JP3042921B2 - 標識系の安定化剤を含有する固相免疫検定法用洗浄溶液およびその使用方法 - Google Patents
標識系の安定化剤を含有する固相免疫検定法用洗浄溶液およびその使用方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、酵素標識の安定化剤を含有する
固相免疫検定法用洗浄溶液およびこの洗浄溶液の使用に
関する。
固相免疫検定法用洗浄溶液およびこの洗浄溶液の使用に
関する。
【０００２】固相免疫検定法、たとえば酵素連結イムノ
ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、その操作に１また
は２以上の洗浄工程を必要とする。これは、非特異的に
結合した物質たとえば免疫グロブリン、または過剰の試
剤たとえば酵素接合体を除去するために固相を洗浄溶液
で洗浄する必要があるからである。これが適当に行われ
れば検定の結果は、被検物質の濃度に相当する測定シグ
ナルとなる。さらに、検定の結果は、再現性のあるもの
となる。
ソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）は、その操作に１また
は２以上の洗浄工程を必要とする。これは、非特異的に
結合した物質たとえば免疫グロブリン、または過剰の試
剤たとえば酵素接合体を除去するために固相を洗浄溶液
で洗浄する必要があるからである。これが適当に行われ
れば検定の結果は、被検物質の濃度に相当する測定シグ
ナルとなる。さらに、検定の結果は、再現性のあるもの
となる。
【０００３】酵素免疫検定法それ自体は、本技術分野の
熟練者にはよく知られていて、文献に記載されている
（たとえば、KYREIN, H. J., Aerztl. Lab. 24, 57〜6
5, 1978参照）。
熟練者にはよく知られていて、文献に記載されている
（たとえば、KYREIN, H. J., Aerztl. Lab. 24, 57〜6
5, 1978参照）。
【０００４】このような酵素免疫検定法に用いられる固
相も同様に、本技術分野の熟練者にはよく知られてい
て、文献に記載されている（たとえば、VOLLER, A.ら、
Bull.World Health Organ. 53, 55〜65, 1976）。
相も同様に、本技術分野の熟練者にはよく知られてい
て、文献に記載されている（たとえば、VOLLER, A.ら、
Bull.World Health Organ. 53, 55〜65, 1976）。
【０００５】このような固相免疫検定法は、装置を用い
て完結させることもできる。これは、洗浄工程が装置に
よって行われることを意味する。たとえば、中性範囲の
界面活性剤含有リン酸緩衝液からなる既知の洗浄溶液
は、これらの系ではある種の欠点がある。洗浄工程を完
結するためにこのような装置を使用した場合、測定され
るシグナルの正確度および再現性の両者とも、ある時間
後にのみ、すなわち、何個かのプレートが完結した後
に、はじめて許容されるレベルに到達する(BURROWS, P.
M.ら: J. Virol. Meth. 8, 207〜216, 1984)。
て完結させることもできる。これは、洗浄工程が装置に
よって行われることを意味する。たとえば、中性範囲の
界面活性剤含有リン酸緩衝液からなる既知の洗浄溶液
は、これらの系ではある種の欠点がある。洗浄工程を完
結するためにこのような装置を使用した場合、測定され
るシグナルの正確度および再現性の両者とも、ある時間
後にのみ、すなわち、何個かのプレートが完結した後
に、はじめて許容されるレベルに到達する(BURROWS, P.
