JPS62500049A - ヒトｔ↓−細胞白血病ウイルスタイプ３の検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトＴ−細胞白血病ウィルスタイプ■の検出概括的説明 本発明は、少菫のＨＴＬｖ−ｍ　（エイズ）の検出及び測定のための酵素結合免 疫測定法である０この測定方法は、エイズヒトウィルス抗体（ｉ（ＴＬＶ−１１ １抗体）を含むことが予想されるヒト試験血清を、不溶性イムノソルベントに結 合したＨＴＬＶ−１［１ウイルス蛋白質と共に培養することを包含する。ＨＴＬ Ｖ−ｆｆｌ蛋白質に結合したヒト免疫グロブリンの童は、最初に該ヒト抗体をヒ ト免疫グロブリンに対精製ヒト免疫グロブ！ｊ　７　（Ｉｇ）からなる複合体と の反応によって決定される０ヒトＩｇＶｉＨＴＬＶ−１抗原に特異的に結合する 。試験血清の存在そして測定は、ペルオキシダーゼ呈色反応を形成するために、 ペルオキシダーゼ酵素と反応する水素ペルオキシダーゼ溶液の添加によシ決定さ れる。

本発明において、ペルオキシダーゼに結合した免疫グロブリンがヒト免疫グロブ リンであることは、特筆される。

証拠は、下記の事項に基づいて、ＨＴＬＶ科のレトロウィルスが後天性免疫不全 症候群（エイズ）の病因であるということを示唆する＝（１）免疫不全の原因に 関し動物のレトロウィルスの前例がある（ネコのネコ白血病ウィルス）　：　（ ２１ＨＴＬＶ科のレトロウィルスはＴ−細胞向性である：（３）それらは“ヘル パー″Ｔ−細胞（ＯＫＴ４＋）を優先的に感染させる；（４）それらは、融合細 胞の形成を誘発することによシ示される様な、様々なヒト及び補乳類の細胞に細 胞変異効果を有する；（５）それらはある種のＴ−細胞の機能を変化させること ができる：（６）ある場合には。

感染は選択的にＴ−細胞を殺す結果を生じる：及び（７）それらは、親密な接触 によりまたは血清製剤を通して伝染される。感染した細胞ＨＴＬＶの細胞膜抗原 に導かれた抗体の存在は、エイズの患者の４０係以上の血清中に示さく１９８３ ））。この抗体は以来ＨＴＬＶのエンベロープの一部として定義されて来た。

ウィルスＨＴＬＶ分離物の最初の検出及び分離は、二つのより早期の開発により 可能となった：インターロイキン２（Ｉｔ−２）とも呼ばれ、正常の及び腫瘍性 の成熟Ｔ−細胞の異なる小部分の一定の選択的成長を可能にしたＴ（１９７７年 ）　（Ｒｕｓｃｅｔｔｉ　、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１１ ９　：ズ　オブ　ザ　ユナイテッドステイッ　オプ　アメリカ。

第７７巻：第６１３４頁（１９８０年）　（Ｐｏｉｅｓｓ、ａｔ　ａｌ　、。

び逆転写酵素測定に基づいたレトロウィルスの検出のための鋭敏な測定法の開発 。ＨＴＬＶ分離及び伝達の方法は。

ウィルスに対して許容性のＴ−細胞を使用しての共培養方法を含んでいた。共培 養実験での正常なヒトＴ−細胞の使用は、いくつかの標的細胞に対する不朽化（ 形質転換）性をもった両方のサブグループのＨＴＬＶｉ優先的に生じた０ これらの発見の開示は、ガロ等（Ｇａｌ　ｌｏ、ｅｔ　ａｌ　、　）　、米国特 許第５ｅｒｉａｌＡ６０２．？　４５号％１９８４年４月２３日出願、及びガロ 等、米国特許第５ｅｒｉａｌＡ６０２，９４６号。

