JP2945074B2

JP2945074B2 - 改良ウエスタンブロッティング法

Info

Publication number: JP2945074B2
Application number: JP2119648A
Authority: JP
Inventors: エマーソン・ダブリュ・チャン; ウイリアム・ジェラルド・ロビイ; ワーナー・シュルズ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1989-05-09
Filing date: 1990-05-09
Publication date: 1999-09-06
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: AU5474290A; AU637097B2; JPH0328765A; CA2016313C; DE69027812T2; ATE140540T1; ES2091777T3; US5356772A; KR900018680A; EP0397129A3; EP0397129B1; CA2016313A1; DE69027812D1; EP0397129A2

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、複数の抗原を単一の固体支持体上に同時に
移動させることを含む改良イムノアッセイ法に関する。
本発明に用いる抗原は天然に存在するものでもよいしま
たは組換え法により製造したものでもよく、種々の電機
泳動ゲル上で精製してよい。本発明は、特に、HIV−１
またはHIV−２ウイルスに感染した患者における該HIV−
１またはHIV−２ウイルスに対する抗体を検出すること
の可能な本質的に純粋な抗原性ポリペプチドを用いた、
極めて高感度の多成分アッセイを提供するのに有用であ
る。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）ヒトの免疫系は、種々のウイルス抗原に対して抗体を
産生することによりウイルスの感染に応答する。抗体の
数および産生される各異なる抗体の量は、ウイルスおよ
び抗体応答を引き起こすウイルス抗原に依存する。

現在のイムノアッセイシステムは、ウイルス感染をモ
ニターするのに有用であることがわかっている。たとえ
ば、部分的に精製したウイルス溶解液を用いたイムノア
ッセイを利用してHIV−１またはHIV−２感染をモニター
することができる。残念ながら、これらの溶解液は不つ
り合いな量の種々の抗原を含んでいるかまたは重要な抗
原性ポリペプチドを欠いているかもしれない。これらの
欠失は、アッセイの感度と選択性の両方に悪影響を及ぼ
す。HIVウイルスの場合、ウイルス溶解液は、経膜ペプ
チドであるgp41および外エンベロープタンパク質である
gp120を欠いているかもしれない。

ウイルス溶解液はまた、望ましくない免疫学的に反応
性の細胞成分、抗原の凝集物および分解された抗原断片
を含んでいること、およびグリコシル化の度合の異なる
抗原ペプチドを有するために満足のいくものではない。
これらの不可避的な外部要因が、ウイルス溶解液をゲル
上で分離するときに精製の問題を生じさせる。というの
は、分離能が全く理想的とはいえないからである。分離
能が理想とは程遠いことにより、欠失したバンド、拡散
したバンド、重複した非特異的バンドまたは多すぎるバ
ンドによって引き起こされる分離の困難さがさらに大き
くなり、ゲルをイムノブロッティング表面に移動させた
ときに解析困難な不満足なイムノブロッティングとなっ
てしまう。さらに、従来のイムノブロッティングのため
の部分的に精製したウイルス溶解液を充分な量で調製す
ることはしばしば困難であり、所望の抗原を充分な量で
提供できないことがまた精製の問題を大きくする。

ウイルス溶解液を使用することに伴う問題は、種々の
異種細胞系で所望の抗原ポリペプチドを発現させること
により部分的に解決することができる。これらの系では
組換え法を用い、これらのポリペプチド生成物を大量に
産生することのできる細胞中に目的のウイルス遺伝子を
挿入させる。この方法では、所望の抗原をしばしば充分
な量で産生させることができるが、一般に新たな不純物
および分解された抗原断片を伴う。これらの方法によっ
て産生された抗原はまた凝集物を生成し、このことは還
元剤を用いることによって最小限に抑えなければなら
ず、さもなければ凝集と分解との両方の問題を回避する
ために複数のゲルを使用する必要がある。

従来のイムノブロッティング法は、複数の抗原との反
応性について複数の試料を分析するのに用いることはで
きない。というのは、選択的で高感度のアッセイを行う
のに必要とされる充分な均一性の抗原を提供するために
多くの精製工程が必要となるからである。典型的なウエ
スタンブロッティング法は、ゴードン（Gordon）らの米
国特許第4,452,901号明細書（1984年３月18日発行）に
記載されている。該文献には、抗原ペプチドを単一のゲ
ルからニトロセルロースに移動させるのに必要な手順が
記載されている。本発明は、抗原ポリペプチドを複数の
ゲルから移動させることを開示するものである。

単一のアッセイにおいて幾つかの抗原を用いることは
すでに記載されている。リン（Lin）らのJ.Virol.59:52
2〜524（1986）には二重抗体プローブ法が記載されてお
り、これはエプスタイン・バーウイルスおよび異なるヘ
ルペスウイルスの抗原を同一のウエスタンブロッティン
グにおいて同定することができる。

単一のウエスタンブロッティングにおいて複数の検出
方法を用いることもできる。リー（Lee）らのJ.Immuno.
Methods、106:27〜30（1988）には、プローブ抗体、酵
素結合発色抗体および酵素基質を一組としてこれらを複
数回、連続的に適用して２種またはそれ以上のインター
フェロンを単一のウエスタンブロッティングで検出する
方法が記載されている。同様の結果は、異なる酵素結合
発色抗体の混合物を用いて２種以上のプローブ抗体を同
時に適用し、ついで異なる基質を連続的に加えることに
よっても得ることができる。

