DE3854665T2 - Verfahren zum schnellen und empfindlichen nachweis von hiv-1-antikörpern. - Google Patents
Verfahren zum schnellen und empfindlichen nachweis von hiv-1-antikörpern.Info
- Publication number
- DE3854665T2 DE3854665T2 DE3854665T DE3854665T DE3854665T2 DE 3854665 T2 DE3854665 T2 DE 3854665T2 DE 3854665 T DE3854665 T DE 3854665T DE 3854665 T DE3854665 T DE 3854665T DE 3854665 T2 DE3854665 T2 DE 3854665T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- hiv
- test
- antibodies
- antigen
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 title description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 title 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims abstract description 72
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 65
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 65
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 51
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 claims abstract description 40
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 97
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 41
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 30
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 19
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 18
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 14
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims description 12
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 claims description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- -1 peroxidase catalase Proteins 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000005773 Xanthine dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010091383 Xanthine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 abstract description 63
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 abstract description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101000719019 Homo sapiens Glutamyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 3
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- BXIYIGBKSGVJOS-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;dihydrate;tetrahydrochloride Chemical group O.O.Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 BXIYIGBKSGVJOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical group C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233870 Pneumocystis Species 0.000 description 1
- 101710124413 Portal protein Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 201000000317 pneumocystosis Diseases 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein rasches und sensitives Assayverfahren für den Nachweis von Antikörpern gegen das Antigen des humanen T-Zell-Leukämievirus-III (HIV-I) und diagnostische Testkits zum Durchführen des Assayverfahrens.
- Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) wurde erstmalig erkannt um das Jahr 1981, aber das auslösende Agens war bisher nicht identifiziert worden. Intensive Forschungsbemühungen führten zu dem Nachweis und der Isolierung von HIV-I (zuvor bekannt als HTLV-III/LAV), dem Retrovirus, das als das etiologische Agens von AIDS identifiziert wurde.
- Von dem Virus wird gegenwärtig angenommen, daß es durch intime sexualkontakte und Blut übertragen wird. Bisher deuten epidemiologische Hinweise an, daß Nahrungsmittel, Wasser, Insekten und zufälliger Kontakt keine Krankheitsüberträger darstellen.
- Das AIDS-Virus wirkt durch Lähmen des Immunsystems des Körpers. Insbesondere greift HIV-I selektiv T4-Lymphozyten an, eine der Subpopulationen der Lymphozyten, die das Immunsystem darstellen. Die Infektion mit HIV-I führt sowohl zu einer Reduktion in der Anzahl wie auch einer Veränderung in der Funktion der angegriffenen T4-Lymphozyten mit dem möglichen Kollaps des Immunsystems.
- Die Gruppen mit dem höchsten Infektionsrisiko für HIV-I umfassen homosexuelle und bisexuelle Männer und Personen, die zu injizierende Drogen mißbrauchen. Andere vorhersagbare Hochriskikogruppen sind Frauen, die künstlich mit Sperma von infizierten Spendern befruchtet werden und Sexualpartner von solchen aus den AIDS-Risikogruppen. Empfänger von Bluttransfusionen und Blutprodukten besitzen ebenfalls ein Risiko der Erkrankung an AIDS.
- Organtransplantatempfänger sind ebenfalls eine Hochrisikogruppe. Das Erkennen der Organtransplantation als ein potentieller Weg für die Ausbreitung von AIDS führte jetzt zum Testen sämtlicher Organspender auf HIV-I-Antikörper. Mit der Ausnahme einiger Nierentransplantate ist es oft schwierig, vorab die Quelle eines gespendeten Organs vorherzusagen. Zum Beispiel sind Opfer tödlicher Autounfälle potentielle Organspender, und da die Zeit und der Ort des Unfalls nicht vorhersehbar ist, stellt das Testen vor der Transplantation ein Problem dar. Das screenen ist somit in diesen und ähnlichen Situationen schwierig und der Bedarf an Einrichtungen für 24- stündiges Testen und, noch wichtiger, Testen vor Ort ist offensichtlich. Weiterhin, hinsichtlich der begrenzten brauchbaren Lebensspanne eines Spenderorgans, wenn es einmal aus dem Wirt entfernt ist, ist der Bedarf an einem raschen Assayverfahren offensichtlich.
- Gegenwärtige Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das AIDS-Virus umfassen den sogenannten enzymgekoppelten Immunsorptionsassay (ELISA), den Western-Blot-Assay und den Immunfluoreszenzassay. Solche Assays sind beschrieben in Sarngadharan, M.G. et al., Science 224:506 (1983) (ELISA); Tsang et al., In: Methods of Enzymology, Band 92, Kapitel 29, 1983, Academic Press and Safai, B. et al., Lancet 1:1438 (1984) (Western-Blot) und Essex, M. et al., Science 220:859 (1983) (Immunofluoreszenztechniken). Das etablierte Verfahren zum Screenen von Blutspendern besteht darin, zunächst einen ELISA durchzuführen, gefolgt von der Bestätigung von Positiven durch einen Western-Blot.
- Die ELISA-Technik umfaßt das Umsetzen einer Testanalysenprobe mit einem Antigenreagenz, das üblicherweise erhalten wird von aufgebrochenem, gesamten oder durch Dichtegradienten konzentrierten HIV-I. Typischerweise wird das HIV-I auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgeschichtet. Nach dem Waschen zum Entfernen von ungebundenen Antikörpern wird Anti-Human-IGG- Antiserum der Ziege, konjugiert mit Meerrettichperoxidase, den Vertiefungen zugesetzt und inkubiert. Nach einer geeigneten Inkubationsperiode wird ein Enzymsubstrat der Mischung zugesetzt und ein nachweisbares, meßbares Farbprodukt wird in der Anwesenheit der Antikörper gegen HIV-I erzeugt.
- In dem Western-Blot-Assay wird andererseits das HIV-I-Antigen elektrophoretisch aufgetrennt auf SDS-Polyacrylamidgelen, wobei jedes 8 x 10 cm Gel beladen wird mit 50 bis 100 ug Protein. Die erhaltenen Proteinbanden werden per Elektrotransfer auf Nitrozellulosepapier übertragen. Der Nachweis der Antikörper gegen HIV-I wird dann durchgeführt entweder durch Radioimmunoassaytechniken an Festphasenstreifen oder durch ELISA. Jedes dieser Verfahren umfaßt eine über-Nacht-Inkubation und somit eine Gesamttestzeit von ungefähr 20 Stunden.
- Das etablierte Screeningverfahren ist nicht vollständig befriedigend wegen der benötigten Zeit, um die Ergebnisse zu erhalten. Dies gilt besonders für die Organtransplantatsituation, insbesondere für das Herz und die Leber. Diese zwei Organe besitzen maximale ischämische Zeiten in der Kälte von 4 bzw. 8 Stunden. Im allgemeinen benötigt der ELISA ungefähr 4 Stunden und der Western-Blot, der, wie angemerkt, eine über-Nacht-Inkubationsperiode umfaßt, benötigt ungefähr 20 Stunden. Es ist anzuerkennen, daß mit herkömmlichen Techniken die Testergebnisse nicht innerhalb der maximalen ischämischen Zeiten für das Herz oder die Leber erhalten werden können.
- In dem "Journal of Infectious Diseases", Band 155, Seite 54 bis 63, 1987, ist ein Verfahren für den Nachweis von Antikörpern gegen das HIV-I-Retrovirus unter Verwendung des normalen Western-Blot-Verfahrens offenbart, wobei das Verfahren einen Zwischenschritt des Blockierens der mit HIV-Antigen beladenen Nitrozellulosefilter umfaßt, durch über-Nacht-Inkubation in 5 % (w/v) fettfreier Trockenmilch, 0,01 % Antifoam A und 0,002 % Thimerosal. Eine Abnahme der unspezifischen Proteinbindung und eine Verbesserung der Ergebnisse wird gezeigt.
- Der sogenannte "Schnelle-Western-Blot"-Assay stellt eine Modifikation des standardmäßigen Western-Blot-Assays dar und ist Gegenstand der WO-Anmeldung Nr. 87/07647. Der Test umfaßt einen Western-Blot-Assay, worin die Konzentration der zu testenden Analysenprobe wie auch des HIV-I-Antigens um mindestens 50 % gesteigert ist gegenüber dem Standard-Western-Blot. Die Technik umfaßt dann die Verwendung des ELISA-Tests, um die gebundenen Antikörper nachzuweisen. Wegen der gesteigerten Konzentration des Antigens und der Testanalysenprobe kann der resultierende Assay in weniger als einer Stunde und zwanzig Minuten durchgeführt werden, ohne den erwarteten unspezifischen Proteinhintergrund. Weiterhin kann der Test in Gebieten durchgeführt werden, die nicht ausgestattet sind, um andere, zeitaufwendigere Tests durchzuführen.