M.ら: J. Virol. Meth. 8, 207〜216, 1984)。
【０００６】したがって、本発明は、ＥＬＩＳＡを完結
するための装置を使用するに際して、これらの装置を直
ちに使用しても、正しい結果の達成を可能にする方法を
見出すことを目的としたものである。被検物質の濃度と
よく相関する測定シグナルおよび得られる結果の再現性
が、正確な検定操作の評価基準と考えられる。
するための装置を使用するに際して、これらの装置を直
ちに使用しても、正しい結果の達成を可能にする方法を
見出すことを目的としたものである。被検物質の濃度と
よく相関する測定シグナルおよび得られる結果の再現性
が、正確な検定操作の評価基準と考えられる。
【０００７】本明細書で用いられる装置とは、その使用
により酵素免疫検定における洗浄工程の機械的実施が可
能となるすべての装置を意味し、これらの装置でＥＬＩ
ＳＡ検定の完結のための他の工程の実施が可能か否かは
関係ない。
により酵素免疫検定における洗浄工程の機械的実施が可
能となるすべての装置を意味し、これらの装置でＥＬＩ
ＳＡ検定の完結のための他の工程の実施が可能か否かは
関係ない。
【０００８】驚くべきことに、この目的は、緩衝剤基
剤、pH、または他の洗浄溶液への添加物とは無関係に、
安定化剤の添加によって達成されることが見出されたの
である。
剤、pH、または他の洗浄溶液への添加物とは無関係に、
安定化剤の添加によって達成されることが見出されたの
である。
【０００９】本発明における意味での安定化剤は、標識
酵素を安定化する物質であり、たとえば、トブラマイシ
ン、フェノールおよびフェノール誘導体であって、フェ
ノール、ならびにＣ1〜Ｃ3アルキル基、塩素および／ま
たは臭素である１または２個以上の置換基を有するフェ
ノール誘導体が好ましい。
酵素を安定化する物質であり、たとえば、トブラマイシ
ン、フェノールおよびフェノール誘導体であって、フェ
ノール、ならびにＣ1〜Ｃ3アルキル基、塩素および／ま
たは臭素である１または２個以上の置換基を有するフェ
ノール誘導体が好ましい。
【００１０】また一般的に、基質や競合的インヒビター
によって酵素を安定化することも可能である。
によって酵素を安定化することも可能である。
【００１１】したがって、本発明は、マーカー酵素の安
定化剤を含有する不均一酵素免疫検定法用の洗浄溶液に
関する。
定化剤を含有する不均一酵素免疫検定法用の洗浄溶液に
関する。
【００１２】本発明はまた、上述の洗浄溶液の不均一酵
素免疫検定法における使用に関する。
素免疫検定法における使用に関する。
【００１３】本発明はさらに、上述の洗浄溶液を、その
少なくとも１つの洗浄工程において使用する不均一酵素
免疫検定法に関する。
少なくとも１つの洗浄工程において使用する不均一酵素
免疫検定法に関する。
【００１４】本発明はさらにまた、不均一酵素免疫検定
法用の洗浄溶液における標識酵素の安定化剤の使用に関
する。
法用の洗浄溶液における標識酵素の安定化剤の使用に関
する。
【００１５】安定化剤は０.０１〜２０mMの濃度で添加
される。０.１〜５mMの濃度が好ましく、１mMの濃度が
とくに好ましい。安定化剤は、固相免疫検定法用として
以前から知られている洗浄溶液または緩衝液に添加する
ことができる。
される。０.１〜５mMの濃度が好ましく、１mMの濃度が
とくに好ましい。安定化剤は、固相免疫検定法用として
以前から知られている洗浄溶液または緩衝液に添加する
ことができる。
【００１６】好ましい実施態様においては、洗浄溶液は
緩衝化される。この場合使用できる緩衝系は本技術分野
の熟練者にはよく知られている。用いられる特定のpHは
そのアッセイ系に依存し、実験によって適宜決定でき
る。
緩衝化される。この場合使用できる緩衝系は本技術分野
の熟練者にはよく知られている。用いられる特定のpHは
そのアッセイ系に依存し、実験によって適宜決定でき
る。
【００１７】好ましい安定化剤はフェノールおよびフェ
ノール誘導体であり、この場合フェノールはＣ1〜Ｃ3ア
ルキル基、塩素および／または臭素原子である１または
２個以上の置換基をもっていてもよい。
ノール誘導体であり、この場合フェノールはＣ1〜Ｃ3ア
ルキル基、塩素および／または臭素原子である１または
２個以上の置換基をもっていてもよい。
