JPS6095356A - B型肝炎コア抗原の免疫化学的測定方法 - Google Patents
B型肝炎コア抗原の免疫化学的測定方法Info
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- JPS6095356A JPS6095356A JP59187855A JP18785584A JPS6095356A JP S6095356 A JPS6095356 A JP S6095356A JP 59187855 A JP59187855 A JP 59187855A JP 18785584 A JP18785584 A JP 18785584A JP S6095356 A JPS6095356 A JP S6095356A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はB型肝炎コア抗原の定性的および/または定量
的測定方法、並びにこの方法に使用するための試験キッ
トに関するものである。
的測定方法、並びにこの方法に使用するための試験キッ
トに関するものである。
ウィルス性肝炎の感染においては、正確な診断を行ない
かつ正確な治療方法を選択するために病源の性質を突き
止め、かつその存在量を測定できることが重要である。
かつ正確な治療方法を選択するために病源の性質を突き
止め、かつその存在量を測定できることが重要である。
微生物学的方法に次いで、この目的には免疫化学的方法
が最も適している。
が最も適している。
迅速な定型測定には後者の方法が特に適しておυ、所望
に応じ簡単にかつ相当な個数を実施することができる。
に応じ簡単にかつ相当な個数を実施することができる。
免疫化学法を用いれば、問題とする肝炎ウィルスに特徴
的である抗原全定性的かつ定量的に検出することができ
る。検査すべき試料中に遊離状態で存在するウィルス抗
原またはウィルスの表面に存在するウィルス抗原のみが
それにより検出される。しかしながら、この種の抗原の
存在または濃度に関する情報は、感染の到達した相を正
確に示さないことがしばしばである。特にB型肝炎ウィ
ルス(HBV)においては、このように検出された抗原
の存在または濃度が完全感染性HBウィルスの存在また
は濃度の明確な表示とならないような複雑さが生ずる。
的である抗原全定性的かつ定量的に検出することができ
る。検査すべき試料中に遊離状態で存在するウィルス抗
原またはウィルスの表面に存在するウィルス抗原のみが
それにより検出される。しかしながら、この種の抗原の
存在または濃度に関する情報は、感染の到達した相を正
確に示さないことがしばしばである。特にB型肝炎ウィ
ルス(HBV)においては、このように検出された抗原
の存在または濃度が完全感染性HBウィルスの存在また
は濃度の明確な表示とならないような複雑さが生ずる。
HBV感染においてはその進行した状態およびHBvの
慢性保菌者の場合、多量の遊離ウィルスコート抗原(c
oat antigen)もしくは表面抗原(5urf
ace antigen ) (HBsAg )が血液
循環中に存在するが、他方完全なHBウィルス(いわゆ
る、ゾーン粒子(1)ane partcles )
)は極めて僅かしか存在しないかまたは全く存在しない
ことが知られている。他方、HBV感染の初期段階にお
いては相当量の完全ウィルスが存在する。これらの完全
ウィルスは、遊離状態であシかつほとんどが種々の形状
に凝集するHBsAgから電子顕微鏡法により区別する
こともできるが、このような区別は公知の免疫化学法で
は可能でない。
慢性保菌者の場合、多量の遊離ウィルスコート抗原(c
oat antigen)もしくは表面抗原(5urf
ace antigen ) (HBsAg )が血液
循環中に存在するが、他方完全なHBウィルス(いわゆ
る、ゾーン粒子(1)ane partcles )
)は極めて僅かしか存在しないかまたは全く存在しない
ことが知られている。他方、HBV感染の初期段階にお
いては相当量の完全ウィルスが存在する。これらの完全