ゴードンらのヨーロッパ特許出願公開0063810号公報
（1982年３月11日公開）には、抗原または抗体または両
者が固体支持体に結合したイムノアッセイ装置およびキ
ットが記載されている。記載の固体支持体を使用するこ
とにより、多数の抗体−抗原反応を一つの操作で同時に
行うことが可能となる。ゴードンらは、抗原または抗体
の溶液をピペットまたはスポイトを用いて１回で、また
は連続的に加えることを記載している。好ましい態様に
おいては、抗原は、少量の抗原溶液を加えることにより
生成する極小の点（microdot）として適用する。しかし
ながら、該公報は、タンパク質の複合混合物から精製し
た抗原を用いたイムノアッセイは記載していない。

レフコビッツ（Lefkovits）のWO 87/03965号明細書
（1987年７月２日公開）には、幾つかの同時アッセイの
ための試験ストリップが記載されている。この試験スト
リップは、抗体を含浸させたニトロセルロースをストリ
ップにカッティングし、不活性なバッキング（backin
g）上に積載したものである。レフコビッツは、支持体
シートを抗原ペプチドの溶液中に浸し、ついで該シート
をストリップにカッティングすることは記載している
が、該抗原を固体支持体へ電気泳動的に移動させること
は記載していない。

（課題を解決するための手段）本発明は、試料中の少なくとも１種の生物学的に活性
な物質の存在を検出する方法であって、（ａ）該物質と免疫反応性の少なくとも１種の基質（su
bstrate）を該基質を含む少なくとも１種の不純混合物
からゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメント（segmen
t）を分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該免疫反応性の基質は該固体支
持体に有効に結合し、（ｄ）該免疫反応性の基質を有する固体支持体を少なく
とも１種の該生物学的に活性な物質を含有する試料と接
触させ、その際、該免疫反応性の物質と該免疫反応性の
基質とは結合ペアを生成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特徴とする方法；試料中の抗HIV−１抗体を検出する方法であって、（ａ）該抗HIV−１抗体と免疫反応性の少なくとも１種
の基質を該基質を含む少なくとも１種の不純混合物から
ゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該免疫反応性の基質は該固体支
持体に有効に結合し、（ｄ）該免疫反応性の基質を有する固体支持体を該抗HI
V−１抗体を含有する試料と接触させ、その際、該抗HIV
−１抗体と該免疫反応性の基質とは結合ペアを生成し、
ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特徴とする方法；および試料中の少なくとも１種の抗HIV−１抗体、抗HIV−２抗
体または抗HTLV−１抗体を検出する方法であって、（ａ）該抗HIV−１抗体、該抗HIV−２抗体または該抗HT
LV−１抗体と免疫反応性の２種以上の基質を該基質を含
む少なくとも１種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該２種以上の精製基質を含む該ゲルの２つ以上の
セグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該２つ以上のセグメントから単一の
固体支持体へ選択的に移動させ、その際、該免疫反応性
の基質のそれぞれは該固体支持体に有効に結合し、（ｄ）該免疫反応性の基質を有する固体支持体を少なく
とも１種の該抗HIV−１抗体、該抗HIV−２抗体または該
抗HTLV−１抗体を含有する試料と接触させ、その際、該
抗HIV−１抗体、該抗HIV−２抗体または該抗HTLV−１抗
体のそれぞれと該免疫反応性の基質とは結合ペアを生成
し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特徴とする方法を提供するものである。

本発明は、感染患者の血清中の特定の抗体を検出する
ために複数の組換えおよび天然の抗原を用いた方法を提
供するものであり、最大の選択性および感度を得るのに
必要な特定の抗原を選択または使用することを可能にす
るものである。

本発明は、試料中の少なくとも１種の生物学的に活性
な物質の存在を検出する方法を包含し、該方法は、不純
な混合物から２種以上の該物質と免疫反応性の基質をゲ
ル上で精製し、該精製基質を含む該ゲルのセグメントを
分離し、該ゲルセグメントから該精製基質を固体支持体
へ選択的に移動させ、その際、該免疫反応性のな基質は
該固体支持体に有効に結合し、該免疫反応性の基質を有
する固体支持体を少なくとも１種の該生物学的に活性な
物質を含有する試料と接触させ、その際、該免疫反応性
の物質と該活性な基質とは結合ペアを生成し、ついで該
結合ペアの存在を検出することによるものである。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、種々の精製の状態の抗原を組み合わせて用
いることが可能な改良ウエスタンブロッティングアッセ
イを行う方法に関する。これらの抗原は、溶液または体
液中の特定の抗体を検出するためのイムノブロッティン
グにおいて便利かつ正確に用いることができる。抗原調
製物は複合混合物としては一般に入手できるが、本発明
は、単一の抗原群を迅速に単離し、ついで不純物、凝集
物または分解された断片を含まないイムノブロッティン
グ分析のために該抗原群を固体支持体に同時に移動させ
るのに用いる方法を提供する。

