JPH0854392A - 分離工程のない特異的結合アッセイ、試験キットおよび乾式分析要素 - Google Patents
分離工程のない特異的結合アッセイ、試験キットおよび乾式分析要素Info
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- JPH0854392A JPH0854392A JP7133996A JP13399695A JPH0854392A JP H0854392 A JPH0854392 A JP H0854392A JP 7133996 A JP7133996 A JP 7133996A JP 13399695 A JP13399695 A JP 13399695A JP H0854392 A JPH0854392 A JP H0854392A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 リガンドの固定化レセプター、リポーター酵
素、阻害抗体および抗阻害抗体を利用するアッセイで、
特異的結合リガンドを検出することを目的とする。 【構成】 前記抗体の両方ともがリポーター酵素に特異
的である。前記阻害抗体は、リポーター酵素と複合する
と、その活性を効果的に遮断する。抗阻害抗体はリポー
ター酵素と結合するが、酵素活性に影響を与えず、また
阻害抗体の結合を妨害する。このアッセイでは、分離も
しくは洗浄工程を用いることなく、標的特異的結合リガ
ンドに正比例して信号が発生する。
素、阻害抗体および抗阻害抗体を利用するアッセイで、
特異的結合リガンドを検出することを目的とする。 【構成】 前記抗体の両方ともがリポーター酵素に特異
的である。前記阻害抗体は、リポーター酵素と複合する
と、その活性を効果的に遮断する。抗阻害抗体はリポー
ター酵素と結合するが、酵素活性に影響を与えず、また
阻害抗体の結合を妨害する。このアッセイでは、分離も
しくは洗浄工程を用いることなく、標的特異的結合リガ
ンドに正比例して信号が発生する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素に特異的な抗体を
用いる特異的結合アッセイに関する。また、アッセイ
は、同じ酵素に特異的である抗阻害抗体を使用する。ま
た、本発明は、これらのアッセイを実施する際に有用な
試験キットおよび分析要素に関する。本発明は、疾病の
指標でありうる種々の特異的結合リガンドを検出して診
断するのに有用である。
用いる特異的結合アッセイに関する。また、アッセイ
は、同じ酵素に特異的である抗阻害抗体を使用する。ま
た、本発明は、これらのアッセイを実施する際に有用な
試験キットおよび分析要素に関する。本発明は、疾病の
指標でありうる種々の特異的結合リガンドを検出して診
断するのに有用である。
【０００２】
【従来の技術】医学的研究および調査、ならびに分析お
よび診断方法において、種々の流体、例えば、生物学的
流体に存在する化学的および生物学的物質の迅速かつ正
確な測定が必要とされ続けている。例えば、治療薬、麻
薬、ホルモン、タンパク質、毒素、微生物、ウイルス、
ステロイドもしくは核酸の存在は、種々疾病もしくは状
態の有効な調査、診断または治療のために迅速かつ正確
に検出されねばならない。
よび診断方法において、種々の流体、例えば、生物学的
流体に存在する化学的および生物学的物質の迅速かつ正
確な測定が必要とされ続けている。例えば、治療薬、麻
薬、ホルモン、タンパク質、毒素、微生物、ウイルス、
ステロイドもしくは核酸の存在は、種々疾病もしくは状
態の有効な調査、診断または治療のために迅速かつ正確
に検出されねばならない。
【０００３】化学的および生物学的物質を検出するため
の多種多様な分析方法がこの10年間で開発されてきた。
そのような方法のほとんどが、「特異的結合」反応とし
て当該技術分野で既知であるものに頼っている。そのよ
うな反応では、検出しようとする未知物質（「特異的結
合リガンド」として既知である）は、対応する「レセプ
ター」分子と特異的かつ優先的に反応する。最もよく知
られている特異的結合反応は、免疫反応体、例えば、抗
体と抗原の間で起こるが、しかしまた別の特異的結合反
応（例えば、アビジンとビオチン、糖とレクチン、また
はホルモンとレセプター）も知られている。
の多種多様な分析方法がこの10年間で開発されてきた。
そのような方法のほとんどが、「特異的結合」反応とし
て当該技術分野で既知であるものに頼っている。そのよ
うな反応では、検出しようとする未知物質（「特異的結
合リガンド」として既知である）は、対応する「レセプ
ター」分子と特異的かつ優先的に反応する。最もよく知
られている特異的結合反応は、免疫反応体、例えば、抗
体と抗原の間で起こるが、しかしまた別の特異的結合反
応（例えば、アビジンとビオチン、糖とレクチン、また
はホルモンとレセプター）も知られている。
【０００４】当該技術分野で既知のアッセイ・フォーマ
ットの多くは、固定化していない反応体が固定化された
反応体から分離されるように、１つ以上の反応体を固形
基体に固定化することを要求する。分離のために固相の
存在を要するアッセイは、一般的には「不均一（hetero
geneous)」系として知られており、通常洗浄工程を要す
る。「均一（homogeneous)」系として知られている、異
なるアッセイ・フォーマットでは、所望の信号がすべて
の反応体が存在する溶液中で検出できるので、一般的に
は全く分離工程を必要としない。洗浄もしくは分離工程
の排除は、所定の状況、例えば、自動化装置で乾式分析
要素を用いる場合に特に重要なことになりうる。均一ア
ッセイは、商品化されており、かなりの文献、特に、Sy
va Corporation（例えば、Rubenstein他の米国特許第
3,935,074号明細書）に記載されている。ほとんどの均
一アッセイでは、酵素活性が試料中の標的特異的結合リ
ガンドの量に相関できるように、酵素標識が何らかの形
で変えられている。
ットの多くは、固定化していない反応体が固定化された
反応体から分離されるように、１つ以上の反応体を固形
基体に固定化することを要求する。分離のために固相の
存在を要するアッセイは、一般的には「不均一（hetero
geneous)」系として知られており、通常洗浄工程を要す
る。「均一（homogeneous)」系として知られている、異
なるアッセイ・フォーマットでは、所望の信号がすべて
の反応体が存在する溶液中で検出できるので、一般的に
は全く分離工程を必要としない。洗浄もしくは分離工程
の排除は、所定の状況、例えば、自動化装置で乾式分析
要素を用いる場合に特に重要なことになりうる。均一ア
ッセイは、商品化されており、かなりの文献、特に、Sy
va Corporation（例えば、Rubenstein他の米国特許第
3,935,074号明細書）に記載されている。ほとんどの均
一アッセイでは、酵素活性が試料中の標的特異的結合リ
ガンドの量に相関できるように、酵素標識が何らかの形
で変えられている。
【０００５】Syva Corporationによって開発された均一
アッセイ（ＥＭＩＴ（商標）アッセイ）では、抗リガン
ド抗体が、遊離リガンドと、リガンドと酵素標識とのコ
ンジュゲートとの間を仕切っている。コンジュゲートに
結合する抗リガンド抗体は、酵素の触媒活性を低減す
る。その利点にもかかわらず、そのようなアッセイはコ
ンジュゲートの調製においてかなりの制限を有する。そ
のようなアッセイに常用される酵素（グルコースデヒド
ロゲナーゼ）は、同様に利用可能である多数の置換部位
を有するが、それらの部位の１つのみが抗リガンド抗体
により酵素活性が変わることに決定的に係わっている。
従って、大部分の酵素分子が阻害可能であることを確か
めるためには、高い置換比が要求される。異なるリガン
ドは、その溶解性、酵素活性の保持および阻害可能性の
点で、得られるコンジュゲートの挙動を変える。コンジ
ュゲートの変化は、製造方法により生じることがあり、
それによって一貫性のないアッセイを実施する別の原因
となるかもしれない。換言すれば、既知均一アッセイ
は、酵素−リガンド・コンジュゲートの濃度の小さな変
化に対して感受性である。さらに、酵素標識の選択が制
限される。
アッセイ（ＥＭＩＴ（商標）アッセイ）では、抗リガン
ド抗体が、遊離リガンドと、リガンドと酵素標識とのコ
ンジュゲートとの間を仕切っている。コンジュゲートに
結合する抗リガンド抗体は、酵素の触媒活性を低減す
る。その利点にもかかわらず、そのようなアッセイはコ
ンジュゲートの調製においてかなりの制限を有する。そ
のようなアッセイに常用される酵素（グルコースデヒド
ロゲナーゼ）は、同様に利用可能である多数の置換部位
を有するが、それらの部位の１つのみが抗リガンド抗体
により酵素活性が変わることに決定的に係わっている。
従って、大部分の酵素分子が阻害可能であることを確か
めるためには、高い置換比が要求される。異なるリガン
ドは、その溶解性、酵素活性の保持および阻害可能性の
点で、得られるコンジュゲートの挙動を変える。コンジ
ュゲートの変化は、製造方法により生じることがあり、
それによって一貫性のないアッセイを実施する別の原因
となるかもしれない。換言すれば、既知均一アッセイ
は、酵素−リガンド・コンジュゲートの濃度の小さな変
化に対して感受性である。さらに、酵素標識の選択が制
限される。
【０００６】別のタイプの均一アッセイ，〔Henderson
他，Clin. Chem., 32(9), 1637-1641 ページ，（198
6）〕は、１対の酵素断片の、その一方が標的リガンド
と結合している、機能性リポーター酵素（functional r
eporter enzyme，例えば、β−ガラクトシダーゼ）の集
団を使用する。次いで抗リガンド抗体は、標的リガンド
の不存在下でコンジュゲートに結合することにより、リ
ポーター酵素の集団を妨害する。２つの特徴が、このア
ッセイを実施困難にしている。より小さい酵素断片を標
的リガンドで誘導体化することは、機能化酵素の集団を
変えるか、または機能化酵素へのそれの組み込みが抗リ
ガンド抗体により遮断されない、結合した断片が得られ
る。第２に、リガンド、抗リガンド抗体および酵素断片
・コンジュゲートの系における平衡は、酵素が十分集合
した近辺にあり、そして得られるイムノアッセイは一時
的にリガンドにのみ依存する。すなわち、平衡では、β
−ガラクトシダーゼは十分活性であり、被分析物に依存
しないであろう。換言すれば、アッセイは、速度論的に
確固としたものではない。
他，Clin. Chem., 32(9), 1637-1641 ページ，（198
6）〕は、１対の酵素断片の、その一方が標的リガンド
と結合している、機能性リポーター酵素（functional r
eporter enzyme，例えば、β−ガラクトシダーゼ）の集
団を使用する。次いで抗リガンド抗体は、標的リガンド
の不存在下でコンジュゲートに結合することにより、リ
ポーター酵素の集団を妨害する。２つの特徴が、このア
ッセイを実施困難にしている。より小さい酵素断片を標
的リガンドで誘導体化することは、機能化酵素の集団を
変えるか、または機能化酵素へのそれの組み込みが抗リ
ガンド抗体により遮断されない、結合した断片が得られ
る。第２に、リガンド、抗リガンド抗体および酵素断片
・コンジュゲートの系における平衡は、酵素が十分集合
した近辺にあり、そして得られるイムノアッセイは一時
的にリガンドにのみ依存する。すなわち、平衡では、β
−ガラクトシダーゼは十分活性であり、被分析物に依存
しないであろう。換言すれば、アッセイは、速度論的に
確固としたものではない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】速度論的に確立され、
かつ少々の変化を伴っても製造が簡単な反応体を用いる
アッセイについての要求が依然として存在する。また、
不均一アッセイに共通である分離工程を回避することは
望ましいであろう。
かつ少々の変化を伴っても製造が簡単な反応体を用いる
アッセイについての要求が依然として存在する。また、
不均一アッセイに共通である分離工程を回避することは
望ましいであろう。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記課題は、 Ａ）いずれかの順序で、 １）標的特異的結合リガンドを含むことが予測される流
体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの固定化レセプター、 ３）リポーター酵素、 ４）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに ５）前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、を合わせて、前記固定
化レセプターと、前記標的特異的結合リガンドもしくは
前記水溶性コンジュゲートのいずれかとの複合体を形成
すること、そして Ｂ）前記流体試料中の前記標的特異的結合リガンドの測
定として、前記リポーター酵素によって発生した信号を
検出すること、を含む、分離工程のない（separation-f
ree)特異的結合アッセイで解決された。
体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの固定化レセプター、 ３）リポーター酵素、 ４）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに ５）前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、を合わせて、前記固定
化レセプターと、前記標的特異的結合リガンドもしくは
前記水溶性コンジュゲートのいずれかとの複合体を形成
すること、そして Ｂ）前記流体試料中の前記標的特異的結合リガンドの測
定として、前記リポーター酵素によって発生した信号を
検出すること、を含む、分離工程のない（separation-f
ree)特異的結合アッセイで解決された。
【０００９】また、本発明は、個々のパックに、標的特
異的結合リガンドの固定化レセプターと、そして、下
記： ｉ）リポーター酵素、 ii）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに iii)前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、からなる群より選ばれ
る少なくとも２つの他の試薬とを含む、分離工程のない
特異的結合アッセイに有用な試験キットを提供する。
異的結合リガンドの固定化レセプターと、そして、下
記： ｉ）リポーター酵素、 ii）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに iii)前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、からなる群より選ばれ
る少なくとも２つの他の試薬とを含む、分離工程のない
特異的結合アッセイに有用な試験キットを提供する。
【００１０】さらにまた、本発明は、固定化リポーター
酵素を含む多孔質展開層を含み、さらに標的特異的結合
リガンドの固定化レセプターを含む乾式分析要素を提供
する。本発明のアッセイは、系で信号発生性試薬として
用いられるリポーター酵素に両方とも特異的である２種
の異なる抗体の相互に独占的な結合に基づいている。あ
る抗体（本明細書では「阻害（inhibitor)」抗体として
知られている）は、それがリポーター酵素に結合したと
きに、酵素活性を阻害する。別の抗体（「抗阻害（anti
-inhibitor）」抗体として知られている）は、リポータ
ー酵素に結合するが、しかし著しく酵素活性を阻害する
ことはない。さらに抗阻害抗体は、阻害抗体がリポータ
ー酵素に結合するのを防いでいる。
酵素を含む多孔質展開層を含み、さらに標的特異的結合
リガンドの固定化レセプターを含む乾式分析要素を提供
する。本発明のアッセイは、系で信号発生性試薬として
用いられるリポーター酵素に両方とも特異的である２種
の異なる抗体の相互に独占的な結合に基づいている。あ
る抗体（本明細書では「阻害（inhibitor)」抗体として
知られている）は、それがリポーター酵素に結合したと
きに、酵素活性を阻害する。別の抗体（「抗阻害（anti
-inhibitor）」抗体として知られている）は、リポータ
ー酵素に結合するが、しかし著しく酵素活性を阻害する
ことはない。さらに抗阻害抗体は、阻害抗体がリポータ
ー酵素に結合するのを防いでいる。
【００１１】本発明では、リポーター酵素の活性は、ア
ッセイ系の標的特異的結合リガンドの量に正比例する。
抗阻害抗体とリガンドとのコンジュゲートは、限定され
たレセプター部位数について試験試料中のリガンドと競
争状態におかれる。リガンドが存在しない場合、コンジ
ュゲートはレセプター部位に優先的に結合し、阻害抗体
はリポーター酵素に自由に接近するであろうから、得ら
れる酵素活性は低いだろう。過剰のリガンドが存在する
場合、コンジュゲートはリポーター酵素に優先的に結合
して阻害抗体の結合を妨害するであろうから、レセプタ
ー酵素から高い信号が得られるだろう。
ッセイ系の標的特異的結合リガンドの量に正比例する。
抗阻害抗体とリガンドとのコンジュゲートは、限定され
たレセプター部位数について試験試料中のリガンドと競
争状態におかれる。リガンドが存在しない場合、コンジ
ュゲートはレセプター部位に優先的に結合し、阻害抗体
はリポーター酵素に自由に接近するであろうから、得ら
れる酵素活性は低いだろう。過剰のリガンドが存在する
場合、コンジュゲートはリポーター酵素に優先的に結合
して阻害抗体の結合を妨害するであろうから、レセプタ
ー酵素から高い信号が得られるだろう。
【００１２】分離工程を回避する利点のほかに、本発明
はかなり広い信号範囲を提供し、従来の均一イムノアッ