ウィルスは、遊離状態であシかつほとんどが種々の形状
に凝集するHBsAgから電子顕微鏡法により区別する
こともできるが、このような区別は公知の免疫化学法で
は可能でない。
形態学的には、完全HBウィルスは表面抗原の被膜内に
遺伝物質およびその他の抗原(すなわちコア抗原(co
re antigen) (HBcAg) )が存在す
ることを%徴とする。被覆されたHBcAgは慣用の免
疫化学法では検出することができない。しかしながらH
BCAgの検出によって感染の(初期)段階を知シうる
方法が特に重要である。
遺伝物質およびその他の抗原(すなわちコア抗原(co
re antigen) (HBcAg) )が存在す
ることを%徴とする。被覆されたHBcAgは慣用の免
疫化学法では検出することができない。しかしながらH
BCAgの検出によって感染の(初期)段階を知シうる
方法が特に重要である。
今回驚くべきことに、検介すべき試料中の完全HBV粒
子中に存在するHB(!Agの正確かつ感度の高い測定
を可能にする方法が見出された。
子中に存在するHB(!Agの正確かつ感度の高い測定
を可能にする方法が見出された。
これを達成するために、本発明による方法は、B型肝炎
表面抗原(HBsAg )に対するキャリア結合した免
疫グロブリンと共に試f’lインキユベートシ、キャリ
ア結合した相と液相とを互いに分離し、キャリア結合し
た相tHBsAgコート全破壊してHBcAge放出す
る薬剤と共にインキュベートし、かつ同時にあるいはそ
の後得られた溶液t=HBcAgに対する免疫グロブリ
ンと共にインキュベートシ、その(iHBcAgとその
抗原に対する免疫グロブリンとの結合を測定して試料中
のHB(!Agを定性的および/または定量的に測定す
ることを特徴とする。
表面抗原(HBsAg )に対するキャリア結合した免
疫グロブリンと共に試f’lインキユベートシ、キャリ
ア結合した相と液相とを互いに分離し、キャリア結合し
た相tHBsAgコート全破壊してHBcAge放出す
る薬剤と共にインキュベートし、かつ同時にあるいはそ
の後得られた溶液t=HBcAgに対する免疫グロブリ
ンと共にインキュベートシ、その(iHBcAgとその
抗原に対する免疫グロブリンとの結合を測定して試料中
のHB(!Agを定性的および/または定量的に測定す
ることを特徴とする。
HB cAgとそnに対する免疫グロブリンとの起り得
る結合は、免疫化学分野でこの目的に慣用される任意の
方法で検出することができる。たとえば、凝集反応また
はいわゆるサンドインチ反応を使用することができる。
る結合は、免疫化学分野でこの目的に慣用される任意の
方法で検出することができる。たとえば、凝集反応また
はいわゆるサンドインチ反応を使用することができる。
凝集反応全使用する場合、HBcAgに対する免疫グロ
ブリンは一般に粒子に結合して使用される。
ブリンは一般に粒子に結合して使用される。
そして、抗原が存在すれば粒子の凝集をもたらし、これ
を定性的または定量的に検知することができる。
を定性的または定量的に検知することができる。
本発明による方法において抗原をサンドイッチ反応によ
り検出する場合、抗原はHBeAgに対するキャリア結
合した免疫グロブリンと標識試薬結合した免疫グロブリ
ンとの両者と一緒にインキュベートすることができる。
り検出する場合、抗原はHBeAgに対するキャリア結
合した免疫グロブリンと標識試薬結合した免疫グロブリ
ンとの両者と一緒にインキュベートすることができる。
両免疫グロブリン誘導体とHBcAgとの一体結合はキ
ャリアへの標識試薬の結合をもたらし、キャリア結合し
たまたは遊離の標識試薬を検出すれば、抗原と免疫グロ
ブリンの結合が測定され、したがって試料中に存在する
HBeAgが測定できる。
ャリアへの標識試薬の結合をもたらし、キャリア結合し
たまたは遊離の標識試薬を検出すれば、抗原と免疫グロ
ブリンの結合が測定され、したがって試料中に存在する
HBeAgが測定できる。
HBcAgに対するキャリア結合した免疫グロブリンは