従来のウエスタンブロッティング法においては、目的
の抗原混合物を、通常はドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、尿素を用い、または２−メルカプトエタノールな
どの還元剤を用いて可溶化させる。可溶化の後、該物質
をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離さ
せ、ついで該抗原を電気泳動的にニトロセルロース紙へ
移動させ、そこで該抗原は不可逆的に結合する。この方
法は、ゴードンらの米国特許第4,452,901号明細書（198
4年６月15日発行）に記載されている。

本発明においては、抗原は一般に種々のゲル上で精製
する。特定の抗原を含む所望のバンドの位置を確認し、
切り出す。該切り出したゲルをついで固体支持体上へエ
レクトロブロッティング（electroblotted）する。

本発明の改良ウエスタンブロッティング法は、優れた
選択性および感度という利点を有する。これらの改良点
は、一層多量の精製抗原を使用することにより達成する
ことができる。切り出したバンド当たり約0.5〜5.0μｇ
の推定量の抗原を適当な固体支持体上に移動させること
ができる。従って、従来のウエスタンブロッティングで
は微かな反応性しか示さない血清も、本発明を行えば強
いバンドを得ることができる。

タンパク質の電気泳動的移動により、切り出したゲル
の配列の正確なレプリカが適当な固体支持体上に得られ
る。そのような移動電気泳動図を用いた抗体アッセイ
は、非特異的タンパク質とインキュベートすることによ
り該固体支持体の残る吸着能が飽和した後に行う。電気
泳動的にブロッティングした特異的タンパク質と該支持
体の残る結合部位をブロッキングするのに用いた非特異
的なタンパク質との間で交換が起こらないので、電気泳
動的に移動させたタンパク質を用いたイムノアッセイが
可能である。結合した抗原が、残りの吸着部位をブロッ
キングするのに用いた非特異的タンパク質により妨害さ
れないことにより、一層長期間のインキュベーションが
可能となる。というのは、抗血清および指示抗体とさら
に接触させても、吸着した非特異的タンパク質との交換
などの副反応は起きないからである。

固体支持体としては、検出抗体の接近を可能にするの
に充分な表面多孔性および抗原を結合させるのに適当な
表面親和性を有するものであればいかなる物質であって
もよい。微細多孔性（microporous）構造が一般に好ま
しいが、水和状態でゲル構造を有する物質も用いること
ができる。

本発明に用いることのできる固体支持体としは、寒
天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グア
ールガム、セルロースエステル（特に硝酸およびカルボ
ン酸とのエステル）、混合セルロースエステルおよびセ
ルロースエーテルなどの天然のポリマー性炭水化物およ
びその合成的に修飾、架橋または置換した誘導体；タンパク質およびその誘導体など（架橋ゼラチンまたは
修飾ゼラチンを含む）の窒素原子含有天然ポリマー；ラテックスおよびゴムなどの天然炭化水素ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩
化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解
した誘導体、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、
ポリメタクリレート、上記重縮合物のコポリマーおよび
ターポリマー（ポリウレタンまたはポリエポキシドなど
のポリエステル、ポリアミドおよび他のポリマーなど）
を含むビニルポリマーなどの適当な多孔性構造を用いて
調製した合成ポリマー；アルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭
酸塩（硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウ
ム、炭酸マグネシウムを含む）、アルカリ金属、アルカ
リ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸
塩；クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、セオライ
ト、シリカゲル、またはガラスなどのアルミニウムまた
はケイ素酸化物または水和物などの多孔性無機物質（こ
れらの物質はまた上記ポリマー物質の充填剤としても用
いることができる）；および上記物質群の混合物またはコポリマー（すでに存在する
天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始することに
よって得られるグラフトコポリマーなど）などが挙げら
れる。

これらすべての物質はフィルム、シートまたはプレー
トなどの適当な形態で用いることができ、または紙、ガ
ラス、プラスチックフィルムまたは織物などの適当な不
活性担体上にコーティング、結合または積層させてもよ
い。

ニトロセルロースの多孔性構造は、本発明と関連して
用いられる広範囲の試薬に対して優れた吸収性能および
吸着性能を有し、好ましい支持体物質である。ナイロン
もまた同様の特性を有し、適当な支持体物質である。

固体支持体は、厚さが約0.01〜0.5mm、好ましくは約
0.1mmのシートの形態であるのが好ましい。孔径は広範
囲で変化してよく、約0.025〜15ミクロン、とりわけ約
0.15〜15ミクロンであるのが好ましい。

これら支持体の表面は、抗原または免疫グロブリンの
該支持体への共有結合を引き起こさせる化学的方法によ
って活性化することができる。しかしながら、一般に抗
原または抗体の非可逆的結合は、充分に理解されていな
い疎水性の力による多孔性物質上への吸着によっても達
成される。ニトロセルロースに基づいた好ましい支持体
は、企業であるミリポア（Millipore）社（ベッドフォ
ード、マサチューセッツ、米国）からミリポアの商品名
で販売されている。適当な支持体はまた、米国特許出願
第07/227,272号明細書（1988年８月２日出願）中にも記
載されている（該文献を参照のため本明細書中に引用す
る）。

