikörper, welcher identifiziert werden soll, enthält, fortschreitend an der Wand haften und haften bleiben aufgrund von Bindungskräften einer ersten Art und zwar von immunologischen Bindungskräften, an denen das Antiglobulin beteiligt ist und die zu Bindungskräften einer zweiten Art hinzukommen während die Zellen welche am Ende des Zentrifugiervorganges eine negative Reaktion kennzeichnen nur über die Bindungskräfte der zweiten Art an die Wand gebunden sind und dann am Scheitelpunkt bzw. Der Kuppe des Behälters gesammelt werden, indem man eine Zentrifugalkraft anwendet, die ausreichend stark ist, um die Bindungskräfte der zweiten Art zu zerstören, aber nicht ausreicht, um die Summe aus Bindungskräften der ersten Art und Bindungskräften der zweiten Art zu zerstören.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auf der Wand des Behälters, Immunoglobulin Ig der immunochemischen Klasse X einer Tierart I, bezeichnet IgX I fixiert, ausserhalb des Behälters eine Probe des biologischen Mediums, das analysiert werden soll mit einer Suspension von Zellen oder Teilchen inkubiert, an die zuvor IgX I gekuppelt wurden, die ausgewählt wurden aufgrund ihrer Antikörperspe-zifität gegenüber dem viralen Antigen, das nachgewiesen werden soll, dass man in dem Behälter ein Reaktionsmedium, bestehend aus der inkubierten Suspension von Zellen oder Teilchen und einem Antiglobulin, vorzugsweise konzentriert, d.h. eine Lösung von Molekülen aus einer von der Tierart I verschiedenen Tierart II sowie Antikörpern gegenüber IgX I, bezeichnet Anti-IgX I der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterwirft, die der Behälterachse parallel gerichtet ist, unter Bedingungen welche die Bindung oder Kupplung von Molekülen Anti-IgX I und IgX I ermöglichen und damit die Ausbildung von Molekülbrücken zwischen der Behälterwand und den Zellen oder Teilchen unter Mitwirkung von Anti-IgX I Molekülen, das man mit einer ersten Beschleunigung zentrifugiert, die die Haftung von allen Zellen an der konisch verlaufenden Wand des Behälters, die mit IgX I bedeckt ist, ermöglicht worauf man das Zentrifugieren unterbricht, um ein Ablösen der Zellen oder Teilchen, sofern vorhanden, ermöglicht, welche für eine negative Reaktion charakteristisch sind, und dass man dann mit einer zweiten Beschleunigung erneut zentrifugiert und die Zellen oder Teilchen, sofern vorhanden, im Scheitelpunkt bzw. der Kuppe des Behälters sammelt, die an der Behälterwand nicht haften können aufgrund der Unbeständigkeit der über die Anti-IgX I Moleküle gebildeten Molekülbrücken.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Zentrifugieren während einer solchen Zeitspanne unterbricht, dass man im Falle einer negativen Reaktion, d.h. einer mit einer Probe, die kein virales Antigen enthält durchgeführten Reaktion, eine Absättigung der auf den einander gegenüberliegenden Flächen von Behälterwand und Zellen oder

Teilchen gebundenen IgX I Moleküle durch die Anti-IgX I Moleküle erhält.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspension von Zellen oder Teilchen nach der Inkubation ausserhalb des Behälters mit dem biologischen Medium, das analysiert werden soll, mit einer physiologischen Lösung wäscht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung von Anti-IgX I molekü-len mit einem Titer von mindestens 128 Coombs rein oder verdünnt in einem Verhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4 verwendet,
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspension von Zellen oder Teilchen, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll, inkubiert worden ist, und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I gleichzeitig in den Behälter einbringt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man in den Behälter zunächst die Suspension von Zellen oder Teilchen einbringt, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll, inkubiert worden ist, und dann die Lösung von Molekülen Anti-IgX I.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man vor der ersten Zentrifugierphase die Komponenten des Reaktionsmediums, d.h. die bereits mit der Probe inkubierte Suspension,von Zellen oder Teilchen und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I während einer Zeitspanne inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, in der 10% der an die Zellen oder Teilchen gebundenen oder an die Behälterwand fixierten Moleküle IgX I mit den Molekülen Anti-IgX I reagiert haben.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium während dieser Inkubation bewegt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass man während einigen Sekunden bis zu einigen 10 Sekunden inkubiert.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Beschleunigung und Dauer jeder Zen-trifugierstufe, d.h. erste Phase, Unterbrechung und zweite Phase, im voraus bestimmt werden und der Beschleunigung und Dauer entsprechen, für die unter den gleichen Bedingungen der Reaktions-partner bei einer negativen Bezugsreaktion die besten Ergebnisse erzielt worden sind, d.h. dass am Ende der ersten Zentrifugierstufe oder -phase praktisch 100% Zellen oder Teilchen an der Behälterwand hafteten, am Ende der Unterbrechung ein ausreichender Sättigungsgrad an Anti-IgX I Molekülen bei den IgX Molekülen erreicht wurde, die an die einander gegenüberliegenden Flächen der Zellen oder Teilchen und der Behälterwand gebunden sind, damit die Haftung der Zellen an der Behälterwand wieder aufgehoben wird und ein Ablösen und Sammeln der Zellen in der Kuppe des Behälters während der zweiten Zentrifugierphase stattgefunden hat.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitpunkt des Abbruchs der zweiten Zentrifugierphase automatisch bestimmt wird, indem das Verfahren gleichzeitig zum einen in einem Behälter durchgeführt wird, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird, und zum anderen in einem Behälter in welchem eine negative Kontrollreaktion durchgeführt wird, und wobei das Bild des Bodens des Kontrollbehälters in regelmässigen Intervallen während der zweiten Zentrifugierphase aufgezeichnet und analysiert wird, und die zweite Zentrifugierphase definitiv abgebrochen wird, wenn das Bild des Bodens des Kontrollbehälters etwa 18% Zellen oder Teilchen versammelt in der Kuppe des Behälters entspricht.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es zum Nachweis des viralen Antigens HBS in einer Humanblutprobe angewandt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,