【００１８】実施例に記載の溶液がとくに好ましく、フ
ェノールが最も好ましい。
ェノールが最も好ましい。
【００１９】不均一酵素免疫検定法は、それ自体は、本
技術分野の熟練者によく知られている。これらは、抗原
および抗体の検出に使用することができ、たとえば、サ
ンドイッチまたは競合的免疫検定法のような付加検定法
とすることができる。さまざまな可能な実施態様が文献
に詳細に記載されている。本発明に包含される検定法中
では、ＥＬＩＳＡが好ましい。
技術分野の熟練者によく知られている。これらは、抗原
および抗体の検出に使用することができ、たとえば、サ
ンドイッチまたは競合的免疫検定法のような付加検定法
とすることができる。さまざまな可能な実施態様が文献
に詳細に記載されている。本発明に包含される検定法中
では、ＥＬＩＳＡが好ましい。
【００２０】このような酵素免疫検定法のマーカー酵素
自体は文献に開示されているが、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの使用が好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼ
の使用がとくに好ましい。
自体は文献に開示されているが、アルカリホスファター
ゼ、β−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシ
ダーゼの使用が好ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼ
の使用がとくに好ましい。
【００２１】不均一酵素免疫検定法の固相はそれ自体、
技術分野の熟練者にはよく知られていて、凹面形状体た
とえばチューブもしくはウエル、凸面形状体たとえばビ
ーズ、スター等、ならびに微粒子（粒子径＜１,０００n
m）たとえばラテックス粒子および磁性粒子の使用が好
ましい。この場合、マイクロタイタープレート型のウエ
ル、ラテックス粒子および磁性粒子がとくに好ましい。
マイクロタイタープレートが最も好ましい。
技術分野の熟練者にはよく知られていて、凹面形状体た
とえばチューブもしくはウエル、凸面形状体たとえばビ
ーズ、スター等、ならびに微粒子（粒子径＜１,０００n
m）たとえばラテックス粒子および磁性粒子の使用が好
ましい。この場合、マイクロタイタープレート型のウエ
ル、ラテックス粒子および磁性粒子がとくに好ましい。
マイクロタイタープレートが最も好ましい。
【００２２】固相の材料は、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている。たとえばラテックス粒子の場合のよう
に固相の性質によってすでに決まっているのでなけれ
ば、ポリスチレンの使用が好ましい。
く知られている。たとえばラテックス粒子の場合のよう
に固相の性質によってすでに決まっているのでなけれ
ば、ポリスチレンの使用が好ましい。
【００２３】酵素免疫検定法に使用される緩衝系は本技
術分野の熟練者にはよく知られている。それぞれの場合
に用いられる緩衝系の性質がとくにその場合に要求され
るpH値に依存することも、本技術分野の熟練者にはよく
知られている。
術分野の熟練者にはよく知られている。それぞれの場合
に用いられる緩衝系の性質がとくにその場合に要求され
るpH値に依存することも、本技術分野の熟練者にはよく
知られている。
【００２４】不均一酵素免疫検定法の洗浄溶液に使用さ
れる界面活性剤も、同様に、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている（たとえば、VOLLER, A.ら: Bull. Worl
d Health Organ. 53, 55〜56, 1976)。非イオン性およ
び両イオン性界面活性剤の使用が好ましく、ポリオキシ
エチレン類がとくに好ましく、RTween ２０が最も好ま
しい。
れる界面活性剤も、同様に、本技術分野の熟練者にはよ
く知られている（たとえば、VOLLER, A.ら: Bull. Worl
d Health Organ. 53, 55〜56, 1976)。非イオン性およ
び両イオン性界面活性剤の使用が好ましく、ポリオキシ
エチレン類がとくに好ましく、RTween ２０が最も好ま
しい。