分析することのできる抗原の数は支持体のサイズによ
ってのみ制限されるが、抗原の変化および組成は無制限
である。同様のサイズを有しているが異なるところから
単離した抗原も、異なるゲルから固体支持体の異なる領
域に移動させることができるので使用可能である。還元
−感受性または還元−依存性の抗原は、これら抗原を別
のプレパラティブゲル中に溶解することにより都合よく
扱うことができる。加えて、各抗原の量は、アッセイの
選択性および感度を最適にすべくコントロールしつり合
いをとることができる。

いかなる所望の数の抗原または抗原もしくは免疫グロ
ブリンの組合わせも単一の試験手順に含ませることがで
き、ついで単一の操作で分析することができる。本発明
は、正常では固有であるが病的状態では変化する抗体の
濃度をモニターし、または病的状態においてのみ観察さ
れる抗体を検出または定量するために用いることができ
る。

上記選択した抗原が固体多孔性支持体上に一担結合し
たら、イムノアッセイに使用可能となる前に、該支持体
を処理して多孔性物質の過剰の結合部位をブロッキング
しなければならない。このことは、抗原ポリペプチドを
含有する支持体を、非特異的タンパク質、またはそのよ
うなタンパク質の混合物、または全血清、またはこれら
成分の組合わせとともにインキュベートすることにより
行う。唯一の制限は、そのようなタンパク質はイムノア
ッセイ中の抗体または抗原のいずれをも妨害または交差
反応してはならないこと、および支持体上に存在するタ
ンパク質とは異なるものでなければならないということ
である。

これらの残る吸着部位のブロッキングはまた段階的に
行うこともできる。たとえば、予備工程において、固定
化抗原または抗体を含有する支持体をタンパク質性の物
質とともにインキュベートしてよい。そのようなタンパ
ク質はバッファー中に希釈して支持体とともにインキュ
ベートするのが都合がよい。この予備処理によってもな
お完全にブロッキングされていないタンパク質結合部位
が存在するかもしれず、これはイムノアッセイを行う前
にブロッキングしなければならない。残留する結合部位
または非特異的タンパク質の交換によるバックグラウン
ド吸着があるときは、そのような吸着はインキュベーシ
ョンをさらにブロッキング剤とともに行うことによって
防ぐことができる。これら混合物を存在させることによ
り、残留する結合部位がブロッキングされるとともに、
非特異的部位に前以て結合したタンパク質と抗体との交
換または免疫グロブリンとのあらゆる種類の非特異的相
互反応が競合により防がれる傾向がある。

抗体の検出のためのイムノアッセイにおいて、期待さ
れる抗体濃度に従い、通常はブロッキング溶液中に約1:
100〜1:10000で希釈した試料とともに室温にて約２時間
または４℃にて一夜インキュベートし、ついでバッファ
ーで洗浄して過剰の未結合抗体を除く。この支持体をつ
いで指示抗体（放射性標識した抗体、蛍光抗体、化学発
光抗体、蛍光物質を結合した抗体、または発色反応を生
成する酵素を結合した抗体）とともにインキュベートす
る。この指示抗体は、通常、ブロッキング溶液の混合物
中で希釈し、支持体とともに約２時間インキュベート
し、ついでバッファー中で再び洗浄する。

すべての種類の患者の抗体含有液（血清、血漿、脳脊
髄液、初乳、リンパ液、乳、唾液、尿または排せつ物な
ど）を本発明を用いて分析することができる。

支持体上の抗原の検出は、適当な指示抗体、補体系の
成分、または抗原−抗体反応に感受性の共役酵素系を用
いて行うことができる。この指示抗体はまた、ヒトまた
は動物免疫グロブリンと特異的に反応するあらゆる抗
体、またはIgG、IgM、IgA、IgDもしくはIgEなどの所望
の抗体クラスの１種とのみまたはそのような特異的免疫
グロブリンのあらゆる所望の組合わせと反応するクラス
特異的抗体であってよい。

指示抗体に結合した酵素は、検出試薬または反応生成
物が抗原−抗体複合体の部位に局所的に停どまる限り、
放射性生成物、化学発光生成物または蛍光生成物、可視
領域または可視領域外に特徴的な吸収または反射スペク
トルを有する生成物の生成により、位置を確認しまたは
定量することができる。結合抗原−抗体複合体を検出す
るのに補体を用いるときは、補体は上記のいずれかの方
法で標識するかまたは特異的な抗補体抗体により検出す
ることができる。

抗原を適用した後に得られるニトロセルロースシート
などの固体支持体は、脱水状態が保持されるならば、乾
燥させて周囲温度で無制限に貯蔵することができる。本
発明の支持体はまた残留する吸着部位をブロッキングし
た後に貯蔵することもでき、乾燥させたときに、防湿条
件下に低温で無制限に保持することができる。

免疫学的分析のための本発明の方法において、一般
に、抗原または免疫グロブリンを含む支持体を分析しよ
うとする試料、たとえば動物またはヒト患者または通常
の健康管理下にあるヒトからの血清または血漿と接触さ
せ、分析しようとする試料の動物種の免疫グロブリンに
向けられた指示抗体の希釈溶液または懸濁液中に浸漬
し、最後に結合した第二の抗体を視覚化する。これらの
手順は充分に簡単で迅速であり、すべての操作を約３時
間またはそれ以下で行うことができる。