- Obwohl das Schnelle-Western-Blot-Verfahren rasch und sensitiv ist, besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, einen noch schnelleren und sensitiveren Nachweis von Antikörpern gegen HIV-I bereitzustellen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein rasches und sensitives Verfahren für den Nachweis von Antikörpern gegen HIV-I-Antigen, das eine modifizierte Schnelle-Western-Blot-Technik verwendet. Insbesondere umfaßt das Verfahren:
- (a) Inkontaktbringen von Nitrozellulosepapier, enthaltend darauf aufgebrachtes, aufgetrenntes HIV-I-Antigenprotein, erhalten von einem gelelektrophoretisch aufgetrennten Viruslysat, mit einer Testanalysenprobe, die mit einem Puffer verdünnt ist, und Inkubieren des Nitrozellulosepapiers und der Testanalysenprobe, um die Bindung von Antikörpern, die in der Analysenprobe vorhanden sind, an das Protein auf dem Nitrozellulosepapier zu ermöglichen, worin
- (1) das Viruslysat per Elektrotransfer auf das Nitrozellulosepapier übertragen wird in einer Konzentration von mindestens 20 %, aber weniger als 40 %, größer als die 50 bis 100 ug von HIV-I-Antigenprotein pro 10 x 16 cm Elektrophoresegel, das in einem herkömmlichen Western- Blot-Assay verwendet wird;
- (2) das aufgetrennte HIV-I-Antigenprotein wird in Schritt (a) (1) in der Anwesenheit von fettfreiem Milchprotein inkubiert; und
- (3) die Testanalysenprobe wird in einem Puffer verdünnt:
- auf eine Konzentration, die ungefähr drei- bis fünfmal größer ist als die Konzentration, die in dem Western- Blot-Assay verwendet wird; oder auf eine Konzentration, die mindestens drei- bis siebenmal größer ist als die 1:100-Verdünnung, die in dem Western-Blot-Assay im Falle einer Serumanalysenprobe verwendet wird;
- (b) Inkontaktbringen des inkubierten Nitrozellulosepapiers aus Schritt (a) mit einem enzymkonjugierten Antiserum, das mit den Antikörpern reaktionsfähig ist, und Inkubieren, um die Bindung des Antiserums an die Antikörper zu ermöglichen;
- (c) Inkontaktbringen des inkubierten Nitrozellulosepapiers aus Schritt (b) mit einem Enzymsubstrat, das spezifisch ist für das Enzym aus Schritt (b), und Tnkubieren, um dadurch eine Farbe zu erzeugen;
- (d) Abstoppen der Farberzeugungsreaktion von Schritt (c); und
- (e) Ermitteln der Menge an hergestellter Farbe als ein Hinweis auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen das HIV-I-Viruslysat;
- um den Assay innerhalb von 60 Minuten zu vervollständigen.
- Überraschenderweise bewirken die Milchproteine sowohl eine Verstärkung wie auch eine beschleunigte spezifische Proteinbindung; und eine Abnahme der unspezifischen Proteinbindung. Konsequenterweise werden Testergebnisse in 50 bis 60 Minuten erhalten.
- In dem Western-Blot-Assay wird die Serumanalysenprobe verdünnt, um zu vermeiden, daß unspezifische Bindung von darin enthaltenen anderen Proteinen überlappende Proteinbanden bilden, die den Nachweis der Antikörper gegen das HIV-I-Antigen beeinträchtigen. Andererseits sind bei Verwendung des Schnellen-Western- Blot-Assays, beschrieben in der zuvor erwähnten weiteren Anmeldung, Proteinkonzentrationen von mindestens 50 % größer als solche, die bei herkömmlichen Western-Blots verwendet werden, erfolgreich eingesetzt wurden, um Antikörper gegen das AIDS- Virus nachzuweisen, während die Testzeit um einen Faktor von 10 verringert wurde. Es ist jetzt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gefunden worden, daß, falls das HIV-I-Antigen in der Anwesenheit von Milchproteinen inkubiert wird, die spezifische Bindung des HIV-I-Antikörpers an das Antigen verstärkt und beschleunigt wird.
- Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Konzentration der Testanalysenprobe relativ zu derjenigen, die in dem Western-Blot-Assay verwendet wird, gesteigert werden, ohne die Selektivität des Assays zu beeinträchtigen, während die Konzentration der Analysenprobe relativ zu derjenigen, die in dem Schnellen-Western-Blot-Assay verwendet wird, verringert werden kann, ohne die Sensitivität zu beeinflussen oder die Inkubationszeit, die für den Assay erforderlich ist, zu steigern. In der Tat führt der erfindungsgemäße Assay zu einer besseren Auftrennung als der Western-Blot, zu einer gesteigerten spezifischen Bindung relativ zu dem Schnellen-Western-Blot, und zu deutlich verringerten Inkubationszeiten, als sie benötigt werden zum Vervollständigen des herkömmlichen Western- Blot- oder Schnellen-Western-Blot-Assays. Weiterhin erzeugt der erfindungsgemäße Assay in signifikanter Weise mehrere unterscheidbare Proteinbanden. Dies ist besonders wichtig für das Auswerten der Teststreifen.
- In Übereinstimmung mit dem Assayverfahren sind die Milchproteine anwesend, wenn die Antikörper gegen HIV-I, die möglicherweise in der zu testenden Analysenprobe vorhanden sind, mit dem HIV-I-Antigen umgesetzt werden. Es wird angenommen, daß eines oder mehrere der Milchproteine die elektronische Struktur der Bindungsstellen auf dem Antigen ändert, wodurch seine Affinität und Spezifität für den HIV-I-Antikörper gesteigert wird.
- Selbstverständlich ist die vorhergehende Erklärung eine Hypothese basierend auf der gegenwärtig beschränkt zugänglichen Information und unterliegt einer Änderung, basierend auf weiteren Entwicklungen. Demzufolge ist die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren setzt Blot-Techniken ein, aber verwendet mindestens 20 %, vorzugsweise ungefähr 20 % bis 40 %, mehr HIV-I-Viruslysat als herkömmliche Western-Blots. Insbesondere werden 60 bis ungefähr 120 ug HIV-I-Antigenprotein/10 x 16 cm Gel in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet im Vergleich mit den 50 bis 100 ug an Protein/10 x 16 cm Gel, das im herkömmlichen Western-Blot verwendet wird. Die Konzentrationen der Testanalysenprobe werden ebenfalls mindestens dreifach gesteigert, vorzugsweise ungefähr fünf- bis siebenmal, gegenüber derjenigen, die in einem herkömmlichen Western-Blot verwendet wird.
- Das erfindungsgemäße Verfahren, wie der herkömmliche Western- Blot, verwendet ein elektrophoretisch aufgetrenntes Antigen, das anschließend per Elektrotransfer auf Testfolien oder -streifen übertragen wird. Die Zunahme der Antigenkonzentration des Lysats zusammen mit der gesteigerten Analysenprobenkonzentration und dem Einbringen der Milchproteine ermöglichen eine drastische Verringerung der Inkubationszeiten. In Übereinstimmung mit dem vorliegenden Verfahren werden Testergebnisse innerhalb von 50 bis 60 Minuten erhalten, das ist 1/30 der Zeit, die erforderlich ist, um den Western-Blot-Assay durchzuführen, und 3/4 der Zeit, die erforderlich ist, um den Schnellen-Western-Blot-Assay durchzuführen. Das vorliegende Verfahren wird deshalb als die "Schnelle-Western-Blot II"-Technik bezeichnet.
- Das Verfahren umfaßt elektrophoretisches Auftrennen von HIV-I- Antigenlysat und anschließendes Übertragen des aufgetrennten Antigens per Elektrotransfer auf Nitrozellulosepapier. Dieses Papier wird mit der zu testenden Analysenprobe inkubiert, um beliebige vorhandene HIV-I-Antikörper nachzuweisen. Der Inkubationsschritt wird in der Anwesenheit der Milchproteine durchgeführt.