【００２５】酵素免疫検定法に使用される中性蛋白質は
本技術分野の熟練者にはよく知られている。使用が好ま
しい例としては、血清アルブミン、ゼラチン、化学修飾
ゼラチンたとえばポリゲリン、および乳蛋白質たとえば
ラクトフェリンがある。ヒトおよびウシ血清アルブミ
ン、ポリゲリン、ならびにラクトフェリンがとくに好ま
しい。ポリゲリンおよびラクトフェリンが最も好まし
く、後者はドイツ特許出願３６ ３８ ７６７号の記載に
従って製造される。
本技術分野の熟練者にはよく知られている。使用が好ま
しい例としては、血清アルブミン、ゼラチン、化学修飾
ゼラチンたとえばポリゲリン、および乳蛋白質たとえば
ラクトフェリンがある。ヒトおよびウシ血清アルブミ
ン、ポリゲリン、ならびにラクトフェリンがとくに好ま
しい。ポリゲリンおよびラクトフェリンが最も好まし
く、後者はドイツ特許出願３６ ３８ ７６７号の記載に
従って製造される。
【００２６】所定の浸透圧に調整するために、酵素免疫
検定法に使用される溶液には中性塩たとえば食塩を添加
することは、本技術分野の熟練者にはよく知られてい
る。
検定法に使用される溶液には中性塩たとえば食塩を添加
することは、本技術分野の熟練者にはよく知られてい
る。
【００２７】上述の物質は、使用時には水溶液中で用い
られるが、使用までは凍結乾燥もしくは顆粒化した乾燥
混合物として保存することも、また最終的に希釈して用
いられる液状体もしくは濃厚液としておくこともでき
る。
られるが、使用までは凍結乾燥もしくは顆粒化した乾燥
混合物として保存することも、また最終的に希釈して用
いられる液状体もしくは濃厚液としておくこともでき
る。
【００２８】本発明の好ましい実施態様における洗浄溶
液は、以下の組成を有する。 緩衝剤：０〜１００mmol／リットル、好ましくは１０〜
２０mmol／リットル、とくに好ましくは１０mmol／リッ
トル 界面活性剤：０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０.
２％（ｗ／ｖ）、とくに好ましくは０.１％（ｗ／ｖ） 中性蛋白質：０〜１％（ｗ／ｖ） 安定化剤：０.１〜２０mmol／リットル、好ましくは１m
mol／リットル
液は、以下の組成を有する。 緩衝剤：０〜１００mmol／リットル、好ましくは１０〜
２０mmol／リットル、とくに好ましくは１０mmol／リッ
トル 界面活性剤：０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０.
２％（ｗ／ｖ）、とくに好ましくは０.１％（ｗ／ｖ） 中性蛋白質：０〜１％（ｗ／ｖ） 安定化剤：０.１〜２０mmol／リットル、好ましくは１m
mol／リットル
【００２９】慣用の洗浄溶液の組成および成分は本技術
分野の熟練者にはよく知られているとおりである。
分野の熟練者にはよく知られているとおりである。
【００３０】これらの一例には、Ｎａ2ＨＰＯ4、ＫＨ2
ＰＯ4、ＮａＣｌ ０.４５％ ｗ／ｖおよび０.１％（ｗ
／ｖ）TweenR ２０からなり、pH６.５の１０mMリン酸塩
緩衝液がある。この洗浄溶液を本発明により、たとえ
ば、１mMのフェノールと混合し、それを使用して、ＥＬ
ＩＳＡの測定シグナルと再現性における改善の達成が証
明された。
ＰＯ4、ＮａＣｌ ０.４５％ ｗ／ｖおよび０.１％（ｗ
／ｖ）TweenR ２０からなり、pH６.５の１０mMリン酸塩
緩衝液がある。この洗浄溶液を本発明により、たとえ
ば、１mMのフェノールと混合し、それを使用して、ＥＬ
ＩＳＡの測定シグナルと再現性における改善の達成が証
明された。
【００３１】以下の実施例は、本発明を例示するもので
あって、いかなる意味においても本発明を限定するもの
ではない。
あって、いかなる意味においても本発明を限定するもの
ではない。
【００３２】実施例１ ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するIgMを検
出するＥＬＩＳＡを固相免疫検定法として選んだ。８×
１２フィールドに９６個の反応ウエルをもつポリスチレ
ンマイクロタイタープレートを固相として使用した。
出するＥＬＩＳＡを固相免疫検定法として選んだ。８×
１２フィールドに９６個の反応ウエルをもつポリスチレ
