CN102150045A

CN102150045A - 增强型电泳检测固相支持物上的分析物

Info

Publication number: CN102150045A
Application number: CN2009801352274A
Authority: CN
Inventors: I·马加里特; G·菲尔德曼; S·利夫希茨
Original assignee: Life Technologies Inc
Current assignee: Life Technologies Inc
Priority date: 2008-07-11
Filing date: 2009-07-10
Publication date: 2011-08-10
Also published as: US20130075261A1; US20150060279A1; US20120309024A1; US20100044229A1; EP2310857A4; WO2010006318A2; EP2310857A2; WO2010006318A3

Abstract

本发明提供了适于对固定化的蛋白质或核酸样品进行干式或大体上干式电-印迹分析的系统、试剂盒和方法。本发明的电印迹可包括增强电泳检测一或多种固定化蛋白或核酸的步骤。固定化蛋白或核酸电印迹的方法可包括对一或多种典型地用于蛋白或核酸印迹方法的试剂施加电压的步骤。一或多种试剂可吸附在适当的载体基质上。用于在这里描述的系统和方法的电印迹可在大体上干燥的条件下(即，有少许或无含水缓冲液)实施。

Description

增强型电泳检测固相支持物上的分析物

交叉申请

本申请要求根据美国法典35 U.S.C.§119(e)，于2009年3月13号提交的美国临时专利申请序列号No.61/160,097，于2008年7月24号提交的美国临时专利申请序列号No.61/083,211，以及于2008年7月11号提交的美国临时专利申请序列号61/080,087的优先权，本申请享有全部这三篇专利申请的优先权，并以引用的方式全部明确地并入本申请。

技术领域

本发明通常涉及免疫检测/核酸印迹领域，更具体地，涉及适于对一种或多种固定化分析物进行电免疫检测/电印迹的系统、试剂盒和方法。

背景技术

对生物样品中的蛋白进行分离和鉴别对于理解和学习如何控制健康和疾病的生物化学是非常关键的。在生命科学中应用最广泛的一种分析技术，蛋白质印迹或“免疫印迹”是一种用于检测和鉴别抗原(例如蛋白、核酸和碳水化合物)的电泳后的技术。

随着电印迹方法例如由Margalit等(U.S. patent Appl.Publ.No.2006/0272946)描述的电印迹装置和方法的应用，免疫检测方法已经获得了很大进展。与传统的电印迹相比，应用这种干式印迹系统，蛋白、核酸和其它生物分子能被更有效和更迅速地从电泳分离凝胶上转移至印迹膜上，且该电印迹方法的实施者不需处理液体缓冲液。例如，使用该电印迹系统，可在5-10分钟的短时间内进行电印迹转移。

在电泳和印迹方面所取得的进展使得样品大小和灵敏性的缺陷成为了关注的限制因素。

在典型的蛋白质印迹过程中，研究者进行了下述步骤：(1)制备蛋白质样品并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：应用电泳，将蛋白质样品中存在的抗原通过相对位移分开；(2)将分开的蛋白质从步骤(1)的SDS-PAGE凝胶上转移至固相支持物上(例如硝酸纤维素或PVDF膜)；(3)使用封闭剂(通常为蛋白质混合物例如脱脂牛奶、酪素、牛血清白蛋白等等)将步骤2的膜温育约1小时以封闭膜表面上存在的任何非特异性耦合位点；(4)在生理中性的缓冲液(例如，PBS(磷酸盐缓冲液))或PBST(含有少量洗涤剂的PBS，例如0.1％吐温-20)中用10分钟洗涤封闭膜3次；(5)用在溶液中稀释过的初级检测剂(primarydetection agent)(例如，和抗体)温育步骤(4)的膜1小时至过夜。该初级检测剂与目标抗原耦合。(6)从初级检测剂溶液中取出步骤(5)的膜，且分别在PBS或PBST中用10分钟洗涤三次，以除去未特异性耦合的初级检测剂；(7)用在溶液中稀释过的二级检测剂(secondary detection agent)温育步骤(6)的膜1小时。该二级检测剂与初级检测剂耦合。所述二级检测剂可为，但不限于，为与报道酶例如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)耦合(耦合)的检测剂，可通过将显色底物(色原)转变为有色沉淀进行肉眼检测，(8)从二级检测剂溶液中取出步骤(7)的膜，且分别在PBS或PBST中用10分钟洗涤三次，以除去未特异性耦合的二级检测剂；(9)应用检测系统例如发光或显色系统或其它方法检测耦合的二级检测剂步骤(3)到步骤(9)的持续时间通常为约4.5小时(7步)。

在传统的蛋白质印迹中，步骤(3)到步骤(9)是在回转式振荡器或摇动装置中进行的。比较传统的蛋白质印迹包含三个温育步骤：第一步是用封闭液温育，第二步是在膜和初级检测剂之间温育；另一步是在膜和二级检测剂之间温育。每个温育步骤通常持续约1小时。

核酸杂交事件的检测在各种不同的生命科学研究、诊断、法学和相关申请中是一项基本的测定。核酸杂交分析的一个共有特征是靶标和探针在杂交条件下耦合，且可检测到发生在互补靶标和探针核酸间的任何杂交事件。然后，应用对杂交事件，即靶标/探针复合物得到有关目标核酸来源的信息，例如在细胞或组织中表达的基因等。

在目前应用的杂交试验中，必须用可检测标记(其中该标记可被直接或间接检测)标记目标核酸，这样可以检测杂交后探针/靶标复合物的存在。目前应用的标记包括同位素标记和荧光标记，其中荧光标记是最受欢迎的标记，特别是在基于杂交试验的分析中。

目前，杂交试验(例如Southern印迹和northen印迹)耗费时间，需要数小时或多达一天，且其在杂交中需多次变化和洗涤缓冲液。

因此需要一个能进行分析物检测试验的系统，该系统耗时少于一天，并能最大程度地减少试验所需的步骤。

发明内容

本发明的实施方案提供了适于对固定蛋白质或核酸样品进行干式或基本干式电检测或电核酸检测(以下称为电印迹)的系统、试剂盒和方法。根据本发明实施方案进行的电印迹试验可包括使对一种或多种固定蛋白质或核酸的检测电泳加速的步骤。对固定蛋白质或核酸进行电印迹检测的方法可包括对在印迹或核酸印迹过程中通常使用的一种或多种试剂施加电压。在一些实施方案中，进行蛋白质或核酸印迹试验所需的某些试剂可被吸附在合适的载体基质上。根据本发明所述系统和方法进行的电印迹可在基本干燥的条件下进行(即，含少量或不含水性缓冲液)。通常，使用20ml或更少的含水缓冲液，15ml或更少的含水缓冲液，10ml或更少的含水缓冲液，5ml或更少的含水缓冲液，3ml或更少的含水缓冲液，1ml或更少的含水缓冲液实施干燥或基本干燥的电印迹法。含水缓冲液可包括用于稀释封闭剂的稀释剂、杂交试剂、一级抗体、二级抗体、核酸探针(RNA/DNA/PNA等)，以及任何进一步处理所需的洗脱缓冲液。

在一些实施方案中，根据本发明的系统、方法和试剂盒进行的电印迹可在30分钟内完成。在一些实施方案中，根据本发明的系统、方法和试剂盒进行的电印迹可在15分钟内完成。在一些实施方案中，根据本发明的系统、方法和试剂盒进行的电印迹可在5分钟内完成。在一些实施方案中，根据本发明的系统、方法和试剂盒进行的电印迹可在3分钟内完成。在一个实施方案中，电印迹系统可包括第一凝胶基体、第二凝胶基体和一种或多种载体基质。第一和第二凝胶基体可包裹于密封的包装中。此外，多阳极和/或阴极凝胶基质离子槽可一起包裹于包装中。在一些实施方案中，一种或多种第一和第二凝胶基体可配有一次性托盘，便于操作。所述托盘可为塑料托盘或任何其它合适的材料。

载体基质可由显示能快速吸收含有大分子(例如，多肽、抗体、核酸等)的液体或水溶液的材料制成，但应能在合适的条件下自由释放这些大分子，同时使这些大分子与载体基质之间的不可逆吸收或耦合最小化。根据本发明的实施方案，适用作载体基质的材料包括在对载体基质施加至少3伏电流时，能在10分钟内能释放吸附在载体基质上的电印迹混合物中45％-约95％或更多生物分子样品的任何材料。

在一些实施方案中，可挑选具有基本平滑表面的的载体基质，以使试验结果中的像素化条带(pixelated ofbands)(即粒度)的形状最小化。代表性的载体基质可包括，但不限于，聚酯纤维、聚碳酸酯纤维、亲水纤维素纤维、醋酸纤维素纤维、羟基化聚酰胺纤维(例如，LOPRODYNE

)、聚醚砜纤维、丙烯酸共聚物纤维、混合纤维素酯纤维、改性的聚(四氟乙烯)(PTFE)、过滤纸、石棉布(felt)，或其组合。在一些实施方案中，载体基质可包括一张或多张印迹纸。在一个实施方案中，载体基质可包括一张或多张过滤纸。在一个实施方案中，载体基质可包括一张或多张微纤维板。这张板中所用的合成微纤维可包括聚酯微纤维、聚酰胺微纤维、或聚酯微纤维和聚酰胺微纤维两者的组合。在一些实施方案中，载体基质可包括一张或多张含有约10％-约90％聚酯微纤维的微纤维板。在一些实施方案中，载体基质可包括一张或多张含有约10％-约90％聚酰胺微纤维的微纤维板。在一些实施方案中，载体基质可包括一张或多张含有约10％-约90％聚酯微纤维和约10％-约90％聚酰胺微纤维的微纤维板。在一些实施方案中，载体基质可包括一张或多张含有约80％聚酯和约20％聚酰胺微纤维的微纤维板。

另一方面，本发明还提供了用于进行电印迹的膜电极组件，其中所述电电极组件包括具有离子源的凝胶基体；和与该凝胶基体相关的导电电极。在一些实施方案中，电极与凝胶基体相连。在一些实施方案中，导电电极至少部分包埋在凝胶基体中。在一些实施方案中，在电泳前或电泳转移期间，凝胶基体与电极在塑料托盘中并列。可将电极组件(electrode assembly)包裹于密封的包装中。干式电印迹系统中所用的电极和本发明提供的电极组件可为，例如，包括非金属导电材料的层状结构，包括非金属导电材料的网，金属薄片，金属网，用导电金属或非金属涂覆的不导电聚合物，或其任意组合。用导电材料涂覆的不导电材料的的电极可以是板、网或其它结构。在一些实施方案中，电极组件的电极包含电化学可离子化金属，例如铅、铜、银或其组合。在一些实施方案中，电极组件的电极含有铝或钯。

在一个实施方案中，电印迹系统可包括阳极组件(assembly)、阴极组件和可位于两者之间的载体基质。在一个实施方案中，载体基质可位于阳极和和阴极组件之间。阳极组件可包括阳极凝胶基体和与之耦合的阳极。阴极组件可包括阴极凝胶基体和与之耦合的阴极。

具有电极和凝胶基体的电极组件可以预制形式、一次性形式提供，从而方便电极组件的应用，并且提供一种有效的商业形式。电极可与凝胶基体并列，且放置于托盘或支持物中。电极组件可包裹于密封的包装中。

在另一个实施方案中，提供了干式电印迹系统，其中所述系统包括载体基质的印迹层(blotting stack)，印迹膜、阳极、与阳极接触且位于阳极和印迹层之间的阳极凝胶基体、阴极、与阴极接触且位于阴极和印迹层之间的阴极凝胶基体。

在一个实施方案中，阳极凝胶基质和阴极凝胶基质各自包括适用电泳的离子源。电印迹系统不需要在电印迹之前或期间(例如当组装印迹层时)往系统中添加大量的液体缓冲液。在一些实施方案中，可如此组装系统，使阳极凝胶基质和阳极位于印迹层的膜一侧，且使阴极凝胶基质和阴极位于印迹层的载体基质一侧。在一些实施方案中，阳极、阴极或其两者可为外壳(housing)的一部分。在一些实施方案中，阳极、阴极或其两者可为电源的一部分和/或与电源耦合。在一些实施方案中，阳极、阴极或其两者可与电源分开。

在一些实施方案中，电印迹系统可包括印迹与固相支持物耦合的抗原的装置。根据这些实施方案的装置可包括：在电印迹中，能支持印迹层的电源、阳极、与阳极并列的位于阳极和印迹层之间的阳极凝胶基体、阴极、与阴极并列的位于阴极和印迹层之间的阴极凝胶基体。在电印迹中，干式或基本干式的电印迹装置不包括，支持物或不与含有电泳用的液体缓冲液的任何槽连接。在一些实施方案中，装置的阳极和阳极凝胶基质以阳极组件的形式提供，所述阳极组件可逆地定位在所述装置的电触头上或与之相对或耦合。在一些实施方案中，阳极或阴极中的一个或其两者是装置的一部分。

在一个实施方案中，阳极可由铜制成。在一些示例性的实施方案中，阳极和阴极均由铜制成。

在一个实施方案中，电印迹系统可任选包括第二载体基质。该第二载体基质与第一载体基质基本相同。第二载体基质可由与第一载体基质不同的材料制成。在一个实施方案中，当进行电印迹程序时，第一载体基质和第二载体基质可同时使用。在一个替代实施方案中，第二载体基质可在第一载体基质之后使用。

在一个实施方案中，电印迹试剂盒包括，在至少第一个适当容器中，一个或多个阳极组件，每个阳极组件包括阳极凝胶基体和与之相连的阳极，一种或多种第一载体基质，和任选的一种或多种第二载体基质。可将一种或多种凝胶基体配置在位于试剂盒的塑料托盘里或托盘上。这中托盘可便于对应用期间的凝胶基体进行处理。

在一个实施方案中，进行干式或基本干式电印迹所用的试剂盒可包括至少一种含有电泳用离子源的凝胶基体和至少一种合适的载体基质。在另一个实施方案中，试剂盒包括至少一种阳极凝胶基体和至少一种阴极凝胶基体。

阳极凝胶基体和阴极凝胶基体可包裹于密封的包装中在试剂盒中提供。本发明设计的电印迹凝胶基质试剂盒可任选地包括至少一种印迹膜，至少一种过滤纸板，至少一种海绵和/或至少一个电极。载体基质可在与阳极和印迹凝胶基质不同的包装中提供。载体基质可被单独包装或与多种其它载体基质一起包装。

试剂盒还包括一个或多个装有合适稀释液的瓶子。示例性的稀释液包括，通过非限制性实施例，磷酸盐缓冲液(PBS)、三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBS)、Hank’s缓冲液、Tris-EDTA(TE)，Tris-EDTA-NaCl(TEN)or WESTERN BREEZE^TM稀释液，来自BioFX^TM的合成封闭缓冲液等。稀释液可任选包括蛋白酶抑制剂、蛋白、洗涤剂、防腐剂、抗菌剂或其任意组合。

试剂盒还包括进行印迹程序所必需的一种或多种试剂。这些其它试剂的非限制性实例包括一级抗体、内参抗体(loading controlantibodies)、二级抗体、封闭试剂盒显色试剂(例如比色显色剂或化学发光显色剂)。

在一个实施方案中，，试剂盒可包括一个或多个一次性阳极组件和/或一个或多个一次性阴极组件。在一些实施方案中，一个或多个阳极组件可包括含有离子源和与凝胶基体并列的电极的凝胶体。在一些实施方案中，一个或多个阴极组件可包括含有离子源和与凝胶基体并列的电极的凝胶体。阳极组件、阴极组件或其两者可在托盘例如一次性塑料托盘中提供。

阳极和/或阴极组件可单独或一起包裹于密封包装中。此外，多阳极和/或多阴极组件可一起包装。在某些方面，电印迹试剂盒可包括一个或多个一次性阳极组件和一个或多个一次性阴极组件。在某些方面，电印迹试剂盒可包括一个或多个一次性阳极组件和一个或多个一次性阴极组件。在一些方面，电印迹试剂盒包括一个或多个一次性阳极组件和至少一种阴极凝胶基体。试剂盒可任选包括一个或多个印迹膜、过滤纸板、海绵或载体基质。

在一个实施方案中，对蛋白质样品实施电印迹份方法可包括提供阳极组件和阴极组件。阳极组件可包括阳极和电泳用离子源。阴极组件可包括阴极和电泳用离子源。在一个实施方案中，离子源可为凝胶基质的形式。凝胶基质可与阳极或阴极电耦合。阳极和阴极组件可与电源耦合，这样电压可从它们中间通过。

进行电印迹的方法还包括提供载体基质和使载体基质与蛋白质或杂交组合物接触。载体基质可由显示能快速吸收其中分散有或吸收有大分子(例如，多肽、抗体、核酸等)的液体或水溶液的材料制成，但应能在合适的条件下自由释放这些大分子，同时使这些大分子与载体基质之间的不可逆吸收或耦合最小化。根据本发明的实施方案，适用作载体基质的材料包括那些释放至少75％或更多，至少80％或更多，至少85％或更多，至少90％或更多，至少95％或更多吸附在载体基质上的蛋白混合物中的蛋白的材料。在一些实施方案中，可选择具有基本平滑表面的载体基质，以使试验结果中的像素化条带(pixelated ofbands)(即粒度)的形状最小化。代表性的载体基质可包括，但不限于，聚酯纤维、聚碳酸酯纤维、亲水纤维素纤维、醋酸纤维素纤维、羟基化聚酰胺纤维(例如，LOPRODYNE