１９８４年４月２３日出願中に見られる。同様の８考文献は、ボボビック等、１ エイズ及び前エイズ患者からの細胞変性レトロウィルス（ＨＴＬＶ−■）の検出 １分離及び連続産生、＃サイエンス、第２２４巻：第４９７頁、１９８４年５月 ４日号（Ｐｏｐｏｖｉｃ　、　ｅｔ　ａｌ、、−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　、　Ｉ　 ５ｏｌａｔｉｏｎ　、　ａｎｄＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ几ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴＬＶ−ｍ）　ｆｒ ｏｍ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ　ａｎｄ　Ｐｒｅ　−プバッハ等 、“エイズに関連したヒ）Ｔ−向リンパ性レトロウィルス（ＨＴＬＶ−ｆ［［） のサブグループの血清学約分４日号（５ｃｈｕｐｂａｃｈ、ｅｔ　ａｌ、、”Ｓ ｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ａ　Ｓｕｂｇｒｏｕｐ　ｏｆ　 Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（ＨＴ Ｌ’Ｖ−ｍ　）Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡＩＤＳ、　”　５ｃｉｅｎ ｃｅ　、２２４：５０３．Ｍａｙ４．１９８４）：及びサルンガドハラン等、１ 工イズ患者の血清中のヒ）Ｔ−向リンパ性レトロウィルス（）［ＴＬＶ−１［Ｉ 　）と反応する抗体“、サイエンス、第２２４巻：第５０６頁、１９８４年５月 ４日号（Ｓ　ａｒｎｇａｄｈａｒａｎ　。

ｅｔ　ａｌ、、”　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　凡ｅａｃｔｉｖｅ　ｗｉｔｈ　）（ ｕｍａｎ　Ｔ　−Ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　几ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　（Ｉ ＩＴＬＶ−１［１）ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｅｒｕｍｏｆ　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔ ｈ　ＡＩＤＳ、−８ｃｉｅｎｃｅ、２２４：５０６．Ｍａｙ４．１９！３４）テ ある。ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ　ライ＃　スｉ　ｆｃ　ハＨＴＬＶ−Ｂｌ　抗体の検出 、分離及び精製のその他の方法は、ガロ等、米国！ｐ！ｊ許第５ｅｒｉａ１４６ ５５．６１０号、１９８４年７月３０日出Ｈ及Ｕ　ウ＃　ツク−、Ｘ　ター＃Ｗ 　（Ｗｏｎｇ−８ｔａａｌ　、　ｅｔ　ａｌ、）。

米国特許第５ｅｒｉａｌＡ６４　！１，５０６号、１９８４年８月２２日出願に 開示されている〇 発明の要約 本発明は、後天性免疫不全症候群（エイズンの治療剤へと導く発見におけるもう 一つの段階であるＯさらに本社の酵素量と呼ばれる謎で使用され、そして好まし い童は免疫物質に加え得る適度な過剰磁のペルオキシダーゼを使用することであ るとｂうことは興味深い。

方法のうちのＩｇ酸成分、利用できる工ｇ抗体例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、　ＩｇＥ 、ＩｇＧ及びＩｇＭから選択される。方法のための好ましい温度は、冷却状態、 そして具体的には１℃またはおよそ１℃である。）ないし５０℃の範囲が許容さ れる。好ましいべ・【、オキシダーゼは、西洋ワサビのペルオキシダーゼである 。ペルオキシダーゼのＩｇｔたはガンマグロブリンに対する好ましい比は５：１ である。

材料の情報開示 シュテルンベルガー、イムノサイトケミストリー。

１非標識抗体酵素法”ルードビイヒ　プレンティス　ハル、１９７４年、第１２ ９−１７１頁（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ　。

Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、”　Ｔｈｅ　Ｕｎｌａｂｅｌｅｄ 　Ａｎｔｉｂｏｄｙ動物への使用に適当であシそして抗ペルオキシダーゼに結合 したペルオキシダーゼを使用するシュテルンベルガーの方法の改良である。ヒト ＰＡＰ試薬は、ヒトにペルオキシダーゼで免疫性？与えることを必要とするから このヒトＰＡＰ試薬は入手できないためにとの方法は動物の試織したヒ）ＩｇＧ に代える◇特に第２図全参照せよ。

マギオ（編集ン、エンザイムーイムノアッセイ、シイアールフイ　プレス社、第 ４４頁以下（１９８０年）イ、ヒストケミ、サイトケミ１．第２２巻、第１０８ ４頁（シ カンプリング（ベルオキダーゼー標識免疫グロブリン）の方法を開示しているが 、しかしＨＴＬＶ−［に対する抗体の検出の方法全開示していない。

