JPH0328765A

JPH0328765A - 改良ウエスタンブロッティング法

Info

Publication number: JPH0328765A
Application number: JP2119648A
Authority: JP
Inventors: Emerson W Chan; エマーソン・ダブリュ・チャン; Gerald Robey William; ウイリアム・ジェラルド・ロビイ; Schulze Werner; ワーナー・シュルズ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1989-05-09
Filing date: 1990-05-09
Publication date: 1991-02-06
Anticipated expiration: 2014-09-06
Also published as: ATE140540T1; AU5474290A; CA2016313A1; EP0397129A2; DE69027812D1; EP0397129A3; US5356772A; KR900018680A; AU637097B2; JP2945074B2; EP0397129B1; CA2016313C; ES2091777T3; DE69027812T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明（エ、複数の抗原を小一の固体支持体」二に同時
に移動させることを含む改良イ八ノアンセイ法に関する
。本発明に用いる抗原は天然に存在するものでもよいし
またはｌｆｌ換え法により製造したものでもよく、種々
の電気泳動ゲル上で精製して上い。本発明は、特に、Ｈ
　Ｉ　Ｖ　−　１またはＩ−１　１　Ｖ２ウイルスに感
染した患者における該１−１　１　Ｖ１またはＩ−１　
１　Ｖ　−　２ウイルスに対ずる抗体を検出することの
可能な本質的に純粋な抗原性ボリペプチｉ・を用いた、
極めて高感度の多戊分アッセイを提供するのに有用であ
る。

（従来の技術および発明か解決しようとする課題）ヒ１
・の免疫系は、種々のウイルス抗原に対して抗体を産生
ずることによりウイルスの感染に応答する。抗体の数お
よび産生される各異なる抗体の量は、ウイルスおよび抗
体応答を引き起こすウイルス抗原に依存する。

現在のイムノアソセイノステムは、ウイルス感染をモニ
ターするのに有用であることがわかっている。たとえば
、部分的に精製したウイルス溶解肢を用いたイムノアッ
セイを利用してＨ　Ｉ　Ｖ　−　１またはＩ−Ｉ　Ｉ　
Ｖ　−　２感染をモニターすることができる。残念なが
ら、これらの溶解岐は不つり合いな量の種々の抗原を含
んでいるかまたは重要な抗原性ポリペプチドを欠いてい
るかもしれない。これらの欠失は、アソセイの感度と選
択性の両方に悪影響を及ばず。ｒ−ｒ　ｒ　ｖウイルス
の場合、ウイルス溶解液は、経膜ペプチドであるｇｐ４
＋および外エンベロープタンパク質であるｇｌ）１２０
を欠いているかもしれない。

ウイルス溶解液はまた、望ましくない免疫学的に反応性
の細胞成分、抗原の凝集物および分解ざれた抗原断片を
含んでいること、およびグリフシ１ノーンヨンの度合の
異なる抗原ペプチトを有するために満足のいくものでは
ない。これらの不可避的な外部要因が、ウイルス溶解肢
をゲル」−で分離するときに精製の問題を生しさせる。

というのは、分離能が全く理想的とはいえないからであ
る。分離能が理想とは程遠いことにより、欠失したバン
ド、拡散したバンド、重複した非特異的バントよたは多
ずぎるバンドによって引き起こされる分離の困難さがさ
らに大きくなり、ゲルをイムノブ［Ｊツティング表面に
移動させたときに解析困難な不満足なイムノブロッティ
ングとなってしまう。さらに、従来のイムノブ口ッティ
ングのための部分的に精製したウイルス溶解肢を充分な
量で調製することはしばしば困難であり、所望の抗原を
充分な量で提供できないことがまた精製の問題を大きく
する。

ウイルス溶解液を使用することに伴う問題は、種々の異
種細胞系で所望の抗原ポリペプヂドを発現させることに
より部分的に解決することができる。これらの系では組
換え法を用い、これらのポリペブチト生成物を大量に産
生ずることのできる細胞中に目的のウイルス遺伝子を挿
入させる。この方法では、所望の抗原をしばしば充分な
量で産生させることができるが、一般に新たな不純物お
よび分解された抗原断片を伴う。これらの方広によって
産生された抗原はまた凝集物を生成し、このことは還元
剤を用いることによって最小限に抑えなければならず、
さもなければ凝集と分解との両方の問題を回避するため
に複数のゲルを使用する必要がある。

従来のイムノブロツティング法は、複数の抗原との反応
性について複数の試料を分析するのに用いることはでき
ない。というのは、選択的で高感度のアッセイを行うの
に必要とざれる充分な均一７８性の抗原を提供するために多くの精製工程が必要となる
からである。典型的なウエスタンブロツテイング法は、
ゴードン（　Ｇ　ｏｒｄｏｎ）らの米国特許第４４５２
．９０１号明細書（１９８４年３月１８１］発行）に記
載されている。該文献には、抗原ペブチドを単一のゲル
からニトロセルロースに移動させるのに必要な手順が記
載されている。本発明は、抗原ポリペプヂドを複数のゲ
ルから移動ざせることを開示ずるものである。

単一のアッセイにおいて幾つかの抗原を用いることはす
でに記載されている。リン（Ｌｉｎ）らの，ＩＶｉｒｏ
ｌ．５９：５２２−５２４（１　９８６）には二重抗体
プローブ法が記載されており、これはエプスタイン・バ
ーウイルスおよび異なるヘルペスウイルスの抗原を同一
のウエスタンブロッティングにおいて同定することがで
きる。

