SE447933B

SE447933B - Bestemning av antigener eller antikkroppar

Info

Publication number: SE447933B
Application number: SE7901771A
Authority: SE
Inventors: C Matte
Original assignee: Centre Nat Transfusion
Priority date: 1978-02-28
Filing date: 1979-02-27
Publication date: 1986-12-22
Also published as: US4297104A; FR2418463A1; IT7920592A0; CA1113858A; DE2907198C2; DE2907198A1; GB2015156B; SE7901771L; JPS6231299B2; FR2418463B1; GB2015156A; IT1114209B; JPS54126596A; NL7901536A; CH643068A5

Description

447 933 blodprov beror på att plasman hos det ena blodprovet kan inne- hålla molekyler, som betecknas som antikroppar och som kan förena sig med såsom antigenenheter eller antigen betecknade komplementära strukturenheter i de röda blodkropparnas mem- bran. Ett dylikt antigen benämns erytrocytärt antigen. En anti- kropp, som kan förena sig med endast ett visst bestämt antigen, betecknas såsom den för detta antigen specifika antikroppen.

Förenandet av antikroppar med antigenenheter på de röda blod- kropparna kan leda till agglutination av dessa röda blodkrop- par, till förstöring därav eller till att de kraftigt pâverkas med avseende på sin mekaniska hållfasthet med risken att stör- ningar kan uppträda vid blodtransfusioner.

Man måste vidare säkerställa att icke vissa sjukdomar över- förs till mottagaren med givarens blod, vilka sjukdomar kan fastställas genom påvisande av närvaron av ett viralt antigen eller ett virus med antigenegenskaper eller en därmed specifik motsvarande antikropp. Ett exempel på en dylik sjukdom är den efter blodöverföringar uppträdande hepatiten, som kan upp- träda hos mottagaren när givarens blod innehåller ett bestämt virus och närmare bestämt HB-virus som är bärare av HBs-anti- genet.

Detta visar hur utomordentligt viktigt det är att undersöka givarens och mottagarens blod på innehållet av eventuella antikroppar, cellulära antigener och vira med antigenegenskaper resp. virala antigener, som hos mottagaren kan utlösa oför- dragbarhetsreaktioner eller uppträdandet av en sjukdom.

När det gäller transfusioner måste därvid säkerställas att analysförfarandet är tillräckligt känsligt. Dessutom måste felrisken vid bestämning av specificiteten av de erytrocytära eller cellulära antigenerna, av antikroppar eller virus resp. virala antigener vara praktiskt taget noll.

I det följande definieras närmare vissa i föreliggande samman- hang använda begrepp. 447 953 "Virus med antigenegenskaper" är i föreliggande sammanhang ett virus, för vilket man känner den med viruset reagerande speci- fika antikroppen. I det följande används även med samma bety- delse beteckningen virus med antigenegenskaper, virus eller också viralt antigen.

Immunoglobuliner är proteinartade molekyler av animaliskt ur- sprung, som antingen uppvisar en enkel antigenaktivitet eller en enkel antikroppsaktivitet eller också båda aktiviteterna samtidigt, d.v.s. såväl antigenaktivitet som antikroppsakti- vitet. För varje djurart existerar immunoglobuliner, som, oberoende av om det rör sig om människan eller ett annat le- vande väsen (exempelvis get, marsvin, kanin m.m.), tillhör olika immunokemiska klasser, d.v.s. immunoglobuliner till- hörande en klass A, som kort betecknas med IgA, immunoglobu- liner tillhörande en klass G, för vilka förkortningen IgG an- vänds. Allmänt betecknas ett immunoglobulin tillhörande den immunokemiska klassen X och djurarten I med IgX I.

Med testserum avses i föreliggande sammanhang ett serum (eller en lösning), som innehåller immunoglobuliner från en bestämd djurart och en bestämd immunokemisk klass, exempelvis immunoglobuliner från människa tillhörande klassen G eller IgG, som uppvisar en antikroppsaktivitet, som är specifik med avseende på ett bestämt erytrocytärt eller cellulärt antigen från en grupp individer tillhörande ifrågavarande djurart, i exemplet ovan en grupp personer. Företrädesvis talar man i detta sammanhang om en grupp individer, eftersom, såsom är uppenbart för varje serolog, ett visst bestämt erytrocytärt eller cellulärt antigen icke måste vara närvarande hos samt- liga individer tillhörande samma djurart utan endast hos vissa bestämda individer, som utgör en grupp.

På analogt sätt betecknas såsom testkroppar, testceller eller testpartiklar sådana kroppar, celler eller partiklar som upp- bär antigenenheter eller -grupper från en bestämd djurart, med vilka de immunoglobuliner kan förena sig som uppbär de 447 933 mot antigenenheterna specifikt svarande antikroppgrupperna.

Såsom antiglobulin betecknas ett immunserum av en från arten I skild djurart II, vilket tillhandahåller immunoglobuliner med en artspecifík antikroppsaktivitet med avseende på IgX I.

Antiglobulinet betecknas såsom Ig II anti-IgX I eller, om någon förväxling icke är möjlig, kort såsom anti-IgX I.

För bestämning av närvaron av antikroppar (eller av erytrocy- tära antigener) i plasma eller serum av ett blodprov (eller på röda blodkroppar) kan man utnyttja reaktionerna enligt Coombs. Vid detta kända förfarande resp. Coombs-testet arbe- tar man på nedan angivna sätt, om man exempelvis skall be- stämma om plasman från ett blodprov från människa innehåller en bestämd antikropp, exempelvis en specifik anti-D-antikropp, eller med andra ord om plasman innehåller för antigenet D specifika immunoglobuliner, av vilka några tillhör den immuno- kemiska klassen G och följaktligen betecknas IgG: I ett litet rör inkuberas plasman, som skall analyseras, med de röda blod- kroppar som uppbär antigenenheterna D d.v.s. enheter med en antigenaktivitet som är specifik för de antikroppar vars när- varo eller frånvaro skall påvisas; immunoglobulinerna av den i plasman eventuellt närvarande specifika antikroppen förenar sig genom detta kontaktbringande med motsvarande antigenen- heter i de röda blodkropparna. Det på detta sätt erhållna reaktionsmediet tvättas och inkuberas därefter med ett anti- globulin, exempelvis med getserum, som tillhandahåller anti- humana IgG-ímmunoglobuliner. Under denna inkubation kopplas ett immunoglobulin från geten, vilket tillhandahålls av anti- globulinet, på grund av sin specifika antihumanfunktion med ett humanimmunoglobulin, som eventuellt är förbundet med en specifik antigenenhet hos en röd blodkropp. Efter avslutad inkubatíon centrifugeras reaktionsblandningen och därvid åstadkommas, om den sökta specifika anti-D-antikroppen verk- ligen var närvarande i plasman, en agglutination av de röda blodkropparna under medverkan av de av antiglobulinet alstra- de immunoglobulinerna och närmare bestämt på grund av bild- 447 933 ningen av följande bindningskedjor: röd blodkropp (antigen D) - specifikt humanimmunoglobulin anti-D - animaliskt antihumanimmunoglobulin - specifikt human anti-D-immunoglobulin - (antigen D) röd blodkropp.

Denna agglutination ger sig till känna såsom en bottensats av agglutinerade röda blodkroppar på bottnen av röret, varvid denna bottensats väl, men icke i alla fall, kan skiljas från en bottensats av icke-agglutinerade röda blodkroppar. För att vara säker på om det rör sig om en bottensats av aggluti- nerade röda blodkroppar eller av icke-agglutinerade röda blodkroppar sätter man rörinnehållet lätt i rörelse. Vid nega- tiva reaktioner, d.v.s. vid reaktioner med ett blodplasma, som icke innehåller den specifika anti-D-antíkroppen, suspenderas de icke-agglutinerade röda blodkropparna åter homogent; ifråga om positiva reaktioner däremot förblir de röda blodkropparna förenade med varandra i mer eller mindre stora grupper.

Detta förfarande baserar sig på relativt långsamma och sofis- tikerade reaktioner, som trots detta många gånger icke är till- räckligt känsliga, vilket kan visa sig innebära en risk.

Samma problem uppställer sig vid noggrann bestämning av be- skaffenheten av antigener i en cell ifråga om organtransplan- tationer. Såsom är känt uppbär lymfocyterna ett visst bestämt antal antigener, som betecknas såsom antigener tillhörande systemet HLA. Vid varje kirurgiskt ingrepp när det gäller transplantationer måste man fastställa vilka HLA-antigenerna hos lymfocyterna hos givaren och hos lymfocyterna hos mot- tagaren är för att man skall kunna fastställa den åtminstone teoretiska vävnadsfördragbarheten mellan lymfocyterna hos de båda olika individerna; utan denna åtminstone teoretiska för- dragbarnet kan en organtransplantation över huvud taget icke komma i betraktande. På grund av det höga antalet olika anti- gener tillhörande systemet HLA, vilka kan vara närvarande på lymfocyterna, måste man genomföra ett avsevärt antal elemen- tarreaktioner för att fastställa specificiteten hos de i varje 447 933 särskilt fall närvarande HLA-antigenerna; hundra reaktioner kan exempelvis därvid bli nödvändiga, vilka reaktioner avse- värt kan försvåras därigenom att lymfocytcellerna står till förfogande endast i mycket ringa mängder och därför endast kan användas för mikroreaktioner.

Dessutom har man vid påvisande eller uppspårande av vissa be- stämda vira eller virala antigener, exempelvis antigenet HBS, använt radioimmunologiska metoder, som är mycket dyrbara och miljöbelastande och därför kräver specialtillstånd. Ändamålet med uppfinningen är att tillhandahålla ett för- farande för analys av ett biologiskt medium, exempelvis ett blodprov från människa, i syfte att påvisa eller identifiera virala antigener, erytrocytära eller cellulära antigener eller antikroppar i detta medium, vilket förfarande kan användas allmänt och möjliggör påvisandet av godtyckliga typer av vi- rala antigener i ett flytande biologiskt medium samt alla typer av erytrocytära eller cellulära antígener och anti- kroppar, som ingår i ett blodprov.

Ett ytterligare ändamål med uppfinningen är att tillhanda- hålla ett dylikt förfarande, som möjliggör en analyskänslig- het, som är vida överlägsen analyskänsligheten hos de kända förfarandena, och som dessutom är utomordentligt specifikt med avseende på det virala antigenet, det erytrocytära eller cellulära antigenet eller den sökta antikroppen. I detta sam- manhang betecknas analysförfarandet såsom känsligare ju mindre den mängd av ett viralt antigen, ett erytrocytärt eller cellu- lärt antigen eller av en antikropp med en bestämd specificitet är, som kan påvisas med hjälp av analysförfarandet; förfaran- det anses mera specifikt ju bättre det möjliggör pâvisandet av alla dessa antigener eller antikroppar med olika specíficitet ' utan fel, d.v.s. utan förväxling. Med andra ord, ett viralt antigen av en bestämd specificitet får icke förväxlas med ett viralt antigen av en annan specificítet, och detsamma gäller vid påvisandet av erytrocytära eller cellulära antigener och 447 953 antikroppar.

Uppfinningen skall vidare tillhandahålla ett analysförfarande, som inte är miljökrävande och med vars hjälp man avsevärt kan nedbringa den tid som krävs för erhållande av analysresultaten och som dessutom baserar sig på reaktioner som möjliggör en mycket sparsam användning av reagens.

Föreliggande uppfinning avser sålunda ett förfarande för ana- lys av ett biologiskt medium för att påvisa eller identifiera virusantigener eller erytrocyt- eller cellantigener eller -antikroppar i mediet, vilket förfarande kännetecknas av att immunoglobulinerna Ig i den immunokemiska klassen X innefat- tande klasserna A och G och från en djurart I, dvs. ímmunoglo- buliner IgX I, fixeras på väggen av en behållare, som uppvisar en på en symmetriaxel i behållaren belägen konvergenspunkt; att en reaktionsblandning innehållande ett prov av det bio- logiska medium som skall anlyseras och ett företrädesvis kon- centrerat antiglobulin (d.v.s. en lösning av molekyler, som kommer från en från djurarten I skild djurart II och är anti- kroppar mot IgX I, i det följande betecknade anti-IgX I) behandlas i behållaren under sådana betingelser att anti-IgX I-molekylerna bindes till IgX I-molekylerna och sålunda bildar molekylbryggor mellan behållarväggen och de i blandningen suspenderade cellerna eller partiklarna med sammansättningen vägg-IgXlI-anti-IgX I-IgX2I-cell/partikel, varvid cellens/ partikelns eventuella bindning till behållarytan pâverkas direkt, när analyten ingår i den immunologiska bindningen mellan cellytan/partikelytan och anti-IgX I-molekylen, eller indirekt genom en sterisk inhibering av sistnämnda immunologiska bindning, när analyten är ett antigen som bin- des till de på cellerna/partiklarna fixerade antigenspecifika antikropparna, och att såväl vid direkt som indirekt påverkan denna bindning utgör ett mått på halten av antigen/antikropp i provet; att behållaren under noggrant reglerade betingelser utsättes för en acceleration i sin symmetriaxels riktning, vilken acceleration är tillräcklig för att förorsaka att de 447 933 celler eller partiklar, som inte är bundna vid väggen medelst molekylbryggor, samlas vid behållarens spets, men inte är tillräcklig för att bryta de förefintliga molekylbryggorna: och att behållaren undersökes för bestämning av närvaron av en mikrobeläggning av celler eller partiklar som samlats vid dess spets och indikerar frånvaron av det sökta antigenet eller antikroppen.

Det ovan definierade förfarandet enligt uppfinningen utnyttjar en speciell typ av reaktioner, nämligen reaktioner av immuno- vidhäftningstyp. Dessa reaktioner betecknas på nämnda sätt, eftersom det förlopp som utvisar reaktionen består i en vid- häftning mellan å ena sidan celler, kroppar eller partiklar och å andra.sidan bottnen av en behållare, överdragen med ett skikt eller hinna av molekyler, som uppvisar antigen- eller antikroppegenskaper. Denna vidhäftning är av immunologisk beskaffenhet, eftersom den tillhandahålls genom uppträdandet av antigen-antikropp-bindningar mellan kropparna, cellerna eller partiklarna å ena sidan och behållaren a andra sidan.

Det har visat sig att förfarandet enligt uppfinningen är väsentligt känsligare än de kända förfarandena och att käns- ligheten närmare bestämt är 100- upp till 1000-faldig. Dess- utom möjliggör förfarandet enligt uppfinningen en avsevärd avkortning av den tid som är nödvändig för erhållande av ana- lysresultaten och möjliggör på detta sätt genomförandet av snabbdiagnoser, som nu exempelvis ifråga om påvisandet av erytrocytära antigener eller kända antikroppar i blodet kan genomföras inom loppet av 6 minuter i stället för som hittills 1 timme. Det nya förfarandet möjliggör dessutom även en avse- värd inbesparing av reagens; detta är mycket viktigt, exempel- vis då så dyrbara reagens krävs som lymfocytära celler test- sera av en sällsynt specificítet.