本発明の免疫学的アッセイを行うのに使用することの
できる抗原群は非常に広範囲にわたり、その例として
は、ヒト生検物質、哺乳動物組織または細胞、体液、マ
イコプラズマ、後生動物の寄生体、かび、細菌、原生動
物、ウイルスまたはこれらからの調製物が挙げられる。
実施例に記載した抗原とは別に、下記のものもまた適し
ている、すなわち、インフルエンザウイルス（Ａ、A₁、
A₂、Ｂ、Ｃ型を含む）、パラインフルエンザウイルス１
型、２型または３型、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス、お
たふくかぜウイルス、Ｑ熱リケッチア、ロタウイルス
（Rotavirus）、風疹ウイルス、アデノウイルス、エプ
スタイン・バーウイルス、ブルセラウイルス、肝炎Ｂ型
ウイルス、コクサッキーB1−B6、A9ウイルス、ポリオ
１、２または３ウイルス、レオウイルス、エクソウイル
ス１−33などのウイルスまたはそれらから調製した抗
原；ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasmosa
capsulaum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioi
des immitis）、ブラストミセス・デルマチチジス（Bla
stomyces dermatitidis）、アスペルギルス・フミガー
ツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・フ
ラーブス（A.flavus）またはアスペルギルス・カルネー
（A.carnea）などのかび抗原；赤痢アメーバ（Entemeba
histolytica）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanos
oma cruzi）、単包条虫（Echinococcus granulosis）、
マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）などの寄生
体抗原；スピロヘータ・ライター（Spirochete reite
r）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidu
m）、大腸菌（Escherichia coli）、レプトスピラ属、
リステリア属、サルモネラ属、シゲラ属、スタヒロコッ
カス属、ストレプトコッカス属、レジオネラ・ニューモ
フィラ（Legionella pneumophila）などの細菌抗原；核
RNP、補体フラクション、ヒト血清タンパク質、リウマ
チ因子、インスリン、インスリンレセプター、甲状腺刺
激ホルモンレセプター、アセチルコリンレセプターおよ
び他のホルモン、レセプターまたはアレルゲンなどの自
己抗原である。

本発明はまた、あらゆる種類の抗原、たとえば薬物お
よびホルモンの検出およびモニタリングに用いることも
できる。そのような試験では、特定の抗体を多孔性の支
持体に適用し、上記のイムノアッセイ手順とは逆の手順
を用いて特定の抗原を検出および定量する。ついで、抗
原−抗体複合体に特異的に結合するという補体タンパク
質の性質を用い、特定の抗原、たとえば薬物や他の薬理
学的試薬またはホルモンまたはそのような抗原のあらゆ
る所望の組合わせを直接または間接に視覚化し定量する
ことができる。

本発明の固体支持体は、乾燥状態で、または抗原のラ
インに垂直に個々の試験ストリップをカッティングした
後、貯蔵し輸送することができる。これらのストリップ
は実施できるほど薄くてよいが、幅は一般に3mmを越え
てはならない。実際の試験では、すべての試薬は適当な
アリコートで凍結乾燥して容易に貯蔵することができ、
試験に際して再構成することができる。

調べようとする血清を、ブロッキング溶液を含有する
食塩水中に適当な倍率で希釈する。約1:100〜1:10000の
希釈倍率が、たいていの使用に際して用いられる。スト
リップをこれらの希釈溶液の一つに、たとえば使捨てウ
エル挿入物中で浸漬する。これらストリップをこの希釈
溶液中で穏やかに攪拌しながら室温にて約２時間または
４℃にて一夜インキュベートする。ついで過剰の血清を
洗浄して除く。洗浄のタイミングは重要ではない。つい
で指示抗体の試料を加える。これは、通常、ペルオキシ
ダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgGの希釈液であり、処理を室温
にて約２時間続ける。この希釈液はまた、通常、ブロッ
キング溶液中のものである。ついで、指示抗体を洗浄し
て除く。ついで、蛍光、オートラジオグラフィーまたは
結合酵素のための適当な基質などの適当な手順により指
示抗体を視覚化する。ペルオキシダーゼの場合は、基質
は過酸化水素の存在下でのジアニシジンまたはクロロナ
フトールであってよい。ついで、発色反応を約30分から
２時間行う。

本発明の方法は、抗原または抗体の分析に限られるも
のではない。タンパク質、タンパク質結合体（糖タンパ
ク質、リポタンパク質またはタンパク質−核酸複合体な
ど）を含む動物または植物由来の巨大分子有機物質もま
た、それらを固体支持体に適用することができる限りす
べて用いることができる。