それぞれ異なるキャリアに結合することができ、同時に
または互いに独立して試料液と接触させることもできる
し、或いは同一のキャリアに一緒に結合することもでき
る。この最後の具体例は、一般に実施が最も簡単な測定
法である。
それぞれ異なるキャリアに結合することができ、同時に
または互いに独立して試料液と接触させることもできる
し、或いは同一のキャリアに一緒に結合することもでき
る。この最後の具体例は、一般に実施が最も簡単な測定
法である。
さらに、本発明は本発明による方法を実施するための最
低限必要な幾つかの購成物からなる試験キットにも関す
るものである。すなわち、この種の試験キットは少なく
ともHBcAgに対する免疫グロブリン並びにHBsA
gに対するキャリア結合した免疫グロブリンを含む。)
lBcAgに対する免疫グロブリンは、試験キットにお
いて、たとえば粒子またはキャリアに結合させることが
できる。
低限必要な幾つかの購成物からなる試験キットにも関す
るものである。すなわち、この種の試験キットは少なく
ともHBcAgに対する免疫グロブリン並びにHBsA
gに対するキャリア結合した免疫グロブリンを含む。)
lBcAgに対する免疫グロブリンは、試験キットにお
いて、たとえば粒子またはキャリアに結合させることが
できる。
このキャリアは、その上にHBsAgIc対する免疫グ
ロブリンを存在させるものと同じであっても、或いはそ
れと異なってもよい。所望ならば、試験キットはさら匡
本発明による測定法全実施するための補助的な化合物、
たとえば標識試薬を検出するための化合物、洗浄緩衝液
および/または表面抗原つコートを破壊しうる薬剤を含
むこともできるO 本発明によるHBsAgに対する免疫グロブリンのキャ
リアとしては、キャリア結合した相およびキャリア結合
していない相に互いに分離することができる任意の形状
もしくは寸法の任意の材料で作成された物体を使用する
ことができる。免疫グロブリンはキャリアに対し直接ま
たは間接に結合させることができる。キャリアに対する
この結合は共有結合、イオン結合または水素架橋によっ
て行なうことができ、或いはたとえばファン・デル・ワ
ールス相互作用によることもできる。適当なキャリアの
例は試験管、マイクロ滴定板のウェル、或いはたとえば
ガラス、プラスチックもしくは天然物質から作成された
ストリップ、神体、ビーズまたはディスクである。
ロブリンを存在させるものと同じであっても、或いはそ
れと異なってもよい。所望ならば、試験キットはさら匡
本発明による測定法全実施するための補助的な化合物、
たとえば標識試薬を検出するための化合物、洗浄緩衝液
および/または表面抗原つコートを破壊しうる薬剤を含
むこともできるO 本発明によるHBsAgに対する免疫グロブリンのキャ
リアとしては、キャリア結合した相およびキャリア結合
していない相に互いに分離することができる任意の形状
もしくは寸法の任意の材料で作成された物体を使用する
ことができる。免疫グロブリンはキャリアに対し直接ま
たは間接に結合させることができる。キャリアに対する
この結合は共有結合、イオン結合または水素架橋によっ
て行なうことができ、或いはたとえばファン・デル・ワ
ールス相互作用によることもできる。適当なキャリアの
例は試験管、マイクロ滴定板のウェル、或いはたとえば
ガラス、プラスチックもしくは天然物質から作成された
ストリップ、神体、ビーズまたはディスクである。
HBsAgのニー)f破壊するのに適する薬剤は、たと
えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルN−サルコシン
酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ドデシルピリミジニウム、バルミトイルリソレシチン
、ドデシル−N−ベタイン、ポリオキシエチレン−アル
コール、ポリオキシエチレン−イソアルコール、ポリオ
キシエチレン−p−t−オクチルフェノール、ポリオキ
シエチレン−ノニルフェノール、脂肪酸のポリオキシエ