En ytterligare fördel med det nya förfarandet ligger däri att ingen som helst radioaktivitet deltar; förfarandet är väsent- ligt billigare är de radioimmunologiska förfarandena och be- lastar i motsats till dessa förfaranden icke miljön. 447 933 Uppfinningen åskådliggöres närmare med hänvisning till bi- fogade ritningar och medelst utföríngsexemplen nedan.

Fig. 1 - 9b åskådliggör schematiskt de olika stegen vid för- farandet enligt uppfinningen, applicerat på undersökningen av ett blodprov i syfte att konstatera om antigen HBS ingår däri.

Fig. l0 åskådliggör schematiskt de krafter som en cell under- kastas vid centrifugering.

Fig. ll - lüb åskådliggör schematiskt de olika stegen vid förfarandet enligt uppfinningen, applicerat på fastställandet av närvaron av antigen D på de röda blodkropparna i ett blod- prov från människa.

Fig. lš - 18 är diagram över centrifugeringsförlopp.

Exempel l Denna första utföringsform av förfarandet åskådliggöres med hänvisning till figurerna 1 - 9b. Förfarandet utnyttjades härvid i syfte att påvisa om serumet eller plasmat från ett blodprov från människa innehöll viralt antigen HBS, som i det följande för enkelhetens skull betecknas antigen HBS. a) Det första steget vid förfarandet består i att förbereda ytan av bottnen av en behållare, som används för att påvisa vidhäftning eller icke-vidhäftning av celler eller partiklar.

Behållaren, vars botten skall uppvisa en på behållarens symmetriaxel belägen_undre konvergenspunkt, är i föreliggande fall en bägare 1 av plastmaterial, exempelvis av polyvinyl- klorid (PVC), med en i genomskärning i form av ett V utformad botten 2. Denna botten 2 är överdragen med ett skikt eller en hinna av immunoglobuliner 3 eller IgX I, som i föreliggande fall är immunoglobuliner från get tillhörande den immunoke- 447 953 10 miska klassen G, d.v.s. get-IgG (fig. 1). Dessa get-IgG - 3 är i figuren återgivna såsom vita reaktanglar.

Fixeringen av IgG på bägarens plastmaterial kan ske med hjälp av olika kemiska förfaranden, exempelvis genom alstring av karbodiimid-bindningar mellan plastmaterialet och IgG-mole- kylerna eller genom enkel adsorption av IgG av plastmateria- let.

IgG-koncentrationen är därvid icke kritisk. Då emellertid reaktionernas sensibilitet eller känslighet är beroende av yttjockleken av de fixerade immunoglobulinerna använder man en med avseende på ímmunoglobulinerna tillräckligt koncentre- rad lösning så att bägarbottnen blir mättad med immunoglobu- liner och på detta sätt en så stor känslighet som möjligt upp- nås.

Efter fixeringen av get-IgG på bägarbottnen tvättas den med IgG överdrigna bägaren med en fysiologisk lösning, exempelvis med fysiologisk koksaltlösning (9% NaCl); för att avlägsna all IgG som icke har fixerats på bägaren utförs flera tvätt- ningar.

Det på plastbägarens botten fixerade skiktet av IgG skall icke torka; därför kvarhâlls på bägarens botten en liten mängd av den fysiologiska koksaltlösningen och IgG-skiktet behåller på detta sätt sin aktivitet under några timmar. b) Därefter förbereds cellerna eller partiklarna (i det föl- jande betecknade reagensceller eller -partiklar), med vars hjälp adherens- eller icke-adherens-förloppet påvisas, allt efter omständigheterna om reaktionen förlöper positivt eller negativt, d.v.s. om det serum som skall analyseras innehåller HBS-antigen eller ej. I det här beskrivna exemplet betecknas dessa celler av röda blodkroppar från får schematiskt med H.

Till dessa röda blodkroppar H kopplas immunoglobuliner, som 447 933 ll med nödvändighet tillhör samma djurart och samma immunoke- miska klass som i bägaren fixerat IgX I; ett av dessa immuno- globuliner måste dessutom uppvisa en antikroppsaktivitet med avseende på HBS-antigenet. Kopplingen av dessa immunoglobu- liner sker med fördel samtidigt med en behandling av de röda blodkropparna med kromklorid för att de röda blodkropparna skall kunna fixera resp. binda äggvitemolekyler. I före- liggande fall kopplas således på de röda blodkropparna från får get-anti-HBS-IgG, som schematiskt återges såsom streckade rektanglar och betecknas med 5. Detta steg, som innebär kopp- ling av IgG på de röda blodkropparna, visas schematiskt i fig. 2.

Detta get-IgG med anti-HBS-verkan utvinnes från serumet av en get, som har injicerats med renat antigen-HBS.

De på detta sätt förberedda röda blodkropparna betecknas så- som "reagensblodkroppar". Naturligtvis kan man i stället för de röda blodkropparna använda godtyckliga andra celler eller partiklar, till vilka immunoglobulinerna kan kopplas. c) De på så sätt förberedda resp. förbehandlade och i fysio- logisk (koksalt) lösning suspenderade röda blodkropparna Ä från får inkuberas med serumet eller plasmat från det blod- prov som skall undersökas i syfte att fastställa om det inne- håller antigen-HBS eller ej. I praktiken används exempelvis ett plasma, som har spets i förhållandet 1:50 eller l:lOO.

Vid denna inkubation, som utförs utanför den i förväg prepa- rerade bägaren, bringas en suspension av preparerade röda blodkroppar från fâr, såsom har beskrivits ovan, i kontakt med serumet från blodprovet och det hela inkuberas vid om- givningens temperatur under en tidsrymd av från några minuter upp till något tiotal minuter. Detta inkubationssteg visas schematiskt i fig. 3, varvid de äggformade eller ovala fin- streckade molekylerna 6 återger antigen-HBS. 447 933 12 Om i det serumprov som skall analyseras antigen-HBS är när- varande, så kopplas molekylerna 6 av antigenen med anti-HBs- IgG 5, som redan är bundna vid de röda blodkropparna H. Såsom visas schematiskt i fig. 3 ordnar sig antigenmolekylerna runt om de till en röd blodkropp bundna anti-HBS-IgG-molekylerna och åstadkommer på detta sätt ett steriskt hinder i de intra- molekylära mellanrum som fram till dess har varit för handen mellan anti-HBS-IgG-molekylerna.

Om det serum som skall analyseras icke innehåller något anti- gen-HBS, så äger någon reaktion icke rum och de röda blod- kropparna förblir i det tillstånd de befann sig vid slutet av föregående steg, d.v.s. i slutet av det steg i vilket anti- HBS-IgG från get fixerades eller bands vid blodkropparna; till följd härav uppträder icke något steriskt hinder runt om dessa anti-HBS-IgG-molekyler.

De på detta sätt inkuberade röda blodkropparna tvättas med fördel flera gånger med fysiologisk (koksalt) lösning (till- sats av lösning, suspendering, centrifugering, dekantering, avdragande av den överliggande vätskan o.s.v.) och närmare bestämt i den behållare vari inkuberingen har ägt rum. d) Därefter införs samtidigt i bägaren 1, vars botten 2 är överdragen med ett skikt av get-IgG 3: för det första de, så- som ovan beskrivits, inkuberade och tvättade röda blodkroppa- na från får och för det andra ett antíglobulin, d.v.s. ett ímmunserum resp. antiserum, som innehåller immunoglobuliner med en specifik antikroppsaktivitet med avseende på immuno- globulinerna, som för det första är fixerade vid bägaren och för det andra bundna till de röda blodkropparna, d.v.s. Ig II anti-IgX I. I föreliggande exempel tillförs ett anti-get- antiglobulin från kanin, som innehåller anti-get-IgG-immuno- globulin G eller IgG från kanin; dessa immunoglobuliner åter- ges schematiskt i fig. Ha och Hb med små svarta rektanglar 7; fig. Ha motsvarardet fall då man erhåller en positiv reaktion och fig. Hb det fall då man erhåller en negativ reaktion. 447 935 13 .

Enligt en modifikation kan först suspensionen av de röda blod- kropparna införas i bägaren och därefter antiglobulinet.

Immunoglobulinerna av antiglobulinet är immunoglobuliner med en åtminstone tvåvärd antikroppsfunktion med avseende på get- IgG; ett kanin-IgG med antiget-IgG-verkan kan således med en av dessa antikroppsfunktioner (eller -grupper) reagera med en vid bägarens botten fixerad molekyl get-IgG och med den andra funktionen med en vid den röda blodkroppen bunden meolekyl anti-HBS-get-IgG. Dessa immunoglobuliner med specifik anti- kroppsaktivitet med avseende på get-IgG erhålles ur serumet från ett djur tillhörande en annan art, i föreliggande fall från serumet av en kanin, som har injicerats med get-IgG, företrädesvis i renad form.

Såsom förklaras närmare nedan användes här antiglobulinet i relativt hög koncentration, exempelvis ett antiget-IgG-anti- globulin, som uppvisar en títer av minst 128 enligt Coombs arbetsmetod, och närmare bestämt i ren form eller ringa ut- spätt (utspädníngsförhållande 1:2 eller lzﬂ).

Under denna inkubation, som betecknas såsom antiglobulin- inkubatíon och som av nedan närmare angivna skäl måste vara mycket kort, hålles bägaren med fördel ständigt i rörelse för att på detta sätt homogenisera blandningen av suspensionen av röda blodkroppar och antiglobulinet. e) Efter antiglobilin-inkubationen centrifugeras det hela, varvid noggranna betingelser måste iakttas; genom centrifu- geringen visas om adherensprocessen har ägt rum eller ej, d.v.s. om det serumprov med vilket de preparerade röda blod- kropparna från får har inkuberats innehåller antigen-HBS eller ej.

Vid centrifugeringen roteras bägaren runt en axel la, som är vinkelrät med avseende på rotatíonsaxeln lb hos bägaren 1; den första fasen, som betecknas anlagringsfasen, igångsättes 447 933 efter en tillräckligt kort tid efter antiglobulin-inkuba- tionens början, d.v.s. en tillräckligt kort tid efter infö- randet av blodkroppssuspensionen och antiglobulinet i bägaren för att en mycket ringa mängd IgG 3, som är fixerat vid bäga- ren, eller IgG 5, som är bundet vid blodkropparna, skall ha reagerat med IgG 7 av antiglobulinet med antiget-IgG-verkan.

Företrädesvís igångsättes denna första centrifugeringsfas efter en tídsrymd, som maximalt motsvarar den tidsrymd inom vilken 10% av get-IgG har reagerat med antiget-IgG-ímmuno- globulinerna av antiglobulinet. I praktiken betyder detta att centrifugeringen påbörjas några sekunder upp till något tiotal sekunder efter antiglobulin-inkubationens början.

Under denna första centrifugeringsfas anlagras reaktions- mediet som består av en suspension av blodkropparna från får och antiglobnlin, vid ytan av bägarbottnen 2 resp. täcker denna botten så att anti-HBS IgG från get 5, som är förenade med de behandlade och inkuberade röda blodkropparna från får, och get-IgG 3, som är fixerade på plastmaterialet, står över varandra och på detta sätt åstadkommer en snabb begynnande vidhäftning eller adherens av de röda blodkropparna på bäga- rens botten och närmare bestämt via immunoglobulinerna 7 av antiglobulinet, som å ena sidan kopplas samman med IgG 5 och å andra sidan med IgG 3; denna snabba begynnelsevidhäftning sker oberoende av om reaktionen förlöper positivt eller nega- tivt, d.v.s. oberoende av om på de röda blodkropparna antigen- HBS-molekyler är bundna eller ej via anti-HBS-IgG från get.

Härför användes en första måttlig centrifugeringshastighet V1; hur denna hastighet bestäms förklaras närmare nedan.

Fig. Sa och Sb visar starkt förstorat de över varandra lig- gande ytorna av en röd blodkropp U och bägarebottnen 2 under förloppet av denna anlagringsfas; fig. 5a motsvarar fallet med en positiv reaktion; fig. 5b motsvarar fallet med en nega- tiv reaktion. 447 935 15 _ I båda fallen ordnar sig immunoglobulinerna Ig 7 av anti- globulinet på grund av sin speciella antikroppsspecifitet med avseende på get-IgG mellan å ena sidan vid de röda blodkrop- parna bundet get-IgG 5 och å andra sidan vid bägarens botten fixerat get-IgG 3. Man antar att under denna anlagring eller beläggning, som leder till en måttligt kraftig vidhäftning av de röda blodkropparna vid ytan av bägarbottnen 2, kanaler eller fria utrymmen mellan plastmaterialet och de röda blod- kropparna utbildas, vilka begränsas av molekylkedjorna IgG 5/Ig 7/IgG 3, som har bildats; dessa kanaler tjänar såsom filter med avseende på ett senare tillträde av nya molekyler IE 7.

Såsom har förklarats ovan utbildas dessa kanaler såväl vid en positiv reaktion, d.v.s. då de röda blodkropparna U från får har bundit antigen-HBS-molekylerna 6 via IgG 5, som vid en negativ reaktion, vid vilken de röda blodkropparna 4 icke har bundit molekylerna av det virala antigenet. Emellertid är ifråga om en positiv reaktion (fig. 6a) dessa kanaler fyllda med molekyler av det virala antigenet medan detta inte är fallet ifråga om en negativ reaktion (fig. 6b).

I praktiken utnyttjar man i detta första centrifugeringssteg eller -fas en acceleration av cirka 200 g (g = jordaccelera- tionen) under från cirka HO till 60 sekunder. Reaktionen ut- föres i en bägare, som uppvisar en öppningsvinkel hos konen av 12o°. f) Därefter avbryts centrifugeringen under flera minuter.

Under detta steg cirkulerar de fria molekylerna Ig 7 i de i förväg under anlagringsfasen bildade kanalerna och har där- vid möjlighet att sammankopplas med fortfarande fritt IgG 5 från de röda blodkropparna eller fortfarande fritt IgG 3 från bäraren. Denna fas, i vilken centrifugeringen avbryts, utgör i själva verket en förlängning av antiglobulin-inkubationen.

Under den i den första fasen av centrifugeringen erhållna 447 933 16 måttliga anlagringen eller beläggningen har bindningskedjor utbildats mellan behållaren (väggen) och de röda blodkropparna vilka bindningskedjor består av: ett IgG fixerat vid behålla- ren, en anti-IgG-molekyl och ett IgG bundna vid en röd blod- kropp. Enligt uppfinningen har det vid försök visat sig att denna konfiguration energetiskt är mindre beständig än i när- varo av ett överskott av anti-IgG-molekyler än den konfigura- tion som består av ett IgG fixerat vid behållaren, en molekyl anti-IgG... en molekyl anti-IgG, ett IgG bundna vid en röd blodkropp. Härav har man kunnat sluta sig till att genom för- wgmgmavmﬁgwﬂmdmwﬁmmmvwﬁﬁßﬁsmb giltigt konfigurationerna IgG/anti-IgG ... anti-IgG/IgG bil- das i större antal än konfigurationerna IgG/anti-IgG/IgG, vilket åstadkommer "vidhäftningen" resp. upplösning av vid- häftningen mellan de röda blodkropparna och behållaren. Detta ' antagande har bekräftats och detta har med fördel utnyttjats.