セイに共通であるように、1000ダルトン以下の被分析物
に限定されない。潜在的な標的特異的結合リガンドの濃
度は、一般的にはナノモル濃度からミリモル濃度の範囲
である。すべての試薬が従来の方法を用いて容易に調製
できる。信号を発生させるのに用いられるリポーター酵
素は、均一アッセイの場合のようにいずれかの方法で固
定化または変性させる必要はない。さらに、本アッセイ
・フォーマットは、多種多様なリポーター酵素に有用で
ある。
はかなり広い信号範囲を提供し、従来の均一イムノアッ
セイに共通であるように、1000ダルトン以下の被分析物
に限定されない。潜在的な標的特異的結合リガンドの濃
度は、一般的にはナノモル濃度からミリモル濃度の範囲
である。すべての試薬が従来の方法を用いて容易に調製
できる。信号を発生させるのに用いられるリポーター酵
素は、均一アッセイの場合のようにいずれかの方法で固
定化または変性させる必要はない。さらに、本アッセイ
・フォーマットは、多種多様なリポーター酵素に有用で
ある。
【００１３】
【具体的な態様】本発明は、リガンドについてのレセプ
ター分子が入手可能であるかまたは製造可能であるよう
な、多種多様な標的特異的結合リガンド（以下本明細書
ではリガンドと示される）のいずれかを定性的、定量的
または半定量的に検出するのに使用できる。リガンド−
レセプター複合体の具体例（すなわち、リガンドと対応
するレセプターとの反応生成物）は、限定されるもので
はないが、抗体−抗原、抗体−ハプテン、アビジン−ビ
オチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィブロネクチンお
よびプロテインＡ−ＩｇＧの複合体を含む。本発明のた
めに、また相補的核酸（すなわち、相補鎖のハイブリッ
ド生成物）がリガンド−レセプター複合体として考えら
れる。そのような相補的核酸は、塩基対毎に相補的であ
る必要はない。一方の鎖がもう一方の鎖よりも長くても
よいし、または一方の鎖が複数のより短い相補鎖を有し
ていてもよい。リガンドは、限定されるものではない
が、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類（酵素
類、抗体類、抗原性タンパク質類、糖タンパク質類、リ
ポタンパク質類およびアビジンを包含する）、ホルモン
類（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、サイロキシ
ン、トリヨードサイロキシン、エストロゲン、ＡＣＴＨ
およびサブスタンスＰ）、免疫系モジュレーター類（例
えば、インターロイキン−１、インターロイキン−６お
よび腫瘍壊死因子α）、ビタミン類、ステロイド類、炭
水化物類（例えば、多糖類）、糖脂質類、治療薬類およ
び悪用される薬物類（例えば、ジゴキシン、ジフェニル
ヒダントイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、
モルフィネおよびテオフィリン）、抗生物質類（例え
ば、ゲンタマイシン）、細菌細胞およびウイルスの成分
（例えば、レンサ球菌種、単純ヘルペスウイルス、レト
ロウイルス類、インフルエンザウイルス類およびマイコ
バクテリウム種）、核酸類（一本鎖および二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを包含する）、医薬品製剤類、ハプテン
類、レクチン類、ビオチン、ならびに当業者に容易に明
らかである別の物質を含む。
ター分子が入手可能であるかまたは製造可能であるよう
な、多種多様な標的特異的結合リガンド（以下本明細書
ではリガンドと示される）のいずれかを定性的、定量的
または半定量的に検出するのに使用できる。リガンド−
レセプター複合体の具体例（すなわち、リガンドと対応
するレセプターとの反応生成物）は、限定されるもので
はないが、抗体−抗原、抗体−ハプテン、アビジン−ビ
オチン、糖−レクチン、ゼラチン−フィブロネクチンお
よびプロテインＡ−ＩｇＧの複合体を含む。本発明のた
めに、また相補的核酸（すなわち、相補鎖のハイブリッ
ド生成物）がリガンド−レセプター複合体として考えら
れる。そのような相補的核酸は、塩基対毎に相補的であ
る必要はない。一方の鎖がもう一方の鎖よりも長くても
よいし、または一方の鎖が複数のより短い相補鎖を有し
ていてもよい。リガンドは、限定されるものではない
が、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類（酵素
類、抗体類、抗原性タンパク質類、糖タンパク質類、リ
ポタンパク質類およびアビジンを包含する）、ホルモン
類（例えば、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、サイロキシ
ン、トリヨードサイロキシン、エストロゲン、ＡＣＴＨ
およびサブスタンスＰ）、免疫系モジュレーター類（例
えば、インターロイキン−１、インターロイキン−６お
よび腫瘍壊死因子α）、ビタミン類、ステロイド類、炭
水化物類（例えば、多糖類）、糖脂質類、治療薬類およ
び悪用される薬物類（例えば、ジゴキシン、ジフェニル
ヒダントイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、
モルフィネおよびテオフィリン）、抗生物質類（例え
ば、ゲンタマイシン）、細菌細胞およびウイルスの成分
（例えば、レンサ球菌種、単純ヘルペスウイルス、レト
ロウイルス類、インフルエンザウイルス類およびマイコ
バクテリウム種）、核酸類（一本鎖および二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを包含する）、医薬品製剤類、ハプテン
類、レクチン類、ビオチン、ならびに当業者に容易に明
らかである別の物質を含む。
【００１４】本発明は、「低分子量」である薬物類およ
びホルモン類を検出するのに特に有用である。「低分子
量」であるとは、約1500ダルトン未満であることを意味
し、それらは、限定されるものではないが、前記のもの
を含み、そして最も好ましいものは薬物類である。好ま
しい態様では、特異的結合リガンドが、抗原性物質類
（例えば、前記薬物類もしくはハプテン類似体類）また
は抗抗体類である。
びホルモン類を検出するのに特に有用である。「低分子
量」であるとは、約1500ダルトン未満であることを意味
し、それらは、限定されるものではないが、前記のもの
を含み、そして最も好ましいものは薬物類である。好ま
しい態様では、特異的結合リガンドが、抗原性物質類
（例えば、前記薬物類もしくはハプテン類似体類）また
は抗抗体類である。
【００１５】一般的には、本発明の分離工程のないアッ
セイ・プロトコールは、いずれかの順序で以下の試薬： １）ある種の型の流体試料中のリガンド（例えば、抗原
性物質）、 ２）前記リガンドに特異的でありかつそれと反応性であ
る、固定化レセプター（例えば、抗体）、 ３）リポーター酵素（下記）、 ４）前記リポーター酵素に特異的でありかつ下記性質を
さらに有する阻害抗体、および ５）前記リポーター酵素に特異的でありかつ下記性質を
さらに有する、リガンド（例えば、薬物）と抗阻害抗体
との水溶性コンジュゲート、を合わせることを含む。
セイ・プロトコールは、いずれかの順序で以下の試薬： １）ある種の型の流体試料中のリガンド（例えば、抗原
性物質）、 ２）前記リガンドに特異的でありかつそれと反応性であ
る、固定化レセプター（例えば、抗体）、 ３）リポーター酵素（下記）、 ４）前記リポーター酵素に特異的でありかつ下記性質を
さらに有する阻害抗体、および ５）前記リポーター酵素に特異的でありかつ下記性質を
さらに有する、リガンド（例えば、薬物）と抗阻害抗体
との水溶性コンジュゲート、を合わせることを含む。
【００１６】これらの試薬は、いずれかの順序で合わせ
ることができるが、リガンド（流体試料）、阻害抗体お
よびコンジュゲートを、レセプターもしくはリポーター
酵素のいずれかと混合した後に、残りの試薬を添加する
ことが好ましい。例えば、リガンド、阻害抗体およびコ
ンジュゲートを固定化レセプターと混合し、続いてリポ
ーター酵素を添加することができる。本方法の種々の試
薬を合わせる別の順序は、当業者に容易に明らかである
だろう。
ることができるが、リガンド（流体試料）、阻害抗体お
よびコンジュゲートを、レセプターもしくはリポーター
酵素のいずれかと混合した後に、残りの試薬を添加する
ことが好ましい。例えば、リガンド、阻害抗体およびコ
ンジュゲートを固定化レセプターと混合し、続いてリポ
ーター酵素を添加することができる。本方法の種々の試
薬を合わせる別の順序は、当業者に容易に明らかである
だろう。
【００１７】一度これらの試薬が合わされると、適当な
反応が生じる。特に、リガンドおよび水溶性コンジュゲ
ートは、固定化レセプター上の利用可能な部位について
競争する。信号は、リポーター酵素の存在により、適当
な信号発生性試薬（下記）を用いて、流体試料中のリガ
ンドの量に正比例して発生する。リガンドが全く存在し
ないとき、阻害抗体はリポーター酵素と複合し、そして
その酵素活性を阻害して信号の発生を妨害するであろ
う。信号は、活性リポーター酵素の存在によってのみ発
生する。固定化レセプターと反応するリガンドの存在下
では、水溶性コンジュゲートはリポーター酵素と複合
し、そして阻害酵素がそれと反応するのを遮断して、リ
ポーター酵素から信号生成物がより多く得られるであろ
う。
反応が生じる。特に、リガンドおよび水溶性コンジュゲ
ートは、固定化レセプター上の利用可能な部位について
競争する。信号は、リポーター酵素の存在により、適当
な信号発生性試薬（下記）を用いて、流体試料中のリガ
ンドの量に正比例して発生する。リガンドが全く存在し
ないとき、阻害抗体はリポーター酵素と複合し、そして
その酵素活性を阻害して信号の発生を妨害するであろ
う。信号は、活性リポーター酵素の存在によってのみ発
生する。固定化レセプターと反応するリガンドの存在下
では、水溶性コンジュゲートはリポーター酵素と複合
し、そして阻害酵素がそれと反応するのを遮断して、リ
ポーター酵素から信号生成物がより多く得られるであろ
う。
【００１８】前記試薬は、適当な温度で合わせることが
できるが、一般的には約４〜約50℃の範囲で、そして好
ましくは室温で合わせることができる。混合する時間は
数秒間〜15分間に変えることができるとはいえ、典型的
には混合工程は約１〜５分間必要である。好ましくは、
すべての試薬が適当な反応器、例えば、マイクロタイタ
ープレート中で実質的に同時に合わせられる。また、方
法全体が約10分間以内に実施されることが好ましい。本
発明のアッセイは、「湿式」もしくは「乾式」系の両方
で実施できる。すなわち、アッセイは、従来の「湿式」
系で適当な反応容器を用いて実施して、それによって得
られた反応混合物中で発生したシグナルを評価すること
ができる。あるいはそして好ましくは、流体試料が、追
加の流体を用いてまたは用いないで、１つ以上の他の試
薬を含んでもよい乾式試験要素もしくは試験ストリップ
に塗布される、「乾式」分析要素でアッセイが実施され
る。要素中で発生した信号は、目視的にまたは適当な検
出装置を用いて評価される。
できるが、一般的には約４〜約50℃の範囲で、そして好
ましくは室温で合わせることができる。混合する時間は
数秒間〜15分間に変えることができるとはいえ、典型的
には混合工程は約１〜５分間必要である。好ましくは、
すべての試薬が適当な反応器、例えば、マイクロタイタ
ープレート中で実質的に同時に合わせられる。また、方
法全体が約10分間以内に実施されることが好ましい。本
発明のアッセイは、「湿式」もしくは「乾式」系の両方
で実施できる。すなわち、アッセイは、従来の「湿式」
系で適当な反応容器を用いて実施して、それによって得
られた反応混合物中で発生したシグナルを評価すること
ができる。あるいはそして好ましくは、流体試料が、追
加の流体を用いてまたは用いないで、１つ以上の他の試
薬を含んでもよい乾式試験要素もしくは試験ストリップ
に塗布される、「乾式」分析要素でアッセイが実施され
る。要素中で発生した信号は、目視的にまたは適当な検
出装置を用いて評価される。
【００１９】検出しようとするリガンドは、限定される
ものではないが、全血、血清、血漿、リンパ液、胆汁、
尿、脊髄液、涙液、綿棒で集めた被検体、便検体、精
液、膣分泌物、唾液、涙、歯肉溝液および当業者に容易
に明らかな別のものを包含する、動物もしくはヒトの体
液の多種多様な流体試料（もしくは水性溶液）中に存在
するであろう。流体試料の量は当該技術分野で知られて
いるように広範に変えることができるが、典型的には少
なくとも約10〜100 μＬである。レセプターは、リガン
ドまたはリガンド−抗阻害抗体・コンジュゲートとの反
応に応じる。一般的には、そのようなレセプターは、リ
ガンドに特異的な抗体である。
ものではないが、全血、血清、血漿、リンパ液、胆汁、
尿、脊髄液、涙液、綿棒で集めた被検体、便検体、精
液、膣分泌物、唾液、涙、歯肉溝液および当業者に容易
に明らかな別のものを包含する、動物もしくはヒトの体
液の多種多様な流体試料（もしくは水性溶液）中に存在
するであろう。流体試料の量は当該技術分野で知られて
いるように広範に変えることができるが、典型的には少
なくとも約10〜100 μＬである。レセプターは、リガン
ドまたはリガンド−抗阻害抗体・コンジュゲートとの反
応に応じる。一般的には、そのようなレセプターは、リ
ガンドに特異的な抗体である。
【００２０】レセプターは、適当な水不溶性支持体上に
固定された形で提供される。適当な支持体は、限定され
るものではないが、ポリマー、磁気もしくはガラスの粒
子、ポリマーもしくはガラスの濾過膜、セルロース系濾
紙、ポリマーフィルム、ガラススライド、試験管、磁性
鉄流体、試験デバイスもしくはマイクロタイタープレー
トの試験ウェル、または当業者に容易に明らかな別のも
のを含む。好ましくは、レセプターが、この目的で設計
されたポリマー粒子上に固定される。このような粒子は
当該技術分野で周知である。粒子表面上の反応性基は、
限定されるものではないが、カルボキシ、２−置換エチ
ルスルホニル、ビニルスルホニル、エポキシ、アルデヒ
ド、活性ハロ原子類、アミノ、ヒドラジンおよび活性エ
ステル類、例えば、スクシンイミドオキシカルボニルを
含む。
固定された形で提供される。適当な支持体は、限定され
るものではないが、ポリマー、磁気もしくはガラスの粒
子、ポリマーもしくはガラスの濾過膜、セルロース系濾
紙、ポリマーフィルム、ガラススライド、試験管、磁性
鉄流体、試験デバイスもしくはマイクロタイタープレー
トの試験ウェル、または当業者に容易に明らかな別のも
のを含む。好ましくは、レセプターが、この目的で設計
されたポリマー粒子上に固定される。このような粒子は
当該技術分野で周知である。粒子表面上の反応性基は、
限定されるものではないが、カルボキシ、２−置換エチ
ルスルホニル、ビニルスルホニル、エポキシ、アルデヒ
ド、活性ハロ原子類、アミノ、ヒドラジンおよび活性エ
ステル類、例えば、スクシンイミドオキシカルボニルを
含む。
【００２１】特に有用な粒状支持体は、例えば、ヨーロ
ッパ特許第 0 323 692号明細書（1989年 7月12日刊行）
および米国特許第 4,997,772号明細書（Sutton他）に記
載されており、それらは、活性ハロ原子類、活性化２−
置換エチレンスルホニルもしくはビニルスルホニル基を
有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーより
調製される。特に有用なカルボキシ含有ポリマー粒子
は、米国特許第 5,262,297号明細書（Sutton他）に記載
されている。この文献は、引用することにより本明細書
中に組み入れられる。別のカルボキシ含有ポリマー粒子
が従来技術文献に記載されており、そして多くのものが
市販されている。
ッパ特許第 0 323 692号明細書（1989年 7月12日刊行）
および米国特許第 4,997,772号明細書（Sutton他）に記
載されており、それらは、活性ハロ原子類、活性化２−
置換エチレンスルホニルもしくはビニルスルホニル基を
有する１つ以上のエチレン系不飽和重合性モノマーより
調製される。特に有用なカルボキシ含有ポリマー粒子
は、米国特許第 5,262,297号明細書（Sutton他）に記載
されている。この文献は、引用することにより本明細書
中に組み入れられる。別のカルボキシ含有ポリマー粒子
が従来技術文献に記載されており、そして多くのものが
市販されている。
【００２２】支持体へのレセプターの付着は、種々の従
来の方法のいずれかを用いて、例えば、レセプター分子
を塗布して吸着させることで、またはインキュベートし
て支持体上の反応性基と共有結合反応させることで達成
できる。そのような方法は、例えば、米国特許第 5,25
2,457号明細書（Snodgrass 他）および米国特許第 5,26
2,297号明細書（Sutton他）（これらは、両方とも引用
することにより本明細書中に組み入れられる）、ならび
に本明細書中で引用された文献に記載されている。最も
好ましくは、前記Sutton他の特許に記載されるように、
レセプター分子がポリマー粒子上の活性化カルボキシ基
に共有結合される。また、レセプターは、支持体に付着
した連結基を有するその支持体に結合させることもでき
る。そのような連結基は、支持体から伸びている化学的
部分であってもよく、または生物学的連結部分、例え
ば、レセプターが複合することができるペプチドもしく
は抗体であってもよい。
来の方法のいずれかを用いて、例えば、レセプター分子
を塗布して吸着させることで、またはインキュベートし
て支持体上の反応性基と共有結合反応させることで達成
できる。そのような方法は、例えば、米国特許第 5,25
2,457号明細書（Snodgrass 他）および米国特許第 5,26