単一のウエスタンブロツティングにおいて複数の検出方
法を用いることもできる。リー（１．，ｅｅ）らのＪ　
．　Ｉ　ｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，　Ｉ　０　６　
：２　７−３　０（１９８８）には、プローブ抗体、酵
素結合発色抗体および酵素基質を一組としてこれらを複
数回、連続１白に適用して２種またはそれ以上のインタ
ーフェロンを単一のウエスタンブロッテイングで検出す
る方法か記載されている。同様の結果は、異なる酵素結
合発色抗体の混合物を用いて２種以上のプローブ抗体を
同時に適用し、ついで異なる基質を連続的に加えること
によっても得ることができる。

ゴードンらのヨーロッパ特許出願公開００６３８１０号
公報（１９８２年３月１１日公開）には、抗原または抗
体または両者が固体支持体に結合したイムノアッセイ装
置およびキットが記載されている。記載の固体支持体を
使用することにより、多数の抗体−抗原反応を一つの操
作で同時に行うことが可能となる。ゴートンらは、抗原
または抗体の溶液をピペットまたはスポイトを用いて１
回で、または連続的に加えることを記載している。

好ましい態様においては、抗原は、少量の抗原溶液を加
えることにより生成する極小の点（ｍｉｃｒｏｄｏｔ）
として適用する。しかしながら、該公報は、クンバク質
の複合混合物から精製した抗原を用いたイムノアッセイ
は記載していない。

レフコビッッ（Ｌ　ｅｆｋｏｖｉｔｓ）のＷＯ　　８７
／０３９６５号明細書（１９８７年７月２日公開）には
、幾つかの同時アッセイのための試験ストリップが記載
されている。この試験ストリップは、抗体を含浸させた
ニトロセルロースをストリップにカッティングし、不活
性なパッキング（ｂａｃｋｉｎｇ）Ｊ二に積載したもの
である。レフコビッッは、支持体シートを抗原ベプチド
の溶液中に浸し、ついで該ソートをストリップにカッテ
ィングすることは記載しているが、該抗原を固体支持体
へ電気泳動的に移動させることは記載していない。

（課題を解決するための手段）本発明は、試料中の少なくともＩ種の生物学的に活性な
物質の存在を検出する方法であって、（ａ）２種以上の
抗原性で反応性の基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を少なく
とも１種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメント（ｓｅｇｍ
ｅｎｔ）を分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体に
有効に結合し、（ｄ）該活性な基質を有する固体支持体を少なくとも１
種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接触さＵ゛
、その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合ペアを
生成し、ついで（ｅ）該固体支持体」二の該結合ペアを検出することを
特徴とする方法試料中の抗Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　１抗体を検出する方法であ
って、（ａ）２種以上の抗原性で反応性の基質を少なくとも１
種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質
を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的（こ移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体
に有効に結合し、（ｄ）該活性な基質を有する固体支持体を少なくとも１
種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接触させ、
その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合ペアを生
成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特
徴とする方法；および試料中の抗Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　１抗体、抗Ｈ　Ｉ　Ｖ　−
　２抗体または抗ＨＴＬＶ−１抗体を検出する方法であ
って、（ａ）２種以上の抗原性で反応性の基質を少なく
とも１種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該精
製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（Ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体に
有効に結合し、（ｄ）該活性な基質を有する固体支持体を少なくともＩ
種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接触させ、
その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合ペアを生
成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特
徴とする方法を提供するものである。

本発明は、感染患者の血清中の特定の抗体を検出するた
めに複数の組換えおよび天然の抗原を用いた方法を提供
するものであり、最大の選択性および感度を得るのに必
要な特定の抗原を選択または使用することを可能にする
ものである。

本発明は、試料中の少なくとも１種の生物学的に活性な
物質の存在を検出する方法を包含し、該方法は、不純な
混合物から２種以上の生物学的に活性な基質をゲル上で
精製し、該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し
、該ゲルセグメントから該精製基質を固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体に
有効に結合し、該活性な基質を有する固体支持体を少な
くとも１種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接
触させ、その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合
ペアを生威し、ついで該結合ペアの存在を検出すること
によるものである。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、種々の精製の状態の抗原を組み合わせて用い
ることが可能な改良ウェスタンブロッティングアソセイ
を行う方法に関する。これらの抗原は、溶液または体液
中の特定の抗体を検出するだめのイムノブロッテイング
において便利かつ正確に用いることができる。抗原調製
物は複合混合物としては一般に入手できるが、本発明は
、単一の抗原群を迅速に単離し、ついで不純物、凝集物
または分解された断片を含まないイムノブロツテイング
分析のために該抗原群を固体支持体に同時に移動させる
のに用いる方法を提供する。

従来のウエスタンブロッティング法においては、目的の
抗原混合物を、通常はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ
）、尿素を用い、または２−メルカプトエタノールなど
の還元剤を用いて可溶化させる。

可溶化の後、該物質をポリアクリルアミドゲル上で電気
泳動により分離させ、ついで該抗原を電気泳動的にニト
ロセルロース紙へ移動ざせ、そこで該抗原は不可逆的に
結合する。この方法は、ゴートンらの米国特許第４．４
５２，９０１号明細書（１９８４年６月１５日発行）に
記載されている。

本発明においては、抗原は一般に種々のゲル−Ｌで精製
する。特定の抗原を含む所望のバンドの位置を確認し、
切り出す。該切り出したゲルをついで固体支持体上へエ
レクトロプロ，ソテイング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔ
ｅｄ）ずる。

本発明の改良ウエスタンブロッティング法は、優れた選
択性および感度という利点を有する。これらの改良点は
、一層多量の精製抗原を使用することにより達成するこ
とができる。切り出したバンド当たり約０．５〜５．０
μクの推定量の抗原を適当な固体支持体上に移動させる
ことができる。