ンマイクロタイタープレートを固相として使用した。
【００３３】ヒト胎児線維芽細胞中で培養したＣＭＶ、
およびＣＭＶ感染していないヒト胎児線維芽細胞を、Kr
ishnaらの方法（J. Clin.Microbiol. 12, 46〜51, 198
0）によって処置して、以下、これらのプレパレーショ
ンをそれぞれ、ＣＭＶ抗原および（陰性）対照抗原と呼
ぶ。
およびＣＭＶ感染していないヒト胎児線維芽細胞を、Kr
ishnaらの方法（J. Clin.Microbiol. 12, 46〜51, 198
0）によって処置して、以下、これらのプレパレーショ
ンをそれぞれ、ＣＭＶ抗原および（陰性）対照抗原と呼
ぶ。
【００３４】次に、各マイクロタイタープレートの反応
ウエルにＣＭＶ抗原溶液０.１mlおよび隣接反応ウエル
に対照抗原０.１mlをピペットで加えて上述の著者らの
方法で被覆し、反応ウエルの列が交互にＣＭＶ抗原溶液
および対照抗原で被覆されるようにした。数個の検定プ
レートをこれと同じ製造サイクルで調製した。
ウエルにＣＭＶ抗原溶液０.１mlおよび隣接反応ウエル
に対照抗原０.１mlをピペットで加えて上述の著者らの
方法で被覆し、反応ウエルの列が交互にＣＭＶ抗原溶液
および対照抗原で被覆されるようにした。数個の検定プ
レートをこれと同じ製造サイクルで調製した。
【００３５】試験サンプル０.１５mlの前希釈およびピ
ペットによる添加は、いずれの場合も常に、Chouらの指
示（J. Clin. Microbiol. 25, 52〜55, 1987）に従い、
一方はＣＭＶ抗原溶液で他方は対照抗原で被覆された隣
接反応ウエルに、平行して行った。
ペットによる添加は、いずれの場合も常に、Chouらの指
示（J. Clin. Microbiol. 25, 52〜55, 1987）に従い、
一方はＣＭＶ抗原溶液で他方は対照抗原で被覆された隣
接反応ウエルに、平行して行った。
【００３６】ＥＬＩＳＡの完結は、Ziegelmaierら（J.
Biol. Stand. 9, 23〜33, 1981）の記載した操作にほぼ
完全に従って、サンプルのインキュベーション、接合体
のインキュベーション、および基質のインキュベーショ
ンを行い、すべてのこれらの反応工程（２）および
（３）に先立って洗浄工程を設けた。
Biol. Stand. 9, 23〜33, 1981）の記載した操作にほぼ
完全に従って、サンプルのインキュベーション、接合体
のインキュベーション、および基質のインキュベーショ
ンを行い、すべてのこれらの反応工程（２）および
（３）に先立って洗浄工程を設けた。
【００３７】検定プロトコール：ウイルス抗原による固
相のコーティング洗浄工程 (*) 工程１：血清用希釈緩衝液中試験血清１５０μｌ(**)
と接合体（ＤＢＳＣ）を３７℃でインキュベートする
（IgGおよびIgMのために）洗浄工程 工程２：ＤＢＳＣ中、抗ヒトIgG ５０μｌとＡＰ接合体
を３７℃で６０分洗浄工程 工程３：基質緩衝液中、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト（ｐ−ＮＰＰ）１００μｌ、２０〜２５℃で４５分 工程４：２Ｎ ＮａＯＨ ５０μｌ 光学的評価 *) 各場合とも３×２００μｌの洗浄緩衝液で５分以内 **) 各場合に記載のウエルあたりの容量
相のコーティング洗浄工程 (*) 工程１：血清用希釈緩衝液中試験血清１５０μｌ(**)
と接合体（ＤＢＳＣ）を３７℃でインキュベートする
（IgGおよびIgMのために）洗浄工程 工程２：ＤＢＳＣ中、抗ヒトIgG ５０μｌとＡＰ接合体
を３７℃で６０分洗浄工程 工程３：基質緩衝液中、ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト（ｐ−ＮＰＰ）１００μｌ、２０〜２５℃で４５分 工程４：２Ｎ ＮａＯＨ ５０μｌ 光学的評価 *) 各場合とも３×２００μｌの洗浄緩衝液で５分以内 **) 各場合に記載のウエルあたりの容量
【００３８】これらの洗浄工程は、洗浄コームを用いて
手動で行うことができるだけでなく、洗浄溶液保存容器
に連結したデバイスにより自動的に行うこともできる。
この点に関する現在の技術水準の例としては、DYNATECH
のUltrawasher II、Flow LaboratoriesのMicroplate Wa