Då reaktionsblandningen befinner sig i vila förlängs antiglo- bulin-inkubationen och get-anti-IgG 7 reagerar med get-IgG 3 eller 5 på det sättet att de mest beständiga konfigurationerna utbildas.

Eftersom emellertid, såsom ovan har förklarats, ifråga om en positiv reaktion de mellan röda blodkroppar och plastmaterial uppkomna kanalerna är väsentligt mera fyllda än ifråga om en negativ reaktion, är ifråga om en negativ reaktion (fig. 6b) väsentligt fler fria molekyler Ig 7 närvarande, som cirkule- rar i de uppkomna kanalerna, än ifråga om en positiv reaktion (fig. 6a). Detta har till följd att de över varandra liggande ytorna av de röda blodkropparna och plastmaterialet i kana- lerna vid en negativ reaktion mättes mycket fortare med IgG 7, som kopplas med IgG 5 hos de röda blodkropparna eller med IgG 3 hos plastmaterialet, än vid en positiv reaktion. Efter det att en viss tid har förflutit uppvisar vid en negativ reaktion (fig. Tb) de över varandra liggande ytorna av de röda blodkropparna och plastmaterialet en övervägande andel konfi- gurationer av följande slag: 447 933 17 . plastmaterial + IgG 3 från get/anti-get-IgG Ig°7 från kanin... anti-get-IgG Ig 7 från kanin/get-IgG 5 + röd blodkropp; denna konfiguration kan, eftersom två molekyler av samma be- skaffenhet ligger mot varandra, icke leda till utbildandet av en fullständig molekylbrygga plastmaterial + get-IgG 3/Ig 7 av kanin med anti-get-IgG-verkan/get-IgG 5 +röd blodkropp.

Eftersom dessa konfigurationer under den förlängda antiglobu- lin-inkubationen bildas i övervägande antal är de molekyl- bryggor som har bildats mellan plastmaterial och röda blod- kroppar under den ursprungliga snabba vidhäftningen i anlag- ríngssteget, icke längre närvarande i ett tillräckligt antal för att upprätthålla vidhäftningen. En upplösning har därför skett.

Vid en positiv reaktion däremot (fig. 7a) inträder denna av- mättnadseffekt hos de mot varandra liggande ytorna av röda blodkroppar och plastmaterial genom Ig 7 mycket långsammare, varför antalet av de med IgG kopplade anti-IgG-molekylerna icke leder till ett upphävande av vidhäftningen av de röda blodkropparna vid den tidpunkt då vid en negativ reaktion redan en upplösning har ägt rum.

Varaktigheten av detta avbrytande av centrifugeringen resp. av den förlängda antiglobulin-inkubationen regleras och styrs således så att man uppnår den grad av mättnad av de mot varandra liggande ytorna av röda blodkroppar och plastmaterial med Ig 7-molekyler som ifråga om en negativ reaktion leder till upplösning men så att man å andra sidan icke uppnår den mättnadseffekt som ifråga om en positiv reaktion leder till upplösning (upphävning av vidhäftningen). g) Därefter följer ett sista steg, där centrifugering sker och närmare bestämt med en hastighet V2, som är större än hastigheten V1. Med hjälp av denna centrifugeringsfas kan man nu skilja mellan en positiv reaktion och en negativ reaktion.

Hastigheten V1 väljs på så sätt att den alstrade centrifugal- 447 933 lö kraften förflyttar de röda blodkroppar som är kraftigare mättade med Ig 7, d.v.s. de blodkroppar som uppvisar negativ reaktion, till spetsen resp. vinkelspetspunkten 10 av bägaren och där sammanför dessa (fíg. Bb), medan de röda blodkroppar som uppvisar eller utmärkes av en positiv reaktion och som förblir vidhäftade vid bägarväggen på grund av de kvarstående molekylbryggorna icke medförs. Dessa molekylbryggorz plast- material + get-IgG 3/IgG av kanin med anti-get-IgG-verkan/ get-IgG 5 + röd blodkropp (fíg. Ba) bibehålles, eftersom den förlängda antiglobulin-inkubationsfasen eller -steget avbryts innan man har uppnått den mättnadsgrad med avseende på Ig 7 av antiglobulinet som leder till upplösning.

I praktiken centrifugerar man vid användning av en bägare med en öppningsvinkel hos konen av 1200 i den sista fasen med en acceleration av cirka 500 g under en tidsrymd av cirka RO sekunder.

Analysresultaten kan därefter omedelbart utläsas efter det att man har avbrutit denna andra centrifugeringsfas.

Ifråga om en positiv reaktion, d.v.s. i det fall då det serumprov med vilket de röda blodkropparna från får har in- kuberats verkligen innehåller antigen HBS, förblir de röda blodkropparna vidhäftade resp. fixerade vid bägarbottnen och närmare bestämt via IgG 3, Ig 7 och IgG 5. Man observerar därvid vid betraktande av bägaren utmed dess axel lb (fíg. 9a) ett homogent monoskikt av röda blodkroppar, som är för- delade över bägarbottnens hela yta; vidhäftning föreligger således.

Om å andra sidan det analyserade serumprovet icke innehåller antigen HBS förflyttas de röda blodkropparna, såsom beskri- vits ovan, till bägarens spets och samlas där. Betraktar man bägaren utmed dess axel så konstaterar man i detta fall att ett mikrosediment av röda blodkroppar har bildats (fíg. 9b): någon vidhäftning föreligger icke. 447 935 19 .

Mängderna av de använda reagenserna är icke kritiska. Såsom exempel kan anges att i en bägare med en diameter av l - 7 mm volymen av den införda vätskan uppgår till 15 - 250 ul, var- vid blodkroppssuspensionen och antiglobulinet med fördel an- vändes i lka stora volymer.

Såsom framgår av det ovan anförda måste de olika stegen ut- föras under noggranna betingelser.

Den använda antiglobulínkoncentrationen är beroende av yt- tjockleken av IgG, som de under förloppet av steg b) erhållna preparerade och såsom reagens tjänande röda blodkropparna uppvisar; detta förklaras närmare nedan i nästa utförings- exempel.

Antíglobulinkoncentrationen måste vara tillräckligt hög för att man å ena sidan skall uppnå en snabb begynnelsevidhäft- ning mellan röda blodkroppar och behållarväggen under det första centrifugeríngssteget och för att å andra sidan ett överskott av anti-IgG-molekyler skall vara närvarande, vilka eventuellt kan leda till upplösning av de röda blodkropparna, kännetecknet på den negativa reaktionen, såsom har närmare förklarats under f) ovan. Antíglobulinkoncentrationen skall å andra sidan icke vara alltför hög så att under anlagrings- fasen icke alltför många molekylbryggor utbildas mellan röda blodkroppar och behâllarvägg, eftersom annars till och med vid en negativ reaktion små kanaler erhålles, som skulle störa cirkulationen av anti-IgG-molekylerna vid upphörande av centrifugeringen.

Vid utförande av dessa immunovidhåftningsreaktioner kunde man dessutom påvisa ett av antiglobulínkoncentrationen beroende "zonfenomen" resp. ett "zonför1opp", d.v.s. en kraftig fluktuaf tion av immunovidhäftningsreaktionens känslighet runt ett maxi- mum, som motsvarar en viss bestämd antiglobulinkoncentration, och dessutom ett ytterligare zonfenomen resp. ett ytterligare zonförlopp, som är beroende av den tid under vilken detta 447 933 20 antiglobulin är i kontakt med IgG före centrifugeringen. Detta av kontakttiden beroende zonfenomen, som har ett kraftigare inflytande på reaktionens känslighet än det av antiglobulin- koncentrationen beroende zonfenomenet, kan förklaras på föl- jande sätt: Under antiglobulin-inkubationsförloppet kopplas de från anti- globulinet härrörande anti-IgG-molekylerna å ena sidan med vid de röda blodkropparna bundet IgG och å andra sidan med vid bägarens plastmaterial bundet IgG; varvid antalet kopp- lade anti-IgG-molekyler är beroende av inkubationstiden. Så- som redan har nämnts följer på antiglobulin-inkubationsfasen en första centrifugeringsfas, som även kan betecknas såsom anlagríngsfas. Ju längre inkubationen dröjer dessto oftare kommer en redan på en rdö blodkropp bunden anti-IgG-molekyl under anlagringsfasen att stå mot en molekyl av samma be- »~skaffenhet, d.v.s. mot en anti-IgG-molekyl, som i sin tur är fixerad vid plastmaterialet. Denna konfiguration röd blod- kropp + IgG/anti-IgG... anti-IgG/IgG + plastmaterial, som ut- bildas under anlagringen av den röda blodkroppen vid bägar- bottnen, inverkar ogynnsamt på möjligheten till en vidhäft- ning av den röda blodkroppen vid plastmateríalet. Härav fram- går lätt att frekvensen av utbildningen av dylika för vid- häftningen ogynnsamma konfigurationer tilltar med antiglobu- lin-inkubatíonens varaktighet och att till följd härav chan- serna till vidhäftning, d.v.s. storleken eller graden av känsligheten hos denna reaktion, blir mindre ju längre anti- globulin-inkubationen varav.

Känsligheten når emellertid icke något maximum vid en inkuba- tionstid O. För att vidhäftningen verkligen skall vara möjlig att genomföra och vara märkbar måste nämligen, i det ögon- blick då anlagríngen äger rum, några anti-IgG-molekyler redan vara bundna vid en av kopplingsdeltagarna, d.v.s. antingen vid det IgG som i sin tur är bundet till en röd blodkropp eller vid det IgG som är fixerat på plastmaterialet. Några sekunder eller bråkdelar av sekunder är tillräckliga för att 447 953 21 . dessa fåtal anti-IgG-molekyler skall kunna bindas eller kopp- las.

Denna utomordentligt korta inkubationstid bestäms experimen- tellt med fördel genom att i det steg som följer omedelbart på antiglobulin-inkubationen, d.v.s. i anlagringsfasen, alla reaktioner leder till anlagring, oberoende av om de är posi- tiva eller negativa. Man utför således de olika stegen i det förfarande som har beskrivits för en negativ reaktion, d.v.s. i föreliggande fall under användning av ett serumprov, som icke innehåller något HBS-antigen, varvid den lämpliga var- aktigheten av inkubationen är så beskaffad att man i anlag- ringsfasen uppnår 100% anlagring eller bindning.

Vidare skall noteras att immunovidhäftningen eller immuno- adherensen under antiglobulin-inkubationens utvecklingsför- lopp är utomordentligt känslig för små eller ringa minsknin- gar av yttjockleken av vid plastmaterialet fixerat IgG, som fortfarande är fritt från anti-IgG-molekyler.

Centrifugeringsförloppet är totalt sett, såsom har beskrivits ovan, komplicerat och förlöper i flera faser, av vilka var och en utövar en speciell mekanisk effekt på reaktionerna. Innan de noggranna betingelser som måste upprätthållas under för- loppet av dessa centrifugeringsfaser förklaras närmare skall de vid en centrifugering uppträdande eller ingripande kraf- terna förklaras med hänvisning till fig. 10.

Centrifugeringen, som uppnås genom rotation omkring en axel la, som är vinkelrät mot bägarens rotationsaxel lb, har den effekten att en röd blodkropp H eller en annan cell eller en annan partikel, som användes för att påvisa vidhäftning eller icke-vidhäftning, underkastas en centrifugalkraft Fc, som är riktad parallellt med bägarens axel lb. Dessutom inver- kar en rad ytterligare parametrar, som kan definieras pâ föl- jæﬂesüt: 447 953 22 Vinkeln a, som bildas av en mantellinje på bägarens kon med dess projektion i ett plan vinkelrätt mot centrifugalkraftens riktning och betecknas "lutnings"-vinkeln; massan m hos en röd blodkropp; talvärdet n för accelerationen g, som användes vid centrifu- gering med en hastighet av V varv per minut; den tidsrymd t under vilken hastigheten utnyttjas; summan av de såsom icke-specifika betecknade krafter (FNS) som kvarhåller en röd blodkropp på plastmaterialet; denna summa innefattar de elektrostatiska atraktionskrafterna mel- lan en röd blodkropp och plastmaterialet; de immunokemiska bindningarna med "parasitär" specifitet med avseende på den huvudspecifitet på vilken reaktionen beror, motståndskrafter- na mot glidning_eller centrifugering genom understödjande av lokala hinder (bägarens strävhet, hinder till följd av att kropparna stöter emot närbelägna celler eller närbelägna par- tiklar i lutande (snedställd) stä1lning); suman av de specifika bindningskrafter som kvarhåller en röd blodkropp på bägarens lutande vägg och som betecknas med FS och som består av kedjan av bindningar mellan plastmaterial och röda blodkroppar, nämligen IgG (fixerat vid ett plastmaterial)/molekyl-anti-IgG/ (IgG bundet vid den röda blodkroppen) den anlagringskraft som utövas på den röda blodkroppen vid en hastighet av V varv per minut, d.v.s. den röda blodkroppens anliggningskraft med avseende på plastmaterialet motsvarande centrifugalkraftens kraftkomposant vinkelrät mot en mantel- linje på konen. Denna anlagringskraft betecknas med Fp och är lika med n X m x cos a; den centrifugalkraft som utövas på en röd blodkropp vid en hastighet av V varv per minut, d.v.s. den kraft med vilken den röda blodkroppen skall befrias eller avrivas genom centri- fugalkraftens kraftkomposant parallell med en mantellinje på konen. Denna centrífugalkraft betecknas Fd och är lika med n x m x sin d.

Efter dessa allmänna betraktelser skall nu nedan närmare för- 447 933 23 klaras de olika steg som försiggår under förloppet av de olika centrifugeringsfaserna.

I det här beskrivna exemplet strävar man efter att i den första centrifugeringsfasen, d.v.s. i anlagringsfasen, uppnå en snabb vidhäftning av de röda blodkropparna och följaktli- gen en snabb utbildning av kanaler mellan de mot varandra liggande ytorna av plastmaterial och röda blodkroppar; dessa kanaler tjänstgör som filter med avseende på det senare till- trädet av nya anti-IgG-molekyler, såsom har redan har förkla- rats ovan.

Hastigheten V1 i denna första centrifugeringsfas väljs följ- aktligen på så sätt att anlagringskraften Fpl åstadkommer att 100% av de röda blodkropparna vidhäftar plastmaterialet och detta vid alla reaktioner, oberoende av om de förlöper poti- tivt eller negativt. Denna hastighet V1 måste följaktligen väljas så att centrifugeringshastigheten Fdl icke är sä stor att de bindningskrafter som kvarhåller de röda blodkropparna vid bägarens botten upphävs.