従って、従来のウエスタンプロッティングでは微かな反
応性しか示さない血清も、本発明を行えば強いバンドを
得ることができる。

タンパク質の電気泳動的移動により、切り出したゲルの
配列の正確なレプリカが適当な固体支持体上に得られる
。そのような移動電気泳動図を用いた抗体アッセイは、
非特異的タンパク質とインキユベートすることにより該
固体支持体の残る吸着能が飽和した後に行う。電気泳動
的にブロツティングした特異的タンパク質と該支持体の
残る結合部位をプロツキングするのに用いた非特異的な
タンパク質との間で交換が起こらないので、電気泳動的
に移動させたタンパク質を用いたイムノアッセイが可能
である。結合した抗原が、残りの吸着部位をプロツキン
グするのに用いた非特異的タンパク質により妨害されな
いことにＪ；り、一層長期間のインキュベーンヨンが可
能となる。というのは、抗血清および指示抗体とさらに
接触させても、吸着した非特異的タンパク質との交換な
どの副反応は起きないからである。

固体支持体としては、検出抗体の接近を可能にするのに
充分な表面多孔性および抗原を結合させるのに適当な表
面親和性を有するものであればいかなる物質であっても
よい。微細多孔性（ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）構造が一
般に好ましいが、水和状態でゲル構造を有する物質も用
いることができる。

本発明に用いることのできる固体支持体としは、寒天、
アガロース、架橋アルギン醗、置換お上び架橋グアール
ガム、セルロースエステル（特１：　硝酸およびカルボ
ン酸とのエステル）、混合セルロースエステルおよびセ
ルロースエーテルなどの天然のボリマー性炭水化物お上
びその合戊的に修飾、架橋または置換した誘導体：タンパク質およびその誘導体など（架橋ゼラチンまたは
修飾ゼラチンを含む）の窒素原子含有天然ボリマーラテックスおよびゴムなどの天然炭化水素ポリマポリエ
チレン、ボリブロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ヒニ
ル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解した誘
導体、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメ
タクリレート、上記重縮合物のコボリマーおよびターボ
リマー（ポリウレタンまたはボリエボキシドなどのポリ
エステル、ボリアミドおよび他のボリマーなど）を含む
ビニルボリマーなどの適当な多孔性構造を用いて凋製し
た合成ボリマーアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩または炭
酸塩（硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム
、炭酸マグネシウムを含む）、アルカリ金属、アルカリ
土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ酸塩
，クレイ、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、
シリカゲル、またはガラスなどのアルミニウムまたはケ
イ素酸化物または水和物などの多孔性無機物質（これら
の物質はまた上記ボリマー物質の充填剤としても用いる
ことができる）；および」二記物質群の混合物またはコポリマ−（すでに存在す
る天然ボリマー上で合威ボリマーの重合を開始すること
によって得られるグラフトコボリマーなと）などが挙げ
られる。

これらすべての物質はフィルム、シートまたはプレート
などの適当な形態で用いることができ、または紙、ガラ
ス、ブラスヂックフィルムまた（ｊ織物などの適当な不
活性担体上にコーティング、結合または積層させてもよ
い。

ニトロセルロースの多孔性構造は、本発明と関連して用
いられる広範囲の試薬に対して優れた吸収性能および吸
着性能を有し、好ましい支持体物質である。ナイ「！ン
もまた同様の特性を打し、適当な支持体物質である。

固体支持体は、厚さが約０　０１〜０　．　５　Ｒｙ，
好ましくは約０．１關のンートの形態であるのが好まし
い。孔径は広範囲で変化してよく、約ＯＯ２５〜１５ミ
クロン、とりわけ約０　１５〜１５ミクロンであるのが
好ましい。

これら支持体の表面は、抗原または免疫グロブリンの該
支持体への共有結合を引き起こさせる化学的方法によっ
て活性化することができる。しかしながら、一般に抗原
または抗体の非可逆的結合は、充分に理解されていない
疎水性の力による多孔性物質上への吸着によっても達成
される。ニトロセルロースに基づいた好ましい支持体は
、企業であるミリボア（Ｍ　ｉ　Ｉ　ｌｉｐｏｒｅ）社
（ベッドフォード、マザチコ，−セッツ、米国）からミ
リボアの商品名で販売されている。適当な支持体はまた
、米国特許出願第０７／２２７，２７２号明細書（１９
８８年８月２日出願）中にも記載されている（該文献を
参照のため本明細書中に引用する）。

分析することのできる抗原の数は支持体のザイズによっ
てのみ制限されるが、抗原の変化および組成は無制限で
ある。同様のサイズを有しているが異なるところから単
離した抗原も、異なるゲルから固体支持体の異なる領域
に移動させることかできるので使用可能である。還元一
感受性または還元一依存性の抗原は、これら抗原を別の
プレパラティブゲル中に溶解することにより都合上く扱
うこどができる。加えて、各抗原の量は、アッセイの選
択性お上び感度を最適にずべくコントロールしつり合い
をとることができる。

いかなる所望の数の抗原または抗原もしくは免疫グロブ
リンの組合わせも単一の試験手順に含ませることができ
、ついで単一の操作で分析することができる。本発明は
、正常では固有であるが病的状態では変化する抗体の濃
度をモニターし、または病的状態においてのみ観察され
る抗体を検出または定量するために用いることができる
。