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dass man die Analyse in einem Behälter vornimmt, dessen Boden konisch ist und einen Winkel am Scheitelpunkt bzw. an der Kuppe von 120° aufweist, dass man die erste Zentrifugierphase mit einer Beschleunigung von 200 g durchführt von der 15. bis zur 60. Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Behälter, das aus der zuvor mit der zu analysierenden Probe inkubierten Suspension von Zellen oder Teilchen und der Lösung der Anti-IgX I Moleküle besteht, und dass *pan das Zentrifugieren von der 60. bis zur 300. Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Behälter unterbricht und dass man beim zweiten Zentrifugieren mit einer Beschleunigung von 500 g während 40 Sekunden arbeitet.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man auf der Wand des Behälters Immunoglobuline Ig der immunochemischen Klasse X einer Tierart I, bezeichnet IgX I fixiert, ausserhalb des Behälters eine Suspension von roten Blutkörperchen des Blutes, das analysiert werden soll, mit einem Testserum (oder das Plasma des Blutes, das analysiert werden soll, mit einer Suspension aus Testkörperchen) unter Bedingungen inkubiert, die die Bindung der IgX I an die Körperchen gestatten, dass man in den Behälter ein Reaktionsmedium, bestehend aus der inkubierten Suspension von Blutkörperchen und einem vorzugsweise konzentrierten Antiglobulin, d.h. eine Lösung von Molekülen einer Tierart II, die verschieden ist von der Tierart I, sowie Antikörper gegenüber IgX I, bezeichnet als Anti-IgX I, der Einwirkung einer Zentrifugalkraft unterwirft, die der Symmetrieachse des Behälters parallel gerichtet ist, unter solchen Bedingungen, dass, wenn erforderlich die Moleküle Anti-IgX I mit den IgX I kuppeln und auf diese Weise Molekülbrücken zwischen der Behälterwand und den Blutkörperchen unter Mitwirkung der Moleküle Anti-IgX I entstehen, dass man in der Weise zentrifugiert,

dass die Blutkörperchen momentan an der Behälterwand angelagert bleiben und die Ausbildung der Molekülbrücken zu Ende geführt wird und dass lediglich die Blutkörperchen, sofern vorhanden, die nicht an der Behälterwand haften können, weil keine Molekülbrücken unter Mithilfe der Moleküle Anti-IgX I ausgebildet werden können, in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension von Blutkörperchen, die analysiert werden soll (oder die Suspension der Test-Blutkörperchen) nachdem sie ausserhalb des Behälters mit einem Testserum (oder mit dem Plasma des Blutes das analysiert werden soll) inkubiert worden ist, mit einer physiologischen Lösung gewaschen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung von Molekülen Anti-IgX I verwendet, die einen Titer von mindestens 128 gemäss Coombs aufweist und zwar rein oder verdünnt in einem Verdünnungsverhältnis von I : 2 oder 1 : 4.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d.h. die Suspension von Blutkörperchen und die Lösung der Anti-IgX I Moleküle getrennt voneinander und gleichzeitig in den Behälter einbringt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man zunächst die zuvor inkubierte Suspension der Blutkörperchen und danach die Lösung der Anti-IgX I Moleküle in den Behälter einbringt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass man vor dem Zentrifugieren im Behälter die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d.h. die zuvor inkubierte Suspension von Blutkörperchen und die Lösung der Anti-IgX I Moleküle, während einer Zeitspanne inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, bei der 10% der an die Blutkörperchen oder an die Behälterwand gebundenen IgX I Moleküle mit den Anti-IgX I Molekülen reagiert haben.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reaktionsmedium während dieser Inkubation bewegt.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass man während einiger Sekunden bis zu einigen 10 Sekunden inkubiert.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reaktionsgemisch erst in den Behälter zum Zentrifugieren einbringt, nachdem die Suspension von von Blutkörperchen ausserhalb des Behälters mit der Lösung von Anti-IgX I Molekülen inkubiert worden ist und dass man unmittelbar nach dem Einbringen des Reaktionsgemisches in den Behälter zentrifugiert.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspension von Blutkörperchen und die Lösung von Anti-IgX I Molekülen etwa 20 Minuten inkubiert.