2,297号明細書（Sutton他）（これらは、両方とも引用
することにより本明細書中に組み入れられる）、ならび
に本明細書中で引用された文献に記載されている。最も
好ましくは、前記Sutton他の特許に記載されるように、
レセプター分子がポリマー粒子上の活性化カルボキシ基
に共有結合される。また、レセプターは、支持体に付着
した連結基を有するその支持体に結合させることもでき
る。そのような連結基は、支持体から伸びている化学的
部分であってもよく、または生物学的連結部分、例え
ば、レセプターが複合することができるペプチドもしく
は抗体であってもよい。
【００２３】アッセイに有用な固定化レセプターの量
は、既知アッセイ・プロトコールから当業者に明らかで
あるだろう。本発明に有用なリポーター酵素は、典型的
には診断系における標識として用いられる。それらは、
限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、
ウリカーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼおよび当業者に容易に明らかな別のものを含む。
ペルオキシダーゼ（種々の供給源のいずれか由来）が好
ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最も好ましい。
は、既知アッセイ・プロトコールから当業者に明らかで
あるだろう。本発明に有用なリポーター酵素は、典型的
には診断系における標識として用いられる。それらは、
限定されるものではないが、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、
ウリカーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼおよび当業者に容易に明らかな別のものを含む。
ペルオキシダーゼ（種々の供給源のいずれか由来）が好
ましく、西洋ワサビペルオキシダーゼが最も好ましい。
【００２４】アッセイに用いられるリポーター酵素の量
は、バックグラウンドが無視できて複合体生成の速度が
受け入れられるように、一般的には、約10-11 モル濃度
以上である。加えて、信号を生成するための酵素基質が
あまり迅速に反応しないように、一般的にはその量は約
３×10-8モル濃度以下である。さらに、その量は、阻害
抗体もしくは抗阻害抗体のいずれか（下記）の濃度より
も少ない。リポーター酵素は、その「遊離」水溶性型で
使用してもよく、またはレセプター分子と同様にそれを
適当な支持体に固定することもできる。従って、レセプ
ター分子についての支持体に関する先の教示が、リポー
ター酵素についても同様に適用される。例えば、リポー
ター酵素は、種々の支持体にレセプター分子を付着させ
ることについて先に記載した方法と同様の方法を用い
て、適当なポリマー粒子上に固定化できる。特に、リポ
ーター酵素に特異的でありかつ粒子に共有結合する、
「バインダー」抗体（下記）を用いてリポーター酵素を
固定化することが有用である。
は、バックグラウンドが無視できて複合体生成の速度が
受け入れられるように、一般的には、約10-11 モル濃度
以上である。加えて、信号を生成するための酵素基質が
あまり迅速に反応しないように、一般的にはその量は約
３×10-8モル濃度以下である。さらに、その量は、阻害
抗体もしくは抗阻害抗体のいずれか（下記）の濃度より
も少ない。リポーター酵素は、その「遊離」水溶性型で
使用してもよく、またはレセプター分子と同様にそれを
適当な支持体に固定することもできる。従って、レセプ
ター分子についての支持体に関する先の教示が、リポー
ター酵素についても同様に適用される。例えば、リポー
ター酵素は、種々の支持体にレセプター分子を付着させ
ることについて先に記載した方法と同様の方法を用い
て、適当なポリマー粒子上に固定化できる。特に、リポ
ーター酵素に特異的でありかつ粒子に共有結合する、
「バインダー」抗体（下記）を用いてリポーター酵素を
固定化することが有用である。
【００２５】すべての抗体について本明細書中で用いら
れている「抗体」なる語は（特に断らない限り）、当該
技術分野で一般的であるように、単一の特異性を有する
完全な免疫グロブリン分子を包含する。加えて、この語
は、そのような分子の化学的に調製された断片〔例え
ば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）′、Ｆ（ａｂ）′2 、断片〕お
よび遺伝学的に調製されたそれらの等価体（例えば、
「一本鎖抗体断片」もしくはＳｃＦｖ断片）を包含する
ことを意味する。本明細書中に記載される各型の抗体
は、モノクローナルもしくはポリクローナル（特に断ら
ない限り）であるが、しかし好ましくは、各型の抗体が
モノクローナルである。モノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いて通常調製されるそれらの分
子を含むが、しかしそれらは電気融合、ウイルス性形質
転換および当該技術分野で既知である別の方法により調
製することもできる。
れている「抗体」なる語は（特に断らない限り）、当該
技術分野で一般的であるように、単一の特異性を有する
完全な免疫グロブリン分子を包含する。加えて、この語
は、そのような分子の化学的に調製された断片〔例え
ば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）′、Ｆ（ａｂ）′2 、断片〕お
よび遺伝学的に調製されたそれらの等価体（例えば、
「一本鎖抗体断片」もしくはＳｃＦｖ断片）を包含する
ことを意味する。本明細書中に記載される各型の抗体
は、モノクローナルもしくはポリクローナル（特に断ら
ない限り）であるが、しかし好ましくは、各型の抗体が
モノクローナルである。モノクローナル抗体は、従来の
ハイブリドーマ技術を用いて通常調製されるそれらの分
子を含むが、しかしそれらは電気融合、ウイルス性形質
転換および当該技術分野で既知である別の方法により調
製することもできる。
【００２６】好ましくは、本発明の実施に際して用いら
れるモノクローナル抗体は、Kohler他，Nature 256, 49
5 (1975)に記載される従来の方法に従って、適当な動物
（例えば、マウスもしくはラット）を対応する抗原、例
えば、リポーター酵素（もしくはタンパク質担体に結合
させたリポーター酵素）で免疫することにより調製され
る。有用なモノクローナル抗体を調製するための特別な
方法についての詳細は、GormanおよびDaiss による「西
洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な阻害および抗阻害
モノクローナル抗体」と題する同日出願の同時係属中で
ありかつ共同譲渡された米国特許出願番号第 08/251,49
6 号明細書に提供されている。
れるモノクローナル抗体は、Kohler他，Nature 256, 49
5 (1975)に記載される従来の方法に従って、適当な動物
（例えば、マウスもしくはラット）を対応する抗原、例
えば、リポーター酵素（もしくはタンパク質担体に結合
させたリポーター酵素）で免疫することにより調製され
る。有用なモノクローナル抗体を調製するための特別な
方法についての詳細は、GormanおよびDaiss による「西
洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な阻害および抗阻害
モノクローナル抗体」と題する同日出願の同時係属中で
ありかつ共同譲渡された米国特許出願番号第 08/251,49
6 号明細書に提供されている。
【００２７】免疫した動物の脾細胞の集団は、Lane「J.
Immunol. Methods 81, 223-228 ページ（1985）〕の教
示に従って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ1450）も
しくは別の融合剤（fusogen ）の存在下で、適当な骨髄
腫（ミエローマ）セルラインと融合できる。得られたハ
イブリッド細胞を選択培地で希釈し、マイクロタイター
プレートに分配し、そして７〜21日間培養した後、スク
リーニングして抗体がどのような型の性質を有するのか
調べる。抗体の特別な調製方法を以下に具体的に示す。
哺乳動物の脾細胞とハイブリッドするための種々の骨髄
腫セルラインは市販されている。そのようなセルライン
の供給源は、American Type Culture Collection (ATC
C), Rockville, Marylandを含む。特に有用な骨髄腫セ
ルラインは、Sp2/0-Ag14およびP3x63Ag8.653骨髄腫細胞
を含み、それらは両方ともATCCより入手可能である。最
初のセルラインが好ましい。
Immunol. Methods 81, 223-228 ページ（1985）〕の教
示に従って、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ1450）も
しくは別の融合剤（fusogen ）の存在下で、適当な骨髄
腫（ミエローマ）セルラインと融合できる。得られたハ
イブリッド細胞を選択培地で希釈し、マイクロタイター
プレートに分配し、そして７〜21日間培養した後、スク
リーニングして抗体がどのような型の性質を有するのか
調べる。抗体の特別な調製方法を以下に具体的に示す。
哺乳動物の脾細胞とハイブリッドするための種々の骨髄
腫セルラインは市販されている。そのようなセルライン
の供給源は、American Type Culture Collection (ATC
C), Rockville, Marylandを含む。特に有用な骨髄腫セ
ルラインは、Sp2/0-Ag14およびP3x63Ag8.653骨髄腫細胞
を含み、それらは両方ともATCCより入手可能である。最
初のセルラインが好ましい。
【００２８】本発明で用いられるモノクローナル抗体の
調製では、選択されたハイブリドーマを、軟寒天でクロ
ーン化し、そして個々のクローンを引き抜いて、従来の
方法を用いて培養し、そして前記方法を用いてスクリー
ニングした。モノクローナル抗体は、振盪フラスコもし
くは中空繊維バイオリアクター中で成長させ、そして固
定化プロテインＡもしくはプロテインＧのいずれかの従
来のアフィニティークロマトグラフィーを用いて収集お
よび精製することができる。所望により、別の従来の精
製方法を用いることもできる。本発明の実施に際して重
要な阻害抗体は、アッセイに用いられるリポーター酵素
に特異的である。加えて、それらは解離定数（Ｋd ）約
125ナノモル濃度以下を有し、かつリポーター酵素の酵
素活性を少なくとも約80％（好ましくは少なくとも約95
％、そしてより好ましくは少なくとも約99％）阻害する
ようにリポーター酵素に結合する。これらのＫd 値が抗
体の相対尺度であること、そしてそのパラメーターを測
定するための別の測定方法がより高いまたはより低い値
を与えるかもしれないことは、理解されるべきである。
調製では、選択されたハイブリドーマを、軟寒天でクロ
ーン化し、そして個々のクローンを引き抜いて、従来の
方法を用いて培養し、そして前記方法を用いてスクリー
ニングした。モノクローナル抗体は、振盪フラスコもし
くは中空繊維バイオリアクター中で成長させ、そして固
定化プロテインＡもしくはプロテインＧのいずれかの従
来のアフィニティークロマトグラフィーを用いて収集お
よび精製することができる。所望により、別の従来の精
製方法を用いることもできる。本発明の実施に際して重
要な阻害抗体は、アッセイに用いられるリポーター酵素
に特異的である。加えて、それらは解離定数（Ｋd ）約
125ナノモル濃度以下を有し、かつリポーター酵素の酵
素活性を少なくとも約80％（好ましくは少なくとも約95
％、そしてより好ましくは少なくとも約99％）阻害する
ようにリポーター酵素に結合する。これらのＫd 値が抗
体の相対尺度であること、そしてそのパラメーターを測
定するための別の測定方法がより高いまたはより低い値
を与えるかもしれないことは、理解されるべきである。
【００２９】抗体生成物のスクリーニングは、ハイブリ
ドーマ技法の重要な工程である。前記ハイブリドーマ培
養液上清は、３種の独立アッセイによりスクリーニング
できる。第１のアッセイは、リポーター酵素、例えば、
西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的である抗体を選択
する手段を与える。第２および第３のアッセイは、第１
のアッセイで測定された特異的抗体の阻害性もしくは抗
阻害性を決定する。西洋ワサビペルオキシダーゼ特異性
についてのスクリーニングに関しては、以下に、どのよ
うにして所定のリポーター酵素についてそのようなスク
リーニング処理が実施されたのか具体的に記載するが、
しかし本発明はそのように限定されると解釈されるもの
ではない。別のリポーター酵素の抗体が同様に調製およ
び同定できると信じる。リポーター酵素に対する特異性
についてのスクリーニングは、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ・コンジュゲートを吸着させて含むポリスチレン・
マイクロタイタープレート中で従来のエンザイム・リン
クト・イムノソルベント・アッセイ（Enzyme Linked Im
munosorbent Assay ）（ＥＬＩＳＡ）を用いて容易に達
成できる。
ドーマ技法の重要な工程である。前記ハイブリドーマ培
養液上清は、３種の独立アッセイによりスクリーニング
できる。第１のアッセイは、リポーター酵素、例えば、
西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的である抗体を選択
する手段を与える。第２および第３のアッセイは、第１
のアッセイで測定された特異的抗体の阻害性もしくは抗
阻害性を決定する。西洋ワサビペルオキシダーゼ特異性
についてのスクリーニングに関しては、以下に、どのよ
うにして所定のリポーター酵素についてそのようなスク
リーニング処理が実施されたのか具体的に記載するが、
しかし本発明はそのように限定されると解釈されるもの
ではない。別のリポーター酵素の抗体が同様に調製およ
び同定できると信じる。リポーター酵素に対する特異性
についてのスクリーニングは、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ・コンジュゲートを吸着させて含むポリスチレン・
マイクロタイタープレート中で従来のエンザイム・リン
クト・イムノソルベント・アッセイ（Enzyme Linked Im
munosorbent Assay ）（ＥＬＩＳＡ）を用いて容易に達
成できる。
【００３０】西洋ワサビペルオキシダーゼについての特
異性：西洋ワサビペルオキシダーゼと、マイクロタイタ
ープレートに対する西洋ワサビペルオキシダーゼの吸着
を媒介するのに役立つ不適当な抗体とのコンジュゲート
を被覆したマイクロタイタープレートのウェルに、各培
養液上清の試料（50μＬ／プレートウェル）を入れる。
この抗体は、例えば、Jackson Immunoresearchから入手
することができる。30〜60分間インキュベーションした
後、プレートを適当な非イオン界面活性剤の緩衝液で洗
浄し、そしてマウスもしくはラット西洋ワサビペルオキ
シダーゼ特異的モノクローナル抗体の存在を、抗マウス
ＩｇＧもしくは抗ラットＩｇＧとアルカリ性ホスファタ
ーゼとのコンジュゲート（抗マウスＦｃとのコンジュゲ
ートは、例えば、Jackson Immunoresearchから入手する
ことができる）を用いて検出する。トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（ 1.5モル濃度，pH８）中
の基質ｏ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（４mg
/mL ）を添加することにより、色素信号を発生できる。
別の信号生成性試薬もしくは酵素標識が同様に使用でき
る。スクリーニングにより、バックグラウンド信号の少
なくとも２倍の濃度の色素信号を約30分後に提供する抗
体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的であると見
なされる。色素信号は、従来のマイクロタイタープレー
ト・リーダーもしくは分光光度計を用いて測定できる。
西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗体は、以下の
ように阻害機能についてスクリーニングできる。
異性：西洋ワサビペルオキシダーゼと、マイクロタイタ
ープレートに対する西洋ワサビペルオキシダーゼの吸着
を媒介するのに役立つ不適当な抗体とのコンジュゲート
を被覆したマイクロタイタープレートのウェルに、各培
養液上清の試料（50μＬ／プレートウェル）を入れる。
この抗体は、例えば、Jackson Immunoresearchから入手
することができる。30〜60分間インキュベーションした
後、プレートを適当な非イオン界面活性剤の緩衝液で洗
浄し、そしてマウスもしくはラット西洋ワサビペルオキ
シダーゼ特異的モノクローナル抗体の存在を、抗マウス
ＩｇＧもしくは抗ラットＩｇＧとアルカリ性ホスファタ
ーゼとのコンジュゲート（抗マウスＦｃとのコンジュゲ
ートは、例えば、Jackson Immunoresearchから入手する
ことができる）を用いて検出する。トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン緩衝液（ 1.5モル濃度，pH８）中
の基質ｏ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（４mg
/mL ）を添加することにより、色素信号を発生できる。
別の信号生成性試薬もしくは酵素標識が同様に使用でき