- Der Nitrozellulose-gebundene Antigen/Antikörperkomplex wird mit enzymkonjugiertem Antiserum inkubiert und mit einem Enzymsubstrat entwickelt (Farbänderungsindikator). Die erhaltenen gefärbten Banden werden dann visuell verglichen mit positiven und negativen Kontrollen, um die Anwesenheit von HIV-I-Antikörpern zu bestimmen.
- Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein diagnostischer Test-Kit bereitgestellt, der ein vor-Ort- Testen nach Antikörpern gegen das AIDS-Virus erlaubt. Der Kit umfaßt einen Satz an Kontrollgefäßen für positive und negative Referenzen wie auch ein Verdünnungsgefäß mit Puffer zum Verdünnen der Testanalysenprobe. Die Inhalte dieser Gefäße werden Reaktionsgefäßen zugesetzt, enthaltend Nitrozelluloseteststreifen, enthaltend aufgetrenntes HIV-I-Antigen, und es wird inkubiert. Die erhaltenen Streifen werden inkubiert mit dem bereitgestellten, enzymkonjugierten Antiserum, das verwendet wird zum Nachweis von jeglichen vorhandenen gebundenen Antikörpern. Die Streifen werden dann endgültig farbentwickelt mit einem Farbänderungsindikator.
- Der erfindungsgemäße diagnostische Kit umfaßt ebenfalls vorentwickelte positive und negative Referenzstreifen und Reagenzkontrollstreifen zum Ermitteln der Testergebnisse durch visuellen Vergleich mit den Teststreifen. Die sichtbaren Proteinbanden auf dem Testanalysenstreifen mit dem positiven Referenzstreifen sollte in dem Test positiv für die HIV-I-Antikörper sein (wie durch die vorab charakterisierten Proteinbanden angezeigt). Der negative Referenzstreifen sollte in dem Test negativ für den HIV-I-Antikörper sein. Demzufolge wird das Ablesen der Ergebnisse des Tests erleichtert, und der Bedarf für speziell ausgebildetes Personal wird tatsächlich beseitigt. Vor- Ort-Testen ist besonders wichtig bei der Organtransplantatsituation, da das Screenen nach AIDS jetzt auf einer 24-stündigen Basis an jedem beliebigen Ort durchgeführt werden kann, ohne speziell ausgebildetes Personal, und die Testergebnisse können in 50 bis 60 Minuten erhalten werden, wobei dies gut innerhalb der Lebensdauer von ischämischen Organen liegt.
- In Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein HIV-I-Antigenkonzentrat elektrophoretisch aufgetrennt. Das HIV- I-Antigenkonzentrat kann gewerblich bezogen werden, z.B. wie von Litton Bionetics als HIV-I-Viruslysat, Katalog Nr. 8464-15. Das Antigenkonzentrat wird in Puffer verdünnt auf eine Proteinkonzentration von mindestens 20 %, aber weniger als 40 % größer als diejenige, die beim herkömmlichen Western-Blot verwendet wird. Vorzugsweise wird die Antigenkonzentration in Puffer verdünnt auf eine Proteinkonzentration von ungefähr 60 bis 120 ug pro 10 x 16 cm Gel. Der bevorzugte Puffer ist 0,05 M TRIS- HCl/50 % Glycerin, pH 8, 2,5 % SDS (Natriumdodecylsulfat) und 5 % Mercaptoethanol. Andere Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls geeignet, wie 9 M Harnstoff in 0,01 M TRIS-HCl.
- Wie oben angemerkt, ist die Proteinkonzentration des Antigenlysats, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ungefähr 20 bis 40 % größer als die 50 bis 100 ug/10 x 16 cm Gel, die typischerweise beim herkömmlichen Western-Blot verwendet werden. Siehe Seiten 380 bis 381 der Richtlinien, wie veröffentlicht von Tsang V.C., J. Peralta, R. Simons, In: Methods of Enzymology, Band 92, Kapitel 29, 1983, Academic Press Inc., die den Arbeitsbereich von 50 bis 100 ug/8 x 10 cm Gel für die Proteinkonzentrationen darlegen, die in dem herkömmlichen Western-Blot-Assay verwendet werden.
- Das Antigen wird üblicherweise zunächst durch Kochen denaturiert, typischerweise für ungefähr 5 Minuten. Dann wird das denaturierte Antigen einer herkömmlichen Gelelektrophorese des Typs unterzogen, der von Tsang et al., Methods in Enzymology, Band 92 (1983) berichtet wird.
- Ein Markerfarbstoff wird üblicherweise dem verdünnten Antigen zugesetzt, um ein sichtbares Proteinbandenmuster zu erzeugen. Der bevorzugte Farbstoff ist Bromphenolblau. Der Farbstoff wird vorzugsweise hergestellt durch Auflösen von 50 mg Bromphenolblau in 8 ml Glycerin plus jeweils 1 ml 0,5 M TRIS-HCl bei pH 8,0 und H&sub2;O. Andere Farbstoffe, die dem Fachmann geläufig sind, können ebenfalls verwendet werden.
- Geeignete Gele für die Elektrophorese werden ebenfalls hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Tsang et al., Methods in Enzymology, Band 92 (1983). Ein 10 %-iges, auftrennendes Polyacrylamidgel mit einem 3 %-igen Stapelgel (SDS-PAGE) ist bevorzugt, da es einen Molekulargewichtsbereich von 12000 bis 160000 auftrennt, wobei es somit die Proteine in dem HIV-I- Viruslysat umfaßt. Jedoch kann auch ein SDS-PAGE-Gradientengel verwendet werden. Zum Beispiel trennt ein Gradient in dem Bereich von 3,3 % bis 20 % Polyacrylamidgel das Antigen in dem gewünschten Molekulargewichtsbereich. Vorzugsweise wird ein Molekulargewichtsmarker zusammen mit dem HIV-I-Antigen elektrophoretisiert. Diese Markermaterialien dienen dem Kalibrieren des Gels und erleichtern die Identifizierung der Proteinbanden mit spezifischen Molekulargewichten. Geeignete Molekulargewichtsmarker sind gewerblich erhältlich, wie ein Cytochrom C- Molekulargewichtssystem von United States Biochemical Corporation.
- Folgend auf die Elektrophorese werden die Proteinbanden des aufgetrennten Antigens per Elektrotransfer übertragen, vorzugsweise auf Nitrozellulosefolien (z.B. solche, die gewerblich erhältlich sind von Schleicher und Schuell, Inc. als Produkt- Nr. BA 83, das eine Rolle aus Nitrozellulosepapier darstellt mit einer Porengröße von 0,2 um). Andere Papierarten, die dem Fachmann bekannt sind, wie ein Papier vom Diazotyp, sind ebenfalls geeignet. Der Elektrotransfer der Proteinbanden wird erzielt durch Mittel, wie den von Tsang et al., Methods in Enzymology, Band 92, insbesondere Seite 378, und W. Van Raamsdonk, et al., J. Immunol. Methods 17:337 (1977).
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das aufgetrennte HIV-I-Protein in der Anwesenheit von Milchproteinen, vorzugsweise von entfetteten Proteinen, inkubiert. (Die Anwesenheit von Fett beeinträchtigt den Test). Geeignete, entfettete Milchproteine umfassen Carnation Niedrigfettmilchpulver, aber beliebige entfettete Milchproteine, die bekannt sind, sind ebenfalls brauchbar. Von diesen Milchproteinen ist bekannt, daß sie ungefähr 60 bis 90 % an Casein enthalten, ein Phosphoprotein, das reich an Serin ist; und von 10 bis 40 % an verschiedenen anderen Proteinen enthalten, einschließlich Lactoalbumin, Lactoglobulin, Membranglobulin und eine geringe Menge an alkalischer Phosphatase, Peroxidasekatalase und Xanthindehydrogenase. Die Milchproteine können in das Assaysystem auf verschiedene Weise eingeführt werden.
- Gemäß einer ersten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird das Nitrozellulosepapier, enthaltend das aufgetrennte HIV-I-Antigenprotein, beschichtet mit den Milchproteinen aus einer Lösung aus Puffer (z.B. PBS-Tween 20), enthaltend ungefähr 5 bis 10 % Milchproteine, für ungefähr 60 Minuten. Das Nitrozellulosepapier wird anschließend bei Raumtemperatur für eine Zeitspanne von 30 bis 60 Minuten getrocknet. Nach dem Verdunsten wird das Papier in der Pufferlösung ohne Milchproteine (z.B. PBS- Tween 20) bei Raumtemperatur für 1 bis 5 Minuten gewaschen. Das behandelte Papier wird dann unter feuchten Bedingungen bis zur Verwendung aufbewahrt.