)、聚醚砜纤维、丙烯酸共聚物纤维、混合纤维素酯纤维、改性的聚(四氟乙烯)(PTFE)、过滤纸、石棉布(felt)，或其组合。在一些实施方案中，载体基质可包括一张或多张印迹纸。在一个实施方案中，载体基质可包括一张或多张合成微纤维板。这张板中所用的合成微纤维可包括聚酯微纤维、聚酰胺微纤维/聚酯微纤维和聚酰胺微纤维。在一个实施方案中，载体基质可包括一张或多张过滤纸。

在一个实施方案中，使蛋白或杂交组合物与载体基质接触可包括制备溶解有或分散有一种或多种蛋白或核酸的水性缓冲液。在一个实施方案中，蛋白或杂交组合物可包括至少一种封闭剂。该封闭剂可为蛋白封闭剂或核酸封闭剂。

在一个实施方案中，蛋白或杂交组合物可包括至少一种一级抗体。该一级抗体可为内参抗体。该一级抗体可为用户定义型抗体。该一级抗体可在试剂盒中提供或由最终用户提供。在一个实施方案中，蛋白或杂交组合物可包括至少一种二级抗体。该二级抗体可与辣根过氧化物酶、生物素、碱性磷酸酶、荧光染料或Qdot纳米晶体耦合。

在一个实施方案中，蛋白或杂交组合物可包括至少一种核酸探针。该核酸探针可为标记探针或未标记探针。该核酸探针可为DNA、RNA或PNA。该核酸探针可为合成的寡肽或可从天然存在的或重组来源分离得到。在一个实施方案中，蛋白或杂交组合物可包括至少一种封闭剂和至少一种一级抗体。在另一个实施方案中，蛋白或杂交组合物可包括至少一种封闭剂和至少一种二级抗体。在又一个实施方案中，蛋白或杂交组合物包括至少一种封闭剂、至少一种一级抗体和至少一种二级抗体。

实施电印迹的方法可包括获得具有与其表面耦合的一种或多种蛋白质或核酸样品的蛋白质印迹膜。该印迹膜可定位到阳极组件上，使得缺少蛋白质或核酸样品的膜与其凝胶基体基本并列或电耦合，以及含有与其耦合的蛋白质样品的膜表面朝上。阳极组件可定位于一次性塑料盘中。

实施电印迹的方法还可以进一步包括制备蛋白或杂交组合物并将其至少一部分吸收到载体基质中。蛋白或杂交组合物可包括分散于适当缓冲水溶液中的适当的封闭剂、一级抗体、二级抗体、核酸探针或其任何组合。含有吸收的蛋白或杂交组合物的载体基质可定位于蛋白质印迹膜的上方，使其与耦合到印迹膜表面的蛋白质样品基本并列。

在一个实施方案中，上面吸收有蛋白或杂交组合物的第二载体基质可定位到第一载体基质的顶部，使第二载体基质与其基本并列。蛋白或杂交组合物可包括分散在适当水性缓冲液中的适当的封闭剂、一级抗体、二级抗体、核酸探针，或其任何组合。在一个替代性实施方案中，在进行完下述的电印迹程序后，可用第二载体基质替换第一载体基质。

在一个实施方案中，实施电印迹程序的方法可包括将阴极组件定位到第一和第二载体基质的上方，使阴极的凝胶基体与其并列并建立电通信，并使阴极能够与一种或多种其它部件例如外壳(housing)耦合。应当注意，上述任意步骤可包括脱泡步骤，从而除去任何组装部件之间的任何气穴。

在一个实施方案中，可将上述组件置于与AC/DC电源电耦合的适当的外壳中，配置电源以向组件的部件施加压力使电流从其中通过。

引文的纳入

本申请说明书中提及的所有出版物、专利、和专利申请以参阅的方式并入本文，参阅的程度为，每件出版物、专利或专利申请被明确和单独地指明作为引文纳入本文。

附图简述

参照下述本发明优选的示例性的实施方案的详述并结合附图，将更容易充分理解本发明方法和装置上述的简要说明以及进一步的目的、特征和优势。

图1A为根据一个实施方案的电免疫检测系统图谱；

图1B为根据另一个实施方案的电免疫检测系统图谱；

图1C为根据又一个实施方案的电免疫检测系统图谱；

图2A为描述根据一个实施方案实施电印迹程序的方法的流程图；

图2B为描述根据一个替代实施方案实施电印迹程序的方法的流程图；

图3为显示在根据一个实施方案的电免疫检测系统使用的pH中性的各种试剂中的固有负电荷图像；在native 1.2％E-GEL

clear上分辨样品，并用考马斯染色凝胶以使分辨的蛋白可视化。样品如下：泳道1，WESTERNBREEZE封闭液；泳道2，小鼠抗肌动蛋白单克隆抗体；泳道3，小鼠抗微管蛋白单克隆抗体；泳道4，与碱性磷酸酶耦合的羊抗兔二级抗体；泳道5，与碱性磷酸酶耦合的羊抗小鼠二级抗体；

图4A示出了根据一个实施方案实施印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果；

图4B示出了根据现有技术通常使用的方法实施印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果；

图5A示出了根据一个实施方案实施印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果；

图5B示出了根据一个替代实施方案实施印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中仅对系统施加电压而不施加电流；

图6A示出了根据一个实施方案实施印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，根据一个实施方案使用过滤纸作为载体基质；

图6B示出了根据一个实施方案实施印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，根据一个替代实施方案使用聚酯/聚酰胺微纤维板作为载体基质；

图7A示出了使用WESTERBREEZE^TM方案实施常规印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL试剂；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM试剂；下面板)检测信号；

图7B示出了根据一个实施方案实施电印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中在施加电压前将封闭试剂和一级和二级抗体应用至载体基质，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL试剂；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM试剂；下面板)检测信号；

图8A示出了实施常规的印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用IBLOT设备将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图8B示出了根据一个实施方案实施电印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用IBLOT

设备将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图9A示出了实施常规的印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用常规的湿转移方法将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图9B示出了实施电印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用常规的湿转移方法将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图10A示出了实施常规的印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用IBLOT

设备将蛋白样品转移至PVDF膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图10B示出了实施电印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用IBLOT

图11A示出了实施常规的印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用常规的湿转移方法将蛋白样品转移至PVDF膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图11B示出了实施电印迹程序检测在SW480全细胞裂解物中的肌动蛋白和微管蛋白后获得的结果，其中使用常规的湿转移方法将蛋白样品转移至PVDF膜上，并使用化学发光方法(使用HRP-耦合的二级抗体和ECL检测；上面板)或显色方法(使用碱性磷酸酶耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM检测试剂；下面板)检测信号；

图12A示出了使用WESTERBREEZE^TM方案实施常规印迹程序检测在大肠杆菌细胞裂解物中的蛋白后获得的结果，使用化学发光方法，采用AP-耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM CL试剂检测信号；

图12B示出了使用WESTERBREEZE^TM方案实施两步印迹程序检测在大肠杆菌细胞裂解物中的蛋白后获得的结果，使用化学发光方法，采用AP-耦合的二级抗体和WESTERNBREEZE^TM CL试剂检测信号；

图13A示出了在单个步骤中对A341裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级(抗-EIF)和二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图13B示出了在单个步骤中对HeLa细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级(抗-ERK)和二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图14A示出了在两个连续步骤中对纯化的牛血清白蛋白(BSA)进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-BSA)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图14B示出了在两个连续步骤中对SW480细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗微管蛋白和抗肌动蛋白)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图14C示出了在两个连续步骤中对HeLa细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-p70)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图14D示出了在两个连续步骤中对SW480细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-p53)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图15A示出了在对电印迹方案中指明的抗原-抗体对进行优化后，对HeLa细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-4E-BP1)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图15B示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对SW480细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-β-连环蛋白)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图15C示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对兔HCG进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(兔抗-HCG)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图15D示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对纯化的GST-标签EGFR进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-EGFR)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图15E示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对纯化的HeLa细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-IKK)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图16A示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对从表达重组组氨酸-标签的Src蛋白的HeLa细胞中制备的细胞裂解物进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-His)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图16B示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对重组Positope进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-V5)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图16C示出了在对电印迹方案中指示的抗原-抗体对进行优化后，对重组Positope进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。将一级抗体(抗-Myc)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图17A示出了使用SW480细胞裂解物对使用SNAPi.d.蛋白质检测系统(微孔；中心面板)进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。根据制造商的指示，使用指示的抗体稀释液进行SNAPi.d.。对电印迹而言，将一级抗体(抗胰岛素)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图17B示出了使用纯化的GST-标签EGFR对使用SNAPi.d.蛋白质检测系统(微孔；中心面板)进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。根据制造商的指示，使用指示的抗体稀释液进行SNAPi.d.。对电印迹而言，将一级抗体(抗EGFR)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图17C示出了使用纯化的SW480裂解物对使用SNAPi.d.蛋白质检测系统(微孔；中心面板)进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。根据制造商的指示，使用指示的抗体稀释液进行SNAPi.d.。对电印迹而言，将一级抗体(抗微管蛋白和抗肌动蛋白)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图17D示出了使用纯化的大肠杆菌裂解物对使用SNAPi.d.蛋白质检测系统(微孔；中心面板)进行常规的免疫印迹(左面板)与电免疫印迹(右面板)比较所获得的结果。根据制造商的指示，使用指示的抗体稀释液进行SNAPi.d.。对电印迹而言，将一级抗体(抗大肠杆菌)指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。接下来，将二级抗体(单克隆抗-小鼠-HRP)的指示的稀释液应用到载体基质，使用指示的条件在单个步骤中进行电印迹。

图18A示出了对比核酸印迹试验；

图18B示出了根据一个实施方案，使用与固相支持物相耦合的标记核酸探针进行的电印迹试验；

图18C示出了根据一个替代实施方案，使用与固相支持物相耦合的标记核酸探针进行的电印迹试验。

本发明易进行各种变化和具有各种替代形式。本发明具体的实施方案通过实施例和附图列出并将在本文中详细描述。附图不能缩放。应当理解附图和详述并非是将本发明限制为特定的形式，相反，本发明意在涵盖落在本发明所附权利要求书的精神和范围之内的所有变化、等价物和替代物。

发明详述

定义

本说明书通篇使用的术语通常具有在本领域中一般的意义，如在本发明的上下文中和其中使用术语的具体的上下文中。以下或在说明书的其它地方对一些术语进行了讨论，以为实施者在描述本发明的装置和方法以及如何使用他们提供附加指导。应理解相同的事物可用一种以上方式表述。因此，可对本文讨论的一个或多个术语应用替代性的语言和同义词，术语是否在本文中详加阐述和讨论并不重要。本文为某些术语提供了同义词。对一个或多个同义词的详述并不妨碍其它同义词的使用。说明书中任何地方的实例，包括本文讨论的任何术语的实例的应用仅用于说明，绝非为了限制本文所述的任何实施方案或任何示例性术语的范围和意义。

本文使用的术语“免疫印迹”与术语“蛋白质印迹”同义。除非另外说明，为了本发明的公开，这两个术语可互换使用。

术语“Southern印迹”是分子生物学中检查DNA样品中DNA序列存在的惯用方法。Southern印迹将用于DNA大小分离的琼脂凝胶电泳与转移分离大小的DNA至过滤膜的方法组合起来，用于探针(通常为核酸)杂交和随后的检测。

术语“northern印迹”是一种与Southern印迹基本相同的方法，不同之处在于，检测的目标分子为RNA而非DNA。因此，尽管并不必要，要进行northern印迹的RNA样品的电泳通常在变性条件下进行。与目标RNA分子进行杂交的探针通常为核酸(即，DNA、RNA或PNA)探针。

术语“蛋白质印迹”和“免疫印迹”可互换使用，是指用于检测给定的组织均质物或提取物样品中的特异蛋白的分析技术。它采用凝胶电泳通过多肽长度(变性条件)和蛋白的3-D结构(天然/非变性条件)分离天然或变性蛋白。然后将蛋白转移至膜上(通常为硝酸纤维素膜或PVDF)，使用目标蛋白的特异性抗体检测这些蛋白。

本文使用的术语“凝胶基质”和“凝胶基体”等通常是指离散单位的胶体基质，其中胶体含有离子源、缓冲液和使该基体适用于电泳的其它成分。

术语“基本并列”，当在上下文中使用两个表面“基本并列”时，通常是指这两个表面基本连续的表面接触。在本发明的上下文中，该术语是指两个并列物体至少50％表面是连续表面接触的。

本文使用的术语“基本干”是为了表明不需要其它水性缓冲液的槽来实施本发明所述的实施方案。这并非是指不含液体，而是指应用的水性缓冲液为最小化且不需要容器装水。液体的应用是为了使检测分子，例如抗体或核酸探针应用到载体基质。同样的，液体被用来形成凝胶基质层。

本文使用的术语“电印迹”、“电增强印迹”、“电辅助印迹”等可互换使用，是指对检测分子(例如一级或二级抗体、核酸探针、寡核苷酸、适配子、低聚物、多肽或寡肽或任何前述标记的类型)施加电场，使检测分子与目标分析物(即，与具有高度特异性的检测分子耦合的分子)接近。术语“电印迹”可能是指这些实施方案中的一小类，其中，检测分子或目标分析物或其两者为抗体或抗原/抗体对。

电印迹系统

本发明实施方案提供了一种基本干式的电印迹系统，该系统包括其中定位有一种或多种载体基质的电印迹层(stack)。所述电印迹层包括阳极、阳极凝胶基体、阴极、定位于阴极之间的阴极凝胶基体，其中阳极凝胶基质和阴极凝胶基质各自含有电泳转移用离子源。电印迹层还包括至少一种可定位于阳极凝胶基质和阴极凝胶基质间的载体基质。载体基质可为板状形式。

根据本发明实施方案的电印迹层被配置为能接受位于两种凝胶体基质间的蛋白或核酸印迹膜(或更简单的“印迹膜”)。所述印迹膜可为本领域中实施免疫或核酸印迹程序所用的任何类型的膜。这些类型多样的膜为本领域技术人员所熟知，且通过非限制性实施例包括，硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。

应用该系统之前，可由最终的用户提供印迹膜。所述印迹膜通常具有与印迹膜耦合的一种或多种生物分子样品(例如多糖、蛋白、肽或核酸)。生物分子样品能够可逆或不可逆地与这种印迹膜耦合。使生物分子样品与印迹膜耦合的方法在本领域中广为人知，且可以包括，但不限于，湿式、半干式和干式电泳转移方法。示例性的非限制的干式电泳转移方法描述于Margalit等的美国专利申请公开号2006/0278531和20060272946，这两件申请被本申请共同享有，并以参阅的方式明确地全文并入与此。＝本领域技术人员熟知的其它可使生物分子样品耦连至固相膜支持物的方法包括，但不限于，斑点印迹、测定点位、真空转移和毛细血管转移。

在一些实施方案中，电印迹系统可不含任何外来缓冲液或在使用中用来容纳液体或水性缓冲液或为系统提供液体或水性缓冲液的槽。在这个意义上，本发明所述的电印迹系统可描述为“干式”或“基本干式”。这样的说法并非意味着该系统完全不含液体，而是指不需要额外供应缓冲液以实施本发明的多个实施方案。例如使用术语“干式”或“基本干式”并不是指将印迹缓冲液吸收到载体基质上无需应用水性缓冲液即可实现。也不是指，例如不适用缓冲液进行洗涤步骤。相反，该术语意在表示不需要外源的水性缓冲液或液体缓冲液槽来为系统供应电泳用的离子源。相反，在一些实施方案中，电印迹系统的一个或多个组件(Component)，例如印迹膜、载体基质或置于印迹层的各层之间的一张或多种过滤纸可在应用系统前进行润湿。然而，在本发明设计的电印迹系统中，湿润一个或多个系统部件，例如含水的印迹膜或过滤纸板，洗涤剂溶液，温育缓冲液，预杂交缓冲液或其它水溶液对于提供驱动电泳转移所需的离子而言并不必要。

构建系统，使当电流通过阳极和阴极之间时，电印迹程序中使用的吸附在载体基质上的分子(例如封闭剂、一级抗体、二级抗体、核酸探针等等)从载体基质转移到与其并列的印迹膜上，其中，这些分子与存在于与膜表面耦合的生物分子样品中的适当抗原耦合。

因此，组装的系统提供了从阴极到阳极的电学连接，其中电流从阴极通过阴极凝胶基体，一种或多种载体基质，印迹膜和阳极凝胶基体通到阳极。因而在一些实施方案中，阴极凝胶基体的一面与阴极接触，阴极凝胶基体的另一面直接或间接与阴极层的载体基质电接触。阳极凝胶基体的一面与阳极接触，阳极凝胶基体的另一面直接或间接与阴极层的载体基质电接触。

现在回到图1，按照特定实施方案，使用之前或使用过程中对电印迹系统，包括对其零件，和它们的组装和结构进行详细的论述。在不脱离本发明精神和范围前提下，这对本领域技术人员来说当然是显而易见的，即电印迹系统的各种可替换的实施方案还包括下文中没有提及的另外的零件，只要该零件没有影响到上述的系统的功能。

图1A所示的是电印迹层的一个实施方案。电印迹层100可包括下层102和上层104。下层102也可称为阳极组件102。同样地，上层104也可被称为阴极组件104。

在一个实施方案中，下层102可包括阳极105和阳极凝胶基质(gel matrix)106，上层104可包括阴极107和阴极凝胶基质108。在一个实施方案中，阳极105可物理连接到阳极凝胶基质106。阳极105可电学连接到阳极凝胶基质106。在一个实施方案中，阴极107可物理连接到阴极凝胶基质108。阴极107可电学连接到阴极凝胶基质108。物理和电学连接电极到凝胶基体不是互斥的。在一个实施方案中，阳极105的表面可并列至少一份阳极凝胶基质106的表面，如图1A所示。同样地，阴极107的表面可并列至少一份阴极凝胶基质108的表面。在一个可选的实施方案中，以至少一份阳极105属于或嵌入到一份阳极凝胶基质106这样的方式制备下层102。同样地，以至少一份阴极107属于或嵌入到一份阴极凝胶基质108这样的方式制备上层104。