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass man bei zwei unterschiedlichen Beschleunigungen zentrifugiert und zwar bei einer ersten Beschleunigung, bei der alle Blutkörperchen an die Behälterwand angelagert werden und bei einer zweiten, höheren Beschleunigung, bei welcher nur die Blutkörperchen, die nicht an der Wand des Behälters haften bleiben können, in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass man so zentrifugiert, dass man eine einzige Beschleunigung erreicht, die geeignet ist, zumindest momentan alle Blutkörperchen an die Wand des Behälters anzulagern und ausserdem so, dass unter diesen Blutkörperchen nur diejenigen, sofern vorhanden, die nicht an der Wand des Behälterbodens haften können, langsam und zunehmend von dieser Wand abgelöst bzw. abgeschleudert und in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass man zur automatischen Bestimmung des endgültigen Abbruchs des Zentrifugierens das Verfahren gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem die Analysereaktion der zu untersuchenden Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem Behälter, in welchem eine zur Kontrolle dienende negative Reaktion vorgenommen wird, dass man das bei der Kontrollreaktion sich bildende Mikrosediment in regelmässigen Intervallen aufzeichnet und analysiert und das Zentrifugieren endgültig abbricht, wenn die Analyse des Mikrosediments der Kontrollreaktion anzeigt, dass etwa 18% Blutkörperchen in der Kuppe des Behälters gesammelt sind.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass man das Zentrifugieren im Hinblick auf die im Gang befindlichen Reaktionen steuert oder regelt, das Verfahren gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem Behälter, in welchem eine negative Kontrollreaktion ausgeführt wird, dass man in regelmässigen Intervallen das Bild des Mikrosedi-mentes, das sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet, aufzeichnet und analysiert, dass man die Wachstumskurve für dieses Mikrosediment und für das Mikrosediment einer negativen Bezugsreaktion miteinander vergleicht und dass man Zeit und Geschwindigkeit beim Zentrifugieren so steuert, dass die Wachstumskurve des analysierten Mikrosedimentes der Wachstumskurve der Bezugsreaktion entspricht.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man das Zentrifugieren definitiv abbricht, wenn die Analyse des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion anzeigt, dass in der Kuppe des Behälterbodens etwa 18% Blutkörperchen gesammelt sind.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass man die Analysereaktion in einem Behälter mit

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konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120° durchführt, nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX I zur Inkubation gebracht worden ist, dass man den Behälter der das Reaktionsgemisch enthält, um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist zur Konusachse, bei einer geringeren Beschleunigung als derjenigen, bei der die Blutkörperchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen, von der Wand des Behälterbodens abgeschleudert werden, dass man diese Beschleunigung 45 Sekunden beibehält, dass man anschliessend gleichmässig die Zentrifugierbeschleunigung alle 30 Sekunden um einen Wert von 100 g erhöht, dass man am Ende jeder dieser Zeitspannen von 30 Sekunden das in der negativen Kontrollreaktion gebildete Mikrosediment analysiert bis die Analyse einen Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters versammelt sind, entspricht, der zumindest gleich ist dem Prozentsatz, wie er für die negative Bezugsreaktion erreicht worden ist.
31. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass man beim Ausführen der Analysereaktion in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120°, nachdem die Suspension von Blutkörperchen mit der Lösung der Anti-IgX I Moleküle zum Inkubieren gebracht worden ist, zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist zur Achse des konischen Behälterbodens, mit einer Beschleunigung von 200 g, die während 45 Sekunden beibehalten wird, und dass man anschliessend die Zentrifugierbeschleunigung schnell bis auf 1600 g erhöht und das Zentrifugieren endgültig abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht ist, bei welchem für eine unter gleichen Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion der Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz, welcher die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.
32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekeimzeichnet, dass man beim Ausführen der Analyse in einem Behälter mit konischem Böden und einem Scheitelwinkel von 120°, nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX I Moleküle inkubiert worden ist, zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht läuft zur Achse des konischen Behälterbodens, mit einer Beschleunigung von 250 g und dass man das Zentrifugieren abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht worden ist, bei welchem für eine unter gleichen Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion der Prozentsatz an roten Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz, welcher die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.
33. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung von Reaktionen der Immuno-Haftung mehrerer Proben, in denen virale Antigene oder zelluläre Antigene oder Antikörper unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen, dieser Satz so viel verschiedene Gruppen von Behältern umfasst, wie unterschiedliche Typen oder Arten von Antigenen oder Antikörpern nachgewiesen werden sollen, wobei die Behälter jeder Gruppe einen anderen Scheitelwinkel des konischen Bodens aufweisen als die Behälter jeder der anderen Gruppen.
34. Vorrichtung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass er aus einer oder mehreren Gruppen von Behältern besteht, deren Scheitelwinkel im Konus der Behälter dieser verschiedenen Gruppen einen der folgenden Werte aufweist: 80, 100, 110, 120, 130 und 140.