クルスターク（編集）、パイラル　イムノダイアグツシス、アカデミツク　プレ ス社、第３−３０頁（１９７４年）Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、、ｐｐ、　５−５（Ｊ 　（１９７４ツノは、様々なイＡ／ベルオキダーゼ法全開示し、その方法の様子 を示している０ サラ七等（Ｓａｓｓｅ、’ｅｔ　ａｌ　）　、米国特許第４，２３５，９６０号 は競合的、二抗体酵素結合免疫測定法を開示している。

詳細な開示 本発明のＨＴＬＶ−１ｌｌ測定方法において、ＨＴＬＶ−１［１抗体に特異的に 結合する抗ヒト免疫グロブリンは、固体イムノクルベント試験細片に前もって結 合したエイズウィルス抗体を含有することが予想されるヒト試験血清に添加され る。試験血清１ｃ結合した免疫グロブリンの盆は、ベルくン オキダーゼで標識したヒト免疫グロブリンを試験細片と共に培養する酵素免疫測 定法により測定される。ＨＴ　Ｌ　Ｖ−■の埴は、　ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原に前 もって結合し、抗ヒト免ゼ複合体の貸を測定することによりめられる。上記した 方法の好ましい方法論を実施例１に開示し、及び第２図に示した。

最初の免疫グロブリン、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、　ＩｇＤ、　ＩｇＥまたはＩｇ Ｍは、好ましくはヤギから調製される０その他の動物の抗ヒト免疫グロブリンが 使用されて良く９例えばウサギ、ハムスター、ニワトリ、ラット、テンジクネズ ミ、ヒツジ、ウマまたはマウスを使用しても良い◎これら免疫グロブリンは市販 され利用できる◇ヒト免疫グロブリン／ペルオキシダーゼ複合体は。

ＨＴＬＶ−■抗原が検出及び測定され得るａ鷹である。この複合体は、好ましい 実施態様においては精製したヒト免疫グロブリン及びペルオキシダーゼを化学的 に結合することによシ形成できる・この複合体の１！製の一方法は。

る■西洋ワサビのペルオキシダーゼは、暗褐色の鉄−ボ％Ｆｅ・から成る）、高 純度にｎ製された結晶形で市販され利用できる０最初の段階で、ＨＲＰの反応性 のアミノ基ヲシニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）でのアルキル化によジブロ ックする。ブロックされたＨＩ（、Ｐ−を次に、　ＮａＩＯ４及びＨ２０（１） Ｈ８）の連続添加によって過沃素酸切断によりカップリングに対して活性化し５ 次に免疫グロブリン−ＮＨ，（ｐＨ８）を添加し１次に免疫グロブリ：ｙ−ＮＨ ２及びＮａＢ）ｆ４（水素化硼素）を添加する。生成物はＩｇＧ−ペルオキシダ ーゼ複合体である。このカップリング方法はよく知られ、一般に利用されている けれども１本発明は。

その他のカップリング方法を使用しても良いｏＩｇＧが好ましいけれども、　Ｉ ｇＡ　、　ＩｇＤ　、　ＩｇＥまたはＩｇＭ全使用しても良い。

本発明において使用されるイムノソルベント試験細片は不溶性でＨＴＬＶ−ｉ１ １抗原に結合することができる０この免疫吸着剤は不溶性の表面として存在し、 玉状のアガロース、炭水化物例えばデキストラン、セルロースまたはニトロセル ロース、プラスチック例えばボリスチ１／ン。

ポリカーボネート、ポリプロピレンまたはポリアミドまたは無機物質例えばガラ スまたはシリカゲルであって良い。ＨＴＬＶ−１１［抗原ｌ″ｉ、化学的にイム ノソルベントに結合されるか、またはイムノソルベントの表面上ＫＭ覆されても 良い。