在一个实施方案中，阳极和阴极凝胶基体的长度和宽度以置于其中的蛋白印迹膜的上下表面与至少一个凝胶基体的表面接触这样的方法进行选择。典型地，阳极凝胶基体和阴极凝胶基体的尺寸基本相似。典型地，阳极凝胶基体和阴极凝胶基体的尺寸基本同与其连接的电极的尺寸相似。在一个实施方案中，至少一面阳极凝胶基体的长度和至少一面阴极凝胶基体的长度的范围为约2～约25cm，约5～约20cm，约8～约15cm，约10～约12cm。同样地，另一面阳极凝胶基体的长度和至少一面阴极凝胶基体的长度的范围为约2～约25cm，约5～约20cm，约8～约15cm，约10～约12cm。在一个实施方案中，每个凝胶基体的厚度范围为约1～约15mm，约2～约10mm，约3～约5mm。

在一个实施方案中，阳极和阴极的尺寸与相应的凝胶基质可基本相同。在一个可选的实施方案中，电极尺寸可基本小于相应的凝胶基体。

凝胶基体

电印迹系统的阳极凝胶基体和阴极凝胶基体可含有相同或不同的组合物。例如，电印迹系统的阳极凝胶基体和阴极凝胶基体可含有相同或不同的凝胶形成聚合物，或一种或多种不同浓度的通用凝胶形成聚合物。电印迹系统的阳极凝胶基体和阴极凝胶基体可含有相同或不同的缓冲液，或可含有不同浓度的通用缓冲液。阳极凝胶基质可包括一种或多种阴极凝胶基质中不含有的其它化合物。阴极凝胶基质可包括一种或多种阳极凝胶基质中不含有的其它化合物。

凝胶基体(阳极凝胶基体或阴极凝胶基体)可包括琼脂、丙烯酰胺、矾土、硅石、淀粉或其它多糖，如壳聚糖、树胶(如，黄原胶、结冷胶)、卡拉胶、果胶或能形成凝胶的聚合物，或这些的任意组合。在一个实施方案中，阴极凝胶基体可包括如浓度为约2.5～约30％，或约5～约20％的丙烯酰胺。在一个实施方案中，阴极凝胶基体可包括如以浓度为约0.1～约5％，或约0.5～约4％，或约1～约3％的琼脂。在一个实施方案中，阴极凝胶基体包括丙烯酰胺和琼脂，例如，阴极凝胶基体可包括约2.5～约30％的丙烯酰胺和约0.1～约5％的琼脂，约5～约20％的丙烯酰胺和约0.2～约2.5％的琼脂。

阳极凝胶基质和阴极凝胶基质的用于电泳转移的离子源自如盐、酸、碱或缓冲液或其组合。在一个实施方案中，阴极凝胶基体可包括至少一种缓冲液，如有机缓冲液。阴极凝胶基质的缓冲液可为两性离子缓冲液。在特定的实施方案中，载体基质包括电印迹的蛋白质或多肽，阴极凝胶基体可包括pKa为约6.5～约8.5，或约7～约8的缓冲液。阴极凝胶基质中的缓冲液可以约10mM～约1M的浓度存在，例如，浓度为约20～约500mM，为约50～约300mM，或为约60～约150mM。

在一个实施方案中，阴极凝胶基体可包括非限制性实例为2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)-2-牛磺酸(ACES)、哌嗪-N，N′-2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉)-2-羟基-丙磺酸(MOPSO)、N，N-双-(羟乙基)-2-牛磺酸(BES)、3-(N-吗啉)-丙磺酸(MOPS)、N-2-羟基乙-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-三-(羟甲基)甲基氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-[双(羟甲基)-甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、三(羟甲基)氨基-甲烷(Tris)、或双[2-羟乙基]亚氨基-三-[羟甲基]甲烷(BisTris)。

可选地，阴极凝胶基质、阳极凝胶基质或两者可包括离子交换基体。例如，阳极凝胶基质可选择性的包括一个阳离子交换基体。阴极凝胶基质可选择性的包括一个阴离子交换基体，例如DEAE纤维素。离子交换基体可装载有离子，如缓冲离子，例如，DEAE离子交换基体，可装载有Tricine阴离子。

阴极凝胶基体可进一步包括乙二醇、醇、一种或多种去污剂、一种或多种抗真菌剂或者一种或多种抗蚀剂等。

阳极凝胶基质的用于电泳转移的离子可源自盐、酸、碱或缓冲液。在一个实施方案中，阳极凝胶基体可包括至少一种缓冲液，如有机缓冲液。阳极凝胶基质的缓冲液可为两性离子缓冲液。在特定的实施方案中，载体基质包括电印迹的蛋白质或多肽，阳极凝胶基体可包括pKa为约6～约8，或约6.2～约7.2的缓冲液。阳极凝胶基质中的缓冲液可以约10mM～约1M的浓度存在，例如，浓度为约20～约500mM，为约50～约300mM，或为约60～约150mM。

在一个实施方案中，阳极凝胶基体可包括2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)-2-牛磺酸(ACES)、哌嗪-N，N′-2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉)-2-羟基-丙磺酸(MOPSO)、N，N-双-(羟乙基)-2-牛磺酸(BES)、3-(N-吗啉)-丙磺酸(MOPS)、N-2-羟基乙-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-三-(羟甲基)甲基氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-[双(羟甲基)-甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)、N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)、三(羟甲基)氨基-甲烷(Tris)、或双[2-羟乙基]亚氨基-三-[羟甲基]甲烷(BisTris)。

不使本发明受任何特殊的机理的限制，预期为：存在于电印迹系统中的阳极凝胶基质上的一种或多种阴离子可随着迅速迁移到阳极，有助于迁移的大分子的电泳浓度，其中，所述的阴离子在电泳转移中当电场形成时移动相对较快，所述的大分子被吸收到下文更为详述的载体基质上，同样也是移动到阳极，但是在无快速移动的阴离子的部分电场中移动。电场运动的上下文中，在快速移动的阴离子(即，它们更远离阳极)后面迁移的大分子可经历电泳浓度，随着快速移动阴离子迅速移动到阳极，阳极凝胶基质的快速移动离子的消耗放大了这种电泳浓度。

阳极凝胶基质唯一提供的阴离子化合物的作用也适合于与在阳极凝胶基质中相比，以显著降低的浓度存在于阴极凝胶基质中的阴离子化合物。本申请中所述的“显著降低的浓度”是指在电印迹系统或仪器的阴极凝胶基质中的阴离子缓冲化合物的浓度是阴极凝胶基质中的阴离子缓冲化合物的浓度的0.5倍或更小，0.2倍或更小，或0.1倍或更小。因此，在一个实施方案中，电印迹系统的阴极层和阳极层可包括相同的阴离子化合物，其中，阴极层和阳极层中化合物的浓度不同。

电印迹仪器、设备或系统的阳极凝胶基质含有，阴极凝胶基质不含有或以显著降低的含量含有的化合物可为缓冲化合物，其在电泳转移过程中，以阴离子的形式存在于电印迹系统中，在本申请中被称为“阴离子缓冲化合物”。阳极凝胶基质含有，阴极凝胶基质不含有(或在阴极凝胶基质中以显著降低的含量存在)的阴离子缓冲化合物相对于一些其它缓冲化合物，移动较快，包括如阴极凝胶基质中含有的其它的阴离子缓冲化合物。因此，在阳极凝胶基质中优选使用的阴离子缓冲化合物的选择部分取决于阴极凝胶基质中含有的阴离子化合物(如缓冲液)、阳极和阴极凝胶基质中的缓冲液pH值、阴离子缓冲化合物的pKa值。例如，电泳转移系统(于中性pH值附近进行电印迹)中的阳极凝胶基质所含有的阴离子缓冲化合物包括pKa为中性(pH为约6.0～约7.0)或在一些实施例为pH6.0～8.0，至少0.5log单位以下，例如，阴极凝胶基质含有的一种或多种缓冲化合物的pKa为约1log单位以下。

在一个实施方案中，电印迹系统的阳极凝胶基质可包括一种阴极凝胶基质中不存在的阴离子缓冲化合物，其中，阴离子化合物的pKa接近或低于中性或在中性或接近中性pH时作为阴离子存在。在一个实施方案中，该化合物可为生物缓冲液，其pKa小于约7.5，小于约7.2，在一些实施方案中，低于7.0，其中，该生物缓冲化合物在电泳过程中在溶液中形成离子。在特定的说明性方面，阴离子缓冲化合物的pKa小于7.5、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6或6.5。

可存在于阳极凝胶基质但不存在阴极凝胶基质中的阴离子化合物的非限制性实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、琥珀酸酯、柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸、马来酸、甲次砷酸盐、N-三(羟甲基)-2-乙磺酸(TES)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-牛磺酸(ACES)、哌嗪-N，N′-2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉)-2-羟基-丙磺酸(MOPSO)、N，N-双-(羟乙基)-2-牛磺酸(BES)或3-(N-吗啉)-丙磺酸(MOPS)。该阴离子缓冲化合物可在电印迹系统中使用，其中，阴极室中阴离子化合物的pKa值大于阳极室中的阳离子化合物的pKa值。在这些实施方案中，系统的阴极室可包括如，一种或多种：甘氨酸、N-2-羟基乙-哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-三-(羟甲基)甲基氨基)-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、3-(N，N-双[2-羟乙基]氨基)-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸(EPPS)、N-[双(羟甲基)-甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)、(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸(TAPS)和N-(1，1-二甲基-2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸(AMPSO)。

在一些实施方案中，阳极凝胶基质中存在的，阴极凝胶基质不存在(或在阴极凝胶基质中以显著降低的含量存在)的阴离子化合物是一种两性离子缓冲液，其pKa值接近或低于中性，如MES、MOPOS、BES、MOPS或ACES。在阳极凝胶基质中包括一种或多种这些缓冲液电印迹系统可选的，在阴极室中包括一种两性离子缓冲液，其pKa值接近或高于中性，如Tricine、Bicine、TAPS、TAPSO或AMPSO。

电印迹系统的阳极凝胶基质中存在的，阴极凝胶基质不存在(或在阴极凝胶基质中以显著降低的含量存在)的阴离子形成缓冲化合物一任意浓度存在，但典型地，阳极凝胶基质中存在的浓度为至少10mM，浓度为约10mM～约1M，浓度为约20mM～约500mM，在一些实施方案中，浓度为50mM～300mM。

电极

如上所述，在一些电印迹系统的实施方案中，阳极凝胶基体与阳极接触。在一些实施方案中，阳极连接到或与阳极凝胶基体的第二面并列，其中，阳极凝胶基体的第二面与接触蛋白质印迹膜的阳极凝胶基体的第一面相反。

阳极可包括任何适合的导电材料，可为任意形状，例如，阳极可为层状，包括非金属导电材料、线圈结构、包含非金属导电材料的网、金属箔、金属网和/或其任意组合。在特定实施方案中，电导电极可包括涂布有导电的金属或非金属的绝缘聚合物。涂布有导电材料的绝缘材料电极可为层状、网状或其他结构。电极还可包括一种或多种导电非金属材料，如石墨、碳、导电聚合物和或其任意组合。阳极可包括，例如导电聚合物、铂、不锈钢、碳、石墨、铝、铜、银或铅。使用电化学可电离的金属阳极使电泳转移发生在无氧排出的阳极，因为金属铜而不是水被优先电离。在一些实施方案中，阳极可包括一次性的铜电极。在其它的实施方案中，阳极可包括铝。在一些实施方案中，阳极可包括一次性的铝电极。

还有可能根据本发明的另一个实施方案，(使用各种不同的金属沉淀方法)在导电的基体上沉淀或涂布金属银(例如但不限于：铜网或栅条或碳或基于石墨的织物、或者甚至电导聚合物的薄层)。可用于将金属银涂布到该导电电极的方法可包括，如蒸汽淀积(CVD)方法、将电极浸在熔化的银中涂布银、电镀方法、用分散在适宜的粘度提高的组合物或制剂的银离子进行喷涂的方法、在水溶液或非水溶液中开展的化学沉淀法(如，将导电电极浸没于含有葡萄糖的含氨硝酸银溶液中，这在镀银制备镜子领域是公知的)等。因此，可使用任何适合的银涂布或沉淀或本领域公知的涂刷方法获得本发明的金属银涂布的电极。

在一个实施方案中，阴极凝胶基体与阴极接触。阴极可连接到或与阴极凝胶基体的第二面并列，其中，阴极凝胶基体的第二面与接触载体基质的阴极凝胶基体的第一面相反。阴极可包括任何适合的导电材料，可为任意形状，例如，阴极可为层状，包括非金属导电材料、包含非金属导电材料的网、金属箔、金属网和/或其任意组合。在特定实施方案中，电导电极可包括涂布有导电的金属或非金属的绝缘聚合物。涂布有导电材料的绝缘材料电极可为层状、网状或其他结构。电极还可包括一种或多种导电非金属材料，如石墨、碳、导电聚合物和或其任意组合。阴极可包括，例如导电聚合物、铂、不锈钢、碳、石墨、铝、铜、银或铅。在一些实施方案中，阴极可包括一次性的铜电极。在其它实施方案中，阴极可包括吸收电泳转移过程中产生的氢气的钯。在一些实施方案中，阴极可包括一次性的铝电极。

在一些实施方案中，阳极和阴极分别可与阳极凝胶基体和阴极凝胶基体的长度和宽度相同或相似。与凝胶基体并列或嵌入到凝胶基体的阳极或阴极的表面不需要连续；例如，电极可为线网或线圈结构。在该实施方案中，电极表面与凝胶基质接触或嵌入到凝胶基质可被认为是与凝胶基质并列的电极结构表面的外部尺寸定义。在一些实施方案中，与阳极凝胶基体并列的阳极表面接触至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的与阳极凝胶基质并列的阳极凝胶基质的面。与阳极凝胶基体并列的阳极表面的面积和与阳极凝胶基质并列的阳极凝胶基质的面的表面积基本相同。例如，对于通常的矩形、卵形或圆形电极和凝胶基体，阳极的长度和宽度为阳极凝胶基体的长度和宽度的20％以内，为阳极凝胶基体的长度和宽度的10％以内，如阳极凝胶基体的长度和宽度的5％以内，如阳极凝胶基体的长度和宽度的2％以内。在该实施方案中，阳极凝胶基体的长度和宽度可有利地与载体基质和电印迹的印迹膜的长度和宽度紧密符合或更大。

在一些实施方案中，与阴极凝胶基体并列的阴极表面接触至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的与阴极凝胶基质并列的阴极凝胶基质的面。与阴极凝胶基体并列的阴极表面的面积和与阴极凝胶基质并列的阴极凝胶基质的面的表面积基本相同。例如，对于通常的矩形、卵形或圆形电极和凝胶基体，阴极的长度和宽度为阴极凝胶基体的长度和宽度的20％以内，为阴极凝胶基体的长度和宽度的10％以内，如阴极凝胶基体的长度和宽度的5％以内，如阴极凝胶基体的长度和宽度的2％以内。在该实施方案中，阴极凝胶基体的长度和宽度可有利地与载体基质和电印迹的印迹膜的长度和宽度紧密符合或更大。

因此，在特定的实施方案中，系统含有与阳极凝胶基体接触的阳极和与阴极凝胶基体接触的阴极，其中阳极凝胶基质与蛋白质印迹膜的一面接触，其中阴极凝胶基质与载体基质的一面接触，其中载体基质的另一面与阳极凝胶基体和阳极上的蛋白质印迹膜。在一些实施方案中，阴极、阴极凝胶基体、阳极和阳极凝胶基体的长度和宽度相同或相近。

在一些实施方案中，阳极、阴极或两者作为电源或包含印迹层的设备不可或缺的部分(意味着每次印迹过程后不能被使用者分开)。在另一个实施方案中，阳极和阴极可从电源或设备中分离出来。例如，电极可为一次性电极，作为电极组件的一部分或从凝胶基体中分离出来。从凝胶体积中分离的电极可连接到电印迹设备，之后可将凝胶基体装入该设备，这样它接触电极或电极和凝胶基体可置于电极夹内，如托盘或保持架，其中，电极夹可连接到或装入电印迹设备。

在一些实施方案中，阳极、阴极或两者作为电极组件的一部分连接到凝胶基体，例如，阳极或阴极可使用紧固件或电极夹连接，将电极置于凝胶基体的反方向。在特定的实施方案中，阳极和阴极至少部分嵌入到阳极凝胶基质中。例如，凝胶基质可通过将未固化的凝胶组分倒在电极上或通过使用凝胶挤压技术制备凝胶基体，这样电极的至少一面被凝胶基质部分涂布或嵌入。在特定的实施方案中，在电泳转移之前或转移过程中，将凝胶基体置于塑料托盘中，方向与导电电极相反。至少塑料托盘的一个区域包含导电材料，用于电路连接电极和电源或电力源头的电接触。

重新回到图1A，电印迹系统可包括电源109、接触阳极105的第一个电接触110和接触阴极107的第二个电接触111。电源可具有在印迹过程中放置印迹层的基部。在一些实施方案中，阳极、阴极或两者与系统电源不可分割。在其它的实施方案中，阳极、阴极或两者可独立于但通过电学连接连接到电源上。电源109和电学连接110和111可进行设置，这样电流在顶层和底部层之间流通。