上記選択した抗原が固体多孔性支持体上に一担結合した
ら、イムノアノセイに使用可能となる前に、該支持体を
処理して多孔性物質の過剰の結合部位をプロツキングし
なければならない。このことば、抗原ポリペプチドを含
有する支持体を、非特異的タンパク質、またはそのよう
なタンパク質の混合物、または全血清、またはこれら或
分の組合わせとともにインキユベートすることにより行
う。唯一の制限は、そのようなタンパク質はイムノアッ
セイ中の抗体または抗原のいずれをも妨害または交差反
応してはならないこと、および支持体」二に存在するタ
ンパク質とは異なるものでなければならないということ
である。

これらの残る吸着部位のプロツキングはまた段階的に行
うこともできる。たとえば、予備工程において、固定化
抗原または抗体を含有する支持体をタンパク質性の物質
とともにインキユベートしてよい。そのようなタンパク
質はバッファ一中に希釈して支持体とともにインキユベ
ートするのが都合がよい。この予備処理によってもなお
完全にプロツキングされていないタンパク質結合部位が
存在するかもしれず、これはイムノアッセイを行う前に
プロノキングしなければならない。残留する結合部位ま
たは非特異的タンパク質の交換によるバノクグラウンド
吸着があるときは、そのような吸着はインキュベーノヨ
ンをさらにブロッキング剤とともに行うことに上って防
ぐことができる。

これら混合物を存在させることにより、残留する結合部
位がプロツキングされるとともに、非特異的部位に前以
て結合したタンパク質と抗体との交換または免疫グロブ
リンとのあらゆる種類の非特異的相互反応が競合により
防がれる傾向がある。

抗体の検出のためのイムノアッセイにおいて、期待され
る抗体濃度に従い、通常はプロツキング溶液中に約１：
Ｉ００〜ｌ：Ｉｏ０００で希釈した試料とともに室温に
て約２時間または４℃にて一夜インキュベ−１−　Ｌ、
ついでバッファーで洗浄シて過剰の未結合抗体を除く。

この支持体をついで指示抗体（放射性標識した抗体、蛍
光抗体、化学発光抗体、蛍光物質を結合した抗体、また
は発色反応を生成する酵素を結合した抗体）とともにイ
ンキュベ−１・する。この指示抗体は、通常、ブロッキ
ング溶液の混合物中で希釈し、支持体とともに約２時間
インキユベートし、ついでバッファ一中で再び洗浄する
。

ずへての種類の患者の抗体含有液（血清、血漿、脳脊髄
液、初乳、リンパ液、乳、唾液、尿または排せつ物など
）を本発明を用いて分析することができる。

支持体上の抗原の検出は、適当な指示抗体、補体系の成
分、または抗原−抗体反応に感受性の共役酵素系を用い
て行うことができる。この指示抗体はまた、ヒトまたは
動物免疫グロブリンと特異的に反応するあらゆる抗体、
またはＩｇＧ，ＩｇＭ、ＩｇＡ，ＩｇＤもしくはＩｇＥ
などの所望の抗体クラスの１種とのみまたはそのような
特異的免疫グロブリンのあらゆる所望の組合わせと反応
するクラス特異的抗体であってよい。

指示抗体に結合した酵素は、検出試薬または反応生威物
が抗原一抗体複合体の部位に局所的に停どまる限り、放
射性生成物、化学発光生成物または蛍光生成物、可視領
域または可視領域外に特徴的な吸収または反射スペクト
ルを有する生成物の生成により、位置を確認しまたは定
量することができる。結合抗原一抗体複合体を検出する
のに補体を用いるときは、補体は上記のいずれかの方法
で標識するかまたは特異的な抗補体抗体により検出する
ことができる。

抗原を適用した後に得られるニトロセルロースシートな
どの固体支持体は、脱水状態が保持されるならば、乾燥
させて周囲温度で無制限に貯蔵することができる。本発
明の支持体はまた残留する吸着部位をプロヅキングした
後に貯蔵することもでき、乾燥させたときに、防湿条件
下に低温で無制限に保持することができる。

免疫学的分析のための本発明の方法において、一般に、
抗原または免疫グロブリンを含む支持体を分析しようと
する試料、たとえば動物またはヒト虫者または通常の健
康管理下にあるヒトからの血清または血漿と接触させ、
分析しようとする試料の動物種の免疫グロブリンに向け
られた指示抗体の希釈溶液またはｓ濁液中に浸漬し、最
後に結合した第二の抗体を視覚化する。これらの手順は
充分に簡単で迅速であり、すべての操作を約３時間また
はそれ以下で行うことができる。