sher、NUNCのImmunoWasher NK 350、SLT LABINSTRUMENT
SのEasy Washer“EAW plus”またはBehringwerkeのBehr
ing ELISA processorを挙げることができる。最後に挙
げたデバイスがこの例に使用された。
手動で行うことができるだけでなく、洗浄溶液保存容器
に連結したデバイスにより自動的に行うこともできる。
この点に関する現在の技術水準の例としては、DYNATECH
のUltrawasher II、Flow LaboratoriesのMicroplate Wa
sher、NUNCのImmunoWasher NK 350、SLT LABINSTRUMENT
SのEasy Washer“EAW plus”またはBehringwerkeのBehr
ing ELISA processorを挙げることができる。最後に挙
げたデバイスがこの例に使用された。
【００３９】Ziegelmaierらの操作を改良して、アルカ
リホスファターゼとの抗ヒトIgMの接合体ではなく、抗
ヒトIgMとマーカー酵素としてのペルオキシダーゼとの
接合体を使用した。この酵素の基質としては、あらかじ
めドイツ特許出願3541978号および3541979号（1985年11
月18日出願）の記載に従って調製したテトラメチルベン
チジンと過酸化水素を選んだ。発色は３０分後に０.１m
lの０.５Ｎ硫酸で停止させ、適当な光度計、たとえばTi
tertekR, Multiskan MC, Flow Laboratoriesの装置また
はBehringwerkeのBehring ELISA processorを用いて、
４５０nmで測定した。最後に挙げた装置がこの例に使用
された。
リホスファターゼとの抗ヒトIgMの接合体ではなく、抗
ヒトIgMとマーカー酵素としてのペルオキシダーゼとの
接合体を使用した。この酵素の基質としては、あらかじ
めドイツ特許出願3541978号および3541979号（1985年11
月18日出願）の記載に従って調製したテトラメチルベン
チジンと過酸化水素を選んだ。発色は３０分後に０.１m
lの０.５Ｎ硫酸で停止させ、適当な光度計、たとえばTi
tertekR, Multiskan MC, Flow Laboratoriesの装置また
はBehringwerkeのBehring ELISA processorを用いて、
４５０nmで測定した。最後に挙げた装置がこの例に使用
された。
【００４０】対照抗原で被覆された反応ウエル中の試験
サンプルで得られた測定シグナルを、ＣＭＶ抗原溶液で
被覆された反応ウエル中の同一サンプルで得られた測定
シグナルから差し引いた。この差（△Ｅ）を特異的シグ
ナル（特異的O.D.）と呼び、これをもっぱら評価する。
サンプルで得られた測定シグナルを、ＣＭＶ抗原溶液で
被覆された反応ウエル中の同一サンプルで得られた測定
シグナルから差し引いた。この差（△Ｅ）を特異的シグ
ナル（特異的O.D.）と呼び、これをもっぱら評価する。
【００４１】洗浄溶液の自動添加がＥＬＩＳＡの結果す
なわち特定のシグナルおよび再現性に与える効果を例示
するためには、単純な実験配置を選択した。
なわち特定のシグナルおよび再現性に与える効果を例示
するためには、単純な実験配置を選択した。
【００４２】検定プレートを２種の試験サンプルのみの
多重反復実験用に被覆した（ｎ＝２４）。一方のサンプ
ルの記号は、ＰＰ １６３５−３、他方はＳ ８１−１８
４c１とした。４個の他の検定プレートも同一のサンプ
ル負荷で調整し、検定は５個のすべてのアッセイプレー
トについて一緒に行った。
多重反復実験用に被覆した（ｎ＝２４）。一方のサンプ
ルの記号は、ＰＰ １６３５−３、他方はＳ ８１−１８
４c１とした。４個の他の検定プレートも同一のサンプ
ル負荷で調整し、検定は５個のすべてのアッセイプレー
トについて一緒に行った。
【００４３】この間、各プレート１〜５の順序は、洗浄
工程を通じて変わらないように注意した。
工程を通じて変わらないように注意した。
【００４４】まず最初に、特異的O.D.の算術平均に出発
して、各アッセイプレートについてのシグナル高を洗浄
順序の関数としてグラフに示した（図１Ａ）。特異的O.