る。スクリーニングにより、バックグラウンド信号の少
なくとも２倍の濃度の色素信号を約30分後に提供する抗
体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的であると見
なされる。色素信号は、従来のマイクロタイタープレー
ト・リーダーもしくは分光光度計を用いて測定できる。
西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗体は、以下の
ように阻害機能についてスクリーニングできる。
【００３１】酵素阻害についてのアッセイ：マイクロタ
イタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50μ
Ｌ）を入れ、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン（
0.8％）を含む溶液（50μＬ）を添加し、そして得られ
た混合物を10分間室温で放置する。次いで、クエン酸／
リン酸緩衝液（50ミリモル濃度，pH 5.5）中に西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ基質、ｏ−フェニレンジアミン（１
mg/mL ）を含むもの 100μＬを添加することにより残留
酵素活性を測定し、そして色素信号の量を 450nmで従来
の分光光度計（速度 100mOD/分）を用いて測定する。別
の基質もしくは色素提供性試薬が同様に使用できる。こ
れらの西洋ワサビペルオキシダーゼを（モノクローナル
抗体が存在しない対照と比較して）約20％以上阻害する
培養液上清は、阻害抗体としてさらに調査することを考
える。
イタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50μ
Ｌ）を入れ、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン（
0.8％）を含む溶液（50μＬ）を添加し、そして得られ
た混合物を10分間室温で放置する。次いで、クエン酸／
リン酸緩衝液（50ミリモル濃度，pH 5.5）中に西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ基質、ｏ−フェニレンジアミン（１
mg/mL ）を含むもの 100μＬを添加することにより残留
酵素活性を測定し、そして色素信号の量を 450nmで従来
の分光光度計（速度 100mOD/分）を用いて測定する。別
の基質もしくは色素提供性試薬が同様に使用できる。こ
れらの西洋ワサビペルオキシダーゼを（モノクローナル
抗体が存在しない対照と比較して）約20％以上阻害する
培養液上清は、阻害抗体としてさらに調査することを考
える。
【００３２】この方法で評価された抗体をさらなる評価
にかけて、本発明の範囲内であるもの、すなわち、リポ
ーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）の
活性を少なくとも約80％阻害するものを見つける。好ま
しくは、阻害量が少なくとも約95％である。阻害の評価
は、前記方法により実施した。また、リポーター酵素に
特異的な抗体は、リポーター酵素に対する阻害抗体の結
合を阻害するそれらの能力についてもスクリーニングさ
れる。西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗阻害抗
体の代表的なスクリーニング方法を以下に記載する。本
発明は、そのように限定されるように解釈されるもので
はない。
にかけて、本発明の範囲内であるもの、すなわち、リポ
ーター酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）の
活性を少なくとも約80％阻害するものを見つける。好ま
しくは、阻害量が少なくとも約95％である。阻害の評価
は、前記方法により実施した。また、リポーター酵素に
特異的な抗体は、リポーター酵素に対する阻害抗体の結
合を阻害するそれらの能力についてもスクリーニングさ
れる。西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗阻害抗
体の代表的なスクリーニング方法を以下に記載する。本
発明は、そのように限定されるように解釈されるもので
はない。
【００３３】抗阻害についてのアッセイ：マイクロタイ
タープレートの各ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ 0.4ナノモル濃度）の試料（25μＬ）を入れ、続いて
各培養液上清の試料（50μＬ）を添加し、30分間インキ
ュベーションし、続いて阻害モノクローナル抗体4-22.2
（25μＬ，15ナノモル濃度，下記第Ｉ表に明示）を添加
する。10分間インキュベーションした後、基質溶液（ 1
00μＬ）を添加し、そしてペルオキシダーゼ活性由来の
色素信号を前記のように評価する（すなわち、基質とし
てｏ−フェニレンジアミンを用いる）。本発明の範囲内
の抗阻害抗体は、本明細書に記載した阻害抗体4-22.2に
よる西洋ワサビペルオキシダーゼの阻害を遮断するもの
と定義される。一般的には、阻害抗体は、酵素活性の80
〜90％を阻害するのに十分なレベルで添加され、抗阻害
抗体との共同インキュベーションの際に測定される酵素
活性は30％を越える。
タープレートの各ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ 0.4ナノモル濃度）の試料（25μＬ）を入れ、続いて
各培養液上清の試料（50μＬ）を添加し、30分間インキ
ュベーションし、続いて阻害モノクローナル抗体4-22.2
（25μＬ，15ナノモル濃度，下記第Ｉ表に明示）を添加
する。10分間インキュベーションした後、基質溶液（ 1
00μＬ）を添加し、そしてペルオキシダーゼ活性由来の
色素信号を前記のように評価する（すなわち、基質とし
てｏ−フェニレンジアミンを用いる）。本発明の範囲内
の抗阻害抗体は、本明細書に記載した阻害抗体4-22.2に
よる西洋ワサビペルオキシダーゼの阻害を遮断するもの
と定義される。一般的には、阻害抗体は、酵素活性の80
〜90％を阻害するのに十分なレベルで添加され、抗阻害
抗体との共同インキュベーションの際に測定される酵素
活性は30％を越える。
【００３４】この開示および特許請求の範囲で酵素活性
阻害のパーセントの表示に「約」が用いられるとき、そ
の語「約」は、±５％の変量を称する。本明細書中でＫ
d 値の表示に「約」が用いられるとき、その語「約」
は、±50％の変量を称する。阻害抗体の解離定数
（Ｋd ）は、リポーター酵素（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼ）の活性を（抗体が存在しないときの酵素
活性と比較して）50％阻害するのに要する抗体の濃度を
測定することにより決定した。本明細書中に記載される
阻害抗体は、一般的には約 125ナノモル濃度以下の
Ｋd 、好ましくは約50ナノモル濃度以下のＫd 、そして
より好ましくは約１ナノモル濃度以下のＫd を有する。
阻害のパーセントの表示に「約」が用いられるとき、そ
の語「約」は、±５％の変量を称する。本明細書中でＫ
d 値の表示に「約」が用いられるとき、その語「約」
は、±50％の変量を称する。阻害抗体の解離定数
（Ｋd ）は、リポーター酵素（例えば、西洋ワサビペル
オキシダーゼ）の活性を（抗体が存在しないときの酵素
活性と比較して）50％阻害するのに要する抗体の濃度を
測定することにより決定した。本明細書中に記載される
阻害抗体は、一般的には約 125ナノモル濃度以下の
Ｋd 、好ましくは約50ナノモル濃度以下のＫd 、そして
より好ましくは約１ナノモル濃度以下のＫd を有する。
【００３５】抗阻害抗体のＫd 値は、前記の通り酵素活
性の約99％を阻害するように決定した、10ナノモル濃度
の阻害抗体4-22.2（下記第Ｉ表に明示）による西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ 0.1ナノモル濃度の阻害の50％を妨
害するのに要する抗体の濃度を測定することにより決定
した。これらのＫd 値は、一般的には約50ナノモル濃度
以下であり、好ましくは約25ナノモル濃度以下であり、
そしてより好ましくは約５ナノモル濃度以下である。好
ましくはこれらの抗体が減少させる西洋ワサビペルオキ
シダーゼの活性は、約６％以下である。これらのＫd 値
が抗体の相対尺度であること、そしてそのパラメーター
を測定するための別の測定方法がより高いまたはより低
い値を与えるかもしれないことは、理解されるべきであ
る。
性の約99％を阻害するように決定した、10ナノモル濃度
の阻害抗体4-22.2（下記第Ｉ表に明示）による西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ 0.1ナノモル濃度の阻害の50％を妨
害するのに要する抗体の濃度を測定することにより決定
した。これらのＫd 値は、一般的には約50ナノモル濃度
以下であり、好ましくは約25ナノモル濃度以下であり、
そしてより好ましくは約５ナノモル濃度以下である。好
ましくはこれらの抗体が減少させる西洋ワサビペルオキ
シダーゼの活性は、約６％以下である。これらのＫd 値
が抗体の相対尺度であること、そしてそのパラメーター
を測定するための別の測定方法がより高いまたはより低
い値を与えるかもしれないことは、理解されるべきであ
る。
【００３６】ここで有用な阻害、抗阻害およびバインダ
ーモノクローナル抗体は、いずれかの有用なクラス、例
えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはＩｇＧのもので
ありうる。好ましくは、それらがＩｇＧクラスのもので
ある。クローン化抗体培養物のアイソタイプの決定は、
従来のアイソタイピング・アッセイおよび市販の試験キ
ットを用いて達成される。リポーター酵素、例えば、西
洋ワサビペルオキシダーゼは、アイソタイピング・アッ
セイの際に種々の支持体上に直接的にまたは間接的に固
定化できる。下記第Ｉ表に、有用な阻害モノクローナル
抗体の種、アイソタイプ、Ｋd および最大西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ阻害を列挙する。
ーモノクローナル抗体は、いずれかの有用なクラス、例
えば、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくはＩｇＧのもので
ありうる。好ましくは、それらがＩｇＧクラスのもので
ある。クローン化抗体培養物のアイソタイプの決定は、
従来のアイソタイピング・アッセイおよび市販の試験キ
ットを用いて達成される。リポーター酵素、例えば、西
洋ワサビペルオキシダーゼは、アイソタイピング・アッ
セイの際に種々の支持体上に直接的にまたは間接的に固
定化できる。下記第Ｉ表に、有用な阻害モノクローナル
抗体の種、アイソタイプ、Ｋd および最大西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ阻害を列挙する。
【００３７】
【表１】
【００３８】モノクローナル抗体4-22.2が好ましい。AT
CCに寄託されたHB11603 と本明細書に明記された新規ハ
イブリドーマ・セルラインを用いることが好ましい。下
記第II表に、本発明の有用な抗阻害モノクローナル抗体
の種、アイソタイプ、Ｋd および最大西洋ワサビペルオ
キシダーゼ阻害を列挙する。
CCに寄託されたHB11603 と本明細書に明記された新規ハ
イブリドーマ・セルラインを用いることが好ましい。下
記第II表に、本発明の有用な抗阻害モノクローナル抗体
の種、アイソタイプ、Ｋd および最大西洋ワサビペルオ
キシダーゼ阻害を列挙する。
【００３９】
【表２】
【００４０】モノクローナル抗体7-32.2が好ましい。そ
れは、ブダペスト条約に基づいてATCCに寄託されたHB11
604 と本明細書に明記された新規ハイブリドーマ・セル
ラインを用いて調製される。抗体6-89.1は、またブダペ
スト条約に基づいてATCCに寄託されたHB11635 と本明細
書に明記された新規ハイブリドーマ・セルラインを用い
て調製される。
れは、ブダペスト条約に基づいてATCCに寄託されたHB11
604 と本明細書に明記された新規ハイブリドーマ・セル
ラインを用いて調製される。抗体6-89.1は、またブダペ
スト条約に基づいてATCCに寄託されたHB11635 と本明細
書に明記された新規ハイブリドーマ・セルラインを用い
て調製される。
【００４１】本発明方法に用いられる阻害抗体の量は、
一般的には酵素活性を少なくとも約80％阻害するのに要
する量すべてである。一般的には、これは約10-9〜約10
-6モル濃度であり、約10-9〜約10-8モル濃度の量が好ま
しい。阻害抗体の量は、所望される酵素活性の阻害レベ
ルおよび所定の抗体の阻害性に依存して変化するだろ
う。また、リガンドと抗阻害抗体との水溶性コンジュゲ
ートが本発明方法に用いられる。コンジュゲートは、タ
ンパク質、ホルモン、薬物、または必要な反応性基を有
する別の化学的もしくは生物学的化合物を共有結合させ
るための当該技術分野の従来の技法のいずれかを用いて
調製できる。従って、抗体およびリガンドの種々の反応
性基は、コンジュゲートを作成するための手段を選択す
る際に考慮できる。そのような基は、限定されるもので
はないが、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チ
オール基およびイミダゾール基を含む。有用な結合方法
は、限定されるものではないが、ペプチド結合、過ヨウ
素酸酸化、グルタルアルデヒド、ジカチオンエーテル、
カルバモイルオニウム塩、カルボジイミドもしくはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドの使用、および当業者に容易
に明らかな別のものを含む。これらおよび別の方法の各
々の詳細は、Williams他，Method in Immunologyand Im
munochemistry, Academic Press, New York, 1976，お
よびYoshitake 他，Eur. J. Biochem. 101, 395 (1979)
を包含する多数の文献に見出される。そのようなコンジ
ュゲートが検出しようとするリガンドの誘導体もしくは
類似体（また、ハプテンとして既知である）を用いて調
製されることが多いことは、理解されるであろう。ま
た、そのような誘導体は、リポーター酵素に対してハプ
テンを結合させるために所望されるであろう反応性基も
しくは連結部分を有する。数種のコンジュゲートの調製
について特定の詳細な説明を、実施例の前に以下に提供
する。
一般的には酵素活性を少なくとも約80％阻害するのに要
する量すべてである。一般的には、これは約10-9〜約10
-6モル濃度であり、約10-9〜約10-8モル濃度の量が好ま
しい。阻害抗体の量は、所望される酵素活性の阻害レベ
ルおよび所定の抗体の阻害性に依存して変化するだろ
う。また、リガンドと抗阻害抗体との水溶性コンジュゲ
ートが本発明方法に用いられる。コンジュゲートは、タ
ンパク質、ホルモン、薬物、または必要な反応性基を有
する別の化学的もしくは生物学的化合物を共有結合させ
るための当該技術分野の従来の技法のいずれかを用いて
調製できる。従って、抗体およびリガンドの種々の反応
性基は、コンジュゲートを作成するための手段を選択す
る際に考慮できる。そのような基は、限定されるもので
はないが、カルボキシ基、アミノ基、ヒドロキシ基、チ
オール基およびイミダゾール基を含む。有用な結合方法
は、限定されるものではないが、ペプチド結合、過ヨウ
素酸酸化、グルタルアルデヒド、ジカチオンエーテル、
カルバモイルオニウム塩、カルボジイミドもしくはＮ−
ヒドロキシスクシンイミドの使用、および当業者に容易
に明らかな別のものを含む。これらおよび別の方法の各
々の詳細は、Williams他，Method in Immunologyand Im
munochemistry, Academic Press, New York, 1976，お
よびYoshitake 他，Eur. J. Biochem. 101, 395 (1979)
を包含する多数の文献に見出される。そのようなコンジ
ュゲートが検出しようとするリガンドの誘導体もしくは
類似体（また、ハプテンとして既知である）を用いて調
製されることが多いことは、理解されるであろう。ま
た、そのような誘導体は、リポーター酵素に対してハプ
テンを結合させるために所望されるであろう反応性基も
しくは連結部分を有する。数種のコンジュゲートの調製
について特定の詳細な説明を、実施例の前に以下に提供
する。
【００４２】本発明方法に用いられる水溶性コンジュゲ
ートの量は、一般的には酵素活性をわずか約20％しか阻
害せず、かつリポーター酵素と阻害抗体との反応を実質
的にすべて遮断するのに要する量である。「実質的にす
べて」とは、少なくとも95％を意味する。典型的には、
コンジュゲートの量は、約 4×10-9〜約 2×10-7モル濃
度であり、約10-8〜約10-7モル濃度の量が好ましい。コ
ンジュゲートの量は、所定の抗体の性質、所望される酵
素活性の量および遮断しようとする阻害抗体の量に依存
して変化するであろう。本発明のアッセイの過程でリポ
ーター酵素により発生させる信号は、信号を発生させる
のに用いられる特定のリポーター酵素および対応する試
薬（例えば、基質）に依存して、化学ルミネセンス、電
気化学もしくは比色信号でありうる。
ートの量は、一般的には酵素活性をわずか約20％しか阻
害せず、かつリポーター酵素と阻害抗体との反応を実質
的にすべて遮断するのに要する量である。「実質的にす