本発明の免疫学的アッセイを行うのに使用することので
きる抗原群は非常に広範囲に４つたり、その例としては
、ヒト生検物質、噛乳動物絹織または細胞、体肢、マイ
コプラズマ、後生動物の寄生体、かび、細菌、原生動物
、ウイルスまたはこれらからの調製物が挙げられる。実
施例に記載した抗原とはｓｌに、下記のものもまた適し
ている、すなわち、インフルエンザウイルス（Ａ，Ａ．
、Ａ２、Ｂ，Ｃ型を含む）、バライノフルエンザウイル
スｉ型、２型または３型、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス
、おたふくかぜウイルス、Ｑ熱リケッチア１ロタウイル
ス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、風疹ウイルス、アデノウイ
ルス、エプスタイン・バーウイルス、ブルセラウイルス
、肝炎Ｂ型ウイルス、コクザッキーＢｌ−８６、Ａ９ウ
イルス、ボリオ１、２または３ウイルス、レオウイルス
、エクソウイルス１３３などのウイルスまたはそれらか
ら凋製した抗原．ヒストプラスマ・カブスラーツム（Ｈ
　ｉｓｔｏｐｌａｓｍｏｓａ　ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）
、コクシジオイデス・イミヂス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄ
ｅｓ　ｉｍｍｉｔｉｓ）、プラストミセス・デルマチヂ
ジス（Ｂ　ｌａｓｔｏｍｙｃｅｓｄｅｒｍａｔ　ｉｔ　
ｉｄ　ｉｓ）、アスベルギルス・フミガーツス（Ａｓｐ
ｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギ
ルス・フラーブス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）またはアスベル
ギルス・カルネー（Ａ　．ｃａｒｎｅａ）などのかび抗
原：赤痢アメーバ（Ｅｎｔｅｍｅｂａ　ｈｉｓｔｏｌｙ
ｔｉｃａ）、トリバノソーマ・クルージ（Ｔ　ｒｙｐａ
ｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ）、マンソン住血
吸虫（Ｓ　ｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｉ）な
どの寄生体抗原；スピロヘータ・ライター（Ｓｐｉｒｏ
ｃｈｅｔｅ　ｒｅｉｔｅｒ）、■・レポネーマ・パリダ
ム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ）、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）、レプトスピラ
属、リステリア属、ザルモネラ属、シゲラ属、スタヒロ
コッカス属、ストレブトコッカス属、レジオネラ・ニュ
ーモフイラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈ
ｉｌａ）などの細菌抗原；核ｒ｛ＮＰ，補体フラクショ
ン、ヒト血清タンパク質、リウマチ因子、インスリン、
インスリンレセプター、甲状腺刺激ホルモンレセプター
アセチルコリンレセブターおよび他のホルモン、レセプ
ターまたはアレルゲンなどの自己抗原である。

本発明はまた、あらゆる種類の抗原、たとえば薬物およ
びホルモンの検出およびモニタリングに用いることもで
きる。そのような試験では、特定の抗体を多孔性の支持
体に適用し、上記のイムノアッセイ手順とは逆の手順を
用いて特定の抗原を検出おｊ；び定量する。ついで、抗
原−抗体複合体に特異的に結合するという補体タンパク
質の性質を用い、特定の抗原、たとえば薬物や他の薬理
学的試薬またはホルモンまたはそのような抗原のあらゆ
る所望の組合わせを直接または間接に視覚化し定量する
ことができる。

本発明の固体支持体は、乾燥状態で、または抗原のライ
ンに垂直に個々の試験ストリップをカッティングした後
、貯蔵し輸送することができる。

これらのストリップは実施できるほど薄くてよいが、幅
は一般に３朋を越えてはならない。実際の試験では、す
べての試薬は適当なアリコートで凍結乾燥して容易に貯
蔵することができ、試験に際して再構成することができ
る。

調べようとする血清を、ブロッキング溶液を含有する食
塩水中に適当な倍率で希釈する。約１１００〜１：Ｉ０
０００の希釈倍率が、たいていの使用に際して用いられ
る。ストリップをこれらの希釈溶肢の一つに、たとえば
使捨てウエル神入物中で浸漬する。これらストリップを
この希釈溶液中で穏やかに攪拌しながら室温にて約２時
間または４℃にて一夜インキユベートする。ついで過剰
の血清を洗浄して除く。洗浄のタイミングは重要ではな
い。ついで指示抗体の試料を加える。これは、通常、ベ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒト【ｇＧの希釈液であり、
処理を室温にて約２時間続ける。この希釈岐はまた、通
常、ブロッキング溶液中のものである。ついで、指示抗
体を洗浄して除く。ついで、蛍光、オートラジオグラフ
ィーまたは結合酵素のための適当な基質などの適当な手
順により指示抗体を視覚化する。ベルオキシダーゼの場
合は、基質は過酸化水素の存在下でのジアニシジンまた
はクロロナフトールであってよい。

ついで、発色反応を約３０分から２時間行う。

本発明の方法は、抗原または抗体の分析に限られるもの
ではない。タンパク質、タンパク質結合体（糖タンパク
質、リボタンパク質またはタンパク質−核酸複合体など
）を含む動物または植物由来の巨大分子有機物質もまた
、それらを固体支持体に適用することができる限りすべ
て用いることができる。

本発明は一般に、ウイルス感染の免疫診断に応用するこ
とができる。抗原の代わりに複数の特異的抗体をニトロ
セルロース上に適用することにより、本発明の方法を複
数の抗原のアッセイに応用することができる。従って、
感染の診断およびステージング（ｓｔａｇｉｎｇ）に重
要な抗原および抗体の血清学に関する重要な情報を得る
ために本発明の方法を都合よく用いることができる。加
えて、ＨＬＶ−１とＨ　Ｉ　Ｖ　−　２、またｌｔＨＩ
Ｖ−１とＨＴＬＶ−ＬまたはＨＩＶ−．１とＨ　Ｂ　Ｖ
　，またハＨＩＶ−１とＣＭＶなとの同時感染（ｃｏ　
−　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を同時にモニターするために
組合わせ試験を組み立てることができる。

つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるしのてはない。

実施例１抗Ｈ　Ｉ．　Ｖ−１抗体の血清検出のための３−バン１
・ウエスタンブロッティング（３Ｂ−ＷＩ３）抗Ｔ｛　
ｒ　Ｖ抗体を検出するために、３種の特定の抗原を用い
て改良ウエスタンブロツティングを設計した。この３−
バント複合ウエスタンブロッティングには、基本的なＨ
　Ｉ　Ｖエンベロープ抗原お上びコア抗原であるｇｐｌ
２０、ｐ４１およびｐ２４か含まれている。Ｉ−１　１
　Ｖ−１感染１−１　９細胞から天然ｇｐｌ２０を精製
し、ｐａｌおよびｐ２４は大腸菌から製造および精製し
た組換え抗原であった。これら３種の抗原（純度に依存
して３０〜３００μｇ）をそれぞれ別々の１　，　５　
ｒａｙ．厚Ｉ２．５％ＳＤＳラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）
ポリアクリルアミドゲル（１２ｃｓｘ１６ｃｉ）Ｊ二に
、その両端の前以て染色したマーカ一とともに載せた。