- Gemäß einer zweiten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Milchproteine sorgfältig mit den Pufferlösungen, enthaltend die Testanalysenprobe und Kontrollen, gemischt und darin gelöst. Die Kontrollen und Serumanalysenproben werden dann mit den Nitrozellulosestreifen für 15 bis 20 Minuten inkubiert. Die Flüssigkeit in jedem Gefäß wird verworfen, und die Streifen werden mit PBS-Tween -Puffer bei pH 7,3 bis 7,4 gewaschen. Der Waschzyklus besteht aus vier Waschvorgängen für jeweils 1 Minute.
- Gemäß einer dritten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die Milchproteine vorab auf die Nitrozellulosestreifen beschichtet und zusätzlich gemischt mit der Pufferlösung und darin gelöst.
- Die Nitrozellulosefolien werden dann in Streifen von ungefähr 2 bis 2,5 mm Breite geschnitten. Jeder Streifen wird nach entsprechender Markierung in ein getrenntes Testgefäß oder in eine Aluminiumfolie eingebracht zum Bestimmen von Antikörpern gegen das HIV-I-Viruslysat mit dem erfindungsgemäßen enzymgekoppelten Immunoassay. Die Nitrozellulosestreifen können auch in Inkubationsgefäßen zum In-Haus-Testen angebracht werden. Es ist jedoch anzumerken, daß eine nicht-geschnittene Folie in einem Inkubationsgefäß angebracht werden kann, das mit einer druckfesten Umhüllung ausgestattet ist, anstatt die Folie in einzelne Streifen zu schneiden. Diese Technik ist auch gut geeignet für den In-Haus-Gebrauch, im Gegensatz zu dem vor-Ort- Testen. Es ist jedoch anzuerkennen, daß das vor-Ort-Testen durch Verwendung von einzelnen Gefäßen erleichtert wird. Auch minimiert das Anbringen der Streifen in einzelnen Gefäßen den Bedarf der Handhabung während des Assayverfahrens und somit ein Verschmieren der anfälligen Proteinmuster durch Fingerabdrücke. Die Verwendung von Streifen ist ferner ökonomischer als die Verwendung von nicht-geschnittener Folie, da weniger Reagenz zum Durchführen des Tests erforderlich ist.
- Testanalysenproben, positive und negative Referenzen und Reagenzkontrollen werden den Gefäßen, enthaltend die Nitrozellulosestreifen mit dem aufgebrachten, aufgetrennten Antigen, zugesetzt. Testanalysenproben umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Serum, Samen und andere Körperflüssigkeiten. Die Positivreferenz ist typischerweise eine Analysenprobe, von der bekannt ist, daß sie Antikörper gegen das HIV-I-Viruslysat enthält. Positive Referenzen sind erhalten worden von den Zentren für Disease Control (CDC), Atlanta, Georgia. Alternativ kann eine positive Referenz von einer beliebigen Analysenprobe hergestellt werden, die standardisiert worden ist mit einer positiven Referenz, erhalten von den CDC. Standardisierung bedeutet üblicherweise, daß die gleichen Testergebnisse in ungefähr 20 Läufen erhalten wurden. Die positive Referenz wird 1/200 (1 Teil positive Referenz auf 200 Teile Puffer) in PBS (phosphatgepufferte Lösung)-Tween , pH 7,2 bis 7,4 verdünnt. Typischerweise werden 15 ul der positiven Referenz gemischt mit 3 ml PBS-Tween .
- Die negative Kontrolle ist eine Analysenprobe, von der bekannt ist, daß sie frei ist von Antikörpern gegen das HIV-I-Viruslysat, und sie wird hergestellt durch 1:20-Verdünnung mit PBS- Tween , pH 7,2 bis 7,4. Typischerweise werden 150 ul einer negativen Referenz mit 3 ml PBS-Tween gemischt. Negative Referenzen sind ebenfalls erhalten worden von den CDC.
- Da das erfindungsgemäße Assayverfahren eher eine qualitative als eine quantitative Bestimmung darstellt, werden die positiven und negativen Referenzen verwendet zum Ermitteln der Testergebnisse durch Vergleich mit den Ergebnissen, die für die Testanalysenproben erhalten wurden.
- Die Reagenzkontrolle ist enthalten als ein Merkmal der Qualitätskontrolle der vorliegenden Erfindung und wird verwendet zum Sicherstellen des exakten Funktionierens des Tests. Normalerweise ist die Reagenzkontrolle der Puffer, der verwendet wird zum Verdünnen der Testanalysenproben und der Kontrollen. Vorzugsweise wird PBS-Tween , pH 7,2 bis 7,4, als die Reagenzkontrolle verwendet. Jedoch ist die Reagenzkontrolle nicht erforderlich während der Routineauswertung der Streifen.
- Wie oben ausgeführt, können unter Verwendung der erfindungsgemäßen Milchproteinbehandlung Testanalysenproben verwendet werden, die stärker konzentriert sind als diejenigen, die im herkömmlichen Western-Blot verwendet werden, um die Bindung der Antikörper an das HIV-I-Viruslysat an das, an den Streifen vorhandene Antigen zu beschleunigen. Typischerweise sind die Testanalysenproben ungefähr drei- bis fünfmal stärker konzentriert als Analysenproben, die mit dem Western-Blot-Assay getestet werden. Andererseits können Testanalysenproben, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ungefähr 2,5 mal geringer konzentriert sein, als die Analysenproben, die in dem Schnellen-Western-Blot-Assay verwendet werden. Das vorliegende Verfahren stellt somit eine gesteigerte Empfindlichkeit bereit, ohne eine deutlich gesteigerte, unspezifische Proteinbindung, wie sie bei Verwendung sehr hoher Konzentrationen der Testanalysenprobe vorkommen kann.
- Für Serumanalysenproben ist eine drei- bis siebenfache Konzentration erforderlich, wie sie in dem herkömmlichen Western- Blot-Assay verwendet wird, d.h. eine Verdünnung von einem Teil Serum auf 20 Teile Puffer im Vergleich zu dem 1: 100-Verdünnungsfaktor, der in dem Western-Blot-Assay verwendet wird (siehe Tsang et al., Method of Enzymology, Band 92, 1983). Theoretisch kann der tatsächliche Verdünnungsfaktor für spezielle Analysenproben variiert werden, jedoch abhängig davon, ob eine Probe eine extrem schwache positive Antwort ergibt. Studien zeigen, daß fünffache Serumkonzentrationen der üblicherweise bei herkömmlichem Western-Blot verwendeten ungeeignet sind, wegen des hohen Gehalts an anderen Serumproteinen, als den zu bestimmenden Antikörpern, die den Test beeinträchtigen. Ein PBS-Tween -Puffer mit pH 7,2 bis 7,4 ist bevorzugt für die Verdünnung der Analysenproben. Typischerweise werden 60 ul einer Serumanalysenprobe gemischt mit 3 ml PBS- Tween . Aber andere bekannte Puffer können eingesetzt werden.
- Die Streifen werden dann inkubiert mit den positiven und negativen Referenzen, Kontrollen und Testanalysenproben bei Raumtemperatur, vorzugsweise für ungefähr 10 bis 20 Minuten, um die Bindung jeglichen Antikörpers gegen HIV-I, der in der Analysenprobe vorhanden ist, an das Antigen in den Nitrozellulosestreifen zu ermöglichen. Eine 20-minütige Inkubationsphase ist besonders bevorzugt, um eine optimale Bindung bei schwach Positiven sicherzustellen.
- Der Flüssigkeitsgehalt in jedem Gefäß wird verworfen, wobei die Streifen in dem Gefäß angeordnet bleiben. Die Streifen werden dann gewaschen, vorzugsweise mit PBS-Tween -Puffer bei pH 7,3. Insbesondere umfaßt der Waschzyklus vier Waschvorgänge für jeweils 1 Minute mit PBS-Tween . Die Streifen werden dann inkubiert mit einem enzymkonjugierten Anti-Human-IgG-Antiserum, vorzugsweise für ungefähr 10 bis 20 Minuten, bei Raumtemperatur, um die Bindung des enzymkonjugierten Antiserums an jeglichen Antikörper zu erlauben, der an das Antigen während der ersten Inkubationsphase gebunden hat. Vorzugsweise wird ein Konjugat aus Anti-Human-IgG-Ziege-Antiserum-Meerrettichperoxidase verwendet, obwohl andere enzymkonjugierte Antiseren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden können. Wiederum ist eine 20-minütige Inkubationsdauer bevorzugt.