チレンエステル、ホリオキシエチレンソルビトールエス
テル、ドデシルスルホン酸ナトリウム、臭化テトラデシ
ルアンモニウムおよびサポニンのような洗剤である。こ
れらのうち、非イオン型洗剤が好適である。極めて適す
る非イオン型洗剤はポリオキシエチレン誘導体であり、
たとえばブリジ(Br1j )、トリトy (’pri
ton )、ノニデット(Non1det ) P 4
0およびツイーン(Tween ) ′f:包含する。
えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルN−サルコシン
酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩
化ドデシルピリミジニウム、バルミトイルリソレシチン
、ドデシル−N−ベタイン、ポリオキシエチレン−アル
コール、ポリオキシエチレン−イソアルコール、ポリオ
キシエチレン−p−t−オクチルフェノール、ポリオキ
シエチレン−ノニルフェノール、脂肪酸のポリオキシエ
チレンエステル、ホリオキシエチレンソルビトールエス
テル、ドデシルスルホン酸ナトリウム、臭化テトラデシ
ルアンモニウムおよびサポニンのような洗剤である。こ
れらのうち、非イオン型洗剤が好適である。極めて適す
る非イオン型洗剤はポリオキシエチレン誘導体であり、
たとえばブリジ(Br1j )、トリトy (’pri
ton )、ノニデット(Non1det ) P 4
0およびツイーン(Tween ) ′f:包含する。
本発明につき使用するのに適した粒子はたとえば赤血球
、ラテックスビーズ、染料ゾル粒子または金属もしくは
金属化合物の粒子である。
、ラテックスビーズ、染料ゾル粒子または金属もしくは
金属化合物の粒子である。
本発明には全ての慣用の標識試薬全使用することができ
る。これらは酵素、放射性原子もしくは化合物、螢光物
質、着色化合物、染料ゾル、金属もしくは金属化合物の
ゾルなどを包含する。
る。これらは酵素、放射性原子もしくは化合物、螢光物
質、着色化合物、染料ゾル、金属もしくは金属化合物の
ゾルなどを包含する。
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明する。
実施例
血清中のHB e A、Pの検出
希釈率を増大させた血清の2つの群につき検査した。こ
れらの血清は抗−HBc−陽性であってHBsA、f保
有者から採取されたものであるが、一方の血清において
は電子顕微鏡下でゾーン粒子が検出されたのに対し、他
方の血清においてはこれらの粒子が存在しなかった。
れらの血清は抗−HBc−陽性であってHBsA、f保
有者から採取されたものであるが、一方の血清において
は電子顕微鏡下でゾーン粒子が検出されたのに対し、他
方の血清においてはこれらの粒子が存在しなかった。
A、試薬:
1、破傷したマイクロ滴定板
ポリスチレン製マイクロ滴定板のウェルの内側を、HB
sAJに対する免疫グロブリンとHBcAJに対する免
疫グロブリンの混合物をpH9,0の重炭酸塩緩衝液中
で前記ウェル中において20Cにて24時間インキュベ
ート与することによシ前記混合物で被覆した。その後、
これらウェルをpH7,2の0.15モル/ノリン酸塩
緩衝液で洗浄した。
sAJに対する免疫グロブリンとHBcAJに対する免
疫グロブリンの混合物をpH9,0の重炭酸塩緩衝液中
で前記ウェル中において20Cにて24時間インキュベ
ート与することによシ前記混合物で被覆した。その後、
これらウェルをpH7,2の0.15モル/ノリン酸塩
緩衝液で洗浄した。
2、結合体
HBcAIiに対する免疫グロブリンと西洋ワサビ(ホ
ースラディツシュ)ペルオキシダーゼ(HRP)との結
合体を、ナカネおよびカワオイの方法にしたがって作成
した(ジャーナルオブヒストクミストリーアンドシトク
ミストリ−(J 、 Histo−Chem、 C7t
ochem、 )、第22巻、第1084−1091頁
、1974 )。
ースラディツシュ)ペルオキシダーゼ(HRP)との結