在一些实施方案中，印迹层100可包括置于如图1A所示的阳极和阴极组件之间的载体基质112。在一个实施方案中，最接近阳极层的载体基质112的表面可与阳极凝胶基质106并列，阳极凝胶基质106与连接到阳极105的表面相反，由此，这种并列通过如下详述的将印迹膜装入其中实现。同样，最接近阴极层的载体基质112的表面可与阴极凝胶基质108并列，阴极凝胶基质108与连接到阴极107的表面相反。这种构造确保了使用过程中电流在载体基质中的流动。目前预期的载体基质的尺寸可基本同上层和/或下层的尺寸相似。可选地，载体基质的尺寸可小于上层和/或下层的尺寸。

在一个实施方案中，载体基质的长度和宽度以与其并列的蛋白印迹膜的一面与载体基质的表面接触这样的方法进行选择。典型地，载体基质和蛋白印迹膜和/或凝胶基体的尺寸基本相似。在一个实施方案中，至少一面载体基质的长度的范围为约2～约25cm，约5～约20cm，约8～约15cm，约10～约12cm。

本申请所用的载体基质为层状，其厚度为约5mm，小于约3mm，小于约2mm，小于约1mm或小于约0.5mm。在一些非限制性实施方案中，载体基质的至少一面或两面可基本是光滑的。使用时，光滑的的载体基质表面与连接有生物分子样品的蛋白印迹膜的表面并列。这样做，基本可增加蛋白质从载体基质向蛋白质印迹膜的转移，降低了实验结果中获得“粒状”条带的像素化的可能性。

在一个实施方案中，载体基质层可由天然原料、合成原料或其组合的纤维或微纤维制成。适合在电印迹系统中使用的载体基质可由能吸收0.2～5ml，0.5～2.5ml，0.75～1.5ml的蛋白质或杂交水溶液或缓冲液的原料制成。在特定的非限制性实施方案中，载体基质可由具吸收性的原料制成，这种具吸收性的原料可以基本上可逆地吸收蛋白质或杂交水溶液，并且最小化内在的蛋白质耦合能力。任何具有这些特性的原料都可以不受限制地在本发明的实施中使用。理想的是，合适的载体基质有这种材料制成，当这种材料被浸没在大量的水溶液中时，在浸没到水溶液内的1min、2min、3min、5min或10min以内，释放至少约20％，至少约35％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％的吸收的蛋白质或杂交组合物到水溶液中的。这种检测对具有本领域的公知常识的从业人员为技术水平之内的，这样的从业人员无需过多的试验即可进行操作。例如，检测受试的原料是否适合用于本发明实施方案的的载体基质，本领域技术人员可在受试原料上吸收公知量的蛋白质或杂交溶液(含有可理解测量的蛋白质，如BSA、IgG、酪蛋白、肌动蛋白、GAPDH等)，并且将受试原料浸没于公知体积的缓冲水溶液(如PBS)。一段时间过后，收集缓冲水溶液中的样品，测定从受试原料中释放出的蛋白质的量(如ELISA、定量蛋白质印迹或其他相似的技术)。可选的，适宜的载体基质可由这样的原料制成，这种原料可在浸没到水溶液内的1min、2min、3min、5min或10min以内，在膜上通至少20V、至少15V、至少10V、至少5V或至少3V，释放至少约20％，至少约35％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％或至少约95％的吸收的蛋白质或杂交组合物。

以非限制性的实例方式，适宜在制备本发明的载体基质层中使用的原料的实例可包括聚酯纤维、聚碳酸酯纤维、玻璃微纤维、亲水纤维素纤维、醋酯纤维、羟基化的聚酰胺纤维(例如，LOPRODYNE聚醚砜纤维、丙烯酸的共聚物纤维、混合的纤维素酯纤维、改性四氟乙烯(PTFE)、滤纸、毛毡或其组合物或混合物。

在一些实施方案中，载体基质可包括一层或多层印迹纸。在一个实施方案中，载体基质可包括一层或多层印滤纸(如WHATMAN

滤纸)。在一个实施方案中，载体基质可包括一层或多层合成微纤维。在这种层中使用的合成微纤维可包括聚酯微纤维、聚酰胺微纤维或聚酯微纤维和聚酰胺微纤维的混合物。适宜本发明目的典型的聚酯微纤维/聚酰胺微纤维层可通过从Sadovsky Houshold products，Ltd.Ashdod，Israel市售获得。

回到图1A中，印迹层的一个实施方案中可进一步包含一个可选的第二个载体基质113。第二个载体基质113同载体基质112的尺寸、性状和组成基本相同。在一些实施方案中，第二个载体基质113可同时与载体基质112组装于印迹层110中。例如，载体基质112可最接近底部层，第二个载体基质113可最接近所示的顶层。

在可选的实施方案中，载体基质112和第二个载体基质113可连续地并入层110内。例如，载体基质112可首先在层110中使用。通电流以后，在其上吸收电泳转移的蛋白质(如封闭液和至少一种初级抗体)完成后，弃掉载体基质112，并用其上吸收了不同蛋白质(如，可选的封闭液和二级抗体)的第二个载体基质113替换。

现在来看图1B，所示的是电印迹系统的可选的实施方案。在这个实施方案中，电印迹系统可包括托盘115。将托盘115的尺寸做成能接受一个或多个层110组件，如底部层102。托盘115可为一次性的塑料托盘。

电印迹系统可包括蛋白质印迹膜116，由电印迹系统的使用者提供。在一个实施方案中，膜116可与载体基质112和113的尺寸基本相同。在一个实施方案中，膜116的尺寸可小于载体基质112和113。在一个实施方案中，膜116可与凝胶基体106和108的尺寸基本相同。在一个实施方案中，膜116的尺寸可小于凝胶基体106和108的尺寸。膜116可有任意原料制成，这种原料可使生物分子样品的分子组分固定在其上面。作为非限制性实例，膜116可包括纸、基于纤维素的印迹膜(如，但不限于硝酸纤维素或醋酸纤维素)、基于硝酸纤维素(NC)的膜、基于聚酰胺的膜、或基于聚偏二氟乙烯(PVDF)的膜或这些膜的激活或衍生版本(表面带电荷的衍生物)或其组合物或混合物。

图1B所示的膜116包括第一个面117和第二个面118。在一些实施方案中，膜116可包括在使用本发明的电印迹系统前耦合到其一面(如面117)上的生物分子样品119。样品119可包括蛋白质、核酸(如DNA或RNA)、碳水化合物、脂类或其任意组合物或混合物。样品119可进行衍生，例如来自于细胞或组织裂解液或其他生物样品，如血清，可为生物分子的复杂的混合物，或可为纯化后的或部分纯化后的。

在一些实施方案中，可在耦合到膜116之前，通过电泳(如SDS-PAGE、琼脂凝胶电泳等)将样品119的组分进行分离。可使用任意本领域认可的技术将样品119耦合到膜116中。这种技术也可被本领域称为“电泳转移”或更为简洁“转移”。各种转移技术，包括湿法、干法或半干法转移技术，都是本领域公知的。适合本发明使用的转移方法的实例，但不限于如描述于题为“Protein Blotting：Areview″by B.T.Kurien and R.H.Scofield published in J.ofImmunological methods，Vol.274，pp.1-15(2003)”的综述文章，在美国专利5,482,613、5,445,723、5,356,772、4,889,606、4,840,714、5,013,420和美国公开的申请2002157953中描述各种蛋白质印迹方法包括湿法、干法或半干法电印迹方法，在美国公开的申请20060278531和20060272946中描述了用于印迹凝胶的干法电印迹系统和其使用方法，其中，该系统包括电印迹转移层。上面所列的参考文献在此明确地以引文的形式全部并入本申请，尽管在此充分公开。其它本领域技术人员公知的用于将生物分子样品耦合到固体膜支持物的方法包括但不限于斑点印迹、点样、真空转移和毛细管转移。

回到图1B，膜116可置于上层102和载体基质112/113之间，这样其面118基本同凝胶基体106并列，并且其面117和样品119基本同所示的载体基质并列。

现在来看图1C，所示的为本发明的电印迹提供的一个实施方案。这个实施方案合并了图1A和1B所示的实施方案的改进，除了去除了托盘115。在这个实施方案中，组装包含阳极105和底部层102的阳极凝胶基质106、阴极107和顶层104的阴极凝胶基质108、载体基质112和113和膜116的印迹层100，并且将其零件按照上面详细描述的进行适当的并列，并且在此也一并纳入。

在一个实施方案中，电印迹系统可包括具有顶部121和底部122的外壳120。在一些实施方案中，顶部121可通过电偶联111耦合到电源109，并且底部122可通过电偶联110耦合到电源109，因此，可使电流通过外壳的顶部和底部。任何适合的外壳可用于该实施方案的实施。特别适宜实施本发明的外壳的实例为IBLOT^TM系统(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)，描述于美国公开的专利申请20060278531和20060272946。在一个实施方案中，外壳120的尺寸为可使层100在组装时位于顶部121和底部122之间。在一个实施方案中，阴极107、阳极109或阴极107和阳极109分别与顶部121和底部122电路流通，这样，可使使用者在阳极和阴极之间通电。

在一个实施方案中，电印迹系统可选地包括海绵123。海绵123可为一次性的或可多次使用的。在一个可选的实施方案中，海绵123可被一张或多张纸替换。使本发明不受任何特殊的理论或机理限制，海绵123可包括在系统内用来吸收外来的液体，这种液体是在外壳120组装后，使用过程中给印迹层施加压力130使产生的。另外，海绵123还可用来在指示方向上增加压力130，这样有助于确保所有并列的表面在使用中保持恒定和/或甚至接触。在一个实施方案中，海绵123可包括夹子124。在一个非限制性实例中，夹子124可与至少两个与其相反的表面并列，并且通过中心部125连接。在另一个实施方案中，夹子124可通过整个海绵123的主体。夹子124可全部或部分的由任意导电原料制成，如金、铜、银、铝、其合金、不锈钢或导电聚合物或聚合物图层，这样可确保在外壳顶部、阴极、印迹层、阳极和外壳底部在使用中是电路连通的。

实施电增强的分析物检测的方法

现在已经描述了电印迹系统的组分以及在使用中彼此之间是如何组装的，现在将根据各种实施方案来描述使用这个系统来实施印迹程序的方法。

应当注意，尽管接下来对使用目前的电印迹系统的实施方案的描述会提及各个实施过程中的步骤，一种或多种的替换方法或步骤同样是可能的，这对于本领域技术人员应当显而易见的，这些替换方法或步骤都包括在本发明公开的范围内。应当注意，无法详细描述任意一种或多种替换方法并不排除落在本发明保护范围内的方法的包含物，只要这些方法落在目前描述的方法的总体精神和范围内，并使用一种或多种本发明公开的系统、方法或仪器，如对于本领域技术人员来说显而易见的属于本发明的系统、方法或仪器。例如，尽管没有描述的步骤以确定的顺序出现，但本领域技术人员可根据具体的上下文，可轻易的识别那些步骤中的特定的步骤，不按照下面详述的顺序也可以完成。作为非限制性实例，某些情况下，母液，稀释的抗体，漂洗液等可在操作之前制备，在后面的步骤中使用。另外，还可以增加另外的一个或多个漂洗步骤、消脱泡步骤、封闭步骤等，尽管下面没有进行详细的论述，但这些都落在本发明的范围内。

回到图2，根据一个实施方案，概述完成电印迹过程的方法。为完成电印迹过程，使用可取一张生物分子样品已经耦合其表面上的蛋白质印迹膜。典型的，制备样品并通过电泳进行分离(如SDS-PAGE)，之后将分离的分子转移或固定到合适的固体支持物上。合适的膜如上所述。使用者还可取具有如上所述的阳极和阳极凝胶基体较低配置。可将蛋白质膜置于该较低配置上，这样没有生物分子样品的膜的一面与阳极凝胶基体的表面并列，与阳极相反，如图1C所示。可选的，去除气泡的步骤可用于去除蛋白质印迹膜和阳极凝胶基质之间的任何气泡。

在一个实施方案中，印迹缓冲液典型地包括稀释剂。稀释剂可由使用者在使用前制备，通常可市售或作为试剂盒的一部分与本发明系统的各种部件一起提供。稀释剂可包括一种生理上可接受的水溶液，pH值为约4～约9，或约5～约8，或约6～约7.5，并且通常还含有至少一种缓冲剂，如磷酸盐缓冲液、重碳酸盐、TAPS、Bicine、Tris、Bis-Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、甲次砷酸盐、MES、醋酸盐、ADA、ACES、乙醇胺、BES、乙酰胺基甘氨酸或glycinaide。适合用于稀释的缓冲液的实例包括但不限于，如PBS、Hank’s溶液、TBS、TE、TEN等。可选地，稀释剂可包括去垢剂。适合的去垢剂可包括非离子型、非变性去垢剂，如Triton X-100、Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij 58、Tween-20、Tween-80、辛基葡糖苷和辛基硫代葡糖苷。稀释剂可含有约0.01～约5vol％，约0.05vol％～约2vol.％，约0.1vol％t～约1.5vol.％，或约0.5vol％～约1vol.％适当的洗涤剂。在通常的步骤中，使用者可制备足够的印迹缓冲液以吸附到载体基质上。足量的印迹缓冲液能足以浸泡载体基质。通常使用者应制备至少1ml，至少2ml，至少5ml，至少10ml，或至少20ml适当的印迹缓冲液。这个体积可用于该程序中的一个或多个步骤。

回到图2A，印迹缓冲液可包括一种或多种封闭试剂。封闭试剂用于在使用一种或多种一级抗体或一种或多种二级抗体检测之前，封闭蛋白质印迹膜上的非特异性位点。封闭剂可分散或溶解于上述的稀释液中。封闭剂可由使用者制备，并在电印迹系统应用之前将其加入印迹缓冲液。或者封闭试剂的原剂(stock preparation)可由使用者预先制备并在使用之前立即加入到稀释液或印迹缓冲液中。封闭试剂的原剂可为蛋白质印迹程序中通常所用浓度的，例如高达20X、高达10X、高达5X、高达2X或高达1.5X。原液可由任何适合的缓冲体系制备。或者，封闭试剂可作为稀释剂的一种组分提供并作为电印迹试剂盒的一部分市售。

任何适合的封闭试剂可以不受限制，用于本发明所述的电印迹系统。本领域已知多种适合的封闭剂，其包括，但不限于，全血清、分离的血清(fractionated serum)、牛血清白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、不含脂肪牛奶、明胶、鱼血清、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、鼠免疫球蛋白、马免疫球蛋白、人免疫球蛋白、猪免疫球蛋白、鸡免疫球蛋白、乳清蛋白，大米蛋白、海藻蛋白或合成封闭剂，例如那些来自例如BioFX Laboratories，Kem-En-Tec Diagnosticsor GeneWay Biotech.市售获得的那些。在本领域中，可获得许多可市购获得的预制备的封闭试剂，全部可用于本发明的系统和方法。这些商购的封闭剂包括，但不限于，WesternBreeze，I-BLOCK，BlockIt，PerfectBlock，合成的封闭缓冲液(BioFX Labs)，Gelantis BetterBlock，SeaBlock，Starting Block和无蛋白封闭缓冲液(Pierce)。在一个实施方案中，印迹缓冲液中存在的封闭试剂的量可在约0.1wt.％-约50wt.％，约1wt.％-约40wt.％，约2.5wt.％-约25wt.％，约5wt.％-约15wt.％或约10wt％。在一个实施方案中，印迹缓冲液中存在的封闭试剂的量可高达约75mg/ml，高达约50mg/ml，高达约40mg/ml，高达约30mg/ml，高达约20mg/ml，高达约15mg/ml，高达约10mg/ml高达约5mg/ml，高达约2.5mg/ml，高达约1mg/ml，高达约0.5mg/ml，高达约0.25mg/ml或高达约0.1mg/ml。

在一个实施方案中，适当的封闭试剂可含有固有的负电荷。具有固有的负电荷可确保应用过程中封闭剂从载体基质迁移到蛋白质印迹膜的表面。已知许多封闭试剂具有固有的负电荷，本领域具有一般知识的实施者可以很好地确定这样的封闭剂。有经验的实施者可采用一种示例性但非限制性的方法确定一种特定的封闭剂是否具有适当足够的固有的负电荷，这样可使封闭剂在膜上电泳，所使用的本发明的系统、方法和试剂盒列于表3并在下文进行了详细讨论。或者，可对蛋白封闭试剂进行改造使其带上负电荷。这些可通过实施例，通过将多个带负电荷的氨基酸整合到蛋白的多肽序列中实现。可使用多种重组DNA技术将带负电荷的氨基酸整合到特点蛋白中，这些技术均在本领域具有一般知识的实施者的知识水平之内。

在一个实施方案中，印迹缓冲液可包括在适当稀释液中的一级抗体。在一个实施方案中，印迹缓冲液可包括上述的和整合得到的封闭试剂，和一级抗体。印迹缓冲液中的的一级抗体的浓度当然可根据所用的特异性一级抗体、使用抗体的环境、抗体的各种其它固有特性发生改变。通常，以及抗体的浓度为1∶10-1∶20,000，1∶100-1∶15,000，1∶1,000-1∶10,000或1∶1,500-1∶5,000。

一级抗体可为用户定义型抗体。抗体可针对使用者限定的抗原。抗体可商购获得或可由使用者制得。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体可来自(raised)小鼠或大鼠。多克隆抗体可为IgG(IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3)，IgM，IgA，IgD和IgE亚类。多克隆抗体可来自兔，小鼠，大鼠，仓鼠，绵羊，山羊，马，驴，鸡。在一个实施方案中，抗体可来自于人人血清。人抗体可被至少部分或全部纯化。制备和纯化抗体的方法在本领域中是公知的。制备和应用各种抗体制剂的一般性指导可在例如参考文献Harlow等，1989，Antibodies∶A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，Harlow et al.，1999，Using Antibodies∶A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，and Harlow，et al.，1988，In∶Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中找到，这些文献全部以参阅的方式并入本文。