本発明は一般に、ウイルス感染の免疫診断に応用する
ことができる。抗原の代わりに複数の特異的抗体をニト
ロセルロース上に適用することにより、本発明の方法を
複数の抗原のアッセイに応用することができる。従っ
て、感染の診断およびステージング（staging）に重要
な抗原および抗体の血清学に関する重要な情報を得るた
めに本発明の方法を都合よく用いることができる。加え
て、HIV−１とHIV−２、またはHIV−１とHTLV−１、ま
たはHIV−１とHBV、またはHIV−１とCMVなどの同時感染
（co−infection）を同時にモニターするために組合わ
せ試験を組み立てることができる。

つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。

実施例１抗HIV−１抗体の血清検出のための３−バンドウエスタ
ンブロッティング（3B−WB）：抗HIV抗体を検出するために、３種の特定の抗原を用
いて改良ウエスタンブロッティングを設計した。この３
−バンド複合ウエスタンブロッティングには、基本的な
HIVエンベロープ抗原およびコア抗原であるgp120、p41
およびp24が含まれている。HIV−１感染H9細胞から天然
gp120を精製し、p41およびp24は大腸菌から製造および
精製した組換え抗原であった。これら３種の抗原（純度
に依存して30〜300μｇ）をそれぞれ別々の1.5mm厚12.5
％SDSラムリ（Laemmli）ポリアクリルアミドゲル（12cm
×16cm）上に、その両端の前以て染色したマーカーとと
もに載せた。染色フロントがゲルの底近く（開始点から
約11cm）に達するまで、電気泳動を室温、45v.にて一夜
（約16時間）行った。gp120は非還元条件下（DTTなし）
で、p41およびp24は還元条件下（10mM DTT）で行った。

抗原バンドは前以て染色したタンパク質マーカーと相
対的な位置にあり、かみそりの刃で切り出した。この切
り出したゲルの切片を一片の硝酸セルロース上に置き、
トランスブロットバイラド・セル（transblot BioRad C
ell）中、65v.、0.2アンペア、室温にて５時間、抗原を
硝酸セルロース上へ移動させた。ついで、この抗原含浸
硝酸セルロースのシートを、回転攪拌器上で穏やかに混
合しながら室温にてバッファー（20mMトリス、pH7.5、5
00mM NaCl、0.5％トリトンＸ−100）を用いて洗浄し
た。ついで、これをブロッキング溶液Ｉ（バッファー中
の１％ゼラチン、１％カゼイン水解物および0.01％チメ
ロサール）中に室温にて２時間または４℃にて一夜浸漬
し、洗浄し、ついでブロッキング溶液II（バッファー中
の10％脱脂粉乳、0.01％チメロサール）中に再浸漬し
た。洗浄後、このシートを空気乾燥させ、イムノブロッ
ティングのためにバンドに垂直にカッティングしてスト
リップとした。このストリップを使用するときまで４℃
にて貯蔵した。洗浄はすべて、室温にて各15分間、回転
攪拌器上で穏やかに混合しながらバッファー中で３回行
った。

HIV特異的抗体について血清を試験するために、管、
またはインキュベータートレイ（バイオ・ラドカタログ
No.170−4037）中の個々のスロット中で、試料バッファ
ー（20mMトリス、pH7.5、150mM NaCl、0.5％トリトンＸ
−100、0.1mg/mlゲンタマイシン、0.1mg/mlチメロサー
ル、10％ヤギ血清、および10％ウシ胎仔血清）中に通常
1:100に希釈した血清試料（4ml）とストリップをそれぞ
れ反応させた。４℃にて一夜インキュベートした後、試
料を吸引して除き、ストリップを洗浄した。ついで、こ
れらストリップを、ともに試料バッファー中で1:1000に
あるヒトIgGまたはIgMに特異的なヤギIgG−西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ結合体と反応させた。室温にて３時間
インキュベートした後、これらストリップを洗浄し、バ
イオ・ラドHRPカラーデベロップメントリージェント（C
olor Development Reagent）を用い推奨される条件下で
発色させた。ついで、これらイムノブロッティングスト
リップを写真にとり、抗原バンドの存在または不存在を
記録した。

上記条件に従って調製したストリップからは、既知の
HIV陽性のヒト血清では強い青色のバンドが観察された
が、正常ヒト血清ではバンドは観察されなかった。本方
法の特異性は、gp120、p41またはp24に特異的なマウス
モノクローナル抗体がそれぞれ対応するバンドとのみ反
応したことから示された。p18または逆転写酵素に特異
的なマウスモノクロナール抗体は反応しなかった。さら
に、大腸菌に対して調製した抗血清は、ストリップ上で
大腸菌抗原を検出することができなかった。

上記アッセイに使用したエンベロープ抗原の純度は、
0.1％トリトンを含有するリン酸緩衝食塩水で抽出する
ことによって、切り出したポリアクリルアミドゲルのバ
ンド中で抗原を回収することにより示された。回収した
抗原はSDS−PAGEにより分析した。ゲルを銀染色するこ
とにより、各抗原はタンパク質の単一のバンドからなる
ことが示された。ウエスタンブロッティングの結果、こ
れら単一のバンドはHIV特異的であり、分解されたこと
を示す小さな抗原断片は存在しないことが示された。