染色フロントがゲルの底近く（開始点から約ｆｌＣｇ）
に達するまで、電気泳動を室温、４５ｖ　　にて一夜（
約１６時間）行った。ｇｐ＋２０は非還元条件下（＋）
ＴＴなし）で、ｐ４１およびｐ２４は還元条件下（Ｉ　
ＯｍＭ　ＤＴＴ）で行つノこ。

抗原バンドは前以て染色したタンパク質マーカーと相対
的な位置にあり、かみそりの刃で切り出した。この切り
出したゲルの切片を一片の硝酸セルロース上に置き、ト
ランスブロットバイラド・セル（ｔｒａｎｓｂｌｏｔ　
ＢｉｏＲａｄ　Ｃｅｌｌ）中、６５ｖ．、０　２アンペ
ア、室温にて５時間、抗原を硝酸セルロース−Ｌへ移動
させた。ついで、この抗原含浸硝酸セルロースのシート
を、回転攪拌器上で穏やかに混合しながら室温にてバッ
ファ一（２０ｍＭ１・リス、ｐ＋−｛　７　．　５、５
　０　０ｍＭ　ＮａＣｌ、０　５％トリトンＸ−　１　
０　０｝を用いて浣浄した。ついで、これをプロツキン
グ溶液Ｉ（バツファ一中の１％ゼラチン、Ｉ％カゼイン
氷解物および０．０１％チメロザール）中に室温にて２
時間または４°Ｃに−ｃ一夜ｅａし、洗浄し、ついでプ
ロツキング溶液■（バッファ一中の１０％脱階粉乳、Ｑ
．ＯＩ％チメロザール）中に再浸漬した。沈浄後、この
ソートを空気乾燥させ、イムノブ口ツテイングのために
バンドに垂直にカッティングしてストリップとした。こ
のス１・リップを伯用ずるときまで４°Ｃにて貯蔵した
。洗浄はすべて、室温にて各１５分間、回転攪拌器上で
穏やかに混合しながらバノファ一中で３回行った。

Ｈ　Ｉ　Ｖ特異的抗体について血清を試験するために、
管、またはインキュベーター１・レイ（バイオ・ラドカ
タログＮｏ．１７０−４０３７）中の個々のスロット中
で、試料バッファ一（２０ｍＭ　　トリス、Ｉ）Ｈ７．
５、１　５　０ｍＭ　ＮａＣｌ、０　５％トリトンＸ−
　１　０　０、０．ｌｉｇ／龍ゲンタマインン、０　．
　Ｉ　ｍｙ／Ｒ（ｌチメロザール、１０％ヤギ血清、お
よび１０％ウン胎仔血清）中に通常１・１００に希釈し
た血清試料（４籾）とストリップをそれぞれ反応させた
。４℃にて一夜インキコベートした後、試料を吸引して
除き、ストリップを洗浄しつこ。ついで、これらストリ
ップを、ともに試料バツファ一中でｌ：ｌｏ００にある
ヒトｉｇＧまたはＩｇＭに特異的なヤギＩｇＧ−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合体と反応させた。室温にて３
時間インキ，，へ一トしノこ後、これらストリップを沈
浄し、バイオ・ラドｉ｛　Ｒ　Ｐカラーデへロツプメン
トリージエント（Ｃｏｆｏｒ　Ｉ）ｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ）を用い推奨される条件下で発色さ
せた。ついて、これらイムノブ口ッティングストリップ
を写真にとり、抗原バンドの存在または不存在を記録し
た。

上記条件に従って調製したストリップからは、既知の１
−１　１　Ｖ陽性のヒト血清では強い青色のバンドが観
察されたが、正常ヒト血清ではバンドは観察されなかっ
た。本方法の特異性は、ｇｐ＋２０、Ｍｌまたはｐ２４
に特異的なマウスモノクローナル抗体かそれぞれ対応す
るバンドとのみ反応しノこことから示された。ｐｌ８ま
たは逆転写酵素に特異的なマウスモノクローナル抗体は
反応しなかった。さらに、大腸閑に対して調製した抗血
清は、ストリンプ上で大腸菌抗原を検出することができ
なかった。

上記アッセイに使用したエンベロープ抗原の純度は、Ｏ
　Ｉ％トリトンを含有するリン酸緩衝食塩水で抽出する
ことによって、切り出したポリアクリルアミドゲルのバ
ンド中で抗原を回収することにより示された。回収した
抗原はＳ　Ｄ　Ｓ　−　１）　ＡＧＥにより分析した。

ゲルを銀染色することにより、各抗原はタンパク質の単
一のバンドからなることが示された。ウエスタンブロツ
ティングの結果、これら単一のバントはＨ　Ｉ　Ｖ特異
的であり、分解されたことを示す小さな抗原断片は存在
しないことが示された。