在一些实施方案中，一级抗体可为“内参抗体”。该内参抗体可由使用者提供或可商购获得，可作为本发明系统(即，例如下面详述的试剂盒)的一部分。可用的或供本发明系统和方法使用的示例性但非限制性的内参抗体可包括靶向肌动蛋白、微管蛋白、组蛋白、波形蛋白、核纤层蛋白、GAPDH、VDAC1、COXIV、hsp-70、hsp-90或TBP的抗体。

在一个实施方案中，印迹缓冲液可包括在适当稀释液中的二级抗体。二级抗体可与检测工具耦合。当然，对本领域技术人员显而易见地是，什么构成了适当的二级抗体取决于上述步骤所用的一种或多种一级抗体的类别(identity)。可挑选二级抗体与至少部分一级抗体耦合。选择适合的抗体还取决于用来检测后续步骤信号的方法。如果研究者使用化学发光技术检测分析物，则合适的二级抗体可与过氧化物酶或碱性磷酸酶耦合。如果研究者使用显色技术检测分析物，则合适的二级抗体可与碱性磷酸酶或过氧化物酶耦合。如果研究者使用荧光技术检测分析物，则合适的二级抗体可与荧光团耦合。任选地，二级抗体可与一种或多种生物素部分耦合，检测分子(例如过氧化物酶、磷酸盐、荧光团等)可与亲和素耦合。采用生物素/生物素蛋白体系可在某些情况下增大弱检测信号。通常，二级抗体的浓度应为1∶10-1∶20,000，1∶100-1∶15,000，1∶1,000-1∶10,000或1∶1,500-1∶5,000。

适用于本发明的系统和方法的二级抗体可来自于，例如兔，小鼠，大鼠，仓鼠，猪，绵羊，山羊，马，驴，火鸡和鸡。二级抗体通常来自于与一级抗体的来源不同的物种。产生的二级抗体应能识别并与一部分一级抗体耦合。二级抗体可被至少部分亲和纯化。二级抗体可靶向小鼠IgG，小鼠IgA，小鼠IgM，大鼠IgG，大鼠IgA，大鼠IgM，兔IgG，兔IgA，兔IgM，仓鼠IgG，仓鼠IgA，仓鼠IgM，山羊IgG，山羊IgA，山羊IgM，马IgG，马IgA，马IgM，绵羊IgG，绵羊IgA，绵羊IgM，猴IgG，猴IgA，猴IgM，鸡IgG，鸡IgA，鸡IgM，鸡IgY，人IgG，人IgA，或人IgM。二级抗体可与一个或多个检测分子例如，通过实施例，如上所述的碱性磷酸酶、过氧化物酶、生物素、荧光团或Qdot纳米晶体耦合。

在一个实施方案中，印迹缓冲液可包括上述的并入本文的封闭试剂和一级抗体和二级抗体。一级抗体和二级抗体的浓度可为1∶10-1∶20,000，1∶100-1∶15,000，1∶1,000-1∶10,000或1∶1,500-1∶5,000，尽管可以使用的不同浓度取决于最终使用者选定的用于本发明的系统和方法的抗体的类别和性质。

在一个替代实施方案中，当使用的二级抗体为生物素化的抗体时，印迹缓冲液可包括过氧化物酶或磷酸酶耦合的亲和素/链霉亲和素。通常，印迹缓冲液中的过氧化物酶或磷酸酶耦合的亲和素/链霉亲和素的浓度为1∶10-1∶20,000，1∶100-1∶15,000，1∶1,000-1∶10,000或1∶1,500-1∶5,000。

现在回到图2A，含有封闭剂的印迹缓冲液、一级抗体、二级抗体，或一级抗体和二级抗体可吸附到上述的载体基质上。吸附到载体基质上的适当体积的印迹缓冲液应为足够体积，以使载体基质的整个基体基本浸没在印迹缓冲液中，但不应过饱和，以致造成过量的缓冲液从载体基质中渗漏出去。构成足够体积印迹缓冲液实现这种效果的材料当然可根据目标基质的尺寸、厚度和容量进行变化。通常，这个体积为约1ml，高达约1.5ml，高达约2ml，高达约2.5ml，高达约4ml，高达约6ml，高达约8ml，或高达约10ml印迹缓冲液。为了实现该目的，可将载体基质置于合适的容器中(例如适当形状和大小的有盖培养皿以容纳载体基质)，含有封闭剂的印迹缓冲液，一级抗体、二级抗体或其各种组合可直接吸附到基质上。然后将浸透的载体基质放置于印迹膜顶部，使得耦合有生物分子样品的印迹膜的表面与浸透的载体基质实质接触。任选地可进行上述的脱泡步骤。

在一个实施方案中，置于印迹膜上的载体基质可含有吸附于其上的封闭剂、一级抗体和二级抗体。

在一个替代的实施方案中，载体基质可含有吸附于其上的封闭剂，可制备其上吸附有一级抗体的第二载体基质并置于第一载体基质的上方。

在另一个替代的实施方案中，载体基质上可吸附有封闭试剂和一级抗体，可制备其上吸附有二级抗体的第二载体基质并置于第一载体基质的上方。

在又一个替代的实施方案中，载体基质上可吸附有封闭试剂。可制备其上吸附有一级抗体的第二载体基质并置于第一载体基质的上方。可制备其上吸附有二级抗体的第三载体基质并置于第二载体基质的上方。

当上述的说明提及“一级抗体”和“二级抗体”时，本领域的技术人员容易理解一种以上的一级抗体的应用和一种以上的二级抗体的应用也同样包括在内，且该应用也落在本发明实施方案的实践范畴内。通过实施例，印迹缓冲液可被制得并可含有多种一级抗体。一种或多种一级抗体可为内参抗体，可全部靶向用户确定的抗原。这些实施方案详细说明如下。

回到图2A，使用者可获得具有印迹凝胶基体和与之耦合的电极的的上部组件。该上部组件可置于一个或多个基质之上，使得阴极凝胶基质的表面与载体基质的表面实质接触。上部组件或其一部分可与外壳时一体的或与外壳分开。使用者根据图1C的描绘，组装其余的部件并施加电流，使电流从阴极和阳极之间通过。可施加电流长达约20分钟，长达约15分钟，长达约10分钟，长达约5分钟，或长达约3分钟.施加的电流可为多达约25V，多达约20V，多达约15V，多达约10V，多达约5V分钟，或多达约3V分钟。给系统施加电流可导致至少部分蛋白质或杂交组合物(例如封闭试剂、一级抗体和二级抗体)从一个或多个载体基质迁移至蛋白质印迹膜，其中可能发生适当抗原-抗体的耦合反应。

当终止电流时，可拆开系统，回收蛋白质印迹膜并进行至少一个洗涤步骤。洗涤步骤的进行通常是为了除去任何多余的二级抗体，从而提高下游采集数据的信噪比。可将膜浸在至少2ml，至少5ml，至少10ml，或至少20ml适当的缓冲液(例如上文所述的和本文纳入的缓冲体系之一)中，任选缓冲液中存在洗涤剂。每个洗涤步骤通常进行至少1min，至少2min，至少5min，或至少10min，但是或长或短的洗涤也是允许的。在通常的步骤中，进行三次5分钟洗涤。

在洗涤步骤之后，是蛋白印迹膜检测步骤。当然适合的检测方法取决于所用二抗的类别和性质，这对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，如果将二抗与过氧化物酶耦合，增强的化学发光(ECL)可用于检测测试抗原的存在。ECL是一种生物学中用于各种检测试验的人工识别技术。辣根过氧化物酶(HRP)连接在目标分子上(通常通过标记特异识别该分子的免疫球蛋白)。然后该酶复合物将靠近该目标分子的ECL底物转化为致敏试剂，其被氢过氧化物酶进一步氧化，生成三(激发态的)羰基，当其衰变为单羰基时发光。ECL能够检测到微量抗原。能够检测到飞克量以下的蛋白，低于大部分检测系统的检测限。

在图2B中，描述了根据另一个实施方案进行电印迹的方法。该实施方案不同于图2A中所示的实施方案，如上所述，不同之处在于之前的实施方案是在一个步骤中进行的，即，一抗和二抗都使用一个或多个载体基质，然后组装成上述系统。给系统施加电流，使一抗和二抗从载体基质迁移至蛋白印迹膜上，如果印迹膜的表面上存在有抗原至少一抗与靶抗原耦合，二抗与一抗耦合。根据下述的另一个实施方案，进行的电印迹程序至少为两个步骤。例如，将一抗用于载体基质，然后组装成上述系统。施加电压，一抗与蛋白印迹膜表面上的靶标耦合。然后，去掉载体基质，将二抗用于第二载体基质，其组装成系统，施加电压，使二抗迁移至蛋白印迹膜的表面上，与相应的一抗耦合。需注意的是，在该实施方案中，所有的试剂、溶液、成分、体积和浓度与单一步骤中具体提及的相一致，所不同的是所述成分的使用顺序以及完成程序所采用步骤的数量。

进行两步电印迹程序时，使用者需获得表面耦合有生物分子样品的蛋白印迹膜。一般地，获得样品并用电泳分解(例如，SDS-PAGE)，然后将分解的分子转移至或固定于适合的固体支持物上。适合的膜如上所述。使用者还能够获得具有上述阳极和阳极凝胶基体(anodic gelmatrix body)的下部组件(lower assembly)。蛋白印迹膜可置于该下部组件上，使不含生物分子样品的膜表面与相反于阳极的阳极凝胶基体表面并列放置，如图1C所示。采用任意的脱泡步骤，去掉蛋白印迹膜和阳极凝胶基体之间的气泡。

在一个实施方案中，使用者需制备第一印迹缓冲液。第一印迹缓冲液可包括适合的稀释剂、封闭剂和一抗。

第一印迹缓冲液可被吸收至上述第一载体基质上，然后将载体基质置于蛋白印迹膜上，使耦合有生物分子样品的膜表面与浸泡的第一载体基质并列放置。采用任意的脱泡步骤，去掉浸泡的载体基质和蛋白印迹膜之间的气泡。

在图2B中，使用者可获得带有阴极凝胶基体(cathodic gel matrixbody)及其所耦合的电极的上部组件(upper assembly)。将所述上部组件置于第一载体基质上，使阴极凝胶基质的表面基本上与载体基质的表面接触。使用者组装如图1C中所示的系统的其余成分并施加电流，使电流通过阴极和阳极。可施加电压高达约20分钟，高达约15分钟，高达约10分钟，高达约5分钟或高达约3分钟。施加的电压可高达约25V，高达约15V，高达约10V，高达约5V或高达约3V。施加电流可引起至少一部分蛋白的或杂交组合物(例如，封闭剂和一抗或核酸探针)从第一载体基质迁移至蛋白印迹膜上，发生正确的抗原-抗体耦合反应。

当通电结束时，至少部分地拆卸系统，回收并去掉至少部分用尽的第一载体基质。保留剩余成分，用于下一轮电印迹。在这一点上，使用者需获得第二载体基质。第二载体基质的性质、组成和大小应与上述相一致并参考于此。

在一个实施方案中，使用者需制备第二印迹缓冲液。第二印迹缓冲液可包括适合的稀释剂、二抗和任选的封闭剂。第二印迹缓冲液可被吸收至上述第二载体基质上，然后将第二载体基质置于蛋白印迹膜上，使耦合有生物分子样品的膜表面与浸泡的第二载体基质并列放置。采用任意的脱泡步骤，去掉浸泡的第二载体基质和蛋白印迹膜之间的气泡。

在一个实施方案中，将带有阴极凝胶基体和耦合有电极的上部组件置于第二载体基质上，使阴极凝胶基质的表面基本上与第二载体基质的表面接触。。使用者组装如图1C中所示的系统的其余成分并施加电压，使电流通过阴极和阳极。可施加电压高达约20分钟，高达约15分钟，高达约10分钟，高达约5分钟或高达约3分钟。施加的电压可高达约25V，高达约15V，高达约10V，高达约5V或高达约3V。施加电流可引起至少一部分蛋白的或杂交组合物(例如，二抗或核酸探针和任选的封闭剂)从第二载体基质迁移至蛋白印迹膜上，使二抗与耦合了抗原的一抗相耦合。

当通电结束时，拆卸系统，回收蛋白印迹膜并进行至少一步洗涤步骤。一般进行洗涤步骤是为了去掉未耦合的二抗，由此提高下游采集数据的信噪比(signalto-noise ratio)。在任选的去污剂存在的条件下，将膜浸于至少2ml，至少10ml或至少20ml的适合的缓冲液(例如，上述的一种缓冲液系统并参考于此)中。一般每步洗涤至少1分钟，至少2分钟，至少5分钟或至少10分钟，洗涤更长或更短的时间是允许的。在一般的第二步程序中，采用三次5分钟洗涤。洗涤步骤之后，进行上述检测步骤并参考于此。

用于电印迹的试剂盒：

在另一方面，本文提供用于电印迹的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可包括至少第一适合的容器(container)，至少包括一种含有用于电泳的离子源的凝胶基体和至少一种印迹膜。凝胶基体可含有上述组合物，优选含有离子源缓冲液。试剂盒中提供的凝胶基体和印迹膜的长度和宽度相同或几乎相同，如其长度和宽度是另一个的＜10％，＜5％或＜2％。

在另一个实施方案中，试剂盒中可包括至少第一适合的容器，至少一种阳极凝胶基体和至少一种阴极凝胶基体，其中阳极凝胶基质包括至少一种不存在于阴极凝胶基质中或以极少的量存在于阴极凝胶基质中的阳极缓冲液化合物。如前面部分所述，阳极缓冲液化合物优选pKa为中性或接近中性的缓冲液化合物。优选地，阳极凝胶基质和阴极凝胶基质都含有缓冲液离子源，阴极室(compartment)含有不存在于(或以极少量存在于)阳极室中的缓冲液化合物，其中阴极缓冲液化合物具有比阳极室中的缓冲液高至少约0.5log单位，如高约1log单位的pKa，其中，阳极室缓冲液形成高于中性pH的阳极。

在另一个实施方案中，试剂盒可包括至少第一适合的容器，至少一种阳极凝胶基体和至少一种阴极凝胶基体，其中，阴极凝胶基质或阳极凝胶基质之一可含有离子交换基质。

阳极凝胶基体和阴极凝胶基体可由密封包装试剂盒提供。电印迹凝胶基质试剂盒还可任选进一步包括至少一种印迹膜，至少一层滤纸，至少一种海绵体(例如，一次性海绵和/或至少一个电极)。印迹膜可与凝胶基体一起提供或分别提供。

在一个实施方案中，试剂盒可包括至少第一适合的容器，多种阳极凝胶基体和阴极凝胶基体。在一些实施方案中，试剂盒可含有约1～约50种阳极凝胶基体和阴极凝胶基体。在一些实施方案中，试剂盒可含有约5～约20种阳极凝胶基体和阴极凝胶基体。在一些实施方案中，试剂盒可含有约8～约15种阳极凝胶基体和阴极凝胶基体。在一些实施方案中，试剂盒可含有约10～约12种阳极凝胶基体和阴极凝胶基体。

在另一方面，本发明试剂盒提供一种或多种一次性阳极组件和/或一种或多种一次性阴极组件。在一些实施方案中，一种或多种阳极组件可包括含有离子源的胶体和胶基质带有的电极。在一些实施方案中，一种或多种阴极组件可包括含有离子源的胶体和胶基质带有的电极。

在一些实施方案中，试剂盒中提供的阴极组件，其与阴极凝胶基体并列的表面，与并列的阴极凝胶基质一侧接触至少50％、至少60％，更优选至少70％，至少80％或至少90^％。在优选的实施方案中，试剂盒中提供的阴极组件，其与阴极凝胶基体并列的表面，与并列的阴极凝胶基体一侧的长度和宽度在＜20％，＜10％，＜5％或＜2％。在示例实施方案中，阴极和阴极凝胶基体一般为直角(rectangular)。

在一个实施方案中，试剂盒可含有许多阳极组件和阴极组件。在一些实施方案中，试剂盒可含有1～约50个阳极和阴极组件。在一些实施方案中，试剂盒可含有约5～约20个阳极和阴极组件。在一些实施方案中，试剂盒可含有约8～约15个阳极和阴极组件。在一些实施方案中，试剂盒可含有约10～约12个阳极和阴极组件。

在一个实施方案中，每个阳极组件和/或阴极组件可由托盘提供，如下述塑料托盘。

阳极和/或阴极凝胶基体，阳极和/或阴极组件或阳极和/或阴极可一起包含于密封的包装中，或分别包装。此外，多个阳极和/或阴极可一起包含于包装中。在特定的实施方案中，许多阳极组件或阳极凝胶基质可参考一起作为底部消耗品，许多阴极组件或阴极凝胶基质可参考一起作为顶部消耗品。

在一些方面，电印迹试剂盒包括一种或多种一次性阳极组件和一种或多种一次性阴极组件。在一些方面，电印迹试剂盒包括一种或多种一次性阳极组件和至少一种阴极凝胶基体。试剂盒可任意包括一种或多种载体基质、滤纸层或海绵体。

在一个实施方案中，试剂盒可含有一种或多种载体基质。所述载体基质可以是层的形式，所述层与阳极组件、阴极组件或阳极和阴极组件并列。本发明提供的适于试剂盒中载体层的性质和组成如上所述并参考于此。

在一个实施方案中，试剂盒提供的载体基质层的大小至少与阳极组件和阴极组件一样大，或比它们小。在一个实施方案中，载体基质层的一侧可以是约1cm～约50cm，约5cm～约20cm，约8cm～约15cm或约10cm～约12cm。根据一些实施方案提供的载体基质层的厚度，可以是≤约5mm，≤约4mm，≤约3mm，≤约2mm，≤约1mm，≤约0.5mm或≤约0.25mm。