合体を、ナカネおよびカワオイの方法にしたがって作成
した(ジャーナルオブヒストクミストリーアンドシトク
ミストリ−(J 、 Histo−Chem、 C7t
ochem、 )、第22巻、第1084−1091頁
、1974 )。
B0手順
pH7,2の0.15モル/ノリン酸塩緩衝液において
希釈率を増大させた一連の試験すべき血清0.1Nを被
覆したマイクロ滴定板の各ウェルに入れ37Cで2時間
インキュベートした。その後、これらウェルを吸引して
空にし、pH7,2の0.15モル/ノリン酸塩緩衝液
0.3mJで3回洗浄し、かつ吸引して窒にした。その
後、これらウェルにpH7,2の0.15モル/ノリン
酸塩緩衝液中ソニデットP40の溶液0.1 mを入れ
37Cで2時間インキュベートし、pH7,2の0.1
5モル/iリン酸塩緩衝i0.3ゴで3回洗浄し、かつ
吸引して空にした。
希釈率を増大させた一連の試験すべき血清0.1Nを被
覆したマイクロ滴定板の各ウェルに入れ37Cで2時間
インキュベートした。その後、これらウェルを吸引して
空にし、pH7,2の0.15モル/ノリン酸塩緩衝液
0.3mJで3回洗浄し、かつ吸引して窒にした。その
後、これらウェルにpH7,2の0.15モル/ノリン
酸塩緩衝液中ソニデットP40の溶液0.1 mを入れ
37Cで2時間インキュベートし、pH7,2の0.1
5モル/iリン酸塩緩衝i0.3ゴで3回洗浄し、かつ
吸引して空にした。
その後、pH7,2の0.15モル/ノリン酸塩緩衝液
に希釈した結合体(A2)のQ、l mlをピペットに
よシ各ウェルに入れた。37tZ’で1時間インキュベ
ートした後、これらウェルを吸引してをにし、pH7,
2の0.15モル/ノリン酸塩緩衝液013m7!で3
回洗浄し、かつ吸引して空にした。次いで、I)H5,
0の0.15モル/ノ酢酸塩緩衝液における0−フェニ
レンジアミン0.4キ/mlと過酸化尿素0.4q7m
lとの混合物Q、l+njを各ウェルに移入した。
に希釈した結合体(A2)のQ、l mlをピペットに
よシ各ウェルに入れた。37tZ’で1時間インキュベ
ートした後、これらウェルを吸引してをにし、pH7,
2の0.15モル/ノリン酸塩緩衝液013m7!で3
回洗浄し、かつ吸引して空にした。次いで、I)H5,
0の0.15モル/ノ酢酸塩緩衝液における0−フェニ
レンジアミン0.4キ/mlと過酸化尿素0.4q7m
lとの混合物Q、l+njを各ウェルに移入した。
30分間インキュベートした後、0.2モル/ノ硫酸溶
液0. l mlを加えて反応を停止させた。
液0. l mlを加えて反応を停止させた。
このようにして得られた溶液の吸光度を、492nmの
波長にて光度計で測定した。
波長にて光度計で測定した。
C0結果
吸光度測定の結果を下記の表に示す。
血清中のゾーン粒子の存在と本発明による試験における
濃度依存性の反応との間にはプラスの相関があると結論
することができる。
濃度依存性の反応との間にはプラスの相関があると結論
することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (11B型肝炎表面抗原(nnsAg)に対するキャリ
ア結合した免疫グロブリンと共に試料をインキュベート
し、キャリア結合した相と液相とを互いに分離t2、キ
ャリア結合した相をHBsAgコートを破壊してB型肝
炎コア抗原(HBcAg )を放出する薬剤と共にイン
キュベートし、かつ同時にまたはその後得られた溶液を
HBcAgに対する免疫グロブリンと共にインキュベー
トし、その後IIB c Agとそれに対する免疫グロ
ブリンとの結合を測定して試料中のHBcAg′f:定
性的および/または定量的に測定することを特徴とする
、B型肝炎コア抗原(HBcAg)の定性的および/ま
たは定量的免疫化学的測定方法。 (2) HBcAgに対する免疫グロブリンとのインキ
ュベーションを、キャリア結合1−た免疫グロブリンお
よび標識試薬結合した免疫グロブリンを用いて行ない、
その後免疫グロブリンとHBcAgとの結合をキャリア