För att de genom vidhäftningen av de röda blodkropparna vid plastmaterialet bildade kanalerna skall tjänstgöra såsom fil- ter under förloppet av den efterföljande fasen, då centrifu- geringen avbryts eller genomföres med mycket mindre hastig- het, måste dessutom hastigheten V1 vara tillräckligt låg för att de röda blodkropparna vid anlagring till bägarens botten icke skall tryckas sönder. Om nämligen anlagringen är för kraftig och de röda blodkropparna därvid trycks sönder på plastmaterialet, sammantrycks även kanalerna och är därefter icke längre för handen, och detta gäller även vid negativa reaktioner. De fria anti-IgG-molekylerna skulle därvid icke längre kunna cirkulera mellan plastmaterial och röda blod- kroppar, varför det förlopp som innebär mättnad av de mot varandra liggande ytorna av röda blodkroppar och plastmaterial med anti-IgG-molekyler, vilket närmare har förklarats ovan vid beskrivningen av de olika stegen, icke längre skulle kunna 447 933 2U ~ äga rum. Ä andra sidan får emellertid hastigheten Vi i detta anlag- ringssteg icke vara för ringa. En alltför svag anlagring eller en alltför ringa anlagring skulle kunna leda till ett otillräckligt närmande mellan de reaktionsbenägna grupperna, d.v.s. ett otillräckligt närmande mellan vid de röda blod- kropparna bundet IgG och vid plastmaterialet fixerat IgG, så att vidhäftningen skulle utbildas dåligt och kanalerna icke skulle anta rätt form.

Den andra centrifugeringsfasen börjar icke omedelbart efter anlagringssteget utan efter ett visst uppehåll eller avbrott, under vilken tid - såsom redan har förklarats ovan - en för- längning av antiglobulin-inkubatíonen inträder. Den andra centrifugeringsfasen genomföras med en hastighet V2, som är större än hastigheten V1. Denna centrifugeringshastighet V2 måste ha den verkan att de röda blodkroppar som mest har bun- dit anti-IgG-molekyler under den förlängda antíglobulin- inkubationen, d.v.s. de röda blodkroppar som är karaktäristis- ka för en negativ reaktion, förflyttas till vinkelspetspunkten resp. spetsen 10 av bägarbottnen, medan däremot de röda blod- kroppar icke medföljer som utmärker en positiv reaktion och som, såsom har förklarats närmare ovan, till följd av vid- häftningen vid bägarbottnens väggar förblir bundna även efter den förlängda antiglobulin-inkubationen, d.v.s. efter det att centrifugeringen har avbrytits. Hastigheten V2 väljs därför på så sätt att den alstrade centrifugalkraft Fdg som inverkar på en röd blodkropp är större än summan av de ospecifika bíndningskrafter som därvid ensamma kvarhåller en röd blod- kropp, som på bägarbottnen utmärker en negativ reaktion; å andra sidan måste centrifugalkraften vara mindre än summan av FNS + FS, d.v.s. summan av de ospecifíka och de specifika bindningskrafter med hjälp av vilka de röda blodkroppar som utmärker en positiv reaktion kvarhålles vid bägarbottnen medelst vidhäftning. 447 933 25 .

I detta fall avcentrifugeras endast de röda blodkroppar som utmärker en negativ reaktion och samlas i bägarens spets, me- dan de blodkroppar som utmärker en positiv reaktion förblir vidhäftade. Skillnaden mellan positiv och negativ reaktion är därvid mycket tydlig.

För varje undersökt system, d.v.s. för en speciell beskaffen- het hos de såsom reagens använda cellerna eller partiklarna, av det virala antigen som skall påvisas och av de i reaktio- nen deltagande molekylerna IgX I och anti-IgX I, kan man så- ledes fastställa de optimala värdena för de ovan definierade parametrar som deltar vid centrifugeringen och för vilka reak tionen ger de bästa resultaten. Man kan därvid konstatera att förhållandet mellan centrifugalkraften Fd och anlagringskraf- ten Fp, vilket förhållande utvisar den möjliga avcentrifuge- ringen, är lika med: n x m x sin a n X m X cos a, d.v.s. tan Q. Talvärdet för detta föhållande är således endast beroende av lutnings- vinkel a.

För en vinkel a = O uppgår således värdet för tan a likaledes till O och möjligheten att partiklarna avcentrifugeras är lika med o. För en vinkel <1 = 9o° däremot är talväraet för han e oändligt, varför likaledes möjligheten att partiklarna av- centrifugeras är oändligt stor, med andra ord är en icke- centrifugering resp. ett bibehållande av vidhäftningen omöj- lig.

Mellanvärdena för vinkeln a möjliggör således en dosering eller mängdmässig fastläggning av förhållandena mellan centri- fugalkraften och anlagringskraften och en anpassning av dessa förhållanden till beskaffenheten av cellerna eller av såsom reagens använda partiklar, av det virala antigenet och av de deltagande molekylerna IgG I och anti-IgG I, varför man erhåller en specifik avcentrífugering eller frigörande av celler eller reagenspartiklar, som utmärker en negativ reak- tion, under förloppet av den andra centrifugeringsfasen. 447 933 26 - För att kunna arbeta under de bästa möjliga betingelserna skall därför företrädesvis en sats bägare med olika lutning vara för handen, så att man kan välja en bägare med den lut- ning a som bäst motsvarar beskafïenheten av reaktionen i fråga.

Man kan på detta sätt samtidigt under samma betingelser vid centrifugeringen, d.v.s. med samma värden på den använda centrifugalkraften, utföra analyser av flera olika prover, i vilka virala antigener av olika specifitet och olika be- skaffenhet skall påvisas, genom att man för vart och ett av dessa olika analysprover väljer den bägare vars botten upp- visar en lutningsvinkel d med ett sådant värde att de för en negativ reaktion karaktäristiska celler eller reagenspartik- larna avcentrifugeras om den för den andra centrifugerings- fasen valda, till förfogande stående centrifugalkraften an- vändes.

. Enligt uppfinningen tillhandahålles således även en sats bä- gare med V-formig botten, vars öppníngsvinklar för konen är olika och exempelvis omfattar intervallet från 80 - 1000 och som var och en skiljer sig från varandra med en vinkel av 100.

För ovan beskrivna exempel för påvísande av viralt antigen HBS i ett blodprov användes med fördel bägare med konísk bot- ten och en öppningsvinkel hos konen av 1200.

Fig. 15 visar ett exempel på ett diagram över de olika centri- fugeringsfaserna, som genomföres vid en reaktion för påvisande av antigen HBS i ett blodprov från människa, varvid immuno- vidhäftningsreaktionen företas i en bägare med konísk botten och en öppningsvinkel hos konen av 1200. Utmed ordinatan är centrifugalkraften, uttryckt i g, avsatt och utmed abskissan tiden i sekunder.

Det reaktionsmedium som innehåller de i förväg med serumpro- vet och antiglobulinet inkuberade blodkropparna införes i 447 933 bägaren, vars botten är överdragen med ett skikt eller hinna av get-IgG, och underkastas där en antiglobulin-inkubation.

Såsom redan angivits ovan hålls bägaren under denna inkuba- tion ständigt i rörelse exempelvis i fram- och återgående rö- relser i en riktning parallell med rotationsaxeln. Denna anti- globulin-inkubations- och skakningsfas betecknas i fig. 15 med I. Denna fas utfördes i detta fall med en acceleration av U g, ett värde som icke har någon verkan på avsättningen eller anlagringen av de röda blodkropparna på bägarens botten. Med accelerationen Ä g utfördes centrífugeringen under 15 sekun- der.

Därefter ökades snabbt accelerationen upp till ett värde av 200 g och detta värde bibehölls upp till den 60:e sekunden efter införandet av reaktionsmediet i bägaren. I den 15:e sekunden började därmed en fas II, i vilken de röda blod- kropparna avsatte sig. varvid hela mängden röda blodkroppar hade samlats på bägarens botten i den 30:e sekunden. På den- na fas II följde anlagringsfasen III, i vilken alla röda blodkroppar anlagrades vid bägarens botten och detta så väl vid positiva reaktioner som vid negativa reaktioner; samti- digt påbörjades bildningen av "filterkanaler" mellan bägar- bottnens yta och de därpå liggande röda blodkropparna.

I den 60:e sekunden började den fas som innebar diffusion av de fortfarande fria, i reaktionsmediet cirkulerande anti- get-IgG-molekylerna mellan plastmaterial och röda blodkrop- « par (fas IV i diagrammet enligt fig. 15); denna fas utgör, såsom redan förklarats ovan, en förlängning av antiglobulin- inkubationen. Denna fas utfördes genom att man centrifuge- rade med en acceleration av 8 g, ett accelerationsvärde som icke alstrade några tillräckligt höga centrifugaleffekter för att de tidigare under fasen III bildade kanalerna skulle sam- mantryckas. Under förloppet av fas IV fortskred mättningen av de mot varandra liggande ytorna av röda blodkroppar och bä- garbottnen med anti-get-IgG-molekyler; den tröskel vid vilken frigörandet av de röda blodkropparna, karaktäristiskt för den 447 933 28 negativa reaktionen, inträdde i anslutning till mättningen uppnåddes i den 300:e sekunden.

Den sista fasen, under vilken de eventuellt för handen varande röda blodkroppar som utmärker en negativ reaktion samlas i bägarbottnens spets, utfördes genom att centrifugal- acceleratíonen snabbt höjdes till 500 g; detta värde är till- räckligt för att frigöra de för den negativa reaktionen ut- märkande röda blodkropparna, eftersom de i slutet av fas IV, under vilken mättnaden med antiglobulinet ägde rum, prak- tiskt taget icke längre häftade vid underlaget. I denna sista fas V uppsamlades snabbt de röda blodkroppar som hade förlorat sin vidhäftning under loppet av den föregående fasen IV.

Denna sista centrifugeringsfas avbryts i det ögonblick då man erhåller en procentuell andel av avcentrifugerade eller befriade röda blodkroppar som just är utmärkande för en verk- lig eller reell negativ reaktion. I det här angivna exemplet avbröts den sista centrifugeringsfasen i den 3üO:e sekunden.

Talvärdena för parametrarna i var och en av dessa faser - centrifugeringshastighet, varaktighet - kan fastställas i förväg medelst försök, som utföres med hjälp av en typisk negativ reaktion med samma reagens, varvid försöket med de bästa resultaten tillhandahåller värdena för de parametrar som sedan används för den egentliga analysreaktionen.

Enligt en modifikation styrs centrifugeringen som en funktion av utvecklingen av de reaktioner som är igång; förfarandet utförs därvid samtidigt å ena sidan i en bägare, i vilken provanalysen företages, och å andra sidan i en bägare, i vil- ken en negativ kontrollreaktion utföres; vid varje rotation under centrifugeringen belyser man bägaren med en stroboskop- blixt.

Den förstorade bilden av bottnen hos den bägare vari kontroll- reaktionen äger rum upptas med en TV-kamera och analyseras, exempelvis en gång per sekund; ytan och opaciteten av bilden 447 933 29 - av det mikrosediment som bildas uppmäts och tillväxtkurvan för detta mikrosediment jämföras med tillväxtkurvan för det mikrosediment som erhålles vid en negativ referensreaktion av samma typ. Hastigheterna och tidsperioderna vid centrifuge- ringen styrs därefter på sådant sätt att tillväxtkurvan för mikrosedimentet från den negativa kontrollreaktionen motsva- rar tillväxtkurvan för referensreaktionen.

Centrifugeringen avbryts slutligen då ytan av det analyserade mikrosedimentet motsvarar en mängd avcentrifugerade röda blodkroppar som åtminstone är lika stor som den mängd som ut- gör tröskelvärdet för en äkta negativ reaktion och definieras på följande sätt: Genom förförsök, utförda på negativa kontrollreaktioner, fastställer man vilken procentsats med avseende på röda blod- kroppar ett mikrosediment innehåller, som betecknar en äkta negativ reaktion, d.v.s. som kan särskiljas och uppmätas och är reproducerbart och som'därvíd är så litet som möjligt.

Därefter bestäms den standardavvikelse 6 som erhålles för dessa negativa reaktioner. Tröskelvärdet för en negativ reaktion motsvarar därvid en procentsats röda blodkroppar i ett mikrosediment, vilken procentsats är den för den negativa reaktionen utmärkande procentsatsen + 2 gånger standardav- vikelsen. På analogt sätt motsvarar tröskelvärdet för en positiv reaktion en procentsats röda blodkroppar i ett mikro- sediment, som är lika med den för en negativ reaktion utmär- kande procentsatsen minskad med 2 gånger standardavvikelsen.

Om exempelvis ifråga om en negativ reaktion de i sedimentet samlade röda blodkropparna i genomsnitt utgör 12% och stan- dardavvikelsen har bestämts till 3% ligger tröskelvärdet för en negativ reaktion vid 12% + 2 gånger 3% = 18%. Om ytan av mikrosedimentet från analysreaktionen motsvarar en procent- sats av centrifugerade och i sedimentet samlade röda blod- kroppar på bägarens botten, vilken procentsats är lika med eller större än 18%, så betraktas reaktionen såsom säkert 447 933 30 . negativ. Tröskelvärdet en positiv reaktion uppgår i detta fall till 12% - 2 gånger 3% = 6; om således ytan av mikrose- dimentet från analysreaktionen motsvarar en procentsats röda blodkroppar, som är samlade i mikrosedimentet, av 6% eller därunder anses reaktionen såsom säkert positiv. Om ytan av det erhållna mikrosedimentet motsvarar en procentsats av röda blodkroppar mellan 6 och 18%, så utvärderas reaktionen såsom tvivelaktig och bör därvid upprepas. Det ovan beskrivna exem- let på en utföringsform av förfarandet enligt uppfinningen av- såg påvisandet av det virala antigenet HÉS i ett blodprov från människa. Naturligtvis kan detta förfarande användas även för påvisande av godtyckliga andra virala antigener i ett blodprov, genom att man på motsvarande sätt fastställer beskaffenheten av de celler eller partiklar som tjänstgör så- som reagens, beskaffenheten av det IgX som fixeras vid bäga- rens botten och binds till nämnda celler eller partiklar samt beskaffenheten av anti-IgX I-molekylerna.

Förfarandet enligt uppfinningen kan även användas på andra *' biologiska vätskor än blod, exempelvis på saliv eller urin, ' för att däri påvisa eventuellt närvarande virala antigener eller helt allmänt påvisa antigener, som kan betecknas såsom "molekylära“, d.v.s. fria molekyler, som icke är bundna till en cell och uppvisar antigenegenskaper, naturligtvis med det förbehållet att de olika reagensen modifieras på motsvarande sätt, d.v.s. de celler eller partiklar som tjänar såsom rea- gens, de immunoglobuliner som kopplas med dessa celler eller partiklar och skall fixeras på bägaren, antiglobuliner och de övriga reaktionsparametrarna.

Exempel 2 Med hänvisning till fig. ll - lüb ges nedan ett andra exempel på en användning eller ett utförande av förfarandet enligt uppfinningen, vid vilket man kan bestämma om de röda blod- f '¿' kropparna i ett blodprov från människa uppvisar antigen- aktivitet D. De blodkroppar som uppvisar denna aktivitet mot- 447 933 31 - svarar en individ med positiv Rhesus-faktor. Om de röda blod- kropparna däremot icke uppvisar dessa aktiviteter emot- svarande försöksperson Rhesus-negativ. Först skall en första utföringsform beskrivas: a) Det första steget består i att, i likhet med exempel 1, att ytan prepareras på den bärare på vilken cellernas vid- häftning eller icke-vidhäftning skall fastställas (fig. ll och 12).