在一个实施方案中，每个试剂盒可供给终端使用者至少一种载体基质。一般地，试剂盒中可供给本发明所述的许多载体基质。在一些实施方案中，试剂盒可含有1～约50个载体基质层。在一些实施方案中，试剂盒可含有约5～约25个载体基质层。在一些实施方案中，试剂盒可含有约10～约15个载体基质层。在一些实施方案中，试剂盒可含有约10～约12个载体基质层。

在一些实施方案中，载体基质层可由阳极组件和阴极组件分别包装。一组载体基质可作为单元一起包装于单一包装中。在一个实施方案中，每个载体基质可分别包装，进一步地，每个分别包装的载体基质与许多其它分别包装的载体基质作为一个单元包装。在一个实施方案中，一种或多种载体基质可与阳极组件一起包装。在一个实施方案中，一种或多种载体基质可与阴极组件一起包装。

在一些实施方案中，试剂盒还可分别提供一种或多种电极。电极可由密封的容器中提供，在特定的实施方案中，还含有干燥剂或抗腐蚀剂。电极可包装于液体或凝胶中，如含有一种或多种防腐剂、还原剂或抗腐蚀剂的醇或溶液或凝胶。提供电极，如一次性电极的试剂盒，还可含有一种或多种凝胶基质，一种或多种印迹膜或一种或多种滤纸层。

任意包括一种或多种载体基质的试剂盒的阳极和/或阴极组件，可分别包装于本领域已知的适合的不透气和水的包装纸(或任何其它适合的容器类型)中，使电极组件的保藏期延长，不至干燥。例如，包装纸或容器可由基于层或箔片的适合的薄的，不透气和水的塑料或聚合物制成，在其中包装电极后，采用本领域已知的(如，但不限于粘合或解除热封等)任意适合的包装纸密封方法进行密封。试剂盒中提供的印迹膜可单独包装或包装于含有电极组件的包装中。

因此，应理解本领域技术人员可耦合本发明的各种不同电极组件的不同组合和亚组合(sub-combinations)，形成许多不同类型的试剂盒。根据用途，吸试剂盒可含有或不含本领域已知的不同染剂和/或染色释放金属(例如，含上述电极组件的阳极银)。近似的凝胶浓度和组成以及交联度可根据印迹的种类而不同。

此外，各种可行的试剂盒部位的大小，如不同类型的电极组件和/或印迹膜，可被改良或改进用于待印迹凝胶的特定大小，这对本领域技术人员而言是显而易见的。

包含于包装纸内的还可以是适合的浅的由塑料或其它适合的材料制成的无盖托盘(open tray)(未示出)。该托盘大小适于盛放其中的载体基质或电极组件以保护所述成分在处理过程中免受机械损坏，使用时打开包装之后，易于处理和操作所述成分。另外，当施用印迹缓冲液时，托盘可用于盛放所述载体基质，如上面详细的描述并参考于此。托盘上方还可用防渗(fluid-impermeable)塑料或箔片(或箔片支持的塑料)密封，可去掉上方的塑料或箔层，露出电极供使用。电极组件(例如，阴极组件)可从托盘中移出使用，或电极组件可在电印迹过程中保持原位。

支持托盘可以是符合电极组件或载体基质形状的矩形托盘。然而，支持托盘可制成其它适合的形状，主要取决于电极组件的形状(形状的不同主要取决于用途)。优选支持托盘由廉价硬质的或半硬质的塑料或聚合物制成，如，但不限于聚氯乙烯(PVC)。然而，应知道任何其它材料可用于形成支持托盘。

支持托盘在进行电印迹转移前，形成印迹组装的过程中还起到固定的作用。

在一个实施方案中，试剂盒可包括一种或多种适用于上述系统的稀释剂容器。稀释剂可用于制备上述蛋白组合物或杂交组合物。稀释剂可含有生理上可接受的水溶液，其pH为约4～约9，或约5～约8，或约6～约7.5，一般其中含有至少一种缓冲试剂，例如磷酸缓冲液、碳酸氢盐、TAPS、N-二甘氨酸(Bicine)、Tris、Bis-Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲碘酸盐、MES、醋酸盐、ADA、ACES、乙醇胺、BES、乙酰氨基甘氨酸(acetamidoglycine)或甘氨酰胺(glycinaide)。适于作为稀释剂的示例缓冲液可包括，但不限于，例如PBS、Hank’s液、TBS、TE、TEN等。任选地，稀释剂可含有去污剂。适合的去污剂可包括非离子型、非变性去污剂，例如TritonX-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij 58、Tween-20、Tween-80、辛基葡萄糖苷和辛基硫代苷(octylthio glucoside)。稀释剂可含有约0.01体积％～约5体积％，约0.05体积％～约2体积％，约0.1体积％～约1.5体积％或约0.5体积％～约1体积％的非离子型的非变性去污剂。

在一些实施方式中，稀释剂可施以全强度(full strength)(即，1X强度)或以易于储藏及装运(shipping)的浓溶液施用。浓稀释剂可由使用者进行稀释。浓稀释剂可以高达约50X，高达约25X，高达约20X，高达约10X或高达约5X或高达约2X强度施用。

在一些实施方案中，稀释剂可由试剂盒提供的盛有稀释剂的一个或多个塑料、PVC或玻璃瓶供给使用者。每个试剂盒可含有1～10瓶稀释剂，1～5瓶稀释剂或1～2瓶稀释剂。每瓶稀释剂可含5L、4L、3L、2L、1L、500mL或100mL稀释剂。

在一些实施方式中，试剂盒可含有适合的封闭剂。可提供溶于或分散于所述稀释剂中的封闭剂，或提供独立于所述稀释剂的封闭剂。封闭剂可含有，但不限于，全血清、分馏血清、牛血清白蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、脱脂牛奶、明胶、鱼血清、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、马免疫球蛋白、人免疫球蛋白、猪免疫球蛋白、鸡免疫球蛋白或合成的封闭剂，如可市售获得的，例如BioFX Laboratories、Kem-En-Tec Diagnostics或GeneWayBiotech。许多市售可获得的已制备的封闭剂是本领域可获得的，所有这些封闭剂可与上述试剂盒一并提供。这类市售可获得的封闭剂包括，但不限于，例如WesternBreeze、I-BLOCK、BlockIt、PerfectBlock、合成封闭缓冲液(Synthetic Blocking Buffer)(BioFX Labs)、GelantisBetterBlock、SeaBlock、起始封闭(Starting Block)和不含蛋白的封闭缓冲液(Protein-Free Blocking Buffer)(Pierce)。在一些实施方案中，提供的封闭剂溶于或分散于所述稀释剂中，封闭剂的量为约0.1重量％～约50重量％，约1重量％～约40重量％，约2.5重量％～约25重量％，约5重量％～约15重量％或约10重量％。在一个实施方案中，印迹缓冲液中封闭剂的量可高达约75mg/mL，高达约50mg/mL，高达约40mg/mL，高达约30mg/mL，高达约20mg/mL，高达约15mg/mL，高达约10mg/mL，高达约5mg/mL，高达约2.5mg/mL，高达约1mg/mL，高达约0.5mg/mL，高达约0.25mg/mL或高达约0.1mg/mL。

在一些实施方式中，试剂盒可含有杂交试剂或在进行核酸杂交试验中适用的杂交缓冲液，或更通俗的“预杂交缓冲液”可与“杂交试剂”或“杂交缓冲液”互换使用。许多预杂交缓冲液是本领域技术人员熟知的，可毫无限制地使用任何的预杂交缓冲液。

在一些实施方式中，试剂盒还含有一种或多种洗涤缓冲液容器。可将本领域技术人员已知的任何适合的洗涤缓冲液与根据本发明所述实施方案的试剂盒一并提供。在一些实施方式中，适合的洗涤缓冲液可与稀释剂相同。在一些实施方式中，洗涤缓冲液可以是缺少一种或多种成分的稀释剂。但不限于，洗涤缓冲液可包括任何下述的液体缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸氢盐、Bis-Tris、麦黄酮(Tricine)、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲碘酸盐、MES、醋酸盐、ADA、ACES、乙醇胺、BES、乙酰氨基甘氨酸(acetamidoglycine)或甘氨酰胺(glycinaide)。适于作为洗涤缓冲液的示例缓冲液可包括，但不限于，例如PBS、Hank’s液、TBS、TE、TEN等。任选地，洗涤缓冲液可含有去污剂。适合的去污剂可包括非离子型、非变性去污剂，例如Triton X-100、Triton X-114、NP-40、Brij-35、Brij 58、Tween-20、Tween-80、辛基葡萄糖苷和辛基硫代苷(octylthio glucoside)。稀释剂可含有约0.01体积％～约5体积％，约0.05体积％～约2体积％，约0.1体积％～约1.5体积％或约0.5体积％～约1体积％的非离子型的非变性去污剂。

在一些实施方式中，洗涤缓冲液可施以全强度(full strength)(即，1X强度)或以易于储藏及航运(shipping)的浓溶液施用。浓洗涤缓冲液可由使用者进行稀释。浓洗涤缓冲液可以高达约50X，高达约25X，高达约20X，高达约10X或高达约5X或高达约2X强度施用。

在一些实施方案中，洗涤缓冲液可由试剂盒提供的盛有洗涤缓冲液的一个或多个塑料、PVC或玻璃瓶供给使用者。每个试剂盒可含有1～10瓶洗涤缓冲液，1～5瓶洗涤缓冲液或1～2瓶洗涤缓冲液。每瓶稀释剂可含5L、4L、3L、2L、1L、500mL或100mL稀释剂。

在一些实施方案中，试剂盒还含有一种或多种由适合的容器提供的一抗。试剂盒可含有高达1mL，高达750μL，高达500μL，高达250μL，高达200μL，高达150μL，高达100μL或高达50μL的一抗。一抗可分散于适合的液体贮藏培养基中。一抗适于贮存于室温，在冷藏环境或冰箱中。

在特定的实施方案中，试剂盒提供的一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体可由小鼠或大鼠产生。单克隆抗体可以是IgG(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)、IgM、IgA、IgD和IgE亚类。多克隆抗体可由兔、小鼠、大鼠、大白鼠、绵羊、山羊、马、驴或小鸡产生。在一个实施方案中，抗体可来自于人血清。人源抗体可至少部分或全部纯化。制备和纯化抗体的方法是本领域广泛知晓的。各种抗体制剂的生产和应用的一般说明可参考，例如Harlow等，1989，Antibodies∶ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York，Harlow等，1999，Using Antibodies∶A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，NY，and Harlow，等，1988，In∶Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，全部作为参考引入于此。

在一些实施方案中，试剂盒所含的一级抗体可为内参抗体。供本发明系统和方法使用的示例性的非限制内参抗体可包括靶向肌动蛋白、微管蛋白、组蛋白、波形蛋白、核纤层蛋白、GAPDH、VDAC1、COXIV、hsp-70、hsp-90或TBP的抗体。本发明还可以包含其它内参抗体，这对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括在适当容器中提供的一个或多个二级抗体。试剂盒可包括高达1ml、高达750μl、高达500μl、高达250μl的、高达200μl、高达150μl、高达100μL或高达50μl的二级抗体。该二级抗体可适合在室温下、在冷藏环境中或冰箱中储存。二级抗体可作为试剂盒的一个组分提供，可产生于兔、小鼠、大鼠、仓鼠、猪、绵羊、山羊、马、驴、火鸡或鸡。二级抗体可能至少部分经亲和纯化。二级抗体可以直接抗小鼠IgG、小鼠IgA、小鼠IgM、大鼠IgG、大鼠IgA、大鼠IgM、兔IgG、兔IgA、兔IgM、仓鼠IgG、仓鼠IgA、仓鼠IgM、山羊IgG、山羊IgA、山羊IgM、马IgG、马IgA、马IgM、绵羊IgG、绵羊IgA、绵羊IgM、驴IgG、驴IgA、驴IgM、鸡IgG、鸡IgA、鸡IgM、鸡IgY、人IgG、人IgA或人IgM。二级抗体可以与一个或多个检测分子耦合，诸如，通过举例，碱性磷酸酶、过氧化物酶、生物素、荧光团或Qdot纳米晶体。

在一些实施方案中，提供的试剂盒可能有一个或多个底部消耗品、一个或多个顶部消耗品和一个或多个载体阵列，一起包装在第一试剂盒容器内。第一试剂盒容器可以储存在室温下或在冷藏环境中。提供的试剂盒还可以具有一个或多个稀释剂容器、一个或多个洗涤缓冲液容器、一个或多个初级抗体容器、一个或多个二级抗体容器，或者一个或多个显影剂容器，一起包装在至少一个第二试剂盒容器中。第二试剂盒容器可以储存在室温下或在冷藏环境中。在一些实施方案中，第二试剂盒容器的至少一个子部分(例如，初级抗体或二级抗体)可以储存在一个冰箱中。

在一些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个核酸探针。这些核酸探针可以是全部或部分长度cDNAs的寡核苷酸，或可以是单链或双链。在一个实施方案中，核酸探针可以是标记的或未标记的。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种用于标记核酸探针的试剂。提供的一些核酸探针可能会给内部实验提供对照试剂。这类探针可以包括，例如，微管蛋白、肌动蛋白、波形蛋白、GAPDH等的DNA或RNA探针。

在一些实施方案中，试剂盒可进一步包括关于试剂盒每个组成部分的使用和/或储存的说明书。这些说明书可直接或指导用户如何实施电印迹程序的一个或多个方面。说明书作为硬拷贝在其交付给客户时与试剂盒一并提供。另外，说明书可能会通过一种或多种电子通讯方式(如电子邮件或提供的试剂盒的公司网站)提供给最终用户。

下面的实施例用于证明本发明优选的实施方案。本领域技术人员应当理解实施例中公开的技术代表本发明人发现的技术，在本发明的实施中起到很好的作用，因此可以被视为构成其实施的优选模式。然而，在本发明公开的基础上，本领域的技术人员应当理解，在不脱离本文实施方案的精神和范围下，可以对公开的特定实施方案做出一种或多种变化，并获得相似或类似的效果。

实施例1

具备固有负电荷几种印迹试剂

在不受特定的作用机制和理论的约束下，因为目前描述的系统和方法部分依赖于印迹试剂从载体基质电泳转移至在固相支持物上固化的分子、试剂(诸如，例如，初级抗体、二级抗体、封闭剂，等等)，因此进行试验以证明这种试剂能够在非变性(即，在SDS存在情况下)的条件接受电泳转移。图3的图像表明在中性pH值下各种试剂(使用本实施方案的电印迹检测系统)的固有负电荷。将样品用原生1.2％E-GEL

clear(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)处理，并且将凝胶用古玛西染色以使处理的蛋白质可视化。样品如下：泳道1，WESTERNBREEZE

封闭液；泳道2，小鼠抗肌动蛋白单克隆抗体；泳道3，小鼠抗微管蛋白单克隆抗体；泳道4，与碱性磷酸酶耦合的羊抗兔二级抗体；泳道5，羊抗鼠二级抗体耦合碱性磷酸酶。这些结果表明，印迹试剂具有固有负电荷示例。

实施例2

常规对比电印迹方法的比较

图4A及4B表明根据本实施方案的电印迹系统和方法(图4A)或使用印迹技术(图4B)，在进行SW480细胞裂解液上的印迹方法以检测后微管蛋白和肌动蛋白所获得的结果。

SW-480细胞裂解液为Prosci incorporated，CA.销售。将连续两倍稀释的裂解液(2μg-62ng，图4a和4b泳道2-7)用标记体积的MAGICMARK^TM分子量蛋白标记(泳道9-12)分解，其按照制造商说明使用NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen Corp.)进行。分解的蛋白质被转移到硝酸纤维素(NC)蛋白印迹膜，其在P3上使用IBLOT^TM干式印迹系统(Invitrogen Corporation，Carl sbad，CA)7分钟，或者在30V下使用NOVEX

湿印迹模块1小时。在室温下用旋转振动筛使用WESTERNBREEZE

试剂盒封闭液将该膜封闭30分钟并使用WESTERNBREEZE

洗涤洗两次各5分钟。在图4B中，按照WESTERNBREEZE

显色检测试剂盒的说明显影膜用于印迹。印迹分别用1∶5000和1∶10,000的抗肌动蛋白和抗微管蛋白的单克隆抗体进行，其在室温下在用旋转振动筛在WESTERNBREEZE

稀释剂进行1小时。去除该印迹溶液并洗涤该膜三次各5分钟。然后，用抗鼠二级抗体碱性磷酸酶(AP)培养膜30分钟，其在旋转振动筛上与WESTERNBREEZE

试剂盒共轭。去除该二级印迹溶剂并将洗膜3次各5分钟并按照制造商说明每显色处理。

[00230]在图4A中，使用小鼠抗微管蛋白和抗肌动蛋白抗体进行在NC膜上固定的SW480细胞裂解液的电印迹，操作如下：在转移后，将上述膜封闭并使用IBLOT^TM系统进行点免疫印迹处理。将膜放在小型IBLOT^TM底部堆栈(stack)。使用吸管将含有初级抗体(1∶2500)和二级抗体(抗小鼠耦合的AP，1∶5000)3.5mL溶液施加于Whatman滤纸载体基质。然后将基质放置在膜顶端和并使用印迹辊来去除空气泡沫。然后将顶堆栈放置在基质顶部并将IBLOT^TM仪器的盖子关闭。IBLOT^TM被设置为P5程序7分钟。当程序运行后，将膜去除，用WESTERNBREEZE

清洗液洗3次并按照如上处理。

实施例3

图5A-B实验结果表明，电场对电印迹进程影响很大，但压力也有一些累加效应。图5A表明在执行电印迹程序后所得到的结果。电印迹程序按照在上述实施例2中所描述的进行。图4A图5B表示当该程序在IBLOT^TM设备上不运行P5所重复获得的结果。