本発明は、二つの異なる目的のために、免疫グロブリンの４？異的結合性を利用 する◎最初の目的は、標識抗体法においてと同様である：すなわち、免疫グロブ リンは。

研究中の組織の抗原の選択的な局在化のための試薬として使用される◇し７か（ −ながら、免疫グロブリンを標識することによりこの反応を視覚化することの代 わシに、視覚化を第二回目に結合する特異的免疫グロブリンを使用して行なうが 、この時免疫グロブリン上に結合している酵素は、適当な組織化学的基質により 検出可能である〇特異的な順序での免疫グロブリンの二重の使用は、免疫グロブ リンの二価性に依存している。

色形成剤は１色を生じるためのペルオキシダーゼ標識されたヒト免疫グロブリン と反応させる色原体試薬であって良い◇好ましい試薬は、過酸化水素及びジアニ シジンを含有する。通常使用されるその他の色原体試薬は５０−フェニレンジア ミン％ｐ−フェニレンジアミン５５−アミン・−サリチル酸、ピロガロール及び 類似の溶液例えばジアミノニーベンジジン、他である０ＨＴＬＶ−ｉｌｌ抗体を 測定する方法は。

ａ）球状、細片状、板状または試験くぼろ状であっても良い不溶性イムノソルベ ント。

ｂ）　ＨＴＬＶ−７１抗体に結合できる抗ヒト免疫グロブリン。

Ｃ）　上記の抗ヒト免疫グロブリンに結合することができる。べＡ・オキシダー ゼで標識されたヒト免疫グロブリン。

ｄ）ペルオキシダーゼとの反応に適した色形成剤または色原体試薬、及び Ｃ）色原体試薬との接触の後にベルオキシダ・−ゼの活性を測定する手段 によシ特徴づけられる試験キット内に組み入れても良い０図面の説明 第１図は、エイズと予想される患者から採取された異なる試験血清中のＨＴＬＶ −ＩＩＩの同定を表わす。

第２図は５本発明を説明する概要図を表わす〇実施例１ ＨＴ　ＬＶ　−１抗原の同定は％１９７２年ないし１９７５年に集めたウガンダ 人の血清により行なった〇ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体全試験した試料の吸光度（ａｂ ｓｏｒｂａｎｃｅｖａｌｖｅ）を標準正常対照血清に対する比率で表し、そして 正常な供血者の〔（平均値＋２標準偏差）　−１０：］　（（：ｍｅａｎ＋２ｓ ｄ）−２，０〕より大きい比率値を有する試料は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（１スラブ に対し２００ｕｇのウィルス、１２チアクリルアミド）によって分離され、そし て１５℃及び３０Ｖで一晩エレクトロブロッティングにようニトロセルロースシ ートに移された主なＨＴ　ＬＶ−ＩＩＩウィルスのバンドに関し陽性の反応性を 要求する確認試Ｍ金行なった０シートを細片に切り、そして１１０２　％メルチ オレートラ含有する５％非脂肪乾燥ミルク中に１：４００で希釈されたヒト試験 血清と共に４℃で１６時間培養した。該細片を洗浄緩衝液。