D.はアッセイプレートの洗浄順序とともに増加すること
が明らかに証明された。
して、各アッセイプレートについてのシグナル高を洗浄
順序の関数としてグラフに示した（図１Ａ）。特異的O.
D.はアッセイプレートの洗浄順序とともに増加すること
が明らかに証明された。
【００４５】次に、特異的O.D.の相対標準偏差（ＣＶ）
に出発して、各アッセイプレートについてのシグナルの
変動を洗浄順序の関数としてグラフに示した（図２
Ａ）。ＣＶはアッセイプレートの洗浄順序とともに低
下、すなわち改善されることが明らかに証明された。
に出発して、各アッセイプレートについてのシグナルの
変動を洗浄順序の関数としてグラフに示した（図２
Ａ）。ＣＶはアッセイプレートの洗浄順序とともに低
下、すなわち改善されることが明らかに証明された。
【００４６】同一の実験的アプローチを、本発明により
洗浄溶液にフェノールをたとえば０.１mMを加えて行
い、この洗浄溶液をデバイスによりアッセイに導入する
と、結果は、驚くべきことに、著しく改善されることが
見出されたのである。
洗浄溶液にフェノールをたとえば０.１mMを加えて行
い、この洗浄溶液をデバイスによりアッセイに導入する
と、結果は、驚くべきことに、著しく改善されることが
見出されたのである。
【００４７】この場合には、特異的O.D.の平均はアッセ
イプレートの洗浄順序とは無関係に、ＣＭＶ−特異的Ig
Mの濃度に相当するシグナルレベルになる（図１Ｂ）。
さらに、シグナルの変動はアッセイプレートの洗浄順序
とは無関係に、きわめて低い（図２Ｂ）。
イプレートの洗浄順序とは無関係に、ＣＭＶ−特異的Ig
Mの濃度に相当するシグナルレベルになる（図１Ｂ）。
さらに、シグナルの変動はアッセイプレートの洗浄順序
とは無関係に、きわめて低い（図２Ｂ）。
【００４８】５個の全アッセイプレートについて得られ
た測定の変動（総ＣＶ）を調べると、本発明によって達
成されたＥＬＩＳＡの結果の再現性における改善はさら
に劇的になる。現在の技術水準における洗浄溶液での総
ＣＶは、使用された試験サンプルに依存して１８〜２０
％である。本発明によりフェノールを添加した洗浄溶液
を使用した場合の総ＣＶは、使用された試験サンプルに
依存して５〜７％である。
た測定の変動（総ＣＶ）を調べると、本発明によって達
成されたＥＬＩＳＡの結果の再現性における改善はさら
に劇的になる。現在の技術水準における洗浄溶液での総
ＣＶは、使用された試験サンプルに依存して１８〜２０
％である。本発明によりフェノールを添加した洗浄溶液
を使用した場合の総ＣＶは、使用された試験サンプルに
依存して５〜７％である。
【図１】洗浄工程用の装置を用いたＥＬＩＳＡの順序と
結果（シグナルの相互関係）を示す図であり、（Ａ）は
フェノール添加なし、（Ｂ）はフェノール添加のもので
ある。
結果（シグナルの相互関係）を示す図であり、（Ａ）は
フェノール添加なし、（Ｂ）はフェノール添加のもので
ある。
【図２】洗浄工程用の装置を用いたＥＬＩＳＡの順序と
結果（再現性の相互関係）を示す図であり、（Ａ）はフ
ェノール添加なし、（Ｂ）はフェノール添加のものであ
る。
結果（再現性の相互関係）を示す図であり、（Ａ）はフ
ェノール添加なし、（Ｂ）はフェノール添加のものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−248061（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−161357（ＪＰ，Ａ) 特公 平２−43472（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/543
Claims (13)
- 【請求項１】 標識酵素の安定化剤を含有する不均一酵
素免疫検定法用洗浄溶液。 - 【請求項２】 安定化剤を０．０１ｍＭ〜２０ｍＭの濃
度で含有する請求項１記載の洗浄溶液。 - 【請求項３】 安定化剤がフェノールまたはフェノール
誘導体である請求項１記載の洗浄溶液。 - 【請求項４】 安定化剤がフェノールである請求項１記
載の洗浄溶液。 - 【請求項５】 フェノールはＣ１〜Ｃ３アルキル基、塩
素および／または臭素原子である１または２個以上の置
換基を場合により有していてもよい請求項１記載の洗浄
溶液。 - 【請求項６】 緩衝剤を含有する請求項１記載の洗浄溶
液。 - 【請求項７】 界面活性剤を含有する請求項１記載の洗
浄溶液。 - 【請求項８】 請求項１記載の洗浄溶液を不均一酵素免
疫検定法において使用する方法。 - 【請求項９】 酵素免疫検定法がＥＬＩＳＡである請求
項８記載の方法。 - 【請求項１０】 酵素免疫検定法における洗浄工程は装
置によって行う請求項８記載の方法。 - 【請求項１１】 標識系がペルオキシダーゼである請求
項８記載の方法。 - 【請求項１２】 請求項１記載の洗浄溶液をその少なく
とも一つの洗浄工程において使用する酵素免疫検定法。 - 【請求項１３】 不均一酵素免疫検定法用の洗浄溶液中