- Ein weiteres Mal wird der Flüssigkeitsgehalt eines jeden Gefäßes verworfen. Die Streifen werden dann gewaschen. Vorzugsweise umfaßt der Waschzyklus vier Waschvorgänge von je 1 Minute mit PBS-Tween , gefolgt von einem Waschvorgang für 1 Minute mit PBS.
- Dann werden die Streifen mit einem Enzymsubstrat (Farbänderungsindikator) für ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Erzeugung einer Farbe inkubiert. Das geeignete Substrat zur Verwendung mit Meerrettichperoxidaseenzym ist 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat (DAB). Selbstverständlich jedoch wird die Substratwahl von dem verwendeten Enzym vorgegeben. Nach der Inkubationsphase wird die Farbreaktion gestoppt durch den Zusatz von destilliertem Wasser, und die Ergebnisse werden bestimmt gemäß den Standardtechniken, wie berichtet von Tsang et al., Methods in Enzymology, Band 92 (1983)
- In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung kann die Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-I in ungefähr 50 bis 60 Minuten erfolgen, wegen der stark verringerten Inkubationszeiten, die insgesamt ungefähr 40 Minuten beträgt, im Vergleich mit dem Western-Blot-Assay, der mindestens 20 Stunden erfordert und dem Schnellen-Western-Blot-Assay, der 80 Minuten erfordert.
- In Übereinstimmung mit einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein separater diagnostischer Test-Kit bereitgestellt, der das "vor-Ort"-Screenen nach Antikörpern gegen HIV-I-Virus erlaubt. Der Test-Kit umfaßt einen Satz Gefäße, enthaltend positive und negative Referenzen und mindestens ein Puffergefäß, enthaltend ein vorab bestimmtes Volumen an Puffer, dem die Testanalysenprobe in einer vorab bestimmten Menge zugesetzt wird, um eine Analysenprobenkonzentration von drei- bis siebenmal größer als derjenigen, die in dem Western-Blot-Assay verwendet wird, zu erhalten. Die Referenz- und Kontrollgefäße sind vorab verdünnt und somit muß der Anwender nur die Testanalysenprobe verdünnen. Ein Satz an Streifengefäßen wird ebenfalls bereitgestellt, wobei jedes Gefäß einen Nitrozellulosestreifen enthält, der aufgetrenntes HIV-I-Antigenprotein enthält, das per Elektrotransfer aus einem SDS-PAGE-Gel übertragen wurde, das mit 20 bis 40 % höherer Antigenproteinkonzentration beladen war, als dasjenige, das im herkömmlichen Western-Blot verwendet wird. Vorzugsweise enthalten die Streifen aufgetrenntes HIV-I-Viruslysat, das per Elektrotransfer von einem 10 x 16 cm SDS-PAGE-Gel übertragen wurde, das mit 61 bis 96 ug Antigenprotein beladen worden war im Vergleich zu einem Bereich von 51 bis 80 ug für einen Western-Blot, abhängig von der relativen Menge an spezifischen HIV-Proteinen.
- Wie oben ausgeführt, ist das Milchproteinadditiv entweder vorgelöst in den Pufferlösungen, enthaltend die Testanalysenprobe und die positiven und negativen Referenzen, oder auf die Nitrozellulosestreifen, die das aufgetrennte HIV-I-Antigenprotein enthalten, aufgeschichtet. Alternativ können die Milchproteine getrennt bereitgestellt werden in Pulverform, die dem Puffer durch den Anwender zugesetzt werden; die erhaltene Pufferlösung kann dann direkt mit den Test- und Referenzanalysenproben gemischt werden oder verwendet werden, um die Teststreifen zu beschichten.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Referenz-, Kontroll- und Analysenprobengefäße numeriert. Den Streifengefäßen werden Zahlen zugeordnet, die denen auf den Referenz-, Kontroll- und Analysenprobegefäßen entsprechen. Den Streifen werden Zahlen zugeordnet, entsprechend den Gefäßen, in die sie eingebracht werden. Diese Art des Numerierungssystems vermeidet unbeabsichtigte Verwechselungen, die die Exaktheit des Tests zerstören können. Es ist verständlich, daß es wahrscheinlich ist, ein falsch-positives Ergebnis zu erhalten, falls der Verschluß eines Gefäßes, das eine positive Analysenprobe enthält, auf einem Gefäß angebracht wird, das eine negative Analysenprobe enthält.
- Der Kit enthält auch Gefäße mit enzymkonjugiertem Antiserumreagenz, Substrat oder Farbänderungsindikator, zwei Waschpuffer und eine Lösung zum Abstoppen der Farbreaktion. Vorzugsweise wird Anti-Human-IgG-Ziegen-Antiserum-Meerrettichperoxidase als das enzymkonjugierte Antiserumreagenz verwendet. Das bevorzugte Substrat, das die Reaktion beendende Reagenz und Waschpuffer sind DAB, destilliertes Wasser und PBS-Tween bzw. PBS.
- Vorzugsweise werden vorab entwickelte positive und negative Referenzstreifen und Reagenzkontrollstreifen in dem Kit bereitgestellt. Diese Kontrollen werden im wesentlichen auf die gleiche Weise hergestellt, wie zuvor beschrieben, außer daß nach dem Entwickeln die Streifen getrocknet werden. Die vorab entwickelten Streifen werden verwendet, um die Testergebnisse durch einen visuellen Vergleich mit den Teststreifen nach dem Vervollständigen einer Farbreaktion zu ermitteln. Die Reagenzkontrolle wird, wie angemerkt, bereitgestellt, um das exakte Funktionieren der Reagenzien sicherzustellen. Die vorab entwikkelten Referenz- und Kontrollstreifen sind ein signifikantes Merkmal der vorliegenden Erfindung, da sie das Auswerten der Assayergebnisse erleichtern und praktisch den Bedarf eines geübten Technikers zum Ermitteln der Ergebnisse beseitigt.
- Weiterhin, da der Kit separat vorliegt, ist eine Laborausstattung nicht erforderlich. Die Vorteile eines solchen Kits sind offensichtlich, da er das Screenen nach HIV-I-Antikörpern zu einer beliebigen Zeit und an jedem Ort ermöglicht, einschließlich abgelegene geographische Regionen und solche Orte, die nicht im Besitz einer 24-stündigen Testeinrichtung sind. Wie zuvor erwähnt, ist dies von größter Bedeutung bei bestimmten Organtransplantationssituationen.
- Es ist berichtet worden, daß bei HIV-I-Infektion die wesentliche Immunreaktivität gegen gp41, ein Protein mit Molekulargewicht 41000, und insbesondere gegen gp120 und gp160, Proteine mit Molekulargewichten von 120000, bzw. 160000, gerichtet ist, wobei von diesen Proteinen angenommen wird, daß sie Hüllproteine des Virus darstellen. Somit sind die gp41-, gp120- und/oder gp160-Banden von entscheidender Signifikanz in dem vorliegenden Verfahren. Auch von Bedeutung ist p24, ein Protein mit Molekulargewicht 24000. Typischerweise wird der Test als positiv angesehen, wenn Aktivität bei den p24- und gp41-Banden und/oder den gp120 und/oder gp160-Banden nachgewiesen wird. Demzufolge ist die richtige Auftrennung des HIV-I-Antigenlysats vital. Die Menge an Protein, die der Elektrophorese unterzogen wird, steht in Beziehung zu der Unterscheidbarkeit der erhaltenen Banden. Offensichtlich ist es wünschenswert, unterscheidbare Banden an den kritischen Stellen, insbesondere gp20, gp160 und gp41 sowie auch p24 mit wenigen oder keinen Hintergrundbanden zu erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer besseren Auftrennung der wichtigen gp160- und gp120-Banden als die herkömmlichen und die Schnellen-Western- Blot-Techniken. Das Vorhandensein dieser Proteine mit höherem Molekulargewicht gestattet einen exakteren Hinweis auf die Anwesenheit des AIDS-Retrovirus in der Testanalysenprobe, da diese Hüllproteine als die zuverlässigsten Banden bei der Auswertung der Teststreifen angesehen werden.
- Die Proteinbanden werden gemäß der vorliegenden Erfindung viel deutlicher und besser aufgetrennt im Vergleich zu den anderen Western-Blots, wobei dies das Interpretieren der Ergebnisse erleichtert.