Bäraren är en bägare 21 av plastmaterial, exempelvis av poly- vinylklorid (PVC), med en V-formig botten 22. Denna botten 22 är överdragen med ett skikt eller tunn hinna av immuno- globuliner 23, som måste tillhöra samma djurart och samma immunokemiska klass som globulinerna med specifik antikropps- verkan mot det antigen vars eventuella förekomst på de röda blodkropparna skall undersökas. I föreliggande fall skall man påvisa om antigen D förekommer på ytan av membranet hos _röda blodkroppar från människa. Den specifika antikroppen mot detta antigen är ett humanimmunoglobulin, framförallt av typ G med antikroppsverkan eller -funktion anti-D. På bä- garens botten fixeras följaktligen humanimmunoglobuliner av typ G, vilka man betecknar human-IgG och som âskådliggöres såsom vita rektanglar 23.i Fixeringen eller bindningen av IgG till det plastmaterial varav bägaren består utföres under samma betingelser som har beskrivits i exempel l ovan. Efter fixeringen av IgG vid bä- garbottnen utföres tvättning med en 9%-ig fysiologisk kok- saltlösning i syfte att avlägsna allt icke-fixerat IgG.

Koncentrationen av tillfört IgG är icke kritisk. Nämnda immunoglobuliner användes företrädesvis i överskott, beräknat på den mängd som kan fixeras, genom att man exempelvis använ- der en lösning innehållande l mg/ml. 447 933 32 p.

För att det vid plastmaterialet bundna IgG-skiktet icke skall torka bibehåller man på bägarens botten en liten mängd fysio- logisk koksaltlösning. b) De celler som skall undersökas eller analyseras i detta exempel är röda blodkroppar i ett blodprov från människa, vilka blodkroppar är suspenderade i fysiologisk koksaltlös- ning; de bringas utanför bägaren vid omgivningens temperatur och under en tidsrymd av från några minuter upp till något tiotal minuter i kontakt med ett för den sökta antigenaktivi- teten specifikt testserum, d.v.s. med ett serum som innehål- ler IgG-molekyler med den kända antikroppsspeoifiteten anti- D, vilka molekyler kan kopplas specifikt med de antigen-D- enheter som eventuellt är närvarande på de röda blodkroppar- na. Detta serum benämnes anti-D-testserum. I praktiken an- vändes exempelvis en suspension av röda blodkroppar från ett blodprov, som har spätts i ett förhållande av 1:50 eller l:lOO.

Fig. lša visar på den högra sidan schematiskt detta inkuba- tionssteg i det fall då de analyserade röda blodkropparna är "positiva", d.v.s. uppbär anti-D-enheter; dessa enheter ut- märkes med punkter, som är närvarande på membranet av de röda blodkropparna 2Ä. Dessa röda blodkroppar kopplas via sina antigen-enheter med antikropps-anti-D-IgG-molekyler 25 från det använda testserumet, varvid dessa IgG-molekyler 25 med antikroppsaktivitet återges med streckade rektanglar; man er- håller ett komplex som betecknas 26 i fig. lša.

På analogt sätt visar fig. l3b schematiskt detta steg i det fall då de röda blodkropparna ZU' är "negativa", d.v.s. icke uppbär några antigen-D-enheter. I detta fall kopplar de röda blodkropparna 2U' icke något anti-D-IgG 25.

Efter avslutad inkubation utföres med fördel tvättning flera gånger, exempelvis tre gånger med fysiologisk lösning, varvid varje tvättomgång omfattar följande arbetssteg: införande av 447 933 33 - den fysiologiska lösningen, suspendering, centrifugering, dekantering och kassering av den överliggande vätskan. Tvätt- ningen företages í den behållare vari inkuberingen har ut- förts. Man erhåller på detta sätt en suspension av inkuberade och tvättade röda blodkroppar, d.v.s. av röda blodkroppar som är suspenderade i ett medium fritt från IgG 25. c) Därefter ínföres samtidigt i bägaren 21, vars botten är beskíktad med human-IgG 23, suspensionen av de inkuberade och tvättade röda blodkropparna och ett antiglobulin, d.v.s. en lösning av animaliska antiglobuliner 27, som uppvisar anti- kroppsverkan med avseende på human-IgG. Dessa immunoglobuli- ner 27 från antiglobulinet återges schematískt med svarta rektanglar.

Enligt en modifíkation kan i en bägare först suspensionen av de röda blodkropparna införas och därefter antiglobulinet.

Såsom antiglobulin användes i detta fall ett immunserum från get, som har injícerats med human-IgG. Detta immunserum till- handahåller immunoglobuliner, betecknade såsom get-Ig med antihuman-IgG-verkan, som uppvisar en åtminstone tvåvärd antikroppsverkan med avseende på human-IgG; ett antihuman- lgG-get-Ig kan följaktligen via sin ena antikroppsfunktion kopplas med ett human-IgG, som är fixerat på bägarens botten, och via den andra funktionen eller gruppen med ett human-IgG, som är bundet vid en röd blodkropp.

Antiglobulinet användes i detta fall i starkt koncentration.

Immunovidhäftningsreaktionens känslighet är nämligen beroende av antiglobulin-koncentrationen. En möjlig förklaring till detta fenomen kan vara följande: likgíltígt hur länge anti- globulin-inkubationen har varat i praktiken uppnås icke på långt när en 100%-ig mättnad av IgG och detta gäller så väl för det IgG som är bundet till de röda blodkropparna som för det vid bägarens botten fixerade IgG. Beläggningen genom av- sättning av röda blodkroppar åstadkommer sâledes att ett avse- 447 933 zu _' värt antal heterologa IgG-molekyler närmar sig varandra, d.v.s. IgG som är fixerat på bägarens botten och IgG som är bundet vid de röda blodkropparna. Så länge emellertid den röda blodkroppen icke har immobíliserats genom vidhäftning, d.v.s. så länge antiglobulinets molekyler icke har bildat någon brygga mellan det vid den röda blodkroppen bundna och det vid plastmaterialet fixerade IgG, rullar eller glider den röda blodkroppen på lutningen av bägarens botten, som är överdragen med IgG, så att tidsperioden för det maximala när- mandet mellan de båda givna heterologa IgG-molekylerna är mycket kort och detta i dessto större utsträckning ju mindre de röda blodkropparna innehåller bundet IgG. Den tidsrymd under vilken avlägsnandet blir gynnsamt för en dubbelreak- tion med en antiglobulin-molekyl, är följaktligen mycket kort. Om det kortaste genomsnittliga avståndet mellan en antiglobulinmolekyl och två heterologa IgG-molekyler är allt- för stort, så att den genomsnittliga tiden för tillträdet av denna antiglobulin-molekyl är kortare än den verksamma tiden för närmandet av två heterologa IgG-molekyler vid gynnsamt avlägsnande, så äger någon reaktion icke rum. Man konstate- rar genast att denna genomsnittliga tillträdestid nedbringas genom en höjning av antiglobulin-koncentrationen.

Då man icke i förväg kan känna till de röda blodkropparnas IgG-yttjocklek måste dessutom antiglobulinet användas i starkare koncentration för att säkerställa att till och med vid en mycket ringa yttjocklek av IgG på de röda blodkroppar- na anti-IgG-molekylerna kan reagera med den på de röda blod- kropparna närvarande ringa mängden IgG i syfte att på detta sätt anlagra dessa vid behållaren. I detta sammanhang skall säjas att inverkan av antiglobulin-koncentrationen på reak- tionens känslighet är mindre kraftig i det fall då man på- visar ett viralt antigen, såsom HBS-antigen, eftersom i detta fall yttjockleken av IgG på de röda blodkropparna, som tjänar såsom reagens, uppskattas vara relativt stor. 447 933 35 _ Man använder exempelvis ett antiglobulin med antihuman-IgG- verkan, som uppvisar en titer av minst 128 enligt Coombs, i ren form eller ringa utspätt. I praktiken användes en späd- ning av antiglobulinet, som uppvisar den såsom optimal be- stämda koncentrationen med avseende på känsligheten av de andra kända analysförfarandena, speciellt med avseende på Coombs-testet, som baserar sig på hämagglutination.

I bägaren inkuberas därefter den enligt steg b) erhållna sus- pensionen av blodkroppar med antiglobulinet, varvid bägaren under denna antiglobulin-inkubation eventuellt hålls i rörel- SG. d) I anslutning till denna inkubation företas en centrifuge- ring; denna måste utföras under noggrant reglerade betingel- ser, eftersom vid denna centrifugering vidhäftníng inträder eller ej, allt eftersom de röda blodkropparna är positiva eller negativa.

Såsom har förklarats i exempel l skall antiglobulin-inkuba- tionen vara mycket kort. Man påbörjar därför centrifugeringen inom några sekunder upp till något tiotal sekunder efter in- förandet av reaktíonsmediet, som består av en suspension av de röda blodkropparna och antiglobulinet, i bägaren, d.v.s. efter en tidsrymd som har varit tillräcklig för att besätta resp. koppla fortfarande i ringa utsträckning förekommande, på bägarens botten fixerad IgG (IgG 23) eller vid blodkrop- parna bundet IgG (IgG 25) med antiglobulinets antihuman-IgG- Ig-molekyler, om motsvarande förutsättningar är givna.

Vid denna centrifugering roteras bägaren omkring en axel 2la, som är vinkelrät mot bägarens rotationsaxel 2lb, varvid centrifugeringen sker i två steg eller tidsintervall resp. faser: I det första steget fördelas reaktionsmediet över ytan av bägarbottnen 22 och anlagras där, så att alla komplex av röda 447 933 36 _ - blodkroppar och IgG, om sådana har bildats, eller alla genom inkubationen med anti-D-testserumet icke förändrade röda blod- kroppar ligger eller står mot det IgG som har fixerats på plastmaterialet, genom att man utnyttjar en första centrifu- geringshastighet V1, vars talvärde icke räcker till för att transportera de röda blodkropparna till spetsen 30 av bäga- rens botten.

Såsom framgår av ovangivna allmänna betraktelser väljs has- tigheten V1 i denna första centrífugeringsfas på sådant sätt att den härigenom alstrade centrifugalhastigheten Fdl är tillräckligt hög för att upphäva eller nedbryta de ospeci- fika bindníngskrafterna FNS, som kvarhåller de röda blod- icke , kropparna vid bägarens botten. De röda blodkropparna anlagras följaktligen och befinner sig i en position, som eventuellt möjliggör att antiglobulinets antihuman-IgG-molekyler utbil- dar en brygga mellan vid plastmaterialet fixerat human-IgG och vid de röda blodkropparna bundet human-IgG. Denna alga- ringsfas möjliggör också att antihuman-IgG-molekyler, som redan är fast bundna med komplexen av positiva röda blod- kroppar och IgG, anordnas över de fortfarande till förfogande stående IgG-ställena på plastmaterialet, d.v.s. i en gynnsam position för att utbilda fullständiga molekylbryggor mellan plastmaterial och röda blodkroppar.

Den första centrifugeringshastigheten V1 bibehålles dessutom under en tillräckligt lång tid så att, om så erfordras, dessa molekylbryggor mellan plastmaterial och röda blodkroppar ut- bildas och fullständigas; dessa bryggor består av en kedja med följande bindningar: Plastmaterial + IgG 23/antíglobulin 27/IgG 25/positiva blod- kroppar ZH.

I praktiken utföres reaktionen i en bägare, som uppvisar en öppningsvinkel hos konen av l20°; den första centrifugerings- fasen utföres med en acceleration av cirka 200 g under cirka 447 933 37 ° 1 minut. e) Härpâ följer en andra centrifugeringsfas, som utföres vid en hastighet V2, som är större än hastigheten V1. Genom denna andra centrifugeringsfas kan man skilja mellan positiv och negativ reaktion. Hastigheten V2 völjs på så sätt att den alstrade centrifugalkraften drar de negativa röda blodkroppar- na, om sådana är närvarande, till spetsen 30 av bägarens bot- ten, där de samlas resp. sammanklumpas (fig. lüb). Hastig- heten ör emellertid icke tillräcklig för att transportera de positiva röda blodkropparna, som förblir bundna vid bägarens vägg och närmare bestämt med hjälp av IgG 23, antihuman-IgG- molekylerna 27 och IgG 25 (fig. lßa). Hastigheten V2 väljs så- ledes på så sätt att den-genom denna centrifugering alstrade centrifugalhastigheten Fda uppvisar en intensitet som är större än summan av de ospecifika bindningskrafterna FNS, som kvarhåller en negativ röd blodkropp på bägarens botten, men änddock är mindre än summan av ospecifika bindníngskrafter och specifika bindningskrafter FNS + FS, som fasthâller en positiv röd blodkropp vid bägarens botten.

I praktiken utför man centrifugeringen, om denna reaktion genomföras i en bägare med en vertikalvinkel av l20°, i denna andra fas med en acceleration av cirka 1600 g och detta under en tidsrymd av från några sekunder upp till något tiotal sekunder.

Analysresultaten framgår omedelbart vid avslutad reaktion.

Vid en positiv reaktion, d.v.s. då de analyserade röda blod- kropparna verkligen uppvisar antigen-D-aktivitet, förblir alla komplex 26 av röda blodkroppar och IgG bundna vid bäga- rens botten och närmare bestämt via antihuman-IgG-molekyler 27 (fig. lﬂa) och human-IgG 23. Vid betraktande av bägaren utmed dess axel 2lb (högra sidan av fig. lüa) konstarerar man ett homogent monoskikt av röda blodkroppar, som är fördelade över bägarbottnens hela yta; vidhäftning föreligger. 447 953 38 Om de analyserade röda blodkropparna däremot icke uppvisar någon antigen-D-aktivitet transporteras de under loppet av den andra centrifugeringsfasen till spetsen 30 av bägarens botten och ihopklumpas där. Om man nu betraktar bägaren utmed dess axel så konstaterar man i detta fall bildningen av ett mikrosediment 31, som består av röda blodkroppar (högra sidan av fig. lUb); man har således icke uppnått någon vidhäftning.

De använda mängderna av reagensen är icke kritiska. I en bäga- re med en diameter av l - 7 mm inför man exempelvis en vätske- volym av 15 - 250 ul, varvid med fördel lika stora volymer av suspensionen av röda blodkroppar och av antiglobulin an- vändes.

Det nyss beskrivna förfarandet, vid vilket man undersöker huruvida antigen-D-enheter är närvarande på röda blodkroppar eller ej, kan användas under samma betingelser i syfte att undersöka huruvida serum eller plasma från ett blodprov från människa innehåller anti-D-specifika antikroppar. I detta fall inkuberas det serum som skall analyseras med testblod- kroppar, som uppvisar den kända antigen-D-specifiteten; om det serum som skall analyseras innehåller antikroppar med anti-D-specifitet kopplas de av detta serum tillhandahållna immunoglobulinerna med anti-D-specifik antikroppsverkan med de röda blodkropparnas antigen-D-enheter.