実施例２抗Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　１抗体、抗１｛　Ｔ　Ｖ　−　２抗
体および抗１｛ＴＬＶ−１抗体の血清検出のための複合
５−バンドウエスタンプ口ヅティング．１２，Ｉ｛ＩＶ−２およびＨ’ｌ”ＬＶ−＋ｉ．ｍ対す
る抗体を検出するために、上記実施例１のウエスタンブ
ロツティング法と同様の複合ウェスタンブロッティング
法を調製した。この「コンポ（ｃｏｍｂｏ）　Ｊブロッ
ティングは、５種の抗原、すなわちｒ｛　Ｉ　Ｖ　−　
ＨＤｇｐｌ　２　０、Ｉ｛　ｒ　Ｖ　−　１のｐ４１，
Ｈ　Ｉ　Ｖ−１のｐ２４、Ｔ−Ｉ　Ｉ　Ｖ−２のｐ４＋
およびＨＴＬＶ−１のｐ２　１を含んテイた。Ｉ−１　
１　Ｖ　−　１抗原は実施例１に記載したものと同じで
あった。Ｉ−ＩＩＶ−２およびＨＴＬＶ−１抗原は、大
腸菌からの組換え抗原であった。これらの抗原を精製し
、ついてプレパラティブＳＯＳ−ＰＡＧＥにより分画し
た。これら抗原のバンドの位置を確認し、ゲルから切り
出した。切り出したゲルス１・リップ中の抗原をＨＩＶ
−１からの３種の抗原とともにニトロセルロース上へエ
レクトロブロツティングした。ついで、実施ｆａｌｌ　
１に記載したようにしてプロッティングシ一トから試験
ストリップを調製した。

これら５−バンドストリップを、陽性コントロール血清
および陰性コントロール血清のパネルて試験した。この
パネルのＨ　Ｉ　Ｖ−１陽性血清は、３つの１−１　１
　Ｖ　−　１バンドとのみ反応した。Ｈ　Ｉ　Ｖ２血清
は、Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　２のｐ４　１およびＩ−Ｉ　Ｉ　
Ｖ　−１のｐ２４と反応した。この結果は、２種の１１
１■ウイルス株のｐ２４コア抗原の間で知られた交差反
応性と矛盾しなかった。Ｉ｛　Ｔ　Ｌ　Ｖ−１血清は、
ＨＴＬＶ−１のｐ２＋とのみ反応した。２つの陰性コン
１・ロール血清は、いずれの抗原バンドとも反応しなか
った。

これらの結果は、複合５−バンドウエスタンプ口ツティ
ングによりトＩＩＶ−１陽性血清、Ｉ−１　１　Ｖ２陽
性血清およびＨ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−　１陽性血清を特異的
に検出ずることができることを示している。

実施例３抗１−Ｉ　Ｔ　Ｖ−１抗体、抗Ｈ　Ｔ　Ｖ　−　２抗体
および抗Ｉ−ＩＴＬＶ−１抗体の同時検出」二記実施例２の陽性コントロール血清を種々の組合わ
せで１　１の比で混合し、これら混合物を実施例２に従
って調製した５−バント試験スＩ・リップを用いてアソ
セイした。Ｉ−１　１　Ｖ−１血清とＨ　ＩＶ−２血清
との混合物は、ＨＩＶ−１）ｇ＋）＋２０、ｐ４＋およ
びＩ）２．１お上びｒ４４１１−１１Ｖ−２を含むバン
ドと陽性の反応を示したが、ｐ２１ＨＴＬＶＩとは反応
しなかった。Ｈ■ｖ−１血清とＩＩ　ＴＬＶ−１血清と
の混合物は、Ｉ−１　１　Ｖ　−　１のｇｐ＋２０、Ｉ
）／ｌ　Ｉおよびｐ２４およびＩＩＴ　Ｌ　Ｖ−１のｐ
２ｌを含むバンドとのみ陽性の反応を示した。Ｉ■■Ｖ
−２血清とＩＩＴＬＶ−１血清との混合物！ＪＳｐ２４
＋−１１Ｖ−１、ｐ７ＩＩ　　＋−１１Ｖ−２およびｐ
２＋１−ＴＴＬＶ−１を含むバンドとのみ陽性の反応を
示した。Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　１血清、Ｈ　Ｉ　Ｖ　−　２
血清およびＩ１１’ＬＶ−１血清の混合物は、５つのす
へてのバン１・に含まれる抗原と反応した。

これらの結果は、３種の型のウイルス抗体のそれぞれは
、もし血清中に存在しておれば（この場合には屁合する
ことにより）、５−バンドウェスタンプ口ッティングに
上り同時に特異的に検出することができることを示して
いる。５−バント試験ストリップはまた、自然感染の結
果として血清中に存在する抗体をも検出することができ
る。従って、５−バンドウエスタンプロソティングは、
複数感染の識別診断に用いることができる。

焦鯰遅』（Ｌ３種のＩ−１　１　Ｖ抗原に対ずる所定のＩ−１　１　
Ｖ　−　１陽性？清の抗体の同時力価測定３ｒ３−ＷＢスｌ・リップを用い、３種の抗原に対ずる
Ｉ−Ｔ　Ｉ　Ｖ　−　１陽性血清の抗体力価を同時に次
定した。試験は血清を２倍に系列希釈して行った。

その結果は、ｐ４　１お上びｐ２４に対して（１強い力
価（１　：４　０　０，０　０　０）を、ｇｐｌ２０に
対しては弱い力価（］：Ｉ６００）を示した。

これらの結果は、３Ｂ−ＷＢの感度がＥＩＡおよびウエ
スタンブロッティングに比較して高いこと、および３Ｂ
−ＷＢが複数の抗原に対ずる抗体を同時に力価測定でき
ることを示していた。

里■枚艷え血清変換のモニタリンク１８員系夕１］−血液血清変換パネル（＋８ｍｅｍｂｅ
ｒ　ｓｅｒｉａｌ　−ｂｌｅｅｄ　ｓｅｒｏｃｏｎｖｅ
ｒｓｉｏｎ　ｐａｎｅｌ）［パネルＣ、ホストン・パイ
メディカ（ＢｏｓｔｏｎＢ　ｉｏｍｅｄｉｃａ」ｎｃ．
）から購入］を３Ｂ−ＷＢにより試験した。たいていの
Ｅ　Ｉ　Ａの記録陽性は８番１」の血液から始まった。