べて」とは、少なくとも95％を意味する。典型的には、
コンジュゲートの量は、約 4×10-9〜約 2×10-7モル濃
度であり、約10-8〜約10-7モル濃度の量が好ましい。コ
ンジュゲートの量は、所定の抗体の性質、所望される酵
素活性の量および遮断しようとする阻害抗体の量に依存
して変化するであろう。本発明のアッセイの過程でリポ
ーター酵素により発生させる信号は、信号を発生させる
のに用いられる特定のリポーター酵素および対応する試
薬（例えば、基質）に依存して、化学ルミネセンス、電
気化学もしくは比色信号でありうる。
【００４３】化学ルミネセンス信号は、リポーター酵素
に応じて多種多様な方法で発生させることができる。ほ
とんどの化学ルミネセンス系では、リポーター酵素がペ
ルオキシダーゼであり、そして酸化体、例えば、過酸化
水素が存在するかまたは何らかの形でそれを発生させて
いる（例えば、オキシダーゼとその基質との反応）。有
用な化学ルミネセンス信号は、例えば、アクリジニウム
塩、テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン、ルシフェ
リン、ルシゲニン、塩化オキザリル、所定のオキシダー
ゼ（例えば、キサンチンオキシダーゼ）および２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類（例えば、ルミ
ノールおよびイソルミノール）を用いて発生させられ
る。そのような化合物およびそれらの用途の多数の具体
例が、従来技術文献、例えば、米国特許第 4,383,031号
明細書（Boguslaski他）、米国特許第 4,598,044号明細
書（Kricka他）、米国特許第 4,729,950号明細書（Kric
ka他）、米国特許第 5,108,893号明細書（Baret ）およ
びChemiluminescence in Organic Chemistry (Gunderma
nn他，Springer-Verlag, Berlin, 1987, 204-207ペー
ジ）で知られている。化学ルミネセンス信号を発生させ
る場合、好ましくはペルオキシダーゼがリポーター酵素
として用いられ、そしてルミノールもしくは同様の化合
物が信号発生性試薬として用いられる。
に応じて多種多様な方法で発生させることができる。ほ
とんどの化学ルミネセンス系では、リポーター酵素がペ
ルオキシダーゼであり、そして酸化体、例えば、過酸化
水素が存在するかまたは何らかの形でそれを発生させて
いる（例えば、オキシダーゼとその基質との反応）。有
用な化学ルミネセンス信号は、例えば、アクリジニウム
塩、テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン、ルシフェ
リン、ルシゲニン、塩化オキザリル、所定のオキシダー
ゼ（例えば、キサンチンオキシダーゼ）および２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン類（例えば、ルミ
ノールおよびイソルミノール）を用いて発生させられ
る。そのような化合物およびそれらの用途の多数の具体
例が、従来技術文献、例えば、米国特許第 4,383,031号
明細書（Boguslaski他）、米国特許第 4,598,044号明細
書（Kricka他）、米国特許第 4,729,950号明細書（Kric
ka他）、米国特許第 5,108,893号明細書（Baret ）およ
びChemiluminescence in Organic Chemistry (Gunderma
nn他，Springer-Verlag, Berlin, 1987, 204-207ペー
ジ）で知られている。化学ルミネセンス信号を発生させ
る場合、好ましくはペルオキシダーゼがリポーター酵素
として用いられ、そしてルミノールもしくは同様の化合
物が信号発生性試薬として用いられる。
【００４４】好ましくは、比色信号が本発明方法で発生
させられる。そのような信号は、当該技術分野で既知で
あるような、多種多様なリポーター酵素および試薬を用
いて達成できる。リポーター酵素がペルオキシダーゼで
ある場合（これは好ましい）、有用な色素提供性試薬
は、限定されるものではないが、テトラメチルベンジジ
ンおよびその誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、トリア
リールメタン類、ならびにイミダゾールロイコ色素類、
例えば、米国特許第 4,087,747号明細書（Bruschi ）お
よび米国特許第 5,024,935号明細書（McClune ）（両方
とも引用することにより本明細書に組み入れられる）に
記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素を含む。種
々のリポーター酵素の基質溶液は、本発明のアッセイに
適する時間に提供してもよく、またはそれらをアッセイ
全体を通して存在させることもできる。ある有用なトリ
アリールイミダゾールロイコ色素の基質溶液は、過酸化
水素および電子移動剤、例えば、４′−ヒドロキシアセ
トアニリドもしくは３′−クロロ−４′−ヒドロキシア
セトアニリドを適当な緩衝液中に含む。
させられる。そのような信号は、当該技術分野で既知で
あるような、多種多様なリポーター酵素および試薬を用
いて達成できる。リポーター酵素がペルオキシダーゼで
ある場合（これは好ましい）、有用な色素提供性試薬
は、限定されるものではないが、テトラメチルベンジジ
ンおよびその誘導体、ｏ−フェニレンジアミン、トリア
リールメタン類、ならびにイミダゾールロイコ色素類、
例えば、米国特許第 4,087,747号明細書（Bruschi ）お
よび米国特許第 5,024,935号明細書（McClune ）（両方
とも引用することにより本明細書に組み入れられる）に
記載のトリアリールイミダゾールロイコ色素を含む。種
々のリポーター酵素の基質溶液は、本発明のアッセイに
適する時間に提供してもよく、またはそれらをアッセイ
全体を通して存在させることもできる。ある有用なトリ
アリールイミダゾールロイコ色素の基質溶液は、過酸化
水素および電子移動剤、例えば、４′−ヒドロキシアセ
トアニリドもしくは３′−クロロ−４′−ヒドロキシア
セトアニリドを適当な緩衝液中に含む。
【００４５】所望の信号を生成するのに必要とされる種
々試薬の量は、種々の信号生成性系について入手可能な
多数の文献を参照することにより、当業者に容易に明ら
かであるだろう。好ましい比色系を得るための特定の手
段を、以下の実施例に示す。また、アッセイで発生する
所望の信号を検出するのに必要とされる装置は、当業者
に容易に明らかであるだろう。いくらかの比色信号は、
使用者の目視的観察により容易に評価できるが、より一
般的には、信号が比色、蛍光もしくは化学ルミネセンス
信号を受けて評価するための適当な装置を用いて評価さ
れる。
々試薬の量は、種々の信号生成性系について入手可能な
多数の文献を参照することにより、当業者に容易に明ら
かであるだろう。好ましい比色系を得るための特定の手
段を、以下の実施例に示す。また、アッセイで発生する
所望の信号を検出するのに必要とされる装置は、当業者
に容易に明らかであるだろう。いくらかの比色信号は、
使用者の目視的観察により容易に評価できるが、より一
般的には、信号が比色、蛍光もしくは化学ルミネセンス
信号を受けて評価するための適当な装置を用いて評価さ
れる。
【００４６】本明細書に記載されかつ本発明方法の実施
に際して使用される試薬は、試験キットの個別に包装さ
れた成分として供給することができる。そのようなキッ
トは、前記固定化レセプターおよび少なくとも２種の他
の試薬を包含する、３種以上の必須の試薬を含む。ま
た、キットは、必要であれば試験デバイスおよび濾過デ
バイスを包含する、適当な容器、装置および本発明方法
を実施するための使用説明書を含むこともできる。好ま
しくは、試験キットが必要な試薬すべてを別個の容器に
含む。
に際して使用される試薬は、試験キットの個別に包装さ
れた成分として供給することができる。そのようなキッ
トは、前記固定化レセプターおよび少なくとも２種の他
の試薬を包含する、３種以上の必須の試薬を含む。ま
た、キットは、必要であれば試験デバイスおよび濾過デ
バイスを包含する、適当な容器、装置および本発明方法
を実施するための使用説明書を含むこともできる。好ま
しくは、試験キットが必要な試薬すべてを別個の容器に
含む。
【００４７】本発明方法は、適当な容器、例えば、マイ
クロタイタープレート、使い捨て試験デバイス（例え
ば、SURECELL（商標）試験デバイスとして市販されてい
るもの）、ガラススライド、試験管および当業者に容易
に明らかな別のもので実施できる。また好ましくは、本
方法が、少なくとも固定化リポーター酵素および前記固
定化レセプターを含む、本発明の乾式分析要素を用いて
実施できる。要素は、希釈されたまたは希釈されていな
い試験試料（一般的には１〜200 μＬ）に適応でき、か
つ濾紙、試験スライド、浸漬棒および当業者に容易に明
らかである別の形状でありうる、少なくとも多孔質の展
開層を含む。
クロタイタープレート、使い捨て試験デバイス（例え
ば、SURECELL（商標）試験デバイスとして市販されてい
るもの）、ガラススライド、試験管および当業者に容易
に明らかな別のもので実施できる。また好ましくは、本
方法が、少なくとも固定化リポーター酵素および前記固
定化レセプターを含む、本発明の乾式分析要素を用いて
実施できる。要素は、希釈されたまたは希釈されていな
い試験試料（一般的には１〜200 μＬ）に適応でき、か
つ濾紙、試験スライド、浸漬棒および当業者に容易に明
らかである別の形状でありうる、少なくとも多孔質の展
開層を含む。
【００４８】好ましくは、その多孔性が、粒子、繊維も
しくは多孔質展開層の別の物質的成分の間の相互に連結
した空間により提供されている多孔質展開層が、等方性
多孔質である。等方性多孔質とは、流体が層中を均一に
展開することを意味する。そのような帯域に有用な物質
は、水不溶性でありかつアッセイ中それらの構造保全性
を維持する。従来の物質は、例えば、米国特許第 3,99
2,158号明細書（Przybylowicz他）、米国特許第 4,258,
001号明細書（Pierce他）、米国特許第 4,292,272号明
細書（Kitajima他）および米国特許第 4,430,436号明細
書（Koyama他）（これらは引用することにより本明細書
中に組み入れられる）に記載されている。好ましい多孔
質展開層は、Pierce他の特許に記載されるような有機ポ
リマー粒子およびポリマー接着剤から調製されるもの、
ならびにPrzybylowicz他の特許に記載されるような「ブ
ラッシング（blush ）」展開層である。
しくは多孔質展開層の別の物質的成分の間の相互に連結
した空間により提供されている多孔質展開層が、等方性
多孔質である。等方性多孔質とは、流体が層中を均一に
展開することを意味する。そのような帯域に有用な物質
は、水不溶性でありかつアッセイ中それらの構造保全性
を維持する。従来の物質は、例えば、米国特許第 3,99
2,158号明細書（Przybylowicz他）、米国特許第 4,258,
001号明細書（Pierce他）、米国特許第 4,292,272号明
細書（Kitajima他）および米国特許第 4,430,436号明細
書（Koyama他）（これらは引用することにより本明細書
中に組み入れられる）に記載されている。好ましい多孔
質展開層は、Pierce他の特許に記載されるような有機ポ
リマー粒子およびポリマー接着剤から調製されるもの、
ならびにPrzybylowicz他の特許に記載されるような「ブ
ラッシング（blush ）」展開層である。
【００４９】好ましくは、固定化リポーター酵素が多孔
質展開層に配置され、そして他の試薬がアッセイ中要素
に添加されるかまたは展開層に組み入れられる（例え
ば、多孔質展開層の上もしくは真下に親水性試薬層）。
好ましくはすべての層が、適当な物質（例えば、紙、金
属ホイル、ガラススライドもしくはポリマーフィルム、
例えば、ポリエステル、ポリカーボネートもしくはポリ
オレフィンのフィルム）から調製される不活性非孔質支
持体上に配置される。支持体は、透明であっても、また
は信号検出モード（例えば、透過もしくは反射率分光
法）に従わなくてもよい。
質展開層に配置され、そして他の試薬がアッセイ中要素
に添加されるかまたは展開層に組み入れられる（例え
ば、多孔質展開層の上もしくは真下に親水性試薬層）。
好ましくはすべての層が、適当な物質（例えば、紙、金
属ホイル、ガラススライドもしくはポリマーフィルム、
例えば、ポリエステル、ポリカーボネートもしくはポリ
オレフィンのフィルム）から調製される不活性非孔質支
持体上に配置される。支持体は、透明であっても、また
は信号検出モード（例えば、透過もしくは反射率分光
法）に従わなくてもよい。
【００５０】すべての他の層は、多孔質展開層と「流体
接触状態」であり、これは、流体および非固定化試薬が
層の間を自由に移動できることを意味する。そのような
層に常用されるバインダー物質は、前記Pierce他および
Przybylowicz他の特許を初めとする当該技術分野で周知
である（例えば、ゼラチン、アクリルアミドポリマー類
およびビニルピロリドンポリマー類）。所望であれば、
要素は、１つ以上の当該技術分野で既知であるような輻
射線遮断性層、下塗り層もしくは水溶解性層を含むこと
ができる。
接触状態」であり、これは、流体および非固定化試薬が
層の間を自由に移動できることを意味する。そのような
層に常用されるバインダー物質は、前記Pierce他および
Przybylowicz他の特許を初めとする当該技術分野で周知
である（例えば、ゼラチン、アクリルアミドポリマー類
およびビニルピロリドンポリマー類）。所望であれば、
要素は、１つ以上の当該技術分野で既知であるような輻
射線遮断性層、下塗り層もしくは水溶解性層を含むこと
ができる。
【００５１】本アッセイで用いられるリポーター酵素お
よびレセプターは、一般的には要素の同じ層または異な
る層の別個の（または異なる）ポリマー粒子上に固定化
できる。加えて、阻害抗体、およびリガンドと抗阻害抗
体との水溶性コンジュゲートは、抗体およびコンジュゲ
ートが、固定化レセプターおよび固定化リポーター酵素
から離されているが血液試料を要素に添加したときに反
応できることを条件として、適当な配置で要素に組み込
まれる。このような分離は、要素の異なる層に試薬を置
くことにより、または幾つかの試薬を水溶解性物質（例
えば、ゲル、デキストランもしくはプロテイノイド類）
を用いてカプセル化して同じ層に入れることにより達成
できる。試験試料を要素に添加すると、カプセル化物質
は溶解して試薬を放出し、反応が起こる。
よびレセプターは、一般的には要素の同じ層または異な
る層の別個の（または異なる）ポリマー粒子上に固定化
できる。加えて、阻害抗体、およびリガンドと抗阻害抗
体との水溶性コンジュゲートは、抗体およびコンジュゲ
ートが、固定化レセプターおよび固定化リポーター酵素
から離されているが血液試料を要素に添加したときに反
応できることを条件として、適当な配置で要素に組み込
まれる。このような分離は、要素の異なる層に試薬を置
くことにより、または幾つかの試薬を水溶解性物質（例
えば、ゲル、デキストランもしくはプロテイノイド類）
を用いてカプセル化して同じ層に入れることにより達成
できる。試験試料を要素に添加すると、カプセル化物質
は溶解して試薬を放出し、反応が起こる。
【００５２】本発明の好ましい態様では、多層要素は、
非孔質支持体上に、流体接触状態で、第１試薬層、下塗
り層、多孔質展開層、多孔質展開層に配置された固定化
レセプターおよび固定化リポーター酵素、ならびに阻害
抗体、およびリガンドと抗阻害抗体との水溶性コンジュ
ゲート（これらのいずれかは第１試薬層もしくは下塗り
層に存在する）、を含む。
非孔質支持体上に、流体接触状態で、第１試薬層、下塗
り層、多孔質展開層、多孔質展開層に配置された固定化
レセプターおよび固定化リポーター酵素、ならびに阻害
抗体、およびリガンドと抗阻害抗体との水溶性コンジュ
ゲート（これらのいずれかは第１試薬層もしくは下塗り
層に存在する）、を含む。
【００５３】また、要素は、製造、流体展開、試薬安定
および望ましくないバックグラウンドの吸収を補助する
ことが当該技術分野で知られているような種々の添加剤
を適当な層に含む。要素は、従来技術文献に記載されて
いるような（グラビア、カーテン、ホッパーおよび別の
塗布技法を含む）従来の塗布方法および装置を用いて調
製できる。要素は、いずれか所望の幅の伸長テープ、シ
ート、スライドもしくはチップを包含する、様々な形を
取ることができる。さらに、本発明方法は、適当な装置
および方法を用いて、要素中で発生した所望の信号を手
動的または自動的に検出できる。一般的には、標的特異
的結合リガンドを含むと推測される流体の試験試料が多
孔質展開層にスポットされ、そして流体が要素内を移動
して、反応に効果的に試薬を混合する。
および望ましくないバックグラウンドの吸収を補助する
ことが当該技術分野で知られているような種々の添加剤
を適当な層に含む。要素は、従来技術文献に記載されて
いるような（グラビア、カーテン、ホッパーおよび別の
塗布技法を含む）従来の塗布方法および装置を用いて調
製できる。要素は、いずれか所望の幅の伸長テープ、シ
ート、スライドもしくはチップを包含する、様々な形を
取ることができる。さらに、本発明方法は、適当な装置
および方法を用いて、要素中で発生した所望の信号を手
動的または自動的に検出できる。一般的には、標的特異
的結合リガンドを含むと推測される流体の試験試料が多
孔質展開層にスポットされ、そして流体が要素内を移動
して、反応に効果的に試薬を混合する。
【００５４】試料塗布後、要素を適当な調節処理、例え