实施例4

滤纸对比聚酯/聚酰胺超细纤维载体基质的比较

图6A-B表明在使用不同的载体基质所获得的结果之间的比较。蛋白质分子量标准(泳道1)和SW480系列2倍稀释的细胞裂解液(泳道3-10)被SDS-PAGE分解并转移到上述实施例2所述的NC膜。在图6A中，电印迹实验基本上按照图4A进行。在图6B中，电印迹实验基本上按照图4A进行，除了滤纸载体基质用聚酯/聚酰胺超细纤维(从Sadovsky Houshold products，Ltd.Ashdod，Israel销售获得)替代。

使用不同的缀合物、检测方法、转移方法和膜的常规印迹对比电印迹(例如5-8)

实施例5

图8A-B表明使用用于印迹试验的化学发光或发光检测法以及使用常规方法(图8A)或电印迹法(图8B)所得到的结果之间的比较。SW480细胞裂解液的系列2倍稀释的细胞裂解液(泳道1-8)用SDS-PAGE分解并转移到上述实施例2所述的NC膜。在图8A中，常规步骤，阻止和印迹演出基本上如上所述。在图8B中，电印迹基本上按照上述2实施例进行，除了滤纸载体基质用在实施例4中所述的聚酯/聚酰胺超细纤维更换，并设置IBLOT^TM 5V的5分钟的程序以内的。当程序运行完，取出膜，用WESTERNBREEZE

洗涤液洗三次，按照制造商说明和上述处理。在图8A及8B中表明包括用ECL(上版面)处理的HRP耦合的二级抗体抗鼠和使用显色方法处理的AP耦合的二级抗体抗鼠的结果。

实施例6

图9A-B表明使用基本上按照实施例5中的电印迹方法得到的结果，除了使用常规的“湿”的转移方法从电泳凝胶向NC膜的蛋白转移。

实施例7

图10A-B表明使用基本上如实施例5中所述电印迹方法获得的结果，除了NC蛋白质印迹膜由PVDF蛋白质印迹膜取代。

实施例8

图11A-B表明使用基本上如实施例6中所述电印迹方法获得的结果，除了NC蛋白质印迹膜由PVDF蛋白质印迹膜取代。

对比常规印迹步电印迹

实施例9

该实施例公开了简化方法，其中封闭剂、初级抗体、二级抗体都包含到免疫印迹膜，其使用SW480细胞裂解液和抗微管蛋白和抗肌动蛋白抗体。

SW-480细胞裂解液样品(1μg-62.5ng两倍稀释)被装上NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris Gel。将凝胶运行37分钟以分离蛋白质样品且分离的蛋白被转移到NC膜，其使用IBLOT^TM，20V，7分钟，如实施例2所述。按照实施例2的常规方法来处理并显影对照膜。

按照对本发明如下的方法处理未封闭膜。未封闭膜置于IBLOT^TM底部堆栈。在本示例性过程中，初级和二级抗体被稀释在25％合成封闭缓冲液(产品编号STSB-0100-01，来自BioFX，Owings Mills，MD.)中——1％酪蛋白、200nM和10nM Bis-Tris。含初级抗体(1∶2500)和二级抗体(抗鼠缀合HRP或AP，1∶5000)的3.5mL稀释液适用于聚酯/聚酰胺超细纤维基质，如实施例4所述。在这种情况下IBLOT^TM被设置为3分钟5V的方案。当程序运行完，去除膜，用WESTERNBREEZE

洗涤液洗三次，如实施例2中所显影。相较于对照膜，按照实施例2的方法处理和显影的结果分别在图7B及7A中表示。

常规印迹对比两步电印迹(实施例10-11)

实施例10

将大肠杆菌裂解液细胞样品购自Promega(1.25μg-78.5双倍稀释)装在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶。运行凝胶37分钟以分离蛋白样品且分离的蛋白转移到使用IBLOT^TM的NC膜，20V下为7分钟。随后封闭膜，在旋转振动筛上使用WESTERNBREEZE

试剂盒封闭液30分钟，使用WESTERNBREEZE

清洗溶液洗涤两次，每次5分钟。

按照WESTERNBREEZE

化学发光检测试剂盒的说明处理该膜用于印迹。用1∶5000稀释的兔抗大肠杆菌多克隆抗体，在WESTERNBREEZE

稀释剂中，用旋转振动筛处理印迹1小时。该分解的溶液是去除和印迹膜洗三次5分钟。然后，用抗兔二级抗体碱性磷酸酶(用在旋转振动筛基于WESTRNBREEZE

试剂盒的缀合溶液)培养该膜30分钟。去除二级印迹溶液，将各个膜洗3次，每次5分钟并化学发光检测显影。

实施例11

该实施例公开了简化方法，其中封闭剂和初级抗体在包括免疫印迹膜的一步中，然后二级抗体(在封闭液)也包括在免疫细胞膜上，在不同步骤中使用大肠杆菌细胞裂解液和抗大肠杆菌抗体。大肠杆菌细胞裂解液样品购于Promega公司(1.25μg-78.5二倍稀释)，将其装于NUPAGE

Novex 4-12％，Bis-Tris凝胶。凝胶运行37分钟以分离蛋白质样品，分离的蛋白被被转移至NC膜，在20V下7分钟，使用IBLOT^TM，如实施例10所述。按照本发明的如下方法处理未封闭膜。未封闭膜放置在小型IBLOT^TM底部堆栈。分离溶液，通过将初级抗体或二级抗体稀释在30％的合成阻断缓冲区的封闭液(产品编号STSB-0100-01，购自BioFX，Owings Mills，MD，0.3％大豆分离，200nM和10nM Bis-Tris)。稀释溶液(3.5mL，含初级(1∶2500)抗体应)用于聚酯/聚酰胺超细纤维基质，如实施例4描述的。在这种情况下，IBLOT^TM被设置为5V 3分钟的程序。当程序运行完，载体基质被去除，并用第二载体基质替代，其中3.5mL的上述稀释液含有二级抗体(羊抗兔缀合的AP，1∶1000)。在这种情况下IBLOT^TM被设置为5V的程序3分钟。当程序运行完，去除膜，用WesternBreeze

洗涤液洗三次并如实施例10所述显影。比较对照膜，以实施例10所述，结果分别见图12B及12A所示。

实施例12

图13A中表示的结果基本上按照实施例2中所述获得，具有以下实施例：2μg-62ng的A431细胞裂解液载于二个相同的NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen公司)且按照制造商说明分解蛋白。分解的蛋白质被转移到硝化纤维(NC)蛋白印迹膜，其使用IBLOT^TM干式印迹系统(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)，运行P3程序7分钟。使用WesternBreeze

试剂盒封闭液在室温下使用旋转振动筛将膜被封闭30分钟，使用WesternBreeze

洗涤液洗两次，每次5分钟。

将其中一张膜(图13A所述的左手版面)进行常规的Western印迹。用1∶10,000倍稀释液的单克隆抗Elf抗体(在WESTERNBREEZE稀释液中)在室温下用旋转振动筛进行印迹1小时。去除印迹溶液并将该膜洗三次，每次5分钟。然后，用WESTERNBREEZE试剂盒的抗鼠二级抗体缀合过氧化物酶在旋转振动筛上将该膜培养30分钟。去除该二级印迹溶液并洗膜3次，每次5分钟，并按照制造商说明用ECL试剂显影。

将另外的膜(在图13A的右边版面的描述)进行如下电印迹：在A431细胞裂解液转移到NC膜后，膜被如上所述封闭，并使用IBLOT^TM系统进行电免疫处理。将膜放置在小型IBLOT^TM底部堆栈。3.5mL含有初级(1∶5,000小鼠抗Elf)和二级抗体(抗鼠缀合HRP，1∶5,000)的溶液被应用于聚酯/聚酰胺超细纤维基质(购于SadovskyHoushold products，Ltd.Ashdod，Israel)。然后将基质放置在膜顶部并用印迹辊是去除气泡。然后将顶部堆栈放置在基质顶部并关闭IBLOT^TM仪器的盖子。将IBLOT^TM设置为3分钟的P7程序。当程序运行完，膜被去除，用WESTERNBREEZE涤液洗三次并使用如上所述的增强化学发光显影。

图13B中表明的得到的结果基本上如图13A所描述的，但下列情况除外：A431细胞裂解液被HeLa细胞裂解液替换。对于常规免疫印迹(在左侧版面中表明)，初级抗体被鼠抗ERK的1∶5,000稀释液取代。二级抗体，及其所使用的稀释液维持不变。对于电免疫印迹(在右侧版面表明)，初级抗体的稀释度为1∶2.500，以及二级抗体稀释度为1∶5.000。

实施例13

图14A至14D所示的实验基本上按照实施例12所述的进行，下列情况除外：在图14A中，纯化牛血清白蛋白(BSA)在NUPAGENovex 4-12％，Bis-Tris凝胶中分解。在常规免疫印迹(在图14A左边的版面中表明)中，鼠标抗BSA初级抗体的稀释度为1∶5,000。

对于电免疫印迹，在图14A中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗BSA的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为3分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的抗鼠1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行3分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图14B中，SW480细胞裂解液分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图14B左边的版面中表明)中，兔抗微管蛋白抗体的稀释度为1∶5,000。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中抗兔缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。对于电免疫印迹，在图14B中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中兔抗微管蛋白的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为3分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的鼠抗兔1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行3分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图14C中，HeLa细胞裂解液分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图14C左边的版面中表明)中，鼠抗p70s6k抗体的稀释度为1∶1,000。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图14C中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗p70s6k的稀释度为1∶500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE稀释剂中HRP抗体缀合的兔抗鼠1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图14D中，SW480细胞裂解液分解在NUPAGE

Novex4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图14C左边的版面中表明)中，兔抗p53抗体的稀释度为1∶5,000。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中鼠抗兔缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图14D中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗p53的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的鼠抗兔1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图15A中，HeLa细胞裂解液分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图15A左边的版面中表明)中，兔抗4E-BP1抗体的稀释度为1∶2,500。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图15A中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗4E-BP1的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的兔抗鼠1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图15B中，SW480细胞裂解液分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图15B左边的版面中表明)中，兔抗-连环蛋白抗体的稀释度为1∶2,500。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图15B中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE稀释剂中抗体中鼠抗-连环蛋白抗体的稀释度为1∶500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的兔抗鼠1∶2,500稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图15C中，HCG裂解液分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图15C左边的版面中表明)中，兔抗-连环蛋白抗体的稀释度为1∶2,500。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图15C中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中兔抗HCG抗体的稀释度为1∶1,250，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P6程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的鼠抗兔1∶2,500稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图15D中，纯化的EGFR-GST融合蛋白分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图15D左边的版面中表明)中，兔抗GST抗体的稀释度为1∶2,500。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图15D中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中兔抗HCG抗体的稀释度为1∶625，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE稀释剂中HRP抗体缀合的鼠抗兔1∶2,500稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图15E中，HeLa细胞裂解物分解在NUPAGENovex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图15E左边的版面中表明)中，鼠抗IKKα抗体的稀释度为1∶2,500。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图15E中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗IKKα抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为3分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图16A中，表达HIS标记的Src的HeLa细胞裂解物分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图16A左边的版面中表明)中，鼠抗HIS抗体的稀释度为1∶5,000。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图16A中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗HIS抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图16B中，POSITOPE^TM对照蛋白(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)分解在NUPAGE

Novex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图16B左边的版面中表明)中，鼠抗V5抗体的稀释度为1∶10,000。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE

稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图16B中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗V5抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

在图16C中，POSITOPE^TM对照蛋白(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)分解在NUPAGENovex 4-12％Bis-Tris凝胶中。在常规免疫印迹(在图16B左边的版面中表明)中，鼠抗MYC抗体的稀释度为1∶10,000。对于二级抗体，使用WESTERNBREEZE稀释液中兔抗鼠缀合HRP抗体的1∶5,000稀释液。

对于电免疫印迹，在图16C中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗MYC抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。

实施例14

电印迹与另外的市售免疫检测替代系统的比较

进行在图17A-D所示的实验以比较使用三种不同的免疫检测方法获得的结果，即常规蛋白质印迹(在图17A-17D左侧版面表明)、SNAP ID^TM蛋白检测系统(Millipore公司，Billerica，MA，在图17A-17D中间版面所示)和电免疫印迹(图17A-17D右侧版面所示的)。在图17A中，纯化的重组胰岛素单独在三个NUPAGENovex4-12％，Bis-Tris凝胶中分解。使用如上所述的IBLOT^TM仪器将分解的蛋白质转移到NC膜。

对对照膜(在图17A左边版面中表明)进行如上所述的常规印迹处理，使用在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中稀释的兔抗胰岛素抗体的1∶5000稀释液，在室温下进行1小时。遗弃抗体溶液，在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中洗膜三次，每次5分钟。在室外下在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中将鼠抗兔HRP缀合的抗体的1∶5000稀释液施加至该膜30分钟。反复洗涤步骤，并采用如上所述的增强化学发光法(ECL)来对印迹进行显影。将ECL处理的印迹暴露于膜5分钟并显影(见左侧版面)。

按照制造商说明使用SNAP ID^TM蛋白检测系统将二级膜(在图17A中间版面所示)进行印迹。在本实验中使用的抗胰岛素抗体和抗兔HRP抗体的稀释度为1∶1650。使用如上所述的增强化学发光(ECL)使印迹显影。将ECL处理的印迹暴露膜5分钟并显影(见中间版面)。

对于电免疫印迹，在图17A中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗胰岛素抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为5分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的鼠抗兔1∶2,500稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行2分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。使用如上所述的增强化学发光(ECL)显影印迹。将ECL处理的印迹暴露于膜1分钟并显影(见右侧版面)。

在图17B中，纯化的重组GST标记的EGFR融合蛋白单独在三个NUPAGE

Novex 4-12％，Bis-Tris凝胶中分解。使用如上所述的IBLOT^TM仪器将分解的蛋白质转移到NC膜。

对对照膜(在图17B左边版面中表明)进行如上所述的常规印迹处理，使用在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中稀释的鼠抗GST抗体的1∶2,500稀释液，在室温下进行1小时。遗弃抗体溶液，在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中洗膜三次，每次5分钟。在室外下在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中将兔抗鼠HRP缀合的抗体的1∶5000稀释液施加至该膜30分钟。反复洗涤步骤，并采用如上所述的增强化学发光法(ECL)来对印迹进行显影。将ECL处理的印迹暴露于膜5分钟并显影(见左侧版面)。

按照制造商说明使用SNAP ID^TM蛋白检测系统将二级膜(在图17B中间版面所示)进行印迹。在本实验中使用的抗GST抗体和抗鼠HRP抗体的稀释度分别为1∶850和1∶1650。使用如上所述的增强化学发光(ECL)使印迹显影。将ECL处理的印迹暴露膜1分钟并显影(见中间版面)。

对于电免疫印迹，在图17B中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

涤液洗三次并用如上所述的增强化学发光显影。使用如上所述的增强化学发光(ECL)显影印迹。将ECL处理的印迹暴露于膜1分钟并显影(见右侧版面)。在图17C中，SW480细胞裂解液单独在三个NUPAGE

Novex4-12％，Bis-Tris凝胶中分解。使用如上所述的IBLOT^TM仪器将分解的蛋白质转移到NC膜。

对对照膜(在图17C左边版面中表明)进行如上所述的常规印迹处理，使用在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中稀释的鼠抗微管蛋白抗体的1∶2,500稀释液和鼠抗肌动蛋白抗体的1∶5,000稀释液，在室温下进行1小时。遗弃抗体溶液，在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中洗膜三次，每次5分钟。在室外下在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中将兔抗鼠HRP缀合的抗体的1∶5000稀释液施加至该膜30分钟。反复洗涤步骤，并采用如上所述的增强化学发光法(ECL)来对印迹进行显影。将ECL处理的印迹暴露于膜1分钟并显影(见左侧版面)。

按照制造商说明使用SNAP ID^TM蛋白检测系统将二级膜(在图17C中间版面所示)进行印迹。在本实验中使用的抗微管蛋白抗体和抗肌动蛋白抗体的稀释度为1∶1,650，且抗鼠HRP抗体的稀释度为1∶2,500。使用如上所述的增强化学发光(ECL)使印迹显影。将ECL处理的印迹暴露膜1分钟并显影(见中间版面)。

对于电免疫印迹，在图17C中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE稀释剂中抗体中鼠抗微管蛋白抗体的稀释度为1∶2,500且鼠抗肌动蛋白抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为3分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的鼠抗兔1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行3分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

在图17D中，大肠杆菌裂解液单独在三个NUPAGE

对对照膜(在图17D左边版面中表明)进行如上所述的常规印迹处理，使用在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中稀释的鼠抗大肠杆菌抗体的1∶2,500稀释液，在室温下进行1小时。遗弃抗体溶液，在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中洗膜三次，每次5分钟。在室外下在WESTERNBREEZE^TM稀释剂中将兔抗鼠HRP缀合的抗体的1∶5000稀释液施加至该膜30分钟。反复洗涤步骤，并采用如上所述的增强化学发光法(ECL)来对印迹进行显影。将ECL处理的印迹暴露于膜1分钟并显影(见左侧版面)。

按照制造商说明使用SNAP ID^TM蛋白检测系统将二级膜(在图17D中间版面所示)进行印迹。在本实验中使用的抗大肠杆菌抗体的稀释度为1∶1,650，且抗兔HRP抗体的稀释度为1∶3,000。使用如上所述的增强化学发光(ECL)使印迹显影。将ECL处理的印迹暴露膜1分钟并显影(见中间版面)。

对于电免疫印迹，在图17D中右侧版面中表明，3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中抗体中鼠抗大肠杆菌抗体的稀释度为1∶2,500，其在聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收。IBLOT^TM装置设置为3分钟P7程序。从仪器去除基质，并有3.5mL的WESTERNBREEZE

稀释剂中HRP抗体缀合的兔抗鼠1∶5,000稀释度在二级聚酯/聚酰胺超细纤维基质上被吸收，其被放置在NC膜上。关闭IBLOT^TM仪器，并在P7再运行3分钟。当程序完成运行，去除膜，使用WESTERNBREEZE

用于检测核酸的电印迹

实施例15

在该实施例中，调整上述电印迹系统和方法适于用于进行核酸印迹实验(即，印迹法)。

Lambda DNA(12.5-0.6ng/孔)样品100V下在3个相同的0.8％琼脂平板凝胶上运行2小时。将该凝胶转移至尼龙膜，使用IBLOT^TM设备(P8，7分钟)以及使用IBLOT^TMNAT的堆栈(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)。在分解的核酸转移至尼龙膜后，通过将尼龙膜浸泡在0.4N NaOH水溶液中10分钟，使固化的核酸变性。然后用紫外线照射尼龙膜，使核酸交联在膜上。

然后在55℃下在杂交缓冲液中将处理后的膜进行预杂交处理，该缓冲液按照AMERSHAM ALKPHOS DIRECT^TM标记和检测试剂盒所提供的指示制备(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)。

在55℃下用含有62.5ng的DNA探针的12.5mL预杂交缓冲液培养旋转来培养其中一张膜(如图18A所示对照膜)(用按照制造商说明的碱性磷酸酶来标记Lambda DNA)。

将其余两个测试膜分别放置在iBlot底部堆栈上并将5mL的含有187ng的制备的DNA探针预杂交缓冲液吸附在基质上。将顶端堆叠分别放置在探针浸透的基质上并按照制造商指示将该装置插入到IBLOT^TM设备中。将该装置在P7下分别运行5分钟(如图18B所示)或3分钟(见图18C)。在印迹后(无论是常规方法或电印迹方法)，按照AMERSHAM ALKPHOS DIRECT^TM标记和检测试剂盒的指示洗膜，并随后然后使用CDP-STAR

试剂(NEB，Ipswich，MA)电发光地显影为基质。将所有这三个膜暴露于X射线胶片1小时，并将胶片显影。结果在图18A-C表明。

尽管本文已经表明且描述了本发明的优选的实施方案，但对于本领域的技术人员来时这些实施方案仅作为实施力的方式提供。本领域的技术人员在不偏离本发明下将联想到多种许多变型、变化和替代。可以理解的是，对本发明的实施方案做出的各种变化将在本发明的实施中应用。如下的权利要求将限定本发明的保护范围以及此所涵盖的在该权利要求及其等同的范围内的方法和结构。

Claims

1.一种系统，其包括：

第一凝胶基体；第二凝胶基体；和

至少第一载体基质；

第一凝胶基体和第二凝胶基体包括用于电泳的离子源，且其中载体基质包括能够大体上可逆吸引蛋白质或杂交组合物。

2.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质位于在第一凝胶基体和第二凝胶基体之间。

3.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质的表面大体上与第一凝胶基体的表面并列。

4.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质包括吸引在其上面的蛋白质组合物。

5.根据权利要求4所述的系统，其中载体基质包括约0.1μg-约10mg的蛋白质组合物。

6.根据权利要求4所述的系统，其中至少一部分蛋白质或杂交组合物为至少部分带负电荷。

7.根据权利要求4所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括一阻断剂。

8.根据权利要求7所述的系统，其中阻断剂包括蛋白质或杂交组合物。

9.根据权利要求7所述的系统，其中阻断剂包括至少一选自下组的蛋白质组分：凝胶、无脂奶、酪蛋白、BSA、CAS-Block、大豆蛋白质、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、马免疫球蛋白、人免疫球蛋白、猪免疫球蛋白、鸡免疫球蛋白、合成肽、水稻蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白、藻蛋白或其任意组合。

10.根据权利要求4所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括一合成的阻断剂。

11.根据权利要求10所述的系统，其中合成的阻断剂包括约1％-约50％的合成的阻断剂。

12.根据权利要求10所述的系统，其中进一步包括0.25％-10％的阻断蛋白。

13.根据权利要求1-12任一项所述的系统，进一步包括蛋白印迹膜。

14.根据权利要求13所述的系统，其中蛋白印迹膜位于在第一载体基质和第二凝胶基体之间。

15.根据权利要求所述13的系统，其中蛋白印迹膜的表面大体上与第一载体基质的表面并列，且其中蛋白印迹膜的相对表面与第二凝胶基体并列。

16.根据权利要求13所述的系统，其中蛋白印迹膜包括至少一个在其表面上的蛋白样品。

17.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质包括至少一个初级抗体。

18.根据权利要求17所述的系统，其中初级抗体直接抗使用者确定的测试抗原。

19.根据权利要求18所述的系统，其中直接抗使用者确定的测试抗原的抗体在系统应用前由使用者添加至第一载体基质上。

20.根据权利要求17所述的系统，其中初级抗体在系统应用前由使用者添加至第一载体基质上。

21.根据权利要求17所述的系统，其中初级抗体为加载的对照抗体。

22.根据权利要求21所述的系统，其中初级抗体选自肌动蛋白、微管蛋白、组蛋白、波形蛋白、核纤层蛋白、GAPDH、VDAC1、COXIV、hsp-70、hsp-90或TBP。

23.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质包括第一初级抗体和第二初级抗体。

24.根据权利要求23所述的系统，其中初级抗体为直接抗使用者确定的测试抗原的抗体。

25.根据权利要求24所述的系统，其中初级抗体在系统应用前由使用者添加至第一载体基质上。

26.根据权利要求23所述的系统，其中第二初级抗体为加载的对照抗体。

27.根据权利要求26所述的系统，其中加载控制器抗体选自肌动蛋白、微管蛋白、组蛋白、波形蛋白、核纤层蛋白、GAPDH、VDAC1、COXIV、hsp-70、hsp-90或TBP。

28.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质包括一第二抗体。

29.根据权利要求28所述的系统，其中第二抗体偶合于辣根过氧化酶、生物素、碱性磷酸酶、荧光染料或Qdot纳米晶体。

30.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质包括至少一个初级抗体和至少一第二抗体。

31.根据权利要求30所述的系统，其中至少一初级抗体为加载的对照抗体。

32.根据权利要求30所述的系统，其中至少一初级抗体为直接抗使用者确定的测试抗原的抗体。

33.根据权利要求32所述的系统，其中直接抗使用者确定的测试抗原的抗体在系统应用前由使用者添加至第一载体基质上。

34.根据权利要求30所述的系统，其中第二抗体偶合于辣根过氧化酶、生物素、碱性磷酸酶、荧光染料或Qdot纳米晶体。

35.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第二载体基质。

36.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质位于第一凝胶基体和第一载体基质之间。

37.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质的表面大体上与第一载体基质的表面并列。

38.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质的表面大体上与第二凝胶体的表面并列。

39.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质包括吸附在其上的蛋白质或杂交组合物。

40.根据权利要求39所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括一阻断剂。

41.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质包括至少一个初级抗体。

42.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质包括至少一个第二抗体。

43.根据权利要求35所述的系统，其中第二载体基质包括至少一个初级抗体和至少一第二抗体。

44.根据权利要求1-43任一项所述的系统，其中第一载体基质或第二载体基质包括一或多个滤纸、一或多个织物、一或多个微纤维片或其任意组合。

45.根据权利要求1所述的系统，其中第一载体基质包括聚酯/聚酰胺微纤维。

46.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第一电极。

47.根据权利要求46所述的系统，其中第一电极为阴极。

48.根据权利要求46所述的系统，其中第一电极被电耦合于至少第一凝胶基体。

49.根据权利要求46所述的系统，其中至少一部分第一电极与第一凝胶基体的表面并列。

50.根据权利要求1所述的系统，进一步包括第二电极。

51.根据权利要求50所述的系统，其中第二电极为阳极。

52.根据权利要求50所述的系统，其中第二电极被电耦合于第二凝胶基体。

53.根据权利要求50所述的系统，其中至少一部分第二电极与第二凝胶基体的表面并列。

54.根据权利要求46-53任一项所述的系统，其中第一电极和第二电极包括铜、银、铅、铝、不锈钢、石墨、铂、金或其组合。

55.根据权利要求46-53所述的系统，其中第一电极和第二电极包括铜。

56.根据权利要求46-53所述的系统，其中第一电极和第二电极与电源连接。

57.根据权利要求46-53任一项所述的系统，其中第一电极、第二电极或第一和第二电极网格设置。

58.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一和第二凝胶基体包括至少一种选自下述的材料：琼脂、丙烯酰胺、矾土、硅石、淀粉、多糖、壳聚糖、黄原胶、洁冷胶、角叉菜胶或果胶。

59.根据权利要求1所述的系统，其中第一凝胶基体、第二凝胶基体或第一凝胶基体和第二凝胶基体两者包括矾土。

60.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括丙烯酰胺。

61.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括约1％-约30％的丙烯酰胺。

62.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括约5％-约20％的丙烯酰胺。

63.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括琼脂。

64.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括约0.5％-约10％的琼脂。

65.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括约1％-约5％的琼脂。

66.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括丙烯酰胺。

67.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括丙烯酰胺和琼脂。

68.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括约1％-约30％的丙烯酰胺和约0.1％-约10％的琼脂。

69.根据权利要求1所述的系统，其中第一凝胶基体和第二凝胶基体包括包含约1-3wt.％琼脂和约5-30wt.％矾土的至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一和第二凝胶基体。

70.根据权利要求1所述的系统，其中包括至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一和第二凝胶基体的用于电泳的离子源包括一或多种盐、一或多种酸、一或多种缓冲液或其任意组合。

71.根据权利要求70所述的系统，其中至少一种盐、酸或缓冲液的浓度在约10mM-1M的范围内。

72.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括有机缓冲液。

73.根据权利要求72所述的系统，其中有机缓冲液具有约6-约8.5的pKa。

74.根据权利要求1所述的系统，其中至少第一凝胶基体、至少第二凝胶基体或至少第一凝胶基体和第二凝胶基体包括离子交换基质。

75.根据权利要求74所述的系统，其中离子交换作用基质为阴离子交换基质或阳离子交换基质。

76.根据权利要求1所述的系统，其中第一凝胶基体的组合物与第二凝胶基体的组合物不同。

77.一种系统，其包括：一装配下述物质的阳极：阳极凝胶基体；耦合于阳极凝胶基体的阳电极；一装配下述物质的阴极：阴极凝胶基体；耦合于阴极凝胶基体的阴电极；和至少位于阳极和阴极凝胶基体之间的第一载体基质。

78.根据权利要求所述77的系统，进一步包括第二载体基质。

79.根据权利要求77所述的系统，其中阳极凝胶基体电耦合于阴极凝胶基体。

80.根据权利要求77所述的系统，其中阳极凝胶基体和阴极凝胶基体包括用于电泳的离子源。

81.根据权利要求77所述的系统，其中载体基质包括能够大体上可逆吸附蛋白质或杂交组合物。

82.根据权利要求77所述的系统，其中载体基质包括一或多种滤纸、一或多种织物、一或多种微纤维片或其组合。

83.根据权利要求77所述的系统，其中第一载体基质包括聚酯/聚酰胺微纤维。

84.根据权利要求77所述的系统，进一步包括蛋白质或杂交组合物，其中所述蛋白质或杂交组合物能够被吸引在第一载体基质上。

85.根据权利要求77所述的系统，其中至少一部分蛋白质或杂交组合物为至少是部分带负电荷。

86.根据权利要求77所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括阻断剂。

87.根据权利要求77所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括至少一种初级抗体。

88.根据权利要求77所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括至少一种第二抗体。

89.根据权利要求77所述的系统，其中蛋白质或杂交组合物包括至少一种初级抗体和一种第二抗体。

90.一种试剂盒，其至少包括：

第一适当的容器；

阳极部件；

阴极部件；和

第一载体基质。

91.根据权利要求90所述的试剂盒，其中阳极部件包括一阳极凝胶基体。

92.根据权利要求90所述的试剂盒，其中阳极部件包括一阳极。

93.根据权利要求90所述的试剂盒，其中阴极部件包括一阴极凝胶基质。

94.根据权利要求90所述的试剂盒，其中阳极部件包括一负电极。

95.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一任选的第二载体基质。

96.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一耦合于阳极凝胶基体的阳极。

97.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一耦合于阴极凝胶基体的阴极。

98.根据权利要求90所述的试剂盒，其中阳极部件和阴极部件被分别包装。

99.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括至少一尺寸可容纳阳极部件或阴极部件的托盘。

100.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括至少一含水缓冲液。

101.根据权利要求100所述的试剂盒，其中含水缓冲液为一阻断缓冲液。

102.根据权利要求100所述的试剂盒，其中含水缓冲液包括至少一种阻断剂。

103.根据权利要求100所述的试剂盒，其中含水缓冲液包括至少一种合成的阻断剂。

104.根据权利要求10303所述的试剂盒，其中合成的阻断剂包括约1％-约50％的合成的阻断剂。

105.根据权利要求1022所述的试剂盒，其中阻断剂包括蛋白质或杂交组合物。

106.根据权利要求1022所述的试剂盒，其中阻断剂包括至少一种选自下组的蛋白质组分：凝胶、无脂奶、酪蛋白、BSA、CAS-Block、大豆蛋白质、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、马免疫球蛋白、人免疫球蛋白、猪免疫球蛋白、鸡免疫球蛋白、合成肽、水稻蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白、藻蛋白或其任意组合。

107.根据权利要求10606所述的试剂盒，其中阻断剂包括0.25wt.％-10wt％的至少一种选自下组的蛋白质组分：凝胶、无脂奶、酪蛋白、BSA、CAS-Block、大豆蛋白质、山羊免疫球蛋白、兔免疫球蛋白、小鼠免疫球蛋白、大鼠免疫球蛋白、马免疫球蛋白、人免疫球蛋白、猪免疫球蛋白、鸡免疫球蛋白、合成肽、水稻蛋白、乳清蛋白、鱼蛋白、藻蛋白或其任意组合。

108.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一含水缓冲液。

109.根据权利要求90所述的试剂盒，其中阳极部件电耦合于阴极部件。

110.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一或多种初级抗体。

111.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一或多种第二抗体。

112.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一或多种泡沫材料。

113.根据权利要求90所述的试剂盒，进一步包括一或多片滤纸。

114.一种方法，其包括：提供包括阳极和用于电泳的离子源的阳极部件；提供包括阴极和用于电泳的离子源的阴极部件；提供包括吸附在上的蛋白质或杂交组合物的第一载体基质；提供包括偶合在其上的蛋白样品的蛋白印迹膜；将蛋白印迹膜和第一载体基质放置在阳极部件和阴极部件之间使得第一载体基质临近阴极组件，蛋白印迹膜临近阳极部件，且具有偶合的蛋白样品的蛋白印迹膜的表面大体上与第一载体基质的表面并列；以及在阳极部件和阴极部件之间施加电压。

115.根据权利要求113所述的方法，其中阳极部件包括一阳极凝胶基体。

116.根据权利要求113所述的方法，其中阴极部件包括一阴极凝胶基体。

117.根据权利要求113所述的方法，其中蛋白质或杂交组合物包括一阻断剂。

118.根据权利要求113所述的方法，其中蛋白质或杂交组合物包括一初级抗体。

119.根据权利要求113所述的方法，其中蛋白质或杂交组合物包括一第二抗体。

120.根据权利要求113所述的方法，其中蛋白质或杂交组合物包括一核酸探针。

121.根据权利要求113所述的方法，其中蛋白质或杂交组合物在放置步骤前被吸附在第一载体基质上。

122.根据权利要求121所述的方法，其中吸附步骤包括将第一载体基质与包括蛋白质或杂交组合物的水溶液接触。

123.根据权利要求114所述的方法，其中电压高达约50V。

124.根据权利要求114所述的方法，其中电压高达约25V。

125.根据权利要求114所述的方法，其中电压高达约15V。

126.根据权利要求114所述的方法，其中电压高达约5V。

127.根据权利要求114所述的方法，其中电压施加至约15分钟。

128.根据权利要求114所述的方法，其中电压施加至约10分钟。

129.根据权利要求114所述的方法，其中电压施加至约5分钟。

130.根据权利要求114所述的方法，其中电压施加至约1-约5分钟。

131.根据权利要求114所述的方法，其中电压施加至约1-约3分钟。

132.根据权利要求114所述的方法，其中电压施加至约3分钟。

133.根据权利要求114所述的方法，其中在阳极部件和阴极部件之间施加电压后，用第二载体基质替换第一载体基质，所述第二载体基质包括吸附在其上的蛋白质或杂交组合物。

134.根据权利要求133所述的方法，其中用第二载体基质替换第一载体基质后在阳极部件和阴极部件之间施加电压。

135.根据权利要求113-134任一项所述的方法，进一步包括将蛋白印迹膜用于一或多个洗涤步骤。

136.根据权利要求135所述的方法，其中蛋白印迹膜至少洗涤三次。

137.根据权利要求135所述的方法，其中至少一个冲洗步骤为约1-5分钟。

138.根据权利要求113，135或137任一项所述的方法，进一步包括将蛋白印迹膜用于检测步骤。

139.根据权利要求138所述的方法，其中检测步骤包括化学发光检测步骤。

140.根据权利要求138所述的方法，其中检测步骤包括比色分析检测步骤。

141.根据权利要求138所述的方法，其中检测步骤包括莹光检测步骤。

142.一种系统，其包括阳极部件、阴极部件和第一载体基质，，其中第一载体基质包括聚酯/聚酰胺微纤维。