De på detta sätt inkuberade röda blodkropparna tvättas där- efter med fördel och införes i behållaren, såsom beskrivits ovan, och då samtidigt med antiglobulinet; därefter utföres samma centrifugeringssteg som har beskrivits ovan.

Om reaktionen är positiv, d.v.s. om det serum som skall ana- lyseras i själva verket innehåller anti-D-specifika anti- kroppar, så utbildas ett homogent monoskikt av röda blod- kroppar, som häftar fast vid ytan av bägarens botten till följd av utbildningen av molekylbryggor med konfigurationen plastmaterial + IgG/anti-IgG/IgG/röda blodkroppar. Om däremot 447 935 39 - det serum som skall analyseras icke innehåller nâgra anti-D- specifika antikroppar så är reaktionen negativ och blodkrop- parna, som icke har kunnat fås att näfta fast vid bägarens botten, återfinnes vid slutet av reaktionen i form av ett mikrosediment i bägarens spets.

Förfarandet har ovan beskrivits för det fall man önskar undersöka huruvida röda blodkroppar uppbär antigen-enheter D eller om i plasmat eller serumet av ett blodprov antikroppar med anti-D-specifitet är närvarande; förfarandet kan även ut- nyttjas för undersökning eller påvisande av godtyckliga andra erytrocytära antigener eller godtyckliga andra antikroppar i plasmat från ett blodprov. Om undersökningen utföres med av- seende på ett bestämt erytrocytärt antigen så ínkuberas de blodkroppar som skall undersökas med avseende på om de verk- ligen uppvisar antigenaktivitet med ett testserum, som inne- håller den kända specifika antikroppen till det sökta anti- genet. Om man vill veta om plasmat från ett blodprov inne- hållet en bestämd antikropp inkuberas omvänt detta serum med kända testblodkroppar, som uppvisar den antigen-aktivitet som motsvarar den sökta antikroppen.

Dessa testblodkroppar kan vara röda blodkroppar, som uppbär antigen-enheter, som är specifika för den sökta antikroppen.

Man kan även använda celler av annan beskaffenhet eller lämp- liga partiklar, exempelvis plastpartiklar, celler eller såda- na partiklar på vilka de för den sökta antikroppen specifika antigen-enheterna har bundits i förväg.

Därefter utföres de övriga stegen på ovan beskrivet sätt ge- nom att man eventuellt modifierar de olika arbetsparametrarna exempelvis parametrarna för centrifugeringen, så att vidhäft- ning eller icke-vidhäftning kan påvisas.

Det andra exemplet på användningen av förfarandet enligt upp- finningen kan även utnyttjas för undersökningar av godtyck- liga typer av cellulära antigener, exempelvis ett antigen som 447 933 ÄO bärs av lymfocyterna eller också blodplättantigen, genom att man på motsvarande sätt väljer beskaffenheten av de olika reagensen, d.v.s. testserum, immunoglobuliner, som fixeras vid bägarens botten, och antiglobulin.

Detta andra exempel på förfarandet enligt uppfinningen kan utföras i modifierad form, såsom beskrives närmare nedan. Det rör sig åter om det fall då det gäller att påvisa om de röda blodkropparna från blodprov från människa uppvisar antigen-D- aktivitet eller ej. a) Såsom vid den tidigare beskrivna varianten består det första steget däri att den koniska bottnen av plastbägaren prepareras på så sätt att den beskiktas eller överdrages med human-IgG, d.v.s. med immunoglobuliner av samma djurart och tillhörande samma immunokemiska klass som de i näste steg använda antigen-D-specifika antikropparna. b) Därefter utföres, såsom tidigare, i en annan bägare än analysbägaren en inkubation av de röda blodkroppar som skall analyseras och som är suspenderade i en lämplig fysiologisk lösning med ett testserum, som innehåller antikroppen med känd anti-D-specifitet (anti-D-testserum). De med testserumet inkuberade röda blodkropparna tvättas därefter lämpligen med fysiologisk lösning. c) Därefter inkuberas, fortfarande utanför analysbägaren, de på så sätt förbehandlade röda blodkropparna med ett anti- globulin, d.v.s. med ett animaliskt immunserum, som tillhanda- håller anti-human-IgG-immunoglobulin. Denna inkubation ut- föres vid sedvanliga temperaturbetingelser, exempelvis vid 2000 och under en tidsrymd som är tillräcklig för att största möjliga antal eller åtminstone en hög procentuell andel av de vid de röda blodkropparna bundna IgG-molekylerna (i det fall då de röda blodkropparna är positiva) skall kopplas med antihuman-IgG-molekylerna. En dylik inkubation har med fördel en varaktighet av 20 minuter. e. 447 933 H1 - Det använda antiglobulinet användes med fördel i hög koncent- ration, av samma skäl som redan beskrivits ovan. I förelig- gande fall arbetar man med ett antiglobulin, som uppvisar en Coombs~titer av minst 128 och som är utspätt eller ringa ut- spätt, d.v.s. i ett spädningsförhâllande av 1:2 eller lzü. d) Vid slutet av denna inkubationstid införes reaktionsmediet som består av en suspension av röda blodkroppar och anti- 8 globulin, i bägaren, vars botten är beskiktad resp. överdra- gen med human-IgG. e) Därefter sker genast en första centrifugering, varvid bä- garen roterar omkring en axel, som är vinkelrät mot dess ro- tationsaxel. Denna centrifugeringsfas utföres vid en hastig- het V1, som är tillräckligt hög för att blodkropparna skall anlagras på ytan av bägarens botten men som icke är till- räcklig för att upphäva de ospecífika bindningskrafter medelst vilka de röda blodkropparna, så väl de negativa som de posi- tiva, är bundna vid bägarens vägg. Hastigheten V1 väljs på så sätt att intensiteten av den alstrade centrifugalkraften är mindre än summan de ospecifika bindningskrafterna FNS. Denna första centrifugeringshastighet bibehålles under en tidsrymd som är tillräcklig för att molekylkedjorna, bestående av ett vid bägarens botten fixerat human-IgG, en anti-human-IgG- molekyl och ett human-IgG, som är kopplat specifikt till en antigen-D-enhet hos en röd blodkropp, skall kunna utbildas; denna tid väljs i förväg med hänsyn till beskaffenheten av det undersökta antigenet eller antikroppen. I föreliggande fall sker centrifugering med en acceleration av cirka 200 g under cirka l minut. f) Därefter sker en andra centrifugering, såsom vid den första utföringsformen.

Närmare bestämt ökas centrifugeringshastigheten till ett värde V2, som väljs på så sätt, såsom redan förklarats ovan, att intensiteten av den alstrade centrifugalkraften är till- 447 933 H2 _ ~ räcklig för att förflytta de blodkroppar som är bundna vid bägaren endast via ospecifika bindningskrafter, d.v.s. de negativa blodkropparna, till bägarens spets men så att inten- siteten icke är tillräcklig för att förflytta blodkropparna med antigen-D-funktion till spetsen; d.v.s. intensiteten är icke tillräcklig för att upphäva summan av ospecifika bind- ningskrafter FNS å ena sidan och specifika bindningskrafter FS å andra sidan, medelst vilka de positiva röda blodkrop- parna kvarhålles vid bägarens lutande vägg, närmare bestämt till följd av de utbildade molekylbryggorna plastmaterial + human-IgG/antihuman-IgG/anti-D-human-IgG-antigen D från en blodkropp.

Man noterar samma resultat som har erhållits tidigare: om reaktionen är positiv inträder en vidhäftning och man konsta- terar vid betraktande av bägaren utmed dess rotationsaxel ett homogent monoskikt av röda blodkroppar, som är fördelade över bägarens botten. Är däremot reaktionen negativ så inträ- der icke någon vidhäftning och man konstaterar i spetsen av bägarens botten ett mikrosediment.

Denna andra utföringsform skiljer sig från den ovan beskriv- na första utföringsformen fram för allt därigenom att anti- globulin-ínkubationen, d.v.s. inkubationen av de röda blod- kroppar som i förväg har inkuberats med testserumet och av antihuman-IgG-molekylerna icke företas i den med human-IgG belagda bägaren omedelbart före den första centrifugerings- fasen utan utanför denna bägare och att det därvid erhållna reaktionsmediet då först införes i bägaren och där centri- fugeras. Vid man härvid eftersträvar är en maximal assymetri mellan den procentuella andel av antihuman-IgG-molekyler som har reagerat med de vid plastmaterialet bundna eller fixerade human-IgG-molekylerna, och den procentuella andel anhuman- IgG-molekyler, som har reagerat med de vid de röda blodkrop- parna bundna human-IgG-molekylerna. Det ideala tillståndet uppnås om 0% av de vid plastmaterialet fixerade human-IgG- molekylerna är upptagna av antihuman-IgG-molekyler resp. har 447 933 H3 - kopplats med dessa och då största möjliga procentuella andel human-IgG~molekyler, som är bundna vid de röda blodkropparna, är upptagna av antihuman-IgG resp. har kopplats med dessa, under förutsättning att detta maximum ligger under det värde som framkallar en direkt agglutination av de röda blodkrop- parna med varandra via anti-IgG-molekylerna.

Det är nämligen sannolikt att den maximala känsligheten hos vidhäftningsreaktionen uppnås då i början av anlagringen av de röda blodkropparna vid ytan av bägarens botten, d.v.s. i början av den första centrifugeringsfasen, en maximal asymme- tri uppnås av fördelningen av de vid de båda möjliga kopplings- ställena bundna anti-IgG-molekylerna, d.v.s. vid plastmateria- let fixerat IgG och vid de röda blodkropparna bundet IgG; denna assymetri är så riktad och har sådan beskaffenhet att kopplingsstället med den mindre yttjockleken med avseende på IgG har den större procentuella andelen anti-IgG-molekyler bundna. I det fall som avses i detta exempel är kopplings- stället (eller kopplingsänden) med den mindre yttjockleken med avseende på IgG den röda blodkroppen och plastmaterialet uppvisar en större yttjocklek med avseende på IgG, eftersom dessa immunoglobuliner här har fixerats eller bundits till mättnadsgraden har uppnåtts.

En dylik antiglobulin-inkubatíon betecknas såsom "asymmetrisw' medan den vid den första utföringsformen ovan beskrivna anti- globulin-inkubationen betecknas såsom symmetrisk, eftersom i sistnämnda fall de båda IgG-kopplingsställena samtidigt bringas i kontakt med antiglobulinet.

I det fall då det gäller att identifiera erytrocytära eller cellulära antigener eller antikroppar kan man med hjälp av en asymmetrisk antiglobulin-inkubation utanför den analys- bägare i vilken immunovidhäftningsreaktionen äger rum uppnå en 10- 100-faldigt högre känslighet än i de fall då en symmetrisk antiglobulin-inkubation utföres. 447 933 H4 _ - Denna andra utföringsform, vid vilken man arbetar med asym- metrisk antiglobulin-inkubation, användes således företrädes- vis fram för allt för sådana reaktioner som kan karaktäriseras såsom svårartade, d.v.s. för reaktioner som karaktäriseras av ett mycket litet antal immunoglobulin-Ig, exempelvis IgG som är bundna vid blodkropparna; detta kan vara resultatet av en mycket liten mängd av en bestämd antikropp, som skall identi- fieras i det analyserade serumet, eller av en mycket ringa yttjocklek av ett cellulärt antigen på de blodkroppar som skall analyseras.

Förfarandet med asymmetrisk antiglobulin-inkubatíon kan även användas i syfte att fastställa om ett serum innehåller anti- kroppen med anti-D-specifitet. I detta fall låter man inkube- ra det serum som skall analyseras med röda testblodkroppar, som uppvisar den kända antigenektiviteten D, och förfar där- efter vidare på ovan beskrivet sätt.

Förfarandet kan även utnyttjas i syfte att identifiera andra erytrocytära antigener än antigen D och helt allmänt i syfte att identifiera alla typer av cellulära antigener, exempelvis lymfocytära antigener eller blodplättantigener; reagensen är delaktiga i immunovidhäftningsreaktionen och parametrarna för centrifugeringen anpassas därvid på lämpligt sätt till det analyserade serologiska systemet. På analogt sätt kan detta förfarande även användas för identifiering av alla typer av antikroppar, som förekommer i plasmat eller serumet från ett blodprov.

I det ovan beskrivna exemplet på förfarandet enligt upp- finníngen, tillämpat på ídentífieringen av erytrocytära eller cellulära antigener eller av antikroppar, som förekommer i plasmat från ett blodprov, omfattade den centrifugering med vilken förekomsten av vidhäftning eller icke-vidhäftning på- visas två faser, varvid den andra fasen genomfördes vid högre centrifugeringshastighet än den första fasen. 447 933 H5 .

Enligt en modifikation kan man vid centrifugeringen arbeta med en enda acceleration, som är lämplig att åtminstone momentant anlagra alla kroppar, exempelvis röda blodkroppar, vid väggen av behållarens botten, varvid talvärdet för denna accelera- tion är sådant att bland dessa partiklar endast sådana, om de över huvudtaget är närvarande, långsamt och i tilltagande ut- sträckning befrias från väggen och uppsamlas i spetsen av be- hållarens botten som icke kan häfta fast vid väggen av be- hållrens botten, eftersom icke några molekylkedjor kan ut- bildas bestående av ett vid plastmaterialet bundet immunoglo- bulin, en molekyl av antiglobulinet och ett immunoglobulin bundet vid en blodkropp. I detta fall hålles accelerationen i den enda centrifugeringsfasen något ovanför det värde som motsvarar den genomsnittliga nivån för upplösning av de ospe- cifika bindningskrafterna, som binder så väl de kroppar som utmärker en negativ reaktion som de kroppar som utmärker en positiv reaktion, varvid dessa ospecifika bindningskrafter är de enda krafter som kvarhåller de för en negativ reaktion ka- raktäristiska kropparna. Eftersom accelerationen resp. hastig- heten vid centrifugeringen är ringa anlagras alla kroppar vid bägarens botten under en tidsrymd som är tillräcklig för att de molekylbryggor som kan utbildas skall kunna fullbordas; utvecklingen och fullbordandet av dessa molekylbryggor för- löper snabbare än frigörandet av de kroppar som är karaktä- ristiska för en negativ reaktion. Om denna centrifugerings- hastighet bíbehålles under en tillräckligt lång tid frigörs gradvis alla de kroppar, om sådana är närvarande, som icke kan häfta fast vid bägarens botten, eftersom några molekylbryggor icke kan utbildas, gradvis från väggen till bägarens botten och samlas i spetsen, medan alla blodkroppar, som utmärker en positiv reaktion, förblir vidhäftade vid väggen till behålla- rens botten, eftersom de molekylbryggor har bildats som kan uppstå.