- Ein Assay (der Schnelle-Western-Blot I) wurde durchgeführt gemäß dem Verfahren, wie ausgeführt in der ebenfalls anhängigen WO-Anmeldung Nr. 87/07647. Das SDS-PAGE-Gel/10 x 16 cm wurde mit 76,5 ug HIV-Lysat beladen, und die gesamte Reaktionszeit betrug 70 Minuten.
- Ein weiterer Assay (der Schnelle-Western-Blot II) wurde gemäß dem hier beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das SDS-PAGE-Gel wurde mit ungefähr 67 ug HIV-Lysat beladen. Das Milchprotein wurde vorab auf die Nitrozellulosestreifen geschichtet und dem Puffer, enthaltend die Analysenproben, zugesetzt. Die gesamte Reaktionszeit betrug 40 Minuten (es ist anzumerken, daß das in jedem der Assays verwendete Viruslysat von verschiedenen Chargen stammte).
- Die folgenden spezifischen Beispiele des schnellen Western- Blot II-Assays und die Verwendung der Milchproteine erläutern die Natur der vorliegenden Erfindung weiter, obwohl es selbstverständlich ist, daß die Erfindung nicht darauf beschränkt ist.
- HIV-I-Antigenkonzentrat wurde elektrophoretisch aufgetrennt in dem Molekulargewichtsbereich von 12000 bis 160000.
- Das HIV-Lysatantigen wurde per Elektrotransfer auf Nitrozellulosepapier übertragen. Das Papier wurde dann in Streifen geschnitten und in getrennte Testgefäße eingebracht.
- 0,15 g Carnation -Milchproteinpulver wurde in jeweils 3 ml Pufferlösung, enthaltend die Analysenprobe und Kontrollen, aufgelöst durch über-Kopf-Drehen, fünf- bis zehnmal, um das vollständige Mischen mit den Milchproteinen zu ermöglichen. Die Kontrollen und die Serumanalysenproben wurden dann mit den Nitrozellulosestreifen für 15 Minuten inkubiert. Die Flüssigkeit aus jedem Gefäß wurde verworfen, und die Streifen wurden mit PBS-Tween-Puffer bei pH 7,3 bis 7,5 gewaschen. Die Waschzyklen bestanden aus vier Waschvorgängen für jeweils 1 Minute.
- Die Streifen wurden dann mit einem enzymkonjugierten Anti- Human-IgG-Antiserum (1:500) für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Flüssigkeit wurde wieder verworfen, und die Streifen wurden viermal mit PBS-Tween gewaschen, gefolgt von einem Waschen für 1 Minute mit PBS alleine.
- Die Streifen wurden für 10 Minuten mit Meerrettichperoxidase und seinem Substrat 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat (DAB) inkubiert. Die Farbreaktion wurde abgestoppt durch den Zusatz von destilliertem Wasser, und die Ergebnisse wurden ermittelt durch Vergleich der Teststreifen mit den vorab entwickelten positiven, negativen und Reagenzstreifen, die mit dem Kit bereitgestellt werden, und der Assay wurde innerhalb von 50 Minuten ab der anfänglichen Behandlung der Testanalysenprobe vervollständigt.
- HIV-Antigenkonzentrat entsprechend 61 ug/10 x 16 cm Gel wurde elektrophoretisch aufgetrennt in dem Molekulargewichtsbereich von 12000 bis 160000.
- Das HIV-Lysatantigen wurde per Elektrotransfer auf Nitrozellulosepapier übertragen. Das Papier wurde dann beschichtet in einem Bad, das ausgerüstet war mit einem Magnetrührer, mit einer PBS-Tween 20-Pufferlösung, enthaltend fettfreie Milchproteine.
- Der PBS-Tween-Puffer enthielt 5 % Carnation -Milchproteine. Dies wurde erreicht durch Mischen von 5 g des Pulvers mit 100 ml des Puffers.
- Das Nitrozellulosepapier wurde anschließend bei Raumtemperatur für eine Dauer von 5 bis 30 Minuten getrocknet. Nach dem Verdunsten wurde das Papier in PBS-Tween 20 bei Raumtemperatur für 2 Minuten gewaschen. Die Streifen wurden dann unter feuchten Bedingungen bis zum Gebrauch aufbewahrt.
- Dem Verfahren aus Beispiel I wurde dann gefolgt, beginnend mit der anfänglichen Inkubation der Nitrozellulosestreifen.
- Eine Studie wurde durchgeführt, in der das Schnelle-Western- Blot II-Verfahren (QWB II), wie hierin beschrieben, verglichen wurde mit dem herkömmlichen Western-Blot und den ELISA-Techniken. Die Ergebnisse der Testläufe mit 338 Serumanalysenproben werden in Tabelle I angegeben. Wie in Tabelle I gezeigt, ist das erfindungsgemäße QWB II-Assayverfahren so zuverlässig, wie der herkömmliche Western-Blot-Assay. Tatsächlich war mindestens eine Analysenprobe, die unter Verwendung des Western-Blots nicht eindeutig war, positiv unter Verwendung des Schnellen- Western-Blot II-Assays. Die Vorteile des Schnellen-Western- Blots II sind offensichtlich.
- Die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-I kann innerhalb von 50 Minuten nachgewiesen werden. Die Geschwindigkeit, mit der der Test durchgeführt werden kann, ist enorm wichtig für Organtransplantatempfänger, da Spenderorgane eine beschränkte brauchbare Lebensspanne außerhalb des Körpers besitzen und in Verletzungsfällen, wo eine sofortige Operation erforderlich ist. Der Schnelle-Western-Blot II führt wegen der Verwendung der Milchproteine zu einer verstärkten und beschleunigten spezifischen Proteinbindung. Weiterhin tritt weniger unspezifische Bindung von Proteinen auf. Die Sicherheit, mit der die spezifischen Banden nachgewiesen werden können, erleichtert die Diagnose von AIDS und stellt möglicherweise auch brauchbare Information bereit hinsichtlich des Stadiums der HIV-Infektion, da Antikörper gegen Antigenproteine mit verschiedenem Molekulargewicht einen Hinweis bieten können auf verschiedene Stadien in der Progression der Krankheit. Tabelle II stellt Information bereit hinsichtlich der Korrelation der Anwesenheit von spezifischen Proteinbanden mit verschiedenen Stadien in der Progression der Krankheit.
- Weiterhin und unabhängig von der Organspendesituation können Krankenhäuser unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und des diagnostischen Test-Kits rasch und exakte Ergebnisse für Patienten erhalten, von denen angenommen wird, daß sie eine HIV-Infektion tragen, und können somit die Behandlung beschleunigen. Weiterhin, falls AIDS diagnostiziert ist, kann das Krankenhauspersonal leichter notwendige Vorsichtsmaßnahmen einleiten und die zufällige Viruskontamination minimieren.
- Während bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen beschrieben worden sind, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne sich von der vorliegenden Erfindung zu entfernen. Demzufolge ist die obige Beschreibung als erläuternd anzusehen, und nicht als beschränkend, wobei der Umfang der Erfindung durch die folgenden Ansprüchen definiert wird. Tabelle I Studie, die den herkömmlichen Western-Blot und ELISA mit dem Schnellen-Western-Blot II vergleicht Positiv für Antikörper keine eindeutigen Ergebnisse negative Ergebnisse
- 338 Serumproben, erhalten vom Baylor University Medical Center und von verschiedenen Laboratorien in der Dallas Ft. Worth Metroplex Region, wurden auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-I getestet, wobei das ELISA-Screenen nach HIV- Antikörpern mit dem Behring Prozessor 2 erfolgte, unter Verwendung des Elektronucleonic HIV-Ak-Test-Kits, mit dem Schnellen-Western-Blot II (QWBII oder RapWB) und mit bestätigender herkömmlicher Western-Blot-Technik. Der QWBII wurde in Übereinstimmung mit dem hierin beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Milchproteine wurden vorab auf die Nitrozellulosestreifen geschichtet und in die Pufferlösungen, enthaltend die Analysenproben und Kontrollen, gemischt. Tabelle II Muster von HIV-Antigen/Antikörper im Schnellen-Western-Blot (Korrelation mit dem Stadium und der Prognose) Klinisches Stadium Testergebnisse Akute Infektion latent, aber noch infektiös (nach 1 bis 2 Monaten folgend auf die Infektion) AIDS und Pneumocystis HIV-Antigenaemie (erste) IgM-Antikörper gegen HIV (zweite) (ELIS A-negativ) IgG-Anti-p24/55 & gp160/120 (dritte) (in einigen Fällen ELISA-negativ am Anfang) IgG-Anti-gp41 (vierte) HIV-Antigenaemie, variabel IgM-Antikörper oft innerhalb des 1. Monats nach Infektion vorhanden (ELISA-negativ) IgG-Anti-p24/55 vorhanden IgG-Anti-gp160/120 vorhanden IgG-Anti-gp41 vorhanden IgG-Anti-p64/53 vorhanden IgG-Anti-Reverse-Transkriptase vorhanden HIV-Antigenaemie vorhanden IgG-Anti-p24/55 niedrig oder nicht vorhanden IgG-Anti-gp41 niedrig oder nicht vorhanden IgG-Anti-gp160 vorhanden bei niedrigem Spiegel IgG-Anti-p53 niedrig oder nicht vorhanden IgG Anti-p64 vorhanden bei niedrigem Spiegel Tabelle II (Fortsetzung) Kaposi-Sarkom HIV-Antigenaemie vorhanden in vielen Fällen IgG-Anti-p24/55 niedrig oder nicht vorhanden IgG-Anti-gp41 niedrig oder nicht vorhanden IgG-Anti-gp120 vorhanden bei niedrigem Spiegel IgG-Anti-gp160 vorhanden bei niedrigem Spiegel IgG-Anti-p53 vorhanden bei niedrigem Spiegel IgG-Anti-p64 vorhanden bei niedrigem Spiegel
- Information für Tabelle II wurde aus folgenden Quellen erhalten:
- 1. Pan, L-2, Cheng - Mayer, C., Levy, JA J. Infect. Dis. (155) 626-632 (1987).