結合I−たおよび/または遊離の標識試薬を計測して測
定することを特徴とする特許請求の範囲第1項記載の方
法。 (3) HB c Agに対する免疫グロブリンとHB
sAgに対する免疫グロブリンの両者を一緒に結合させ
るキャリアを使用することを特徴とする特許請求の範囲
第2項記載の方法。 (4)標識試薬として酵素を使用することを特徴とする
特許請求の範囲第2項または第3項記載の方法。 (5) HB c Agに対する免疫グロブリンとのイ
ンキュベーションを、粒子に結合した免疫グロブリンを
用いて行なうことを特徴とする特許請求の範囲第1項記
載の方法。 (6)少なくとも次のものニ ーHBsAgに対するキャリア結合した免疫グロブリン
; −HB c Agに対する免疫グロブリンからなること
を特徴とする特許請求の範囲第1項記載の測定方法を行
なうための試験キット。 (7)少なくとも次のものニ ー HB s Agに対する免疫グロブリンおよびHB
cAgに対する免疫グロブリンが結合1−でいるキャリ
ア; −HBcAgに対する、標識試薬結合し、た免疫グロブ
リン からなることを特徴とする特許請求の範囲第6項記載の
試験キット。 (8)少なくとも次のものニ ー HB s Agに対する、第1キヤリアに結合した
免疫グロブリン; −HB c Agに対する、第2キヤリアに結合しt、
弘シ戊フ゛口でソシノ −HBcAgに対する、標識試薬に結合した免疫グロブ
リン からなることを特徴とする特許請求の範囲第6項記載の
試験キット。 (9)標識試薬として酵素を含むことに%eとする特許
請求の範囲第7項または第8項記載の試験キット。 aα 酵素用の基質をさらに含むことを特徴とする特許
請求の範囲第9項記載の試験キット。 Ql) 少なくとも次のものニ ーHBsAgに対する、キャリアに結合した免疫グロブ
リン; −HBcAgに対する、粒子に結合した免疫グロブリン からなることを特徴とする特許請求の範囲@6項記載の
試験キット。 鰺 洗剤をさらに含むことを特徴とする特許請求の範囲
第6項乃至第11項のいずれかに記載の試験キット。 α3)非イオン型洗剤を含むことを特徴とする特許請求
の範囲第12項記載の試験キット。 α4) HBsAgに対する抗体およびHBcAgに対
する抗体を一緒にキャリアに結合して含むことを特徴と
する免疫化学試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8303169 | 1983-09-14 | ||
NL8303169 | 1983-09-14 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6095356A true JPS6095356A (ja) | 1985-05-28 |
JPH0576582B2 JPH0576582B2 (ja) | 1993-10-22 |
Family
ID=19842397
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59187855A Granted JPS6095356A (ja) | 1983-09-14 | 1984-09-07 | B型肝炎コア抗原の免疫化学的測定方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4701410A (ja) |
EP (1) | EP0139316B1 (ja) |
JP (1) | JPS6095356A (ja) |
AT (1) | ATE42002T1 (ja) |
CA (1) | CA1229790A (ja) |
DE (1) | DE3477610D1 (ja) |
DK (1) | DK159297C (ja) |
FI (1) | FI78181C (ja) |
Families Citing this family (3)
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