När det gäller att påvisa antigen-D-aktivitet hos de röda blodkropparna från ett blodprov från människa uppgår accelera- tionen i denna enda centrifugeringsfas till cirka 250 g och 447 933 H6 _ - denna acceleration bibehålles under virka H00 sekunder, då analysen utföres i en bägare med en lutningsvínkel av 1200 hos konen.

Med hänvisning till fig. 16 - 18 beskrives nu tre olika centrifugeringsdiagram, som kan användas vid ovan beskrivna reaktioner för identifiering av erytrocytära antigener eller antikroppar. I vart och ett av dessa diagram är den använda centrifugalkraften, uttryckt i g avsatt utmed ordinatan och centrifugeringsförloppets varaktighet i sekunder utefter abskissan, varvid immunovidhäftningsreaktionen har utförts i en bägare, vars koniska botten uppvisar en lutningsvinkel av 12o°.

Det första diagrammet (fig. 16) motsvarar det fall då en symmetrisk antiglobulin-inkubation har utförts. Vid tidpunk- ten O, d.v.s. efter avslutad tillsats av reaktionsmediet be- stående av en suspension av röda blodkroppar och antiglobulin till bägaren, underkastades detta en låg centrifugerings- hastighet, i föreliggande fall H g, genom att bägaren rotera- de omkring en axel vinkelrätt mot dess rotationsaxel. Denna fas I omfattar de första 15 sekunderna och är en antiglobulin- inkubationsfas; hastigheten är icke tillräcklig för att på något sätt åstadkomma en snabb avsättning och anlagring av de röda blodkropparna på bägarens botten. Eventuellt kan härvid samtidigt reaktionsmediet i bägaren hållas i rörelse.

Därefter ökas snabbt centrifugalaccelerationen till ett värde under det genomsnittliga värde vid vilket uteslutande de ospecifika bindningskrafterna FNS upphävs. Om denna genom- snittliga nivå ligger vid ett värde 230 g, såsom var fallet i föreliggande exempel, där ett blodprov från människa under- söktes med avseende på om antigen-D-aktivitet var närvarande på de röda blodkropparna, så inställs accelerationen på 200 g.

Från den 15:e till den 30:e sekunden förlöper en fas II, i vilken de röda blodkropparna vandrar mot bägarens botten, var- vid samtliga blodkroppar har nått bägarens botten i den 30:e 447 933 H7 - sekunden.

Centrifugalaccelerationen hålls vid 100 g upp till den 60:e sekunden. Härigenom avgränsas en fas III från den 30:e till den 60:e sekunden, i vilken fas de röda blodkropparna anlag- ras vid bägarens botten; i denna fas kan de molekylbryggor uppstå som kan utbildas mellan plastmaterial och röda blod- kroppar och i den 60:e sekunden är praktiskt taget alla möj- liga molekylbryggor närvarande.

Därefter höjs snabbt centrifugeringshastigheten upp till ett sådant värde att summan av de ospecifika bindningskrafter medelst vilka endast de negativa röda blodkropparna hålls fast vid bägaren upphävs; naturligtvis måste centrifugal- accelerationen ligga under det värde vid vilket man uppnår ett upphävande av summan av de specifika bindningskrafterna och de ospecifika bindningskrafter medelst vilka de positiva blodkropparna hålls bundna vid plastmateríalet. I föreliggan- de fall inställdes accelerationen på 1600 g. Den sista fasen IV är följaktligen en fas, i vilken de ospecifika bindnings- krafterna upphävs, om blott dessa håller fast de röda blod- kropparna vid plastmaterialet; samtidigt ihopsamlas eller agglutineras i denna fas de befriade röda blodkropparna.

Centrifugeringsförloppet avbryts definitivt i den Büze sekun- den.

Samma centrifugeringsdiagram kan med endast en liten modifi- kation tillämpas på det förfarande då man arbetar med asym- metrisk antiglobulin-inkubation. I detta fall bortfaller anti- globulin-inkubationsfasen eller -steget I i bägaren under rörelse, eftersom antíglobulin-inkubationen företas utanför bägaren mellan i förväg med testserumet inkuberade röda blod- kroppar - eller med testblodkroppar inkuberat serum, som skall analyseras - och antoglobulinet. Efter avslutad asymmetrisk antiglobulin-inkubation införes reaktionsmediet i bägaren och centrifugeras då omeldelbart en första gång med en accelera- tion av 200 g. 447 933 us _.

Ett annat sätt att centrifugera, vilket kan användas på reak- tionen för identifiering av erytrocytära antigener av anti- kroppar, visas i diagrammet enligt fig. 17.

Såsom i diagrammet enligt fig. 16 sker centrifugering fram till 15:e sekunden med en mycket ringa acceleration, i före- liggande fall med H g, under den symmetriska antiglobulín- inkubationsfasen eller -steget I; eventuellt hålls bägaren samtidigt i rörelse under denna inkubation.

I den 15:e sekunden ökas snabbt centrifugalaccelerationen, i detta fall emellertid till ett värde, som ligger strax över det värde som motsvarar den genomsnittliga nivån för upphävande av enbart de ospecifika bindningskrafterna. Denna genomsnittliga nivå beräknas i detta fall till 230 g och has- tigheten inställes därför på 250 g. Från den 15:e till den 30:e sekunden förölper fas II, i vilken de röda blodkropparna avsätts; i den 30:e sekunden har samtliga blodkroppar nått bägarens botten. Eftersom accelerationen här hålls vid 250 g, d.v.s. strax ovanför det genomsnittliga värde vid vilket de ospecifika bindningskrafterna upphävs följer här omedelbart på fasen.II, vari blodkropparna avsätts, en fas III, i vilken de ospecifika bíndningskrafterna långsamt och försiktigt upp- hävs, om endast en röd blodkropp är bunden till plastmateria- let via dessa bindningskrafter och dessa röda blodkroppar tillgör den del av blodkropparna som utmärker den negativa reaktionen och som har åtminstone ospecifika bindningskrafter.

I denna fas ihopsamlas således samtidigt de befriade cellerna långsamt med tilltagande hastighet. Hastigheten för denna hopsamling är utomordentligt låg, så att omedelbart efter det steg i vilket de röda blodkropparna avsätts dessa förblir anlagrade på bägarens botten under en tillräckligt lång tid för att de molekylbryggor som kan utbildas kan uppstå; ut- vecklingen av molekylbryggorna förlöper snabbare än cellerna befrias från väggen. Eftersom centrifugalaccelerationen genom- gående hålls vid 250 g har efter en viss tidsperiod alla mole- kylbryggor uppstått som kan utbildas, medan de icke specifikt 447 933 H9 ~ vid bägarens botten bundna röda blodkropparna gradvis fort- sätter att befrias från väggen. Denna fas III varar relativt lämge och avbryts exempelvis i den HlO:e sekunden.

Den här använda metoden för att utlösa blodkropparna från väggen är så varsam att de erhâllna'resultaten är utomordent- ligt känsliga. Metoden är speciellt väl lämpad för reaktioner, vid vilka svaga bindningar mellan röda blodkroppar och plast- material spelar en roll.

Diagrammet enligt fig. 18 motsvarar ett centrifugeringsförlopp som regleras eller styrs såsom en funktion av utvecklingen av de förlöpande reaktionerna. Förfarandet utföres samtidigt i en bägare, i vilken analysen av provet företas, och å andra sidan i en bägare, i vilken en negativ kontrollreaktion ut- förs; denna kontrollbägare belyses vid varje roterat varv under centrifugeringen med en stroboskop-blixt.

Principen för denna styrning är analog med den princip som ovan har utvecklats för påvisandet av antigen HBS. Den för- storade bilden av bottnen hos den bägar i vilken den negativa kontrollreaktionen förlöper filmas med en TV-kamera och ana- lyseras, exempelvis en gång per sekund. Ytan och opaciteten den bild av mikrosedimentet som bildas vid den negativa kontrollreaktionen jämförs med ytan och opaciteten hos mikro- sedimentet från en negativa regerensreaktion av samma typ, som har utförts i förväg.

Diagrammet i fig. 18 motsvarar ett centrifugeringsprogram, som användes vid en reaktion för identifiering av erytrocy- tärt eller cellulärt antigen eller av antikroppar, varvid den genomsnittliga nivån för upphävandet av de ospecifika bind- ningskrafterna enbart motsvarar en acceleration av H50 g.

Detta diagram för ett styrt centrifugeringsprogram kan till- lämpas på ett serologiskt system, vars särdrag i förväg icke är kända, framförallt icke den genomsnittliga nivån för upp- hävande av de ospecifika bindningskrafterna. 447 933 so _.

Vid detta förfarande tillämpas en symmetrisk antiglobulin- inkubation. I detta fall hålls centrifugalaccelerationen vid H g upp till den 15:e sekunden, d.v.s. vid ett alltför lågt värde för att någon som helst avsättning och avlagring av blodkroppar eller celler på bägarens botten skall kunna ske.

Detta är antiglobulín-inkubationsfas I, under vilken even- tuellt bägaren dessutom hålls i rörelse. ' I den l5:e sekunden ökas accelarationen snabbt till 200 g.

Från den 15:e fram till den 30:e sekunden sjunker cellerna eller blodkropparna till bägarens botten (fas II) och fram till den 60: sekunden sker en anlagring av cellerna eller blodkropparna på bägarens botten (fas III), under vilken fas molekylbryggor uppstår, som kan utbildas mellan bägarens bot- ten och cellerna eller blodkropparna.

Vid slutet av anlagringsfasen, d.v.s. i den 30: sekunden, ökas accelerationen med lO0 g och hålls under 30 sekunder vid 300 g (fas IV). I den 90: sekunden sker en mätning av ytan och opaciteten hos mikrosedimentet från den negativa kontrollreaktionen och dessa mätningar jämföres med värdena för mikrosedimentet från den negativa referensreaktionen; om mätdata för yta och opacitet hos kontrollmikrosedimentet ligger under motsvarande data för referensmikrosedímentet, så ' betyder detta att accelerationen om 300 g icke är tillräcklig för att upphäva resp. bryta de ospecifika bindningskrafterna.

Accelerationen ökas således en ytterligare gång med 100 g och accelerationen om ÄOO g bibehålls under 30 sekunder (fas V).

I den l20:e sekunden uppmäts ånyo yta och opacitet hos kontrollmikrosedimentet och erhållna mätdata jämföres med motsvarande data för referensmikrosedimentet: i föreliggande fall, vid vilket den genomsnittliga nivån för upphävande av de ospecifika bindningskrafterna ligger vid H50 g, ligger mätdata för ytan och opaciteten hos mikrosedímentet från den negativa kontrollreaktionen efter centrifugeringen vid H00 g fortfarande under motsvarande mätdata för referensmikrosedi- 447 933 51 - mentet, eftersom de röda blodkropparna från den negativa kontrollreaktionen, vilka är bundna vid bägaren via ospeci- fika bindningskrafter, icke har kunnat befrias från bägarens vägg.

Accelerationen ökas således en ytterligare gång med 100 g och uppnår nu värdet 500 g (fas VI). Efter 30 sekunder, d.v.s. i den l50:e sekunden, företas en ytterligare mätning av yta och opacitet hos míkrosedimentet från den negativa kontrollreak- tionen; mätdata jämföres med motsvarande mätdata för referens- mikrosedimentet. I föreliggande fall har nu den genomsnitt- liga nivån för upphävande av de ospecifika bindningskrafterna överskridits, så att man vid den negativa kontrollreaktionen erhåller ett mikrosediment, vars yta och opacitet åtminstone år lika ytan och opaciteten hos referensmikrosedimentet. Den fas eller det steg vari de ospecifika bindningskrafterna en- bart upphävs och samtidigt de utlösta eller befriade blod- kropparna ihopsamlas börjar således med den l20:e sekunden.

Centrifugalaccelerationen hålls vid 500 g under ytterligare en period och centrifugeringen avbryts slutligen när ytan och opacitet hos mikrosedimentet från den negativa kontrollreak- tionen motsvarar en mängd avcentrifugerade röda blodkroppar som är helt representativ för en verklig eller äkta negativ reaktion; i föreliggande fall avbryts centrifugeringsförloppet slutligen i den 330:e sekunden.

Tröskelvärdena för en positiv reaktion och en negativ reak- tion bestäms på samma sätt som har beskrivits ovan med hän- visning till förfarandet för påvisande av HBS-antigen.

Utgör således den andel röda blodkroppar i ett mikrosediment, som uppvisar en äkta negativ reaktion, såsom framgår av för- försök, 12% och uppgår standardavvikelsen till 3% så ligger tröskelvärdet för en äkta negativ reaktion, såsom ovan an- givits, vid 18% röda blodkroppar, som har hopsamlats till ett mikrosediment, medan tröskelvärdet för en positiv reaktion motsvarar en andel om 6% röda blodkroppar, hopsamlade till 447 933 52 _ - mikrosediment.

Förfarandet enligt uppfinningen möjliggör slutligen kvanti- tativ bestämning av ett bestämt erytrocytärt eller cellulärt antigen eller en bestämd antikropp, som skall påvisas. Ytan och/eller opaciteten hos det erhållna mikrosedímentet är näm- ligen beroende av den mängd antigen eller antikropp som är närvarande i det analyserade mediet. Det räcker således att jämföra den uppmätta ytan och/eller opaciteten hos i en posi- tiv reaktion bildat sediment med motsvarande värden som har erhållits för en serie kontrollprodukter eller med en i för- väg fastställd kalibreringskurva för att man skall erhålla den i mediet för-handen-varande mängden antigen eller anti- kropp.

Detta andra exempel på användningen av förfarandet kan även, analogt med det första exemplet, utföras under samma centri- fugeringsbetingelser med prover, i vilka erytrocytära eller cellulära antigener eller antikroppar med olika specifitet och av olika beskaffenhet skall påvisas.

Såsom förklarats ovan är nämligen möjligheten för de röda blodkropparna att avcentrifugeras eller utlösas endast be- roende av bägarbottnens lutning. Man utväljer därför för varje reaktionstyp den bägare som uppvisar den för den ifråga- varande reaktionen bäst lämpade lutningen, så att vid ett utvalt accelerationsvärde endast de celler eller partiklar avcentrifugeras som utmärker en negativ reaktion.