- 2. Lelie, P.N., Van der Poel, C.L., Reesink, H.W. Lancet (I) Seite 632 (1987).
- 3. Kumar, P., Pearson, J., Martin, D.H. et al. Ann. Intern. Med. (106) 244-245 (1987).
- 4. Wall, R.A., Denning, D.W., Amos, A. Lancet (I) Seite 566 (1987).
- 5. Weber, J.M., Clapham, P.R. Lancet (I) 119-122 (1987).
Claims (16)
1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das HIV-I-
Retrovirus, umfassend:
(a) Inkontaktbringen von Nitrozellulosepapier, enthaltend
darauf aufgebrachtes aufgetrenntes HIV-I-Antigenprotein,
erhalten von einem gelelektrophoretisch aufgetrennten
Viruslysat, mit einer Testanalysenprobe, die mit einem Puffer
verdünnt ist, und Inkubieren des Nitrozellulosepapiers und
der Testanalysenprobe, um die Bindung von Antikörpern, die
in der Analysenprobe vorhanden sind, an das Protein auf dem
Nitrozellulosepapier zu ermöglichen, worin
(1) das Viruslysat per Elektrotransfer auf das
Nitrozellulosepapier übertragen wird in einer Konzentration von
mindestens 20 %, aber weniger als 40 %, größer als die 50-100
ug von HIV-I-Antigenprotein pro 10 x 16 cm
Elektrophoresegel, das in einem herkömmlichen Western-Blot-Assay
verwendet wird;
(2) das aufgetrennte HIV-I-Antigenprotein wird in Schritt
(a) (1) in der Anwesenheit von fettfreiem Milchprotein
inkubiert; und
(3) die Testanalysenprobe wird in einem Puffer verdünnt auf
eine Konzentration, die ungefähr 3-5 mal größer ist als die
Konzentration, die in dem herkömmlichen Western-Blot-Assay
verwendet wird; oder auf eine Konzentration, die mindestens
3 mal aber weniger als 7 mal größer ist als die 1:100
Verdünnung der Testanalysenprobe, die in dem Western-Blot-
Assay im Falle einer Serumanalysenprobe verwendet wird;
(b) Inkontaktbringen des inkubierten Nitrozellulosepapiers aus
Schritt (a) mit einem enzymkonjugierten Antiserum, das mit
den Antikörpern reaktionsfähig ist, und Inkubieren, um die
Bindung des Antiserums an die Antikörper zu ermöglichen;
(c) Inkontaktbringen des inkubierten Nitrozellulosepapiers aus
Schritt (b) mit einem Enzymsubstrat, das spezifisch ist für
das Enzym aus Schritt (b), und Inkubieren, um dadurch eine
Farbe zu erzeugen;
(d) Abstoppen der Farberzeugungsreaktion von Schritt (c); und
(e) Ermitteln der Menge an hergestellter Farbe als einen
Hinweis auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen das HIV-I-
Viruslysat;
um den Assay innerhalb von 60 Minuten zu vervollständigen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das fettfreie Milchprotein
60 bis 90 Gew.-% Casein und 10 bis 40 Gew.-% eines Materials
umfaßt, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus
Lactoglobulin, Membranglobulin, alkalischer Phosphatase,
Peroxidasekatalase, Xyanthindehydrogenase und Mischungen davon.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nitrozellulosepapier,
das das aufgebrachte aufgetrennte HIV-I-Antigen enthält,
beschichtet wird mit fettfreiem Milchprotein vor der Inkubation
mit der Testanalysenprobe in Schritt (a).
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das fettfreie Milchprotein
mit dem Puffer, der zum Verdünnen der Testanalysenprobe
verwendet wird, gemischt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Antigenlysat eine
Proteinkonzentration zwischen 60 bis 100 ug pro 10 x 16 cm Gel
besitzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Testanalysenprobe ein
Serum ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Schritt (a) wiederholt
wird mit mindestens einer Positivkontrolle (einer Analysenprobe
enthaltend HIV-I-Antikörper) und mindestens einer
Negativkontrolle (einer Analysenprobe, die frei ist von
HIV-I-Antikörpern) anstelle der Testanalysenprobe, das dadurch gebildete
Reaktionsprodukt wird Schritten (b) bis (e) unterzogen, und die
erzeugten Farben werden als Standards mit der Farbe verglichen,
die von der Testanalysenprobe erzeugt wird, um die Anwesenheit
von Antikörpern gegen das HIV-I-Retrovirus in der
Testanalysenprobe zu ermitteln.
8. Verfahren nach Anspruch 1, worin das aufgetrennte HIV-I-
Antigenprotein aus Schritt (a) (1) behandelt wird mit
fettfreiem Milchprotein durch
(1) Beschichten des Nitrozellulosepapiers, hergestellt durch
die Übertragung in Schritt (a) (1), mit 3 bis 10 %
fettfreiem Milchprotein, oder
(2) Einbringen von 3 bis 10 % fettfreiem Milchprotein in den in
Schritt (a) (2) verwendeten Puffer.
9. Verfahren nach Anspruch 8, in dem Schritt (a) wiederholt
wird mit mindestens einer Positivkontrolle (einer
Analysenprobe, enthaltend HIV-I-Antikörper) und einer Negativkontrolle
(einer Analysenprobe, die frei ist von HIV-I-Antikörpern)
anstelle der Testanalysenprobe, das dadurch gebildete
Reaktionsprodukt wird Schritten (b) bis (e) unterzogen, und die
erzeugten Farben werden als Standards verglichen mit der von der
Testanalysenprobe erzeugten Farbe, um die Anwesenheit von
Antikörpern gegen das HIV-I-Retrovirus in der Testanalysenprobe zu
ermitteln.
10. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Testanalysenprobe
gemischt wird mit einem Puffer ausgewählt aus der Gruppe
bestehend aus PBS-Tween, TRIS-Puffern, TBS-Puffern, Harnstoffpuffern
und Polyethylenglycol in Kochsalz oder destilliertem Wasser.
11. Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder Inkubationsschritt
nicht mehr als 20 Minuten durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, in dem Schritt (a) wiederholt
wird mit mindestens einer Positivkontrolle (einer
Analysenprobe, enthaltend HIV-I-Antikörper) und einer Negativkontrolle
(einer Analysenprobe, die frei ist von HIV-I-Antikörpern)
anstelle der Testanalysenprobe, das dadurch gebildete
Reaktionsprodukt wird Schritten (b) bis (e) unterzogen, und die erzeugte
Farbe wird als Standards verglichen mit der von der
Testanalysenprobe erzeugten Farbe, um die Anwesenheit von Antikörpern
gegen das HIV-I-Retrovirus in der Testanalysenprobe zu
ermitteln.