ば、インキュベーション、加熱または別の処理にかけ
て、要素内の所望の反応を速めるかまたは促進させる。
あるいは、調節処理を中断して、要素に組み入れられて
いない１つ以上の試薬を添加することができる。発生し
た信号は、要素の限定領域で評価してもよく、またはそ
の全表面に渡って評価してもよい。以下の実施例は、本
発明を具体的に説明するものであり、限定することを意
図するものではない。すべてのパーセンテージは、特に
断らない限り重量パーセントである。
ば、インキュベーション、加熱または別の処理にかけ
て、要素内の所望の反応を速めるかまたは促進させる。
あるいは、調節処理を中断して、要素に組み入れられて
いない１つ以上の試薬を添加することができる。発生し
た信号は、要素の限定領域で評価してもよく、またはそ
の全表面に渡って評価してもよい。以下の実施例は、本
発明を具体的に説明するものであり、限定することを意
図するものではない。すべてのパーセンテージは、特に
断らない限り重量パーセントである。
【００５５】実施例の材料および方法： 西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な阻害モノクロー
ナル抗体の調製： 前記第Ｉ表で4-22.2と示されたモノク
ローナル抗体を以下のように調製した。スプレーグ・ド
ーリーネズミに、市販TDM/MPL アジュバント乳剤（RIBI
Corporation）に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ 400μ
ｇ）を含む溶液を、４週間おきに４回注射した。５回目
の注射は、リン酸緩衝溶液中西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ 400μｇ）を用いて行った。３日後、免疫したラッ
トの脾細胞を、従来の方法を用いてSp2/0-Ag14骨髄腫セ
ルライン由来の細胞と融合させた。
ナル抗体の調製： 前記第Ｉ表で4-22.2と示されたモノク
ローナル抗体を以下のように調製した。スプレーグ・ド
ーリーネズミに、市販TDM/MPL アジュバント乳剤（RIBI
Corporation）に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ 400μ
ｇ）を含む溶液を、４週間おきに４回注射した。５回目
の注射は、リン酸緩衝溶液中西洋ワサビペルオキシダー
ゼ（ 400μｇ）を用いて行った。３日後、免疫したラッ
トの脾細胞を、従来の方法を用いてSp2/0-Ag14骨髄腫セ
ルライン由来の細胞と融合させた。
【００５６】前記のように、西洋ワサビペルオキシダー
ゼと、マイクロタイタープレートに対する西洋ワサビペ
ルオキシダーゼの吸着を媒介するのに役立つ不適当な抗
体とのコンジュゲートを被覆したマイクロタイタープレ
ートのウェルに50μＬの培養液上清を添加することによ
り、得られた西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗
体のスクリーニングを実施した。ヤギ抗マウスＩｇＧ
Ｆｃとアルカリ性ホスファターゼとのコンジュゲート
（Jackson Immunoresearch）を添加し、続いてトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ 1.5モル濃
度，pH８）中にアルカリ性ホスファターゼの基質として
ｏ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（Sigma Chem
ical）を含むもの（４mg/mL ）を用いて信号を発生させ
ることにより、結合した抗体を検出した。30分後に、従
来のマイクロタイタープレート・リーダーを用いて色素
信号を評価した。
ゼと、マイクロタイタープレートに対する西洋ワサビペ
ルオキシダーゼの吸着を媒介するのに役立つ不適当な抗
体とのコンジュゲートを被覆したマイクロタイタープレ
ートのウェルに50μＬの培養液上清を添加することによ
り、得られた西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗
体のスクリーニングを実施した。ヤギ抗マウスＩｇＧ
Ｆｃとアルカリ性ホスファターゼとのコンジュゲート
（Jackson Immunoresearch）を添加し、続いてトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ 1.5モル濃
度，pH８）中にアルカリ性ホスファターゼの基質として
ｏ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（Sigma Chem
ical）を含むもの（４mg/mL ）を用いて信号を発生させ
ることにより、結合した抗体を検出した。30分後に、従
来のマイクロタイタープレート・リーダーを用いて色素
信号を評価した。
【００５７】西洋ワサビペルオキシダーゼ阻害機能につ
いてのスクリーニングを以下のように実施した。マイク
ロタイタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50
μＬ）を添加し、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン
（ 0.8％）を含むものを添加し、そして得られた混合物
を10分間室温でインキュベートした。クエン酸／リン酸
緩衝液（50μＬ，50ミリモル濃度，pH 5.5）中にｏ−フ
ェニレンジアミン（１mg/mL ）を含む溶液（ 100μＬ）
を添加し、そして色素信号の量を 450nmで従来のマイク
ロタイタープレート・リーダー（ 100mOD/分）を用いて
測定することにより、残留西洋ワサビペルオキシダーゼ
活性を測定した。等容量の培養液上清および西洋ワサビ
ペルオキシダーゼをマイクロタイタープレートのウェル
に添加し、そして前記方法（「酵素阻害についてのアッ
セイ」）を用いて、酵素活性を少なくとも約20％阻害し
た抗体を選択した。抗体4-22.2を測定すると、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ活性を99％阻害した。
いてのスクリーニングを以下のように実施した。マイク
ロタイタープレートのウェルに各培養液上清の試料（50
μＬ）を添加し、続いてリン酸緩衝溶液中に西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ 0.2ナノモル濃度）およびゼラチン
（ 0.8％）を含むものを添加し、そして得られた混合物
を10分間室温でインキュベートした。クエン酸／リン酸
緩衝液（50μＬ，50ミリモル濃度，pH 5.5）中にｏ−フ
ェニレンジアミン（１mg/mL ）を含む溶液（ 100μＬ）
を添加し、そして色素信号の量を 450nmで従来のマイク
ロタイタープレート・リーダー（ 100mOD/分）を用いて
測定することにより、残留西洋ワサビペルオキシダーゼ
活性を測定した。等容量の培養液上清および西洋ワサビ
ペルオキシダーゼをマイクロタイタープレートのウェル
に添加し、そして前記方法（「酵素阻害についてのアッ
セイ」）を用いて、酵素活性を少なくとも約20％阻害し
た抗体を選択した。抗体4-22.2を測定すると、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ活性を99％阻害した。
【００５８】西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗
阻害モノクローナル抗体の調製：前記第II表で7-32.2と
示されたモノクローナル抗体を以下のように調製した。
マウスの免疫化および得られた脾細胞の融合を、前記調
製で記載したように実施した。TDM/MPL アジュバント乳
剤中にＣ反応性タンパク質と西洋ワサビペルオキシダー
ゼとのコンジュゲート（各々 100μｇ/mL ）を含むもの
で、４週間おきに４回マウスを免疫した。５回目かつ最
終免疫は、リン酸緩衝溶液を用いて行った。プレートを
10〜30分間振盪した後、阻害抗体4-22.2（約15ナノモル
濃度，前記）の溶液（25μＬ）各プレートのウェルに添
加したことを除いて、前記のように西洋ワサビペルオキ
シダーゼ活性についてのスクリーニングを実施した。得
られた混合物を室温で10分間インキュベートした。
阻害モノクローナル抗体の調製：前記第II表で7-32.2と
示されたモノクローナル抗体を以下のように調製した。
マウスの免疫化および得られた脾細胞の融合を、前記調
製で記載したように実施した。TDM/MPL アジュバント乳
剤中にＣ反応性タンパク質と西洋ワサビペルオキシダー
ゼとのコンジュゲート（各々 100μｇ/mL ）を含むもの
で、４週間おきに４回マウスを免疫した。５回目かつ最
終免疫は、リン酸緩衝溶液を用いて行った。プレートを
10〜30分間振盪した後、阻害抗体4-22.2（約15ナノモル
濃度，前記）の溶液（25μＬ）各プレートのウェルに添
加したことを除いて、前記のように西洋ワサビペルオキ
シダーゼ活性についてのスクリーニングを実施した。得
られた混合物を室温で10分間インキュベートした。
【００５９】クエン酸／リン酸緩衝液（ 0.1モル濃度，
pH 5.5）中にｏ−フェニレンジアミン（ 1.2mg/mL ）を
含む溶液（ 100μＬ）を添加し、そして色素信号の量を
450nmで従来の分光光度計（ 100mOD/分）を用いて前記
調製で記載したように測定することにより、残留西洋ワ
サビペルオキシダーゼ活性を測定した。抗阻害剤である
抗体の測定を、前記方法（「抗阻害についてのアッセ
イ」）を用いて実施した。抗体7-32.2を測定すると、酵
素活性を１％未満（実質的には０％）しか減少しなかっ
た。
pH 5.5）中にｏ−フェニレンジアミン（ 1.2mg/mL ）を
含む溶液（ 100μＬ）を添加し、そして色素信号の量を
450nmで従来の分光光度計（ 100mOD/分）を用いて前記
調製で記載したように測定することにより、残留西洋ワ
サビペルオキシダーゼ活性を測定した。抗阻害剤である
抗体の測定を、前記方法（「抗阻害についてのアッセ
イ」）を用いて実施した。抗体7-32.2を測定すると、酵
素活性を１％未満（実質的には０％）しか減少しなかっ
た。
【００６０】抗阻害モノクローナル抗体とジフェニルヒ
ダントイン・ハプテンとのコンジュゲートの調製：ジフ
ェニルヒダントイン・ハプテンと２つの抗阻害モノクロ
ーナル抗体との水溶性コンジュゲートを調製した。この
調製法は単に代表的なものであり、本発明に有用なコン
ジュゲートの調製に必須であるわけではない。別の調製
方法も存在する。ハプテン、５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンを、ヨーロッパ特許第
0 517 327号明細書（1993年５月５日発行）の調製例２
に記載される方法により調製した。
ダントイン・ハプテンとのコンジュゲートの調製：ジフ
ェニルヒダントイン・ハプテンと２つの抗阻害モノクロ
ーナル抗体との水溶性コンジュゲートを調製した。この
調製法は単に代表的なものであり、本発明に有用なコン
ジュゲートの調製に必須であるわけではない。別の調製
方法も存在する。ハプテン、５，５−ジフェニル−３−
｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカルボニルプ
ロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニル〕ブチル｝
−２，４−イミダゾリジンジオンを、ヨーロッパ特許第
0 517 327号明細書（1993年５月５日発行）の調製例２
に記載される方法により調製した。
【００６１】このハプテンと、7-32.2もしくは6-89.1と
示した（第II表）モノクローナル抗体とを、モル比9:1
または18:1で、ジメチルスルホキシド中の濃縮したハプ
テンを、Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペリジン−
Ｎ′−〔３−プロパンスルホン酸〕緩衝液（ 0.1モル濃
度，pH８）中にいずれかの抗体（１mg/mL ）を含む溶液
にゆっくり添加することにより結合させた。得られた混
合物を室温で４時間インキュベートし、次いで一晩リン
酸緩衝溶液で透析した。最終生成物であるコンジュゲー
トを、市販の0.22μｍフィルター（Nalge Corporation,
Rochester, N.Y.）を通して濾過した。最終タンパク質
濃度を、市販の分光光度計（Beckman Instruments ）を
用いて 280nmにおける吸光度により求めた。
示した（第II表）モノクローナル抗体とを、モル比9:1
または18:1で、ジメチルスルホキシド中の濃縮したハプ
テンを、Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペリジン−
Ｎ′−〔３−プロパンスルホン酸〕緩衝液（ 0.1モル濃
度，pH８）中にいずれかの抗体（１mg/mL ）を含む溶液
にゆっくり添加することにより結合させた。得られた混
合物を室温で４時間インキュベートし、次いで一晩リン
酸緩衝溶液で透析した。最終生成物であるコンジュゲー
トを、市販の0.22μｍフィルター（Nalge Corporation,
Rochester, N.Y.）を通して濾過した。最終タンパク質
濃度を、市販の分光光度計（Beckman Instruments ）を
用いて 280nmにおける吸光度により求めた。
【００６２】抗阻害モノクローナル抗体とフェノバルビ
タール・ハプテンとのコンジュゲートの調製：フェニバ
ルビタール・ハプテンと抗阻害モノクローナル抗体との
２つの水溶性コンジュゲートを以下の方法で調製した。
この調製法は単に代表的なものであり、本発明に有用な
コンジュゲートの調製に必須であるわけではない。別の
調製方法も存在する。ハプテン、５−エチル−５−フェ
ニル−１−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカ
ルボニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニ
ル〕ブチル｝−２，４，６−（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）ピリ
ミジントリオンを、ヨーロッパ特許第 0517 327号明細
書（1993年５月５日発行）の調製例４に記載される方法
により調製した。
タール・ハプテンとのコンジュゲートの調製：フェニバ
ルビタール・ハプテンと抗阻害モノクローナル抗体との
２つの水溶性コンジュゲートを以下の方法で調製した。
この調製法は単に代表的なものであり、本発明に有用な
コンジュゲートの調製に必須であるわけではない。別の
調製方法も存在する。ハプテン、５−エチル−５−フェ
ニル−１−｛４−〔４−（３−スクシンイミドオキシカ
ルボニルプロピオニル）−１−ピペラジニルカルボニ
ル〕ブチル｝−２，４，６−（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）ピリ
ミジントリオンを、ヨーロッパ特許第 0517 327号明細
書（1993年５月５日発行）の調製例４に記載される方法
により調製した。
【００６３】このハプテンと、7-32.2もしくは6-89.1と
示した（第II表）モノクローナル抗体とを、モル比9:1
，18:1または27:1で、ジメチルスルホキシド中の濃縮
したハプテンを、Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペリ
ジン−Ｎ′−〔３−プロパンスルホン酸〕緩衝液（ 0.1
モル濃度，pH８）中にいずれかの抗体（１mg/mL ）を含
む溶液にゆっくり添加することにより結合させた。得ら
れた混合物を室温で４時間インキュベートし、次いで一
晩リン酸緩衝溶液で透析した。最終生成物であるコンジ
ュゲートを、市販の0.22μｍフィルター（Nalge Corpor
ation, Rochester, N.Y.）を通して濾過した。最終タン
パク質濃度を、市販の分光光度計（Beckman Instrument
s ）を用いて 280nmにおける吸光度により求めた。
示した（第II表）モノクローナル抗体とを、モル比9:1
，18:1または27:1で、ジメチルスルホキシド中の濃縮
したハプテンを、Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペリ
ジン−Ｎ′−〔３−プロパンスルホン酸〕緩衝液（ 0.1
モル濃度，pH８）中にいずれかの抗体（１mg/mL ）を含
む溶液にゆっくり添加することにより結合させた。得ら
れた混合物を室温で４時間インキュベートし、次いで一
晩リン酸緩衝溶液で透析した。最終生成物であるコンジ
ュゲートを、市販の0.22μｍフィルター（Nalge Corpor
ation, Rochester, N.Y.）を通して濾過した。最終タン
パク質濃度を、市販の分光光度計（Beckman Instrument
s ）を用いて 280nmにおける吸光度により求めた。
【００６４】抗阻害モノクローナル抗体とジゴキシン・
ハプテンとのコンジュゲートの調製：ジゴキシン・ハプ
テンと抗阻害モノクローナル抗体との２つの水溶性コン
ジュゲートを以下の方法で調製した。この調製法は代表
的なものであり、そのようなコンジュゲートを調製する
別の調製方法を使用できる。ハプテンと、7-32.2もしく
は6-89.1と示した（第II表）モノクローナル抗体とを、
２mgの各抗体（1:1 ）を酢酸ナトリウム（ 0.1モル濃
度，pH5.5 ）で２mLを越えないように希釈することによ
り結合させた。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（１mL）を6.
66mg/mL の濃度で添加した。ホイルで反応混合物に蓋を
して、室温で20分間回転させた。酢酸ナトリウム（ 0.1
モル濃度，pH5.5 ）で予め平衡化させた市販のPD10カラ
ム（Pharmacia, Inc. ）に反応混合物を通過させて、過
剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。ジゴキシゲ
ニン−ｘ−ヒドラジド（Boehringer Mannheim ）の２つ
のバイアル（１mL中３mg）を各混合物に添加し、そして
室温で１時間インキュベートした。反応を遮断するため
に、過剰のグリシン（最終濃度10％）をpH７で添加し、
続いて水にシアノホウ水素化ナトリウムを含むものを最
終濃度20ミリモル濃度まで添加した。反応混合物を室温
で３時間攪拌し、次いで一晩３−（Ｎ−モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸緩衝液（0.02モル濃度，pH７）で透析
した。最終生成物であるコンジュゲートを、市販の0.22
μｍフィルター（Nalge Corporation, Rochester, N.
Y.）を通して濾過した。最終タンパク質濃度を、市販の
分光光度計（Beckman Instruments ）を用いて 280nmに
おける吸光度により求めた。
ハプテンとのコンジュゲートの調製：ジゴキシン・ハプ
テンと抗阻害モノクローナル抗体との２つの水溶性コン
ジュゲートを以下の方法で調製した。この調製法は代表
的なものであり、そのようなコンジュゲートを調製する
別の調製方法を使用できる。ハプテンと、7-32.2もしく
は6-89.1と示した（第II表）モノクローナル抗体とを、
２mgの各抗体（1:1 ）を酢酸ナトリウム（ 0.1モル濃
度，pH5.5 ）で２mLを越えないように希釈することによ
り結合させた。メタ過ヨウ素酸ナトリウム（１mL）を6.
66mg/mL の濃度で添加した。ホイルで反応混合物に蓋を
して、室温で20分間回転させた。酢酸ナトリウム（ 0.1
モル濃度，pH5.5 ）で予め平衡化させた市販のPD10カラ
ム（Pharmacia, Inc. ）に反応混合物を通過させて、過
剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。ジゴキシゲ
ニン−ｘ−ヒドラジド（Boehringer Mannheim ）の２つ
のバイアル（１mL中３mg）を各混合物に添加し、そして
室温で１時間インキュベートした。反応を遮断するため
に、過剰のグリシン（最終濃度10％）をpH７で添加し、
続いて水にシアノホウ水素化ナトリウムを含むものを最
終濃度20ミリモル濃度まで添加した。反応混合物を室温
で３時間攪拌し、次いで一晩３−（Ｎ−モルホリノ）プ
ロパンスルホン酸緩衝液（0.02モル濃度，pH７）で透析
した。最終生成物であるコンジュゲートを、市販の0.22
μｍフィルター（Nalge Corporation, Rochester, N.
Y.）を通して濾過した。最終タンパク質濃度を、市販の
分光光度計（Beckman Instruments ）を用いて 280nmに
おける吸光度により求めた。
【００６５】抗体の固定化：実施例のアッセイに用いら
れる種々の標的特異的結合リガンドの抗体を、ポリ〔ス
チレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸〕（モル比95:5，平均サイズ１μｍ）の粒上に、米
国特許第 5,177,023号明細書（Sutton他）に記載された
方法（引用することにより本明細書中に組み入れられ
る）を用いて固定化した。ジフェニルヒダントインに特
異的な抗体をBeckman より入手した。
れる種々の標的特異的結合リガンドの抗体を、ポリ〔ス
チレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸〕（モル比95:5，平均サイズ１μｍ）の粒上に、米
国特許第 5,177,023号明細書（Sutton他）に記載された
方法（引用することにより本明細書中に組み入れられ
る）を用いて固定化した。ジフェニルヒダントインに特
異的な抗体をBeckman より入手した。
【００６６】酵素活性も酵素への阻害抗体の結合性も阻
害しない、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗体
を調製し、そして本発明の実施に際して使用した。これ
らの抗体は、それらが西洋ワサビペルオキシダーゼに特
異的に結合するため、本明細書では「バインダー」抗体
と示されている。しかしながら、それらは実質的には前
記阻害抗体もしくは抗阻害抗体の性質を有していない。
前記ハイブリドーマ技法および前記スクリーニング方法
を用いて、バインダー抗体を調製して同定した。そのよ
うな抗体は、酵素に対して高い親和性を示した。先に、
そのような抗体は本明細書中「5-10」と示されており、
それらはBalb/cを用いて前記方法により誘導されたＩｇ
Ｇ１抗体である。そのＫd を測定すると少なくとも10-8
であり、そしてその西洋ワサビペルオキシダーゼ阻害は
１％未満であった。
害しない、西洋ワサビペルオキシダーゼに特異的な抗体
を調製し、そして本発明の実施に際して使用した。これ
らの抗体は、それらが西洋ワサビペルオキシダーゼに特
異的に結合するため、本明細書では「バインダー」抗体
と示されている。しかしながら、それらは実質的には前
記阻害抗体もしくは抗阻害抗体の性質を有していない。
前記ハイブリドーマ技法および前記スクリーニング方法
を用いて、バインダー抗体を調製して同定した。そのよ
うな抗体は、酵素に対して高い親和性を示した。先に、
そのような抗体は本明細書中「5-10」と示されており、
それらはBalb/cを用いて前記方法により誘導されたＩｇ
Ｇ１抗体である。そのＫd を測定すると少なくとも10-8
であり、そしてその西洋ワサビペルオキシダーゼ阻害は
１％未満であった。
【００６７】西洋ワサビペルオキシダーゼ，イソ酵素Ｃ
は、Servac, Inc.（南アフリカ）より入手した。それを
米国特許第 5,177,023号明細書（前記）に記載された方
法を用いて固定化されているバインダー抗体5-10と複合
させることにより、抗リガンド抗体について先に記載し
たものと同じ型のポリマー粒子上にそれを固定化した。
酵素基質溶液Ａは、メルチオレート（商標， 0.1％）を
含むクエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム0.05モル濃
度，二塩基性リン酸ナトリウム 0.1モル濃度，pH5.5 ）
の溶液（25mL）にｏ−フェニレンジアミン（30mg）を含
む。最終生成物に（1.33リットル当たり）、尿素／過酸
化水素の１グラム錠を添加した。
は、Servac, Inc.（南アフリカ）より入手した。それを
米国特許第 5,177,023号明細書（前記）に記載された方
法を用いて固定化されているバインダー抗体5-10と複合
させることにより、抗リガンド抗体について先に記載し
たものと同じ型のポリマー粒子上にそれを固定化した。
酵素基質溶液Ａは、メルチオレート（商標， 0.1％）を
含むクエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム0.05モル濃
度，二塩基性リン酸ナトリウム 0.1モル濃度，pH5.5 ）
の溶液（25mL）にｏ−フェニレンジアミン（30mg）を含
む。最終生成物に（1.33リットル当たり）、尿素／過酸
化水素の１グラム錠を添加した。
【００６８】Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに４，５−
ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒド
ロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色
素（１ｇ）を含む溶液（５mL）をポリビニルピロリドン
（ 125ｇ）の溶液（ 500mL）に添加して、１時間攪拌す
ることにより、酵素基質溶液Ｂを調製した。ジエチレン
トリアミン五酢酸（１mL， 0.1モル濃度）を一塩基性リ
ン酸ナトリウム（13.8ｇ）の溶液（9500mL）に攪拌しな
がら添加し、続いて３′−クロロ−４′−ヒドロキシア
セトアニリド（ 9.4ｇ）を添加した。得られた混合物を
成分が溶解するまで攪拌し、そして50％水酸化ナトリウ
ムでpHを 6.8に調整した。激しく攪拌しながら、次いで
それをロイコ色素溶液と混合した。過酸化水素（10mL，
30％）を添加し、そして最終混合物をさらに15分間攪拌
した。
ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２−（４−ヒド
ロキシ−３−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ色
素（１ｇ）を含む溶液（５mL）をポリビニルピロリドン
（ 125ｇ）の溶液（ 500mL）に添加して、１時間攪拌す
ることにより、酵素基質溶液Ｂを調製した。ジエチレン
トリアミン五酢酸（１mL， 0.1モル濃度）を一塩基性リ
ン酸ナトリウム（13.8ｇ）の溶液（9500mL）に攪拌しな
がら添加し、続いて３′−クロロ−４′−ヒドロキシア
セトアニリド（ 9.4ｇ）を添加した。得られた混合物を
成分が溶解するまで攪拌し、そして50％水酸化ナトリウ
ムでpHを 6.8に調整した。激しく攪拌しながら、次いで
それをロイコ色素溶液と混合した。過酸化水素（10mL，
30％）を添加し、そして最終混合物をさらに15分間攪拌
した。
【００６９】実施例１ ジフェニルヒダントインについ
ての分離工程を含まないアッセイ リガンド、ジフェニルヒダントイン（フェニトイン）
を、以下のように本発明に従って測定した。阻害抗体溶
液（10-9モル濃度）と抗阻害抗体−ジフェニルヒダント
イン・コンジュゲート溶液（ 5.3×10-8モル濃度）とを
混合した（総容量25μＬ）。この混合物に、ジフェニル
ヒダントイン（０〜10-4モル濃度の幾つかの濃度）およ
びゼラチン（ 0.8％）をリン酸緩衝溶液に含む試験試料
（25μＬ）を添加した。前記のようにポリマー粒子に付
着させた西洋ワサビペルオキシダーゼ（25μＬ，10-1 0
モル濃度）および前記のようにポリマー粒子に付着させ
た抗ジフェニルヒダントイン抗体（25μＬ，３×10-6モ
ル濃度）の懸濁液を調製した。次いでこの懸濁液を、被
分析物を含む混合物と混合して反応混合物（ 100μＬ，
pH７）を生成し、そして従来のマイクロタイタープレー
トのウェルに入れた。その混合物を室温で攪拌しながら
10分間インキュベートし、その後、ｏ−フェニレンジア
ミンの酵素基質溶液（ 100μＬ）をプレート振盪器上で
さらに混合させながら添加した。市販のマイクロタイタ
ープレート・リーダー TITERTEK（商標）MCC340 Mark
IIを用いて 450nmで、酵素活性由来の色素信号を測定し
た。
ての分離工程を含まないアッセイ リガンド、ジフェニルヒダントイン（フェニトイン）
を、以下のように本発明に従って測定した。阻害抗体溶
液（10-9モル濃度）と抗阻害抗体−ジフェニルヒダント
イン・コンジュゲート溶液（ 5.3×10-8モル濃度）とを
混合した（総容量25μＬ）。この混合物に、ジフェニル
ヒダントイン（０〜10-4モル濃度の幾つかの濃度）およ
びゼラチン（ 0.8％）をリン酸緩衝溶液に含む試験試料
（25μＬ）を添加した。前記のようにポリマー粒子に付
着させた西洋ワサビペルオキシダーゼ（25μＬ，10-1 0
モル濃度）および前記のようにポリマー粒子に付着させ
た抗ジフェニルヒダントイン抗体（25μＬ，３×10-6モ
ル濃度）の懸濁液を調製した。次いでこの懸濁液を、被
分析物を含む混合物と混合して反応混合物（ 100μＬ，
pH７）を生成し、そして従来のマイクロタイタープレー
トのウェルに入れた。その混合物を室温で攪拌しながら
10分間インキュベートし、その後、ｏ−フェニレンジア
ミンの酵素基質溶液（ 100μＬ）をプレート振盪器上で
さらに混合させながら添加した。市販のマイクロタイタ
ープレート・リーダー TITERTEK（商標）MCC340 Mark
IIを用いて 450nmで、酵素活性由来の色素信号を測定し
た。
【００７０】ｙ軸に西洋ワサビペルオキシダーゼ活性
（％）を取りかつｘ軸にジフェニルヒダントインのモル
濃度を取って得られた用量反応曲線を図１に示す。種々
の試験試料中のリガンドの増加量は、イムノアッセイで
観察された酵素活性の増加量に直接相関したことは明ら
かである。観察された酵素活性の速度は、リガンド濃度
が低いときには阻害されていない速度の約10％であり、
そしてリガンド濃度が高いときには阻害されていない速
度の60％と同程度の高さであった。
（％）を取りかつｘ軸にジフェニルヒダントインのモル
濃度を取って得られた用量反応曲線を図１に示す。種々
の試験試料中のリガンドの増加量は、イムノアッセイで
観察された酵素活性の増加量に直接相関したことは明ら
かである。観察された酵素活性の速度は、リガンド濃度
が低いときには阻害されていない速度の約10％であり、
そしてリガンド濃度が高いときには阻害されていない速
度の60％と同程度の高さであった。
【００７１】実施例２ フェノバルビタールについての
分離工程を含まないアッセイ リガンド、フェノバルビタールを、以下のように本発明
に従って測定した。阻害抗体溶液（10-9モル濃度）と抗
阻害抗体−フェノバルビタール・コンジュゲート溶液
（ 5.3×10-8モル濃度）とを混合した（総容量25μ
Ｌ）。この混合物に、フェノバルビタール（０〜10-4モ
ル濃度の幾つかの濃度）およびゼラチン（0.8％）をリ
ン酸緩衝溶液に含む試験試料（25μＬ）を添加した。前
記のようにポリマー粒子に付着させた西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（25μＬ，10-10 モル濃度）および前記のよ
うにポリマー粒子に付着させた抗フェノバルビタール抗
体（25μＬ，３×10-6モル濃度）の懸濁液を調製した。
次いでこの懸濁液を、被分析物を含む混合物と混合して
反応混合物（ 100μＬ，pH７）を生成し、そして従来の
マイクロタイタープレートのウェルに入れた。その混合
物を室温で攪拌しながら５分間インキュベートし、その
後、ｏ−フェニレンジアミンの酵素基質溶液（100μ
Ｌ）をプレート振盪器上でさらに混合させながら添加し
た。市販のマイクロタイタープレート・リーダー TITE
RTEK（商標）MCC340 Mark IIを用いて 450nmで、酵素活
性由来の色素信号を測定した。
分離工程を含まないアッセイ リガンド、フェノバルビタールを、以下のように本発明
に従って測定した。阻害抗体溶液（10-9モル濃度）と抗
阻害抗体−フェノバルビタール・コンジュゲート溶液
（ 5.3×10-8モル濃度）とを混合した（総容量25μ
Ｌ）。この混合物に、フェノバルビタール（０〜10-4モ
ル濃度の幾つかの濃度）およびゼラチン（0.8％）をリ
ン酸緩衝溶液に含む試験試料（25μＬ）を添加した。前
記のようにポリマー粒子に付着させた西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（25μＬ，10-10 モル濃度）および前記のよ
うにポリマー粒子に付着させた抗フェノバルビタール抗
体（25μＬ，３×10-6モル濃度）の懸濁液を調製した。
次いでこの懸濁液を、被分析物を含む混合物と混合して
反応混合物（ 100μＬ，pH７）を生成し、そして従来の
マイクロタイタープレートのウェルに入れた。その混合
物を室温で攪拌しながら５分間インキュベートし、その
後、ｏ−フェニレンジアミンの酵素基質溶液（100μ
Ｌ）をプレート振盪器上でさらに混合させながら添加し
た。市販のマイクロタイタープレート・リーダー TITE
RTEK（商標）MCC340 Mark IIを用いて 450nmで、酵素活
性由来の色素信号を測定した。
【００７２】ｙ軸に西洋ワサビペルオキシダーゼ活性
（％）を取りかつｘ軸にフェノバルビタールのモル濃度
を取って得られた用量反応曲線を図２に示す。種々の試
験試料中のリガンドの増加量は、イムノアッセイで観察
された酵素活性の増加量に直接相関したことは明らかで
ある。観察された酵素活性の速度は、リガンド濃度が低
いときには阻害されていない速度の約28％であり、そし
てリガンド濃度が高いときには阻害されていない速度の
75％と同程度の高さであった。曲線の中間点は、約10-6
であった。
（％）を取りかつｘ軸にフェノバルビタールのモル濃度
を取って得られた用量反応曲線を図２に示す。種々の試
験試料中のリガンドの増加量は、イムノアッセイで観察
された酵素活性の増加量に直接相関したことは明らかで
ある。観察された酵素活性の速度は、リガンド濃度が低
いときには阻害されていない速度の約28％であり、そし
てリガンド濃度が高いときには阻害されていない速度の
75％と同程度の高さであった。曲線の中間点は、約10-6
であった。
【００７３】実施例３ ジゴキシンについての分離工程
を含まないアッセイ リガンド、ジゴキシンを、以下のように本発明に従って
測定した。阻害抗体溶液（10-9モル濃度）と抗阻害抗体
−ジゴキシン・コンジュゲート溶液（ 5.3×10-8モル濃
度）とを混合した（総容量25μＬ）。この混合物に、ジ
ゴキシン（０〜10-4モル濃度の幾つかの濃度）およびゼ
ラチン（ 0.8％）をリン酸緩衝溶液に含む試験試料（25
μＬ）を添加した。前記のようにポリマー粒子に付着さ
せた西洋ワサビペルオキシダーゼ（25μＬ，10-10 モル
濃度）および前記のようにポリマー粒子に付着させた抗
ジゴキシン抗体（25μＬ，３×10-6モル濃度）の懸濁液
を調製した。次いでこの懸濁液を、被分析物を含む混合
物と混合して反応混合物（ 100μＬ，pH７）を生成し、
そして従来のマイクロタイタープレートのウェルに入れ
た。その混合物を室温で攪拌しながら10分間インキュベ
ートし、その後、ｏ−フェニレンジアミンの酵素基質溶
液（ 100μＬ）をプレート振盪器上でさらに混合させな
がら添加した。市販のマイクロタイタープレート・リー
ダー TITERTEK（商標）MCC340 Mark IIを用いて 450nm
で、酵素活性由来の色素信号を測定した。
を含まないアッセイ リガンド、ジゴキシンを、以下のように本発明に従って
測定した。阻害抗体溶液（10-9モル濃度）と抗阻害抗体
−ジゴキシン・コンジュゲート溶液（ 5.3×10-8モル濃
度）とを混合した（総容量25μＬ）。この混合物に、ジ
ゴキシン（０〜10-4モル濃度の幾つかの濃度）およびゼ
ラチン（ 0.8％）をリン酸緩衝溶液に含む試験試料（25
μＬ）を添加した。前記のようにポリマー粒子に付着さ
せた西洋ワサビペルオキシダーゼ（25μＬ，10-10 モル
濃度）および前記のようにポリマー粒子に付着させた抗
ジゴキシン抗体（25μＬ，３×10-6モル濃度）の懸濁液
を調製した。次いでこの懸濁液を、被分析物を含む混合
物と混合して反応混合物（ 100μＬ，pH７）を生成し、
そして従来のマイクロタイタープレートのウェルに入れ
た。その混合物を室温で攪拌しながら10分間インキュベ
ートし、その後、ｏ−フェニレンジアミンの酵素基質溶
液（ 100μＬ）をプレート振盪器上でさらに混合させな
がら添加した。市販のマイクロタイタープレート・リー
ダー TITERTEK（商標）MCC340 Mark IIを用いて 450nm
で、酵素活性由来の色素信号を測定した。
【００７４】ｙ軸に西洋ワサビペルオキシダーゼ活性
（％）を取りかつｘ軸にジゴキシンのモル濃度を取って
得られた用量反応曲線を図３に示す。種々の試験試料中
のリガンドの増加量は、イムノアッセイで観察された酵
素活性の増加量に直接相関したことは明らかである。観
察された酵素活性の速度は、リガンド濃度が低いときに
は阻害されていない速度の約23％であり、そしてリガン
ド濃度が高いときには阻害されていない速度の36％と同
程度の高さであり、これは本アッセイが最適化されなか
ったことを意味する。曲線の中間点は、約３×10-7であ
った。
（％）を取りかつｘ軸にジゴキシンのモル濃度を取って
得られた用量反応曲線を図３に示す。種々の試験試料中
のリガンドの増加量は、イムノアッセイで観察された酵
素活性の増加量に直接相関したことは明らかである。観
察された酵素活性の速度は、リガンド濃度が低いときに
は阻害されていない速度の約23％であり、そしてリガン
ド濃度が高いときには阻害されていない速度の36％と同
程度の高さであり、これは本アッセイが最適化されなか
ったことを意味する。曲線の中間点は、約３×10-7であ
った。
【００７５】実施例４ ジフェニルヒダントインについ
ての均一アッセイに有用な分析要素 以下の層配置および成分を有する、ジフェニルヒダント
インの検出に有用な本発明の要素を調製した。 要素構造 付着量 層 材料 (g/m2) 展開層 ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸） （重量比98:2）ビーズ 130.0 ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド− ２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２− アセトアセトキシエチルメタクリレート） （重量比90:4:6） 2.583 ウシ血清アルブミン 1.00 グリセロール 2.00 マンニトール 1.00 ジメドン 0.50 ジメチルスルホキシド 1.80 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２− （３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル） イミダゾールロイコ色素 0.20 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.45 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２− アミノメタンスルホン酸緩衝液〕 0.219 固定化抗ジフェニルヒダントイン・モノクローナル抗体 2.4 バインダー抗体5-10を用いてポリマー粒子上に固定化さ れた西洋ワサビペルオキシダーゼ 0.25 バイン ゼラチン（硬化） 10.00 ダー層 ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル 0.15 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 TRITON（商標）X-100 非イオン界面活性剤 0.02 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２− アミノメタンスルホン酸緩衝液〕 4.58 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体
ての均一アッセイに有用な分析要素 以下の層配置および成分を有する、ジフェニルヒダント
インの検出に有用な本発明の要素を調製した。 要素構造 付着量 層 材料 (g/m2) 展開層 ポリ（ビニルトルエン−コ−メタクリル酸） （重量比98:2）ビーズ 130.0 ポリ（メチルアクリレート−コ−２−アクリルアミド− ２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム−コ−２− アセトアセトキシエチルメタクリレート） （重量比90:4:6） 2.583 ウシ血清アルブミン 1.00 グリセロール 2.00 マンニトール 1.00 ジメドン 0.50 ジメチルスルホキシド 1.80 ４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−２− （３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル） イミダゾールロイコ色素 0.20 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.45 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２− アミノメタンスルホン酸緩衝液〕 0.219 固定化抗ジフェニルヒダントイン・モノクローナル抗体 2.4 バインダー抗体5-10を用いてポリマー粒子上に固定化さ れた西洋ワサビペルオキシダーゼ 0.25 バイン ゼラチン（硬化） 10.00 ダー層 ビス（ビニルスルホニルメチル）エーテル 0.15 ４′−ヒドロキシアセトアニリド 0.15 TRITON（商標）X-100 非イオン界面活性剤 0.02 Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２− アミノメタンスルホン酸緩衝液〕 4.58 ポリ（エチレンテレフタレート）支持体
【００７６】幾つかの要素の試料を以下の溶液を用いて
評価した。 １）被分析物なし、または10-4モル濃度のジフェニルヒ
ダントイン。 ２）10または3.16μg/mLの阻害抗体4-22.2。 ３）水溶性抗阻害抗体−ジフェニルヒダントイン・コン
ジュゲート 0.8、 2.5、 8または25μg/mL。
評価した。 １）被分析物なし、または10-4モル濃度のジフェニルヒ
ダントイン。 ２）10または3.16μg/mLの阻害抗体4-22.2。 ３）水溶性抗阻害抗体−ジフェニルヒダントイン・コン
ジュゲート 0.8、 2.5、 8または25μg/mL。
【００７７】前記３種の溶液各々10μＬを要素展開層の
上にスポットし、そして室温で５分間インキュベートす
ることにより、アッセイを実施した。次いで二塩基性リ
ン酸ナトリウム（10ミリモル濃度，水酸化ナトリウムで
pHを 6.8に調整）中に過酸化水素、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（10マイクロモル濃度）、４′−ヒドロキシア
セトアニリド（５ミリモル濃度）を含む基質溶液（10μ
Ｌ）を塗布し、そして15分後、従来のKODAK GOLD（商
標）200 カラープリントフィルムを用いて各要素の写真
画像を取ることにより、各要素の色素信号を評価した。
色素信号は、以下のように肉眼判定した。 − 色素信号なし ＋ 若干の色素信号あり ＋＋＋＋ かなりの色素信号あり これらの結果を下記第III 表に列挙する。
上にスポットし、そして室温で５分間インキュベートす
ることにより、アッセイを実施した。次いで二塩基性リ
ン酸ナトリウム（10ミリモル濃度，水酸化ナトリウムで
pHを 6.8に調整）中に過酸化水素、ジエチレントリアミ
ン五酢酸（10マイクロモル濃度）、４′−ヒドロキシア
セトアニリド（５ミリモル濃度）を含む基質溶液（10μ
Ｌ）を塗布し、そして15分後、従来のKODAK GOLD（商
標）200 カラープリントフィルムを用いて各要素の写真
画像を取ることにより、各要素の色素信号を評価した。
色素信号は、以下のように肉眼判定した。 − 色素信号なし ＋ 若干の色素信号あり ＋＋＋＋ かなりの色素信号あり これらの結果を下記第III 表に列挙する。
【００７８】
【表３】
【００７９】本発明をその好ましい態様を特に参照して
詳細に記載してきたが、修正および変更が本発明の精神
および範囲内で可能であることは理解されるであろう。
詳細に記載してきたが、修正および変更が本発明の精神
および範囲内で可能であることは理解されるであろう。
【図１】図１は、ジフェニルヒダントインの濃度に対し
て観察した西洋ワサビペルオキシダーゼ活性（％）をプ
ロットしたグラフであり、実施例１に記載したものであ
る。
て観察した西洋ワサビペルオキシダーゼ活性（％）をプ
ロットしたグラフであり、実施例１に記載したものであ
る。
【図２】図２は、フェノバルビタールの濃度に対して観
察した西洋ワサビペルオキシダーゼ活性（％）をプロッ
トしたグラフであり、実施例２に記載したものである。
察した西洋ワサビペルオキシダーゼ活性（％）をプロッ
トしたグラフであり、実施例２に記載したものである。
【図３】図３は、ジゴキシンの濃度に対して観察した西
洋ワサビペルオキシダーゼ活性（％）をプロットしたグ
ラフであり、実施例３に記載したものである。
洋ワサビペルオキシダーゼ活性（％）をプロットしたグ
ラフであり、実施例３に記載したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケビン エム．ゴーマン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14616, ロチェスター，コンラド ドライブ 204 (72)発明者 キャロライン アール．ヒンチマン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，セント ポール ブールバ ード 3332
Claims (19)
- 【請求項１】 Ａ）いずれかの順序で、 １）標的特異的結合リガンドを含むことが予測される流
体試料、 ２）前記標的特異的結合リガンドの固定化レセプター、 ３）リポーター酵素、 ４）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに ５）前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、を合わせて、 前記固定化レセプターと、前記標的特異的結合リガンド
もしくは前記水溶性コンジュゲートのいずれかとの複合
体を形成すること、そして Ｂ）前記流体試料中の前記標的特異的結合リガンドの測
定として、前記リポーター酵素によって発生した信号を
検出すること、を含む、分離工程のない特異的結合アッ
セイ。 - 【請求項２】 前記リポーター酵素が水不溶性支持体上
に固定化されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記リポーター酵素および前記レセプタ
ーが別個のポリマー粒子上に固定化されている、請求項
２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記阻害抗体および前記抗阻害抗体のい
ずれかまたは両方がモノクローナル抗体である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記リポーター酵素が、ペルオキシダー
ゼ、アルカリ性ホスファターゼ、クレアチンキナーゼ、
グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、グルコース−６
−ホスフェートデヒドロゲナーゼまたはβ−ガラクトシ
ダーゼである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記リポーター酵素が西洋ワサビペルオ
キシダーゼである、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記阻害抗体が、モノクローナルであ
り、約10ナノモル濃度以下の解離定数を有し、かつ前記
リポーター酵素の酵素活性の少なくとも約95％を阻害す
るように前記リポーター酵素に結合し、そして前記抗阻
害抗体が、モノクローナルであり、約５ナノモル濃度以
下の解離定数を有し、かつ前記リポーター酵素の酵素活
性が約６％以下しか減少されないように前記リポーター
酵素に結合する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 前記検出工程Ｂ）が、適当な基質の存在
下で前記リポーター酵素により発生する比色信号を評価
することによって実施される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 前記固定化レセプターが、ジフェニルヒ
ダントイン、ジゴキシンもしくはフェノバルビタールで
ある標的特異的結合リガンドに特異的な抗体であり、そ
して前記水溶性コンジュゲートが、前記抗阻害抗体と、
ジフェニルヒダントイン、ジゴキシンもしくはフェノバ
ルビタールとから生成される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記流体試料、前記阻害抗体および前
記水溶性コンジュゲートが、前記固定化レセプターもし
くは前記リポーター酵素と接触せしめられる前に混合さ
れる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 個々のパックに、 標的特異的結合リガンドの固定化レセプターと、そし
て、 下記： ｉ）リポーター酵素、 ii）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに iii)前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、からなる群より選ばれ
る少なくとも２つの他の試薬とを含む、分離工程のない
特異的結合アッセイに有用な試験キット。 - 【請求項１２】 前記リポーター酵素がポリマー粒子上
に固定化されている、請求項１１に記載の試験キット。 - 【請求項１３】 前記阻害抗体および前記抗阻害抗体の
いずれかまたは両方がモノクローナル抗体である、請求
項１１に記載の試験キット。 - 【請求項１４】 前記リポーター酵素が西洋ワサビペル
オキシダーゼであり、 前記阻害抗体が、モノクローナルであり、約10ナノモル
濃度以下の解離定数を有し、かつ前記西洋ワサビペルオ
キシダーゼの酵素活性の少なくとも約95％を阻害するよ
うに前記西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し、そして
前記抗阻害抗体が、モノクローナルであり、約５ナノモ
ル濃度以下の解離定数を有し、かつ前記西洋ワサビペル
オキシダーゼの酵素活性が約６％以下しか減少されない
ように前記西洋ワサビペルオキシダーゼに結合する、請
求項１１に記載の試験キット。 - 【請求項１５】 前記固定化レセプターが、ジフェニル
ヒダントイン、ジゴキシンもしくはフェノバルビタール
である標的特異的結合リガンドに特異的な抗体であり、
そして前記水溶性コンジュゲートが、前記抗阻害抗体
と、ジフェニルヒダントイン、ジゴキシンもしくはフェ
ノバルビタールとから生成される、請求項１１に記載の
試験キット。 - 【請求項１６】 固定化リポーター酵素を含有する多孔
質展開層を含み、さらに標的特異的結合リガンドの固定
化レセプターを含む乾式分析要素。 - 【請求項１７】 非孔質支持体の上に、順に、１つ以上
の親水性試薬層および前記多孔質展開層を有する、請求
項１６に記載の要素。 - 【請求項１８】 前記リポーター酵素および前記レセプ
ターが、前記多孔質展開層内の別個のポリマー粒子上に
固定化されている、請求項１６に記載の要素。 - 【請求項１９】 非孔質支持体の上に、順に、１つ以上
の親水性試薬層および前記多孔質展開層を有する乾式分
析要素であって、 さらに、以下の試薬： １）標的特異的結合リガンドの固定化レセプター、 ２）固定化リポーター酵素、 ３）以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約 125ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性を少なくとも約80％
阻害するように、前記リポーター酵素に結合すること、
を有する阻害抗体、ならびに ４）前記標的特異的結合リガンドと抗阻害抗体との水溶
性コンジュゲート（前記抗阻害抗体は、以下の特徴： ａ）前記リポーター酵素に対する特異性、 ｂ）約50ナノモル濃度以下の解離定数、および ｃ）前記リポーター酵素の酵素活性が約20％以下しか減
少されず、かつ前記阻害抗体の前記リポーター酵素との
結合性が実質的に遮断されるように、前記リポーター酵
素に結合すること、を有する）、を含み、 試薬１）および２）が試薬３）および４）から離されて
いるが、前記要素が前記標的特異的結合リガンドのアッ
セイに用いられるとき、反応に利用できることを条件と
する、乾式分析要素。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/250,883 US5565326A (en) | 1994-05-31 | 1994-05-31 | Separation-free specific binding assays using anti-inhibitor antibodies |
| US250883 | 1994-05-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| AU (1) | AU2041095A (ja) |
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- 1995-05-31 JP JP7133996A patent/JPH0854392A/ja active Pending
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