Claims

447 933 53 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för analys av ett biologiskt medium för att påvisa eller identifiera virusantigener eller erytrocyt- eller cellantigener eller -antikroppar i mediet, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att immunoglobulinerna Ig i den immunokemiska klassen X innefattande klasserna A och G och från en djurart I, dvs. immunoglobuliner IgX I, fixeras på väggen av en behållare, som uppvisar en på en symmetriaxel i behållaren belägen konvergenspunkt; att en reaktionsblandning innehållande ett prov av det biologiska medium som skall anlyseras och ett företrädesvis koncentrerat antiglobulin (d.v.s. en lösning av molekyler, som kommer från en från djurarten I skild djurart II och är antikroppar mot IgX I, i det följande betecknade anti-IgX I) behandlas i behållaren under sådana betingelser att anti-IgX I-molekylerna bindes till IgX I-molekylerna och sålunda bildar molekylbryggor mellan behållarväggen och de i blandningen suspenderade cellerna eller partiklarna med sammansättningen vägg-IgX I- anti-IgX I-IgX2I-cell/partikel, varvid cellens/partikelnš eventuella bindning till behållarytan påverkas direkt, när analyten ingår i den immunologiska bíndningen mellan cell- ytan/partikelytan och anti-IgX I-molekylen, eller indirekt genom en sterisk inhibering av sistnämnda immunologiska bindning, när analyten är ett antigen som bindes till de på cellerna/partiklarna fixerade antigenspecifika antikrop- parna, och att såväl vid direkt som indirekt påverkan denna bindning utgör ett mått på halten av antigen/antikropp i provet: att behållaren under noggrant reglerade betingelser utsättes för en acceleration i sin symmetriaxels riktning, vilken acceleration är tillräcklig för att förorsaka att de celler eller partiklar, som inte är bundna vid väggen medelst molekylbryggor, samlas vid behâllarens spets, men inte är tillräcklig för att bryta de förefintliga molekylbryggorna: och att behållaren undersökes för bestämning av närvaron av en mikrobeläggning av celler eller partiklar som samlats vid dess spets och indikerar frånvaron av det sökta antigenet J* 447 933 54 . ' eller antikroppen.

2. giskt medium, såsom blodplasma, för att påvisa eller identi- Förfarande enligt patentkravet l för analys av ett biolo- fiera virusantigener i mediet, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att ett prov av det biologiska medium som skall analyseras inkuberas utanför behållaren med en suspension av celler eller partiklar, på vilka IgX I redan har fixerats, varvid detta IgX I specificiteten hos har utvalts på grundval av antikropps- immunoglobulinerna mot det virusantigen som skall påvisas: en reaktionsblandning som innehåller den sålunda inkuberade suspensionen av celler eller partiklar och det angivna koncentrerade antiglobulinet underkastas i be- hållaren en centrifugalkraft som är parallell med axeln, varigenom centrifugering genomföres med en första accelera- tion för bildning av molekylbryggor mellan alla cellerna eller partiklarna och behållarens koniska vägg, som är täckt med IgX I, och sedan avbrytes centrifugeringen medan ytterligare anti-IgX I-molekyler reagerar med IgX I-molekyler och bryter de molekylbryggor som bildats med celler eller partiklar, som inte bär det antigen som skall påvisas, under det att närvaron av sådant antigen hindrar tillträdet för sådana ytterligare anti-IgX I-molekyler och sålunda brytningen av molekyl- bryggorna, varefter centrifugering fortsättes med en andra acceleration för uppsamling vid behållarens spets av endast de celler eller partiklar, om sådana är närvarande, som inte är bundna vid behållarväggen medelst molekylbryggor som bil- dats av anti-IgX I-molekylerna.

3. d ä r a v, att man avbryter centrifugeringen under en sådan Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t tidsrymd att man ifråga om en negativ reaktion, d.v.s. en med ett prov, som icke innehåller något viralt antigen, genomförd reaktion, erhåller en mättnad av de på de mot varandra lig- gande ytorna av behållarvägg och celler eller partiklar bundna IgX I-molekylerna med avseende på anti-IgX I-molekylerna. 447 953 55 .

4. Förfarande enligt patentkravet 2 eller 3, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man tvättar suspensionen av celler eller partiklar efter inkubationen utanför behållaren med det biologiska medium som skall analyseras med en fysio- logisk koksaltlösning.

5. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 4, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man använder en lösning av anti- Igx I-molekyler med en titer av minst 128 enligt Coombs' metod, ren eller utspädd i ett förhållande av 1:2 eller 1:4.

6. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 5, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man samtidigt i behållaren in- 'för suspensionen av celler eller partiklar, som har inkube- rats i förväg med det biologiska medium som skall analyseras och lösningen av anti-IgX I-molekyler.

7. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 5, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man i behållaren först inför suspensionen av celler eller partiklar, som i förväg har inku- berats med det biologiska medium som skall analyseras, och därefter lösningen av anti-IgX I-molekyler.

8. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 7, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man före den första centrifuge- ringsfasen inkuberar komponenterna i reaktionsmediet, d.v.s. den redan med provet inkuberade suspensionen av celler eller partiklar och lösningen av anti-IgX I-molekyler, under en tidsrymd som är högst lika med den tidsrymd under vilken 10% av de vid cellerna eller partiklarna bundna eller vid behål- larväggen fixerade IgX I-molekylerna har reagerat med anti- IgX I-molekylerna.

9. Förfarande enligt patentkravet 8, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att reaktionsmediet under denna inkubation hålls i rörelse. 447 933 se _.

10. Förfarande enligt patentkravet 8 eller 9: k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man inkuberar under några se- kunder upp till något tiotal sekunder.

11. ll. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 10, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att accelerationen i och varaktigheten av varje centrifugeringssteg, d.v.s. första fasen, avbrott och andra fasen, bestäms i förväg och mot- svarar den acceleration och varaktighet för vilka de bästa resultaten uppnås under samma betingelser hos reagensen vid en negativ referensreaktion, d.v.s. att i slutet av det första centrifugeringssteget eller -fasen praktiskt taget 100% celler eller partiklar häftar fast vid behållarväggen, att i slutet av avbrytandet av accelerationen en tillräcklig mättnadsgrad med avseende på anti-IgX I-molekyler har uppnåtts vid de IgX- molekyler som är bundna vid de mot varandra liggande ytorna av cellerna eller partiklarna och behållarväggen så att vid- häftningen av cellerna vid behâllarväggen åter upphävs och en utlösning och hopsamling av cellerna i behållarens spets under den andra centrifugeringsfasen har ägt rum.

12. - Förfarande enligt patentkravet ll, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v, att tidpunkten för avbrytandet av den andra centrifugeringsfasen bestäms automatiskt genom att förfaran- det samtidigt utföres för det första i en behållare, vari provanalysen utföres, och för det andra i en behållare, i vilken en negativ kontrollreaktion utföres, varvid bilden av kontrollbehållarens botten med regelbundna intervall under den andra centrifugeringsfasen avbildas och analyseras, och att den andra centrifugeringsfasen definitivt avbryts när bilden av kontrollbehâllarens botten motsvarar cirka 18% celler eller partiklar samlade i behâllarens spets.

13. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 12, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att det används för på- visande av det virala antigenet HBS i ett blodprov från människa. 447 933 57 . '

14. Förfarande enligt patentkravet 13, k ä n_n e t e c k n a t d ä r a v, att man utför analysen i en behållare, vars bot- ten är konisk och uppvisar en vinkel vid spetsen av l20°, att man utför den första centrifugeríngsfasen med en accele- ration av 200 g från den 15:e till den 60:e sekunden efter införandet av reaktionsmediet i behållaren, vilket reaktions- medium består av den i förväg med det för analys avsedda pro- vet inkuberade suspensionen av celler eller partiklar och lös- ningen av anti-IgX I-molekyler, och att man avbryter centri- fugeringen från den 60:e upp till den 300:e sekunden efter införandet av reaktionsmedíet i behållaren samt att man vid den andra centrifugeringen arbetar med en acceleration av 500 g under HO sekunder.

15. Förfarande enligt patentkravet l för analys av blod för att påvisa eller identifiera cellulära antigener (eller anticellulära antikroppar) i blod, k ä n n e t e c k n a t därav, att en suspension av bloderytrocyter under analys inkuberas med ett testserum (eller också inkuberas den blodplasma som skall analyseras med en suspension av test- erytrocyter) under sådana betingelser att IgX I fixeras på erytrocyterna och ett reaktionsmedium som innefattar suspen- sionen av sålunda inkuberade blodkroppar och det angivna kon- centrerade antiglobulinet underkastas i behållaren en centri- fugalkraft som är parallell med behållarens symmetriaxel under sådana betingelser att anti-Igx I-molekylerna kan bindas med IgX I och sålunda bilda molekylbryggor mellan de erytrocyter - som bär IgX I och behållarväggen under medverkan av anti-IgX I-molekyler, varvid centrifugeringen genomföres så att erytrocyterna temporärt fastnar på behållarväggen så att molekylbryggorna kan bildas och att de enda erytrocyter som samlas vid behållarens spets, är de, om sådana är närvarande, som inte bär IgX I.

16. Föpfapande enligt patentkravet 15, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v, att den suspension av blodkroppar som skall analyseras (eller suspensionen av testblodkropparna) tvättas 447 953 med en fysiologisk lösning efter det att de har inkuberats utanför behållaren med ett testserum (eller med plasmat från det blod som skall analyseras).

17. Förfarande enligt patentkravet 15 eller 16, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man använder en lösning av anti-IgX I-molekyler, som uppvisar en títer av minst 128 en- ligt Coombs och då i ren eller utspädd form i ett utspäd- ningsförhållande av 1:2 eller lzü.

18. Förfarande enligt något av patentkraven 15 - ll, k ä n n e t e c k n a t d ä r a V, att man samtidigt och skilda från varandra i behållaren inför de båda komponen- terna i reaktionsmediet, d.v.s. suspensionen av blodkroppar och lösningen av anti-IgX I-molekyler. '

19. Förfarande enligt något av patentkraven 15 - 17, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att man i behållaren först inför den i förväg inkuberade suspensionen av blod- kroppar och därefter lösningen av anti-IgX I.

20. Förfarande enligt patentkravet 18 eller 19, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man före centrifugeringen i be- hållaren inkuberar de båda komponenterna i reaktionsmediet, d.v.s. den i förväg inkuberade suspensionen av blodkroppar och lösningen av anti-IgX I-molekyler, under en tidsrymd som högst är lika med den tidsrymd under vilken 10% av de vid blodkropparna eller behållarväggen bundna IgX I-molekylerna har reagerat med anti-IgX I-molekylerna.

21. Förfarande enligt patentkravet 20, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v, att man håller reaktionsmediet i rörelse under denna inkubation.

22. - Förfarande enligt patentkravet 20 eller 21, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man utför ínkubationen under en 447 933 59 ~ tidsrymd av från några sekunder upp till några tiotal sekun- der.

23. - Förfarande enligt något av patentkraven 15 - 17, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att man inför reaktions- blandningen i centrifugeringsbehållaren först efter det att suspensionen av blodkroppar har inkuberats utanför behålla- ren med lösningen av anti-IgX I-molekyler och att man omedel- bart efter införandet av reaktionsblandningen i behållaren utför centrifugeríngen.

24. Förfarande enligt patentkravet 23, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v, att man inkuberar suspensionen av blod- kroppar och lösningen av anti-IgX I-molekyler under cirka 20 minuter.

25. Förfarande enligt något av patentkraven 15 - 24, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att man centrifugerar vid tvâ olika accelerationer och närmare bestämt vid en första acceleration, vid vilken alla blodkroppar anlagras vid be- hållarväggen, och vid en andra högre acceleration, vid vil- ken endast de blodkroppar som icke kan förbli fasthäftade vid behållarväggen hopsamlas i behållarens spets.

26. - Förfarande enligt något av patentkraven 15 - 24, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att man centrifugerar på så sätt att man uppnår en enda acceleration som är lämplig att åtminstone momentant anlagra alla blodkroppar vid be- hållarväggen, och dessutom så att bland dessa blodkroppar endast sådana, om de är närvarande, som icke kan häfta fast vid behâllarbottnens vägg långsamt och i tilltagande utsträck- ning utlöses resp. avcentrifugeras från denna vägg och hop- samlas i behâllarens spets.

27. - Förfarande enligt patentkravet 25 eller 26, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man för automatisk bestämning av det slutliga avbrytandet av centrifugeringen utför för- 447 933 60 . ' farandet samtidigt och under lika betingelser å ena sidan i en behållare, vari analysen av det för undersökning avsedda provet utföres, och å andra sidan i en behållare, vari en för kontroll tjänande negativ reaktion utföres, att man av- bildar och analyserar det vid kontrollreaktionen bildade mikrosedimentet med regelbundna intervall och att centrifuge- ringen slutligen avbryts när analysen av mikrosedimentet från' kontrollreaktionen visar att cirka 18% blodkroppar har sam- lats i behållarens spets.

28. Pörfarande enligt något av patentkraven 15 - 24, k ä n n e t e c k n a t d ä r a v, att man styr eller reg- lerar centrifugeringen såsom en funktion av de reaktioner som är igång, att förfarandet utföres samtidigt och under samma betingelser å ena sidan i en behållare, vari man utför ana- lys av provet, och å andra sidan i en behållare, vari en negativ kontrollreaktion utföres, att man med regelbundna intervall avbildar och analyserar bilden av det mikrosediment som bildas vid den negativa kontrollreaktionen, att man jäm- för tillväxtkurvan för detta mikrosediment och för mikro- sedimentet från en negativ referensreaktion med varandra och att man styr tiden och hastigheten vid centrifugeringen på så sätt att tillväxtkurvan fördetanalyserade mikrosedimen- tet motsvarar tillväxtkurvan för referensreaktionen. l

29. Förfarande enligt patentkravet 28, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v, att man definitivt avbryter centrifugerin- gen när analysen av mikrosedimentet från den negativa kon- trollreaktionen visar att cirka 18% blodkroppar har samlats i behållarbottnens spets.

30. - Förfarande enligt patentkravet 28 eller 29, k ä n n e - t e c k n a t d ä r a v, att man utför analysreaktionen i en behållare med konisk botten och en lutningsvinkel av 1200 efter det att blodkroppssuspensionen har inkuberats med lös- ningen av anti-IgX I, att man roterar behållaren, som inne- håller reaktionsblandningen, omkring en axel, som är vinkel- 447 933 61 _- rät mot konens axel, med en mindre acceleration än den vid vilken de blodkroppar som utmärker en negativ reaktion av- centrifugeras från behâllarbottnens vägg, att man bibehåller denna acceleration under H5 sekunder, att man därefter jämnt ökar centrifugalaccelerationen var 30:e sekund med ett värde om 100 g, att man i slutet av varje tidsrymd om 30 sekunder analyserar det vid den negativa kontrollreaktionen bildade mikrosedimentet till dess analysen motsvarar en procentuell andel av de blodkroppar som är samlade i behållarens spets som åtminstone är lika med den procentuella andel som har uppnåtts för den negativa referensreaktionen.

31. Förfarande enligt patentkravet 25, k ä n n e t e c k - n a t d ä r a v, att man vid utförande av analysreaktionen utför centrifugeringen i en behållare med konisk botten och en lutningsvinkel av l20° efter det att suspensionen av blod- kroppar har bringats till inkubering med lösningen av anti- IgX I-molekylerna genom att man roterar behållaren kring en axel, som är vinkelrät mot axeln av den koniska behållar- bottnen, med en acceleration av 200 g, som bibehålles under H5 sekunder och att man därefter snabbt ökar centrifugal- accelerationen upp till 1600 g och slutligen avbryter centri- fugeringen efter det att man har uppnått den tidpunkt vid vilken för en under samma betingelser genomförd negativ kontrollreaktion den procentuella andel av de blodkroppar som är samlade i behâllarens spets åtminstone är lika med den procentuella andel som definierar tröskelvärdet för en nega- tiv reaktion.