実施例２抗HIV−１抗体、抗HIV−２抗体および抗HTLV−１抗体の
血清検出のための複合５−バンドウエスタンブロッティ
ング： HIV−１、HIV−２およびHTLV−１に対する抗体を検出
するために、上記実施例１のウエスタンブロッティング
法と同様の複合ウエスタンブロッティング法を調製し
た。この「コンボ（combo）」ブロッティングは、５種
の抗原、すなわちHIV−１のgp120、HIV−１のp41、HIV
−１のp24、HIV−２のp41およびHTLV−１のp21を含んで
いた。HIV−１抗原は実施例１に記載したものと同じで
あった。HIV−２およびHTLV−１抗原は、大腸菌からの
組換え抗原であった。これらの抗原を精製し、ついでプ
レパラティブSDS−PAGEにより分画した。これら抗原の
バンドの位置を確認し、ゲルから切り出した。切り出し
たゲルストリップ中の抗原をHIV−１からの３種の抗原
とともにニトロセルロース上へエレクトロブロッティン
グした。ついで、実施例１に記載したようにしてブロッ
ティングシートから試験ストリップを調製した。

これら５−バンドストリップを、陽性コントロール血
清および陰性コントロール血清のパネルで試験した。こ
のパネルのHIV−１陽性血清は、３つのHIV−１バンドと
のみ反応した。HIV−２血清は、HIV−２のp41およびHIV
−１のp24と反応した。この結果は、２種のHIVウイルス
株のp24コア抗原の間で知られた交差反応性と矛盾しな
かった。HTLV−１血清は、HTLV−１のp21とのみ反応し
た。２つの陰性コントロール血清は、いずれの抗原バン
ドとも反応しなかった。

これらの結果は、複合５−バンドウエスタンブロッテ
ィングによりHIV−１陽性血清、HIV−２陽性血清および
HTLV−１陽性血清を特異的に検出することができること
を示している。

実施例３抗HIV−１抗体、抗HIV−２抗体および抗HTLV−１抗体の
同時検出：上記実施例２の陽性コントロール血清を種々の組合わ
せで1:1の比で混合し、これら混合物を実施例２に従っ
て調製した５−バンド試験ストリップを用いてアッセイ
した。HIV−１血清とHIV−２血清との混合物は、HIV−
１のgp120、p41およびp24およびp41 HIV−２を含むバン
ドと陽性の反応を示したが、p21 HTLV−１とは反応しな
かった。HIV−１血清とHTLV−１血清との混合物は、HIV
−１のgp120、p41およびp24およびHTLV−１のp21を含む
バンドとのみ陽性の反応を示した。HIV−２血清とHTLV
−１血清との混合物は、p24 HIV−１、p41 HIV−２およ
びp21 HTLV−１を含むバンドとのみ陽性の反応を示し
た。HIV−１血清、HIV−２血清およびHTLV−１血清の混
合物は、５つのすべてのバンドに含まれる抗原と反応し
た。

これらの結果は、３種の型のウイルス抗体のそれぞれ
は、もし血清中に存在しておれば（この場合には混合す
ることにより）、５−バンドウエスタンブロッティング
により同時に特異的に検出することができることを示し
ている。５−バンド試験ストリップはまた、自然感染の
結果として血清中に存在する抗体をも検出することがで
きる。従って、５−バンドウエスタンブロッティング
は、複数感染の識別診断に用いることができる。

比較試験１３種のHIV抗原に対する所定のHIV−１陽性血清の抗体の
同時力価測定： 3B−WBストリップを用い、３種の抗原に対するHIV−
１陽性血清の抗体力価を同時に決定した。試験は血清を
２倍に系列希釈して行った。その結果は、p41およびp24
に対しては強い力価（1:400,000）を、gp120に対しては
弱い力価（1:1600）を示した。

これらの結果は、3B−WBの感度がEIAおよびウエスタ
ンブロッティングに比較して高いこと、および3B−WBが
複数の抗原に対する抗体を同時に力価測定できることを
示していた。

比較試験２血清変換のモニタリング： 18員系列−血液血清変換パネル（18 member serial−
bleed seroconversion panel）［パネルＣ、ボストン・
バイメディカ（Boston Biomedica,Inc.）から購入］を3
B−WBにより試験した。たいていのEIAの記録陽性は８番
目の血液から始まった。標準的なウイルスを用いたウエ
スタンブロッティングでは、早くも５番目の血液からp2
4抗体が検出され始めた。これに対して、3B−WBでは、g
p120、p41およびp24に対する陽性結果は最初の血液から
得られた。

これらのデータは、3B−WBの感度がEIAおよび標準WB
に比べて優れていることを確認するとともに、エンベロ
ープ抗体とコア抗体との相対力価を明らかにした。

上記パネルを再びアッセイし、ヒトIgMに特異的なウ
サギIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体［カルバ
イオケム（Calbiochem）カタログNo.401875］を用いてI
gM型の反応抗体をモニターした。その結果は、５つの血
液（３番目〜７番目）において弱いIgM応答を示した。

IgM抗体は５番目の血液でピークに達し、次第に減衰し
て８番目の血液で消失した。

これらの結果は、3B−WBの汎用性および感度の高さを
示していた。

比較試験３免疫状態と感染状態との相関付け：感染の３つの段階（ASY、ARCおよびAIDS）にある患者
からの各10個の血清を3B−WBにより評価した。その結果
は、すべての患者は抗p41抗体および抗gp120抗体を有し
ていたが、抗p24抗体の普及率は疾患が進行するにつれ
て減衰していった。