において標識酵素の安定化剤を使用する方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4037764A DE4037764A1 (de) | 1990-11-28 | 1990-11-28 | Waschloesung fuer festphasen-immunometrische verfahren, die stabilisatoren fuer das markierungssystem enthaelt und ihre verwendung |
| DE40377644 | 1990-11-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04291154A JPH04291154A (ja) | 1992-10-15 |
| JP3042921B2 true JP3042921B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=6419033
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3312027A Expired - Fee Related JP3042921B2 (ja) | 1990-11-28 | 1991-11-27 | 標識系の安定化剤を含有する固相免疫検定法用洗浄溶液およびその使用方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6664070B1 (ja) |
| EP (1) | EP0488171B1 (ja) |
| JP (1) | JP3042921B2 (ja) |
| AT (1) | ATE138199T1 (ja) |
| AU (1) | AU654687B2 (ja) |
| CA (1) | CA2056312C (ja) |
| DE (2) | DE4037764A1 (ja) |
| DK (1) | DK0488171T3 (ja) |
| ES (1) | ES2089096T3 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070237857A1 (en) * | 2006-04-10 | 2007-10-11 | Silver Richard S | Stabilized Enzyme Compositions |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4132598A (en) * | 1977-06-03 | 1979-01-02 | Modrovich Ivan Endre | Stabilized liquid phosphate containing diagnostic compositions and method of preparing same |
| US4487830A (en) * | 1982-05-14 | 1984-12-11 | American Hoechst Corporation | Enzyme/immunofluorescent assay for autoantibodies |
| US4521511A (en) * | 1982-09-22 | 1985-06-04 | Enzyme Technology Company | Catalyzed colorimetric and fluorometric substrates for peroxidase enzyme determinations |
| EP0116454B1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-04-29 | National Research Development Corporation | Enhanced luminescent or luminometric assay |
| US4496654A (en) * | 1983-04-08 | 1985-01-29 | Quidel | Detection of HCG with solid phase support having avidin coating |
| DE3509238A1 (de) * | 1985-03-14 | 1986-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisierung der aktivitaet von peroxidase in loesung |
| DE3541978A1 (de) | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
| DE3541979A1 (de) | 1985-11-28 | 1987-06-04 | Behringwerke Ag | Mittel zur bestimmung von peroxidase-aktivitaet mit stabilisator, verfahren zur herstellung und seine verwendung |
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