０．５％デオキシコレート、ａ５％トリトンＸ−１００及び１ｍＭ７ｚニル−、 メチル−、スルホニルフルオリト（ＰＭＳＦ）を含有するＰＢＳで洗浄した。次 に該細片を緩衝液１．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、α２ＭＮａＣ４，α３％トリトン Ｘ−１００，２ＴＮＩ／−牛血清アルブミン及び４％正常ヤギ血清を含有する２ ０ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，５中に１：４００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ　 Ｆｃ　フラグメント（カベル　ラプス）　（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂｓ　）と共に 室温で１時間培養した。該細片を上記の様罠洗浄し、そして０．５チツィーン− ２０及び５％正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中で西洋ワサビの反応を、１１０２ ％過酸化水素及び００２５％ｏ−ジアニシジンを含有するｚｓｓＭ）！ＪスｐＨ １５中で培養することによシ発現させた０第１図のパネル（Ａ）及び（Ｂ）は、 連続した実験で試験された３９の異なる血清を示す□細片は、上昇するスクリー ニングの比率の順に左から右へ並べている：レーン番号は、ニトロセルロースプ ロット内の細片の最初の位置に関するロレーンＡ１及びＢ１は、正常対照ヒト血 清を含む；Ａ２及びＢ２は、エイズ患者からの陽性対照血清を含む〇 １１６１０１２２２３２０６１３７１９５１７１５１４１１２１４９旧８２１６ １７２１１９７１８２６４１３１５２０９　’５５１４１２１１　Ｅ３１０２ご Ｖ　克；Ｒ知７１ル（へ・ＩＶ−耘し７−ろ′□τ鉗０戯′）特０←灸ハフ゛Ｏ ７じ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗原に結合したエイズウイルス抗体を抗ヒト免疫グ ロブリンと共に培養し、 （ｂ）ベルオキシダーゼー標識したＩｇを添加し、（ｃ）色形成剤を添加し、ペ ルオキシダーゼと反応させ、そして （ｄ）該ペルオキシダーゼの活性を測定することにより、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体 の量を間接的に測定する、ことを特徴とする、存在するヒトＴ−細胞白血病ウイ ルスタイブＩＩＩに対する抗体の量を決定するために測定する方法。
2. ２．ａ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を不溶性固体イムノソルベントに結合し、 ｂ）抗ヒト免疫グロブリンを該抗体と反応させ、ｃ）該抗体に結合している該抗 ヒト免疫グロブリンを、さらにベルオキンダーゼ−標識したヒト免疫グロブリン と反応させ、該ヒト免疫グロブリンは該抗ヒト免疫グロブリンに特異的に結合し ており、 ｄ）色形成剤を添加し、該ペルオキシダーゼと特異的に反応させ、 ｅ）該試験溶液中に存在するＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体の量を間接的に測定するため に、ベルオキシダーゼの活性を測定する、 ことを特徴とする、試料溶液中に存在するヒトＴ−細胞白血病ウイルスタイプＩ ＩＩに対する抗体の量を決定するために測定する方法。
3. ３．抗ヒト免疫グロプリンが、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ，及びＩｇＭか ら成る免疫グロブリンの群から選択される一つであることを特徴とする請求の範 囲第２項記載の方法。
4. ４．該免疫グロプリンが、動物の免疫グロブリンであることを特徴とする請求の 範囲第３項記載の方法。
5. ５．該不溶性固体イムノソルベントが、玉状のアガロース、炭水化物例えばデキ ストラン、セルロースまたはニトロセルロース、プラスチック例えばポリスチレ ン、ポリカーボネート、ポリプロピレンまたはポリアミド及び無機物質例えばガ ラスまたはシリカゲルから成る群の一つから選択されることを特徴とする請求の 範囲第２項記載の方法。
6. ６．ａ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を含有すると予想される試料溶液または既知のＨ ＴＬＶ−ＩＩＩ特異性を示す抗体を、イムノソルペントと該抗体が該イムノソル ペントに結合するようにな条件で接触させ、 ｂ）抗ヒト免疫グロブリンを、該免疫グロブリンが該抗体に結合するような条件 で該イムノソルベントに結合した該抗体に添加し、 ｃ）ベルオキシダーゼ−標識したヒト免疫グロブリンを、該ヒト免疫グロブリン が該抗ヒト免疫グロブリンに結合するような条件で該イムノソルベントに添加し 、ｄ）該ペルオキシダーゼと特異的に反応する色形成剤を添加し、そして ｅ）該試験溶液中に存在する該ＨＴＬＶ抗体の量を間接的に測定するために、色 形成剤と反応したペルオキシダーゼの活性を測定する、 ことを特徴とする、試料溶液中のヒトＴ−細胞白血病ウイルスタィブＩＩＩ（Ｈ ＴＬＶ−ＩＩＩ）の量を決定する方法。
7. ７．ａ）球状、細片状，板状または試験くぼみ状であっても良い不溶性イムノソ ルベント、 ｂ）ＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体に結合できる抗ヒト免疫グロブリン、Ｃ）上記の抗ヒ ト免疫グロプリンに結合することができる、ペルオキシダーゼで標識されたヒト 免疫グロブリン、 ｄ）ベルオキシダーゼとの反応に適した色形成剤または色原体試薬、及び ｅ）色原体試薬との接触の後にペルオキシダーゼの活性を測定する手段 により特徴づけられるＨＴＬＶ−ＩＩＩ抗体を測定する試験キット。