これらのデータは報告の所見と矛盾しないものであ
り、HIV感染の血清検出のためのマーカーとしてp41が重
要であることを示していた。

フロントページの続き (72)発明者ワーナー・シュルズアメリカ合衆国イリノイ 60087、ウォークガン、ノース・アベニュー 1950番 (56)参考文献特開昭63−298（ＪＰ，Ａ) 特表昭61−500987（ＪＰ，Ａ) 米国特許4816387（ＵＳ，Ａ) 国際公開88／5536（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 33/543,33/561 G01N 33/569,33/574

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の少なくとも１種の生物学的に活性
な物質の存在を検出する方法であって、（ａ）該物質と免疫反応性の少なくとも１種の基質を該
基質を含む少なくとも１種の不純混合物からゲル上で精
製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該免疫反応性の基質は該固体支
持体に有効に結合し、（ｄ）該免疫反応性の基質を有する固体支持体を少なく
とも１種の該生物学的に活性な物質を含有する試料と接
触させ、その際、該活性な物質と該免疫反応性の基質と
は結合ペアを生成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特徴とする方法。
【請求項２】該活性な物質が体液中の抗体である請求項
（１）に記載の方法。
【請求項３】該免疫反応性の基質が抗原である請求項
（１）に記載の方法。
【請求項４】抗原がHIV抗原およびHTLV抗原よりなる群
から選ばれたものである請求項（３）に記載の方法。
【請求項５】該免疫反応性の基質が組換え法を用いて製
造したものである請求項（１）に記載の方法。
【請求項６】該免疫反応性の基質が、HIV抗原およびHTL
V抗原よりなる群から選ばれたものである請求項（１）
に記載の方法。
【請求項７】該免疫反応性の基質がHIV−1 gp120、HIV
−1 p41、HIV−1 p24、HIV−2 p41およびHTLV−1 p21よ
りなる群から選ばれた抗原である請求項（１）に記載の
方法。
【請求項８】該精製基質を含有する２つ以上のセグメン
トを同一ゲルから分離し、同一固体支持体上に選択的に
移動させる請求項（１）に記載の方法。
【請求項９】該精製基質を含有する２つ以上のセグメン
トを２つ以上のゲルから分離し、同一固体支持体上に選
択的に移動させる請求項（１）に記載の方法。
【請求項１０】移動をエレクトロブロッティングにより
行う請求項（１）に記載の方法。
【請求項１１】試料中の少なくとも１種の抗HIV−１抗
体を検出する方法であって、（ａ）該抗HIV−１抗体と免疫反応性の少なくとも１種
の基質を該基質を含む少なくとも１種の不純混合物から
ゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該免疫反応性の基質は該固体支
持体に有効に結合し、（ｄ）該免疫反応性の基質を有する固体支持体を該抗HI
V−１抗体を含有する試料と接触させ、その際、該抗HIV
−１抗体と該免疫反応性の基質とは結合ペアを生成し、
ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特徴とする方法。
【請求項１２】該免疫反応性の基質が組換え法を用いて
製造したものである請求項（11）に記載の方法。
【請求項１３】該免疫反応性の基質が、HIV抗原およびH
TLV抗原よりなる群から選ばれたものである請求項（1
1）に記載の方法。
【請求項１４】該免疫反応性の基質がHIV−1 gp120、HI
V−1 p41およびHIV−1 p24_-よりなる群から選ばれた抗
原である請求項（11）に記載の方法。
【請求項１５】試料中の少なくとも１種の抗HIV−１抗
体、抗HIV−２抗体または抗HTLV−１抗体を検出する方
法であって、（ａ）該抗HIV−１抗体、該抗HIV−２抗体または該抗HT
LV−１抗体と免疫反応性の２種以上の基質を該基質を含
む少なくとも１種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該２種以上の精製基質を含む該ゲルの２つ以上の
セグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該２つ以上のセグメントから単一の
固体支持体へ選択的に移動させ、その際、該免疫反応性
の基質のそれぞれは該固体支持体に有効に結合し、（ｄ）該免疫反応性の基質を有する固体支持体を少なく
とも１種の該抗HIV−１抗体、該抗HIV−２抗体または該
抗HTLV−１抗体を含有する試料と接触させ、その際、該
抗HIV−１抗体、該抗HIV−２抗体または該抗HTLV−１抗
体のそれぞれと該免疫反応性の基質とは結合ペアを生成
し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特徴とする方法。
【請求項１６】該免疫反応性の基質が組換え法を用いて
製造したものである請求項（15）に記載の方法。
【請求項１７】該免疫反応性の基質が、HIV抗原およびH
TLV抗原よりなる群から選ばれたものである請求項（1
5）に記載の方法。
【請求項１８】該免疫反応性の基質がHIV−1 gp120、HI
V−1 p41、HIV−1 p24、HIV−2 p41およびHTLV−1 p21
よりなる群から選ばれた抗原である請求項（15）に記載
の方法。