標準的なウィルスを用いたウエスタンブロソティングで
は、早くも５番ｌヨの血液から［１２４抗体が検出され
始めた。これに対して、３ｒ３−ＷＢでは、ｇｐ＋２０
、Ｉ）４１および１）２４に対する陽性結果は最初の血
液から得られノこ。

これらのデータは、３１３−ＷＢの感度がＥＩＡおよび
標準ＷＢに比べて優れていることを確認するとともに、
エンベロープ抗体とコア抗体との相対力価を明らかにし
た。

」二記パネルを再びアッセイし、ヒトＩｇＭに特異的な
ウサギＩｇＧ−西洋ワザビペルオキンダーゼ結合体［カ
ルバイオケム（Ｃ　ａｌｂｉｏｃｈｅｍ）カタログＮｏ
．４０１８７５］を用いてＴｇＭ型の反応抗体をモニタ
ーした。その結果は、５つの血液（３番目〜７番目）に
おいて弱いＩｇＭ応答を示した。

ＩｇＭ抗体は５番目の血岐でピークに達し、次第に減衰
して８番目の血液で消失した。

これらの結果は、３Ｂ−ＷＢの汎用性および感度の高ざ
を示していた。

比較試験３免疫状態と感染状態との相関付け感染の３つの段階（ＡＳＹ，ΔＲＣおよびＡＩＤＳ）に
ある患者からの各１０個の血清を３日ＷＢにより評価し
た。その結果は、すべての患者は抗ｐ４１抗体および抗
ｇｌ）＋２０抗体を有していたが、抗ｐ２４抗体の普及
率は疾患が進行するにつれて減衰していった。

これらのデータは報告の所見と矛盾しないものであり、
Ｉ｛　Ｉ　Ｖ感染の血清検出のためのマーカーとしてｐ
４１が重要であることを示していた。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試料中の少なくとも１種の生物学的に活性な物質
の存在を検出する方法であって、（ａ）２種以上の抗原
性で反応性の基質を少なくとも１種の不純混合物からゲ
ル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体に
有効に結合し、（ｄ）該活性な基質を有する固体支持体を少なくとも１
種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接触させ、
その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合ペアを生
成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特
徴とする方法。
（２）活性な物質が体液中の抗体である請求項（１）に
記載の方法。
（３）活性な基質が抗原である請求項（１）に記載の方
法。
（４）抗原がＨＩＶ抗原およびＨＴＬＶ抗原よりなる群
から選ばれたものである請求項（３）に記載の方法。
（５）抗原性で反応性の基質が組換え法を用いて製造し
たものである請求項（１）に記載の方法。
（６）抗原性で反応性の基質が、ＨＩＶ抗原およびＨＴ
ＬＶ抗原よりなる群から選ばれたものである請求項（１
）に記載の方法。
（７）抗原がＨＩＶ−１ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１ｐ４１
、ＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−２ｐ４１およびＨＴＬＶ
−１ｐ２１よりなる群から選ばれたものである請求項（
３）に記載の方法。
（８）該精製基質を含有する２つ以上のセグメントを同
一ゲルから分離する請求項（１）に記載の方法。
（９）該精製基質を含有する２つ以上のセグメントを２
つ以上のゲルから分離する請求項（１）に記載の方法。
（１０）移動をエレクトロブロッティングにより行う請
求項（１）に記載の方法。
（１１）試料中の抗ＨＩＶ−１抗体を検出する方法であ
って、（ａ）２種以上の抗原性で反応性の基質を少なくとも１
種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体に
有効に結合し、（ｄ）該活性な基質を有する固体支持体を少なくとも１
種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接触させ、
その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合ペアを生
成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特
徴とする方法。
（１２）抗原性で反応性の基質が組換え法を用いて製造
したものである請求項（１１）に記載の方法。
（１３）抗原性で反応性の基質が、ＨＩＶ抗原およびＨ
ＴＬＶ抗原よりなる群から選ばれたものである請求項（
１１）に記載の方法。
（１４）抗原がＨＩＶ−１ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１ｐ４１、ＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−２ｐ４１およびＨ
ＴＬＶ−１ｐ２１よりなる群から選ばれたものである請
求項（１１）に記載の方法。
（１５）試料中の抗ＨＩＶ−１抗体、抗ＨＩＶ−２抗体
または抗ＨＴＬＶ−１抗体を検出する方法であって、（ａ）２種以上の抗原性で反応性の基質を少なくとも１
種の不純混合物からゲル上で精製し、（ｂ）該精製基質を含む該ゲルのセグメントを分離し、（ｃ）該精製基質を該セグメントから固体支持体へ選択
的に移動させ、その際、該活性な基質は該固体支持体に
有効に結合し、（ｄ）該活性な基質を有する固体支持体を少なくとも１
種の免疫学的に活性な物質を含有する試料と接触させ、
その際、該活性な物質と該活性な基質とは結合ペアを生
成し、ついで（ｅ）該固体支持体上の該結合ペアを検出することを特
徴とする方法。
（１６）抗原性で反応性の基質が組換え法を用いて製造
したものである請求項（１５）に記載の方法。
（１７）抗原性で反応性の基質が、ＨＩＶ抗原およびＨ
ＴＬＶ抗原よりなる群から選ばれたものである請求項（
１５）に記載の方法。
（１８）抗原がＨＩＶ−１ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１ｐ４
１、ＨＩＶ−１ｐ２４、ＨＩＶ−２ｐ４１およびＨＴＬ
Ｖ−１ｐ２１よりなる群から選ばれたものである請求項
（１５）に記載の方法。