13. Ein diagnostischer Testkit für den Nachweis von
AIDS-spezifischen Antikörpern, umfassend:
(a) einen Satz an Kontrollgefäßen, umfassend positive und
negative Referenzen;
(b) mindestens ein Kontrollreagenzgefäß;
(c) mindestens ein Verdünnungsgefäß, enthaltend ein vorab
bestimmtes Volumen an Puffer zum Verdünnen der
Testanalysenprobe, um eine Konzentration der Testanalysenproben von
ungefähr 3 bis 5 mal größer als die Konzentration, die in dem
Western-Blot-Assay verwendet wird, zu erhalten; oder auf
eine Konzentration von 3 bis 7 mal größer als die 1:100
Verdünnung der Testanalysenprobe, die in dem Western-Blot-
Assay in dem Fall der Serumanalysenprobe verwendet wird;
(d) einen Satz an Gefäßen, enthaltend
Nitrozelluloseteststreifen, enthaltend aufgetrenntes HIV-I-Antigen, wobei das
Antigen von gelelektrophoretisch aufgetrenntem Viruslysat
erhalten wurde, worin das aufgetrennte HIV-I-Antigen in einer
Konzentration von mindestens 20 % bis 40 % größer ist als
die 50 bis 100 ug von Antigenprotein pro 10 x 16 cm
Elektrophoresegel, das in dem herkömmlichen Western-Blot-Assay
verwendet wird;
(e) ein fettfreies Milchproteinreagenz zum Binden mit dem
aufgetrennten HIV-I-Antigen, wobei das Reagenz gelöst ist in
dem Puffer in Verdünnungsgefäß (c) oder beschichtet ist auf
die Nitrozelluloseteststreifen in Gefäßen (d);
(f) ein enzymkonjugiertes Antiserum zum Reagieren mit dem
Antikörper-Antigenkomplex;
(g) ein Farbwechselindikator zum Sicherstellen, ob die HIV-I-
Antikörper vorhanden sind; und
(h) vorentwickelte positive und negative Referenzstreifen und
Reagenzkontrollstreifen zum Abschätzen der Ergebnisse des
Tests durch visuelles Vergleichen der vorentwickelten
Streifen mit den Teststreifen nach dem Beenden einer
Farbänderungsreaktion.
14. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 13, worin das
elektrophoretisch aufgetrennte Antigen eine Konzentration von 60 bis
100 ug HIV-Protein/10 x 16 cm Gel besitzt.
15. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 13, worin das
Verdünnungsgefäß 3 bis 10 % fettfreie Milchproteine enthält.
16. Diagnostischer Testkit nach Anspruch 15, worin die
fettfreien Milchproteine 60 bis 90 Gew.-% Casein und 10 bis 40
Gew.-% eines Materials umfaßt, das ausgewählt wird aus der
Gruppe, bestehend aus Lactoglobulin, Membranglobulin,
alkalische Phosphatase, Peroxidasekatalase, Xanthindehydrogenase und
Mischungen davon.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK362287A DK362287D0 (da) | 1987-07-13 | 1987-07-13 | Method for rapid and sensitive detection of hiv-1 antibodies |
US07/099,311 US4885235A (en) | 1987-07-06 | 1987-09-21 | Method for rapid and sensitive detection of HIV-1 antibodies |
PCT/US1988/002178 WO1989000207A1 (en) | 1987-07-13 | 1988-06-28 | Method for rapid and sensitive detection of hiv-i antibodies |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3854665D1 DE3854665D1 (de) | 1995-12-14 |
DE3854665T2 true DE3854665T2 (de) | 1996-03-21 |
Family
ID=26067141
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE3854665T Expired - Fee Related DE3854665T2 (de) | 1987-07-13 | 1988-06-28 | Verfahren zum schnellen und empfindlichen nachweis von hiv-1-antikörpern. |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0324834B1 (de) |
AT (1) | ATE130050T1 (de) |
CA (1) | CA1314208C (de) |
DE (1) | DE3854665T2 (de) |
WO (1) | WO1989000207A1 (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU637097B2 (en) * | 1989-05-09 | 1993-05-20 | Abbott Laboratories | Process for preparing an improved western blot immunoassay |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4452901A (en) * | 1980-03-20 | 1984-06-05 | Ciba-Geigy Corporation | Electrophoretically transferring electropherograms to nitrocellulose sheets for immuno-assays |
US4629783A (en) * | 1985-04-29 | 1986-12-16 | Genetic Systems Corporation | Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease |
DE3722272A1 (de) * | 1986-07-08 | 1988-01-21 | Bio Rad Laboratories | Differenzierung des krankheitszustandes bei aids-antikoerpertests |
US4865966A (en) * | 1987-04-17 | 1989-09-12 | New York University | Method for detecting antibodies to human immunodeficiency virus |
-
1988
- 1988-06-28 DE DE3854665T patent/DE3854665T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-06-28 AT AT88906559T patent/ATE130050T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-06-28 EP EP88906559A patent/EP0324834B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-28 WO PCT/US1988/002178 patent/WO1989000207A1/en active IP Right Grant
- 1988-07-04 CA CA000571086A patent/CA1314208C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0324834A4 (en) | 1992-05-06 |
EP0324834A1 (de) | 1989-07-26 |
ATE130050T1 (de) | 1995-11-15 |
EP0324834B1 (de) | 1995-11-08 |
CA1314208C (en) | 1993-03-09 |
WO1989000207A1 (en) | 1989-01-12 |
DE3854665D1 (de) | 1995-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2851150C2 (de) | Verfahren zur immunologischen Untersuchung einer Serumprobe | |
DE68924878T2 (de) | Bestimmung eines felinen pathogen-specifischen Antikörpers und eines felinen pathogenen Antigens in einem Immuntest. | |
DE3854553T2 (de) | Verfahren zum schnellen und empfindlichen Nachweis von IgM-Antikörpern gegen retrovirale Antigene. | |
DE68922243T2 (de) | Immuntest für HIV-1-Antigene unter Benutzung von F(AB')2-Fragmenten als Sonde. | |
DE3872500T2 (de) | Verwendung eines mit biotin verknuepften immobilisierten rezeptors in einer testvorrichtung, einem testsatz und einer methode zur bestimmung eines liganden. | |
DE69025940T2 (de) | Durch Silber intensiviertes, auf Goldmarkierung beruhendes Immuntestverfahren | |
DE3882705T3 (de) | Immunoglobulin-bestimmungsverfahren. | |
US4885235A (en) | Method for rapid and sensitive detection of HIV-1 antibodies | |
DE68917613T2 (de) | Natriumdecylsulfat enthaltende Waschlösung, Testsatz und Verfahren zur Bestimmung eines immunologischen Liganden. | |
Lin et al. | Standardized quantitative enzyme-linked immunoassay for antibodies to Toxoplasma gondii | |
DE69819643T2 (de) | Zwei-Inkubations mit markiertem Antigen verwendenes Immunoassay | |
EP0957360B1 (de) | Entstörung durch Rheumafaktoren | |
US4816387A (en) | Method for detection of antibodies to HTLV-III and diagnostic test kit useful therewith | |
Nishanian et al. | Significance of quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) results in evaluation of three ELISAs and Western blot tests for detection of antibodies to human immunodeficiency virus in a high-risk population | |
DE3636540A1 (de) | Verfahren zur bestimmung von anti-hiv, mittel dazu und ihre verwendung in diesem verfahren | |
DE69003618T2 (de) | Waschzusammensetzung, testsatz und ihre verwendung zur bestimmung eines viralen antigens aus herpes simplex. | |
DE3854665T2 (de) | Verfahren zum schnellen und empfindlichen nachweis von hiv-1-antikörpern. | |
DE69016617T2 (de) | Gepufferte Waschzusammensetzung, Zusammensetzung zur Unlöslichmachung, Testsätze und Verfahren zu ihrer Verwendung. | |
Ohlsson-Wilhelm et al. | Circulating human immunodeficiency virus (HIV) p24 antigen-positive lymphocytes: a flow cytometric measure of HIV infection | |
DE69119445T2 (de) | Analysemethode für infektiöse Pferdeanämie-Viren (EIA-Virus) | |
DE69929468T2 (de) | VERBESSERTE SPEZIFITÄT IN DER DETEKTION DER ANTI-RUBELLA IgM ANTIKÖRPER | |
Tonelli | Enzyme-linked immunosorbent assay methods for detection of feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus | |
EP0402757A2 (de) | Festphasenimmunoassay und Testbesteck zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern | |
DE3513915A1 (de) | Immunologischer testkit | |
EP0583689B1 (de) | Immunchemisches Verfahren zum Nachweis eines Analyten |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |