JPH02107196A - 抗ＨＩＶ―１ｐ２４マウスモノクローナル抗体、その産生細胞株およびそれを用いたイムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病因で
あるヒト免疫不全ウィルス（１−［ＩＶ−１）の血清、
血漿または他の体液中での検出に関する。

さらに詳しくは、本発明は、ＨＩＶ−１コアタンパク質
［１２４の検出のために独特のマウスモノクローナル抗
体の組合わせをプローブとして用いた診断試験に関する
。

（従来の技術および発明か解決しようとする課題）ＡＩ
ＤＳは、親密な性的接触、または汚染された血液もしく
は血液製剤に暴露することにより伝播する感染性の致死
性疾患である。ＨＩ　Ｖ　−１には、以前、ヒトＴ細胞
すンパ趨向性つィルスＩＩＩ型（ＩＩ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　Ｔ
ｌ１）、リンパ節障害関連ウィルス（ＬＡ■）およびＡ
ＩＤＳ関連ウィルス（ＡＲＶ）と命名されていたウィル
スが含まれる。Ｉ−＋　１　Ｖ　−１は、インヒトａで
の特性、形態学的特徴およびヌクレオチド配列に基づい
て一群の細胞毒性レトロウィルス、すなわちレンチウィ
ルスに関係する［ゴング（Ｑ　ｏｎｄａ）らの５ｃｉｅ
ｎｃｅ（１９８５）２２７　：　Ｉ　７７〜１７９．ス
テファン（Ｓ　ｔｅｐｈａｎ）らのＳ　ｃｉｅｎｃｅ（
１９８６）２３　＋・５８９〜５９４１ ＡＩＤＳを診断するだめの現在のところ最ム信頼性の高
い方法は、ＩＴＩ’ｌ−１の構造タンパク質に対する血
清抗体を試験することである。これらの試験は感度が高
いものの、血液中に抗体が存在することはＩ−１１Ｖ　
−、−１に以前暴露されたことを示すだけであって、Ｈ
Ｉ　Ｖ　−１感染の存在を示すものではない。ざらに、
−次感染かなされた場合でも、ＨＩ　Ｖ−１血ｔｔｔ変
換により人々が感染するまで６〜８週間までの時間経過
かあり得る［ターパー　（Ｃｏｏｐｅｒ）らのＬａｎｃ
（！Ｌ（１９８５）Ｉ　：５３７−５４０、ポー（ｒ−
１ｏ）らのＡｎｎ、　Ｉ　ｎｔ、Ｍｅｄ、（１９８５）
１０３：８８０〜８８３］。このＭ間の間にウィルスは
宿主内で活発に増殖しているからしれず、それゆえ、・
この宿主は感染血液として血清学的に陰性の源となる。

従って、輸血による感染の蔓畑を防ぐために、血清変換
に先立つ期間の間にウィルス感染を検出する必要性が存
在する。

感染個体中で１−１１　Ｖ　−１を検出するために最ら
広く用いられている方法としては、感染血液または血球
からウィルスを単離し、ついで該ウィルスをリンパ球培
地中でインヒドロ増殖させる方法がある。インビトロの
複製ウィルスは、逆転ち゛酵素（ＲＴ）レベルの測定、
ウィルスタンパク質の免疫細胞化学的染色、電子顕微鏡
および核酸ブローブハイブリダイゼーンヨンにより検出
することができる。ウィルスのインヒドロ培養および単
離は大変な労力を要する上に技術力の差により影響を受
けやすく、日常的な診断法として使用するには実際的で
ない。

最近になって、感染者の血清や他の体液中のＨＩＶ−１
抗原を検出するための酵素イムノアッセイ法が開発され
た［グッズミヅ）　（Ｇ　ｏｕｄｓｍｉＤらのＴｈｅ　
Ｌａｎｃｅｔ（１９８６）２：ｌ　７７〜Ｉ　８０；ア
レン（Ａｌｌａｉｎ）らのＢｒ１ｔ、Ｍｅｄ、Ｊ　、（
１９８６）２９９３：１４５９〜＋４６２．カルーソ（
Ｃａｒｕｓｏ）らのＪ、Ｖｉｒｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ（
＋　９８７）ｌ　７：１９９〜２！０コ。これらの酵素
イムノアッセイ法は、容易に行うことができ、ＨＩ　Ｖ
　−１に対して特異的であり、従来のＲＴアッセイに比
べて感度が高い。

これらのアッセイを使用し、ハイリスクの個人に長期的
な研究を行うことにより、ＨＩＶ−１抗原血症、コアタ
ンパク質ｐ２４に対する抗体の低下、および無症候の血
清陽性からフルブラウンＡ、　Ｉ　ＤＳに至るまての疾
但の進行の間の明確な相関が確立された１ボール（Ｐａ
ｕｌ）らの、Ｊ　、Ｍｅｄ、　Ｖ　１ｒｏ１．（１９８
７）２２：３５７〜３６３・ラッグ（Ｌ　ａｎｇｅ）ら
のＢｒ１Ｌ、Ｍｅｄ、Ｊ　、（１９８６）２９３　：Ｉ
　１１５９−１４６２、グツズミツトらのＣｏｎｃｉｓ
ｅ　Ｃｏｍｍ、（１９８６）＋５５：５５８〜５６０　
　ラングらのＴｈｅＬａｎｃｅｔ（１９８７）２月　１
９０］。Ｊ川えて、ＡＺ′ｒで治療した中、者において
ＨＩＶ−１ｐ２４抗原の有為の減少か観察された［ヂエ
Ｊソン（ＣｈａｉＳｓ。

ｎ）らのＮｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、（１９８６）３
１５：１６１．０〜１６＋１１゜これらの研究は、＋１
１　Ｖ１コア抗原か感染の初期診断および疾但進行の重
要な血清学的マーカーであり、Ａ　Ｉ　Ｉ）　Ｓ　ＡＥ
、Ｈにおいて抗ウィルス療法をモニターする丸めの手段
となり得ることを示している。

（課題を解決するための手段） 本発明は、ヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧによっては認識され
ないＩＮＶ−１ｐ２４−１−のエピト−プに対する特與
性を有するモノクローナル抗体該モノクローナル抗体を
産生ずる不死性哺乳動物抗体産生細胞株； 生物学的試料中のＨｒＶ−１ｐ２４抗原を検出するため
のイムノアッセイ法であって、抗体部分がモノクローナ
ル抗体の混合物からなる抗体／抗原複合体を生成させ、
その際、該混合物の少なくとも１つの抗体がヒト抗１（
ＴＶ−１ＩｇＧによっては認識されないエピトープと結
合することができ、該混合物の他の少なくとら１つの抗
体が１−１１Ｖ−１ｐ２４の異なるエピトープと結合す
ることができるようにし、生成した抗体／抗原複合体の
存在または量を決定することをも認識する方法：生物学
的試料中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原を検出するためのイム
ノアッセイ法であって、（ａ）固相支持体をヒト抗１（
ＴＶ−１ＩｇＧでコーティングし、 （ｂ）該コーティング支持体を生物学的試料と接触さけ
、インキュベートし、洗浄し、 （ｃ）該支持体を、モノクローナル抗体３１−４２１９
とモノクローナル抗体３１−９０−２５とからなるモノ
クローナル抗体混合物と接触させ、インキュベートし、
洗浄し、（ｄ）該支持体を、西洋ワサビペルオキシダー
ゼを結合した抗マウス抗体またはその断片と接触させ、
インキュベートし、洗浄し、 （ｅ）該支持体を０−フェニレンジアミン−過酸化水素
溶液と接触させ、ついで （ｆ）発色生成物の４９２ｎｍにおける吸光度を測定し
て試料中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の存在を検出する、こ
とをも認識する方法；および 試験試料中のＨＩＶ−１９２４に対する抗体の存在また
は量を決定するためのイムノアッセイ法であって、 （ａ）試験試料を、ウィルス性ＨＩＶ−ｔｐ２４タンパ
ク質または組換えＨｌｌ−１ｐ２４タンパク質内にある
標的エピトープとｆ昆合し、該混合物をインキュベート
し、 （ｂ）該混合物を、固相支持体に結合したヒト抗ＨＩＶ
−１ｐ２４　ＩｇＧ、およびモノクローナル抗体３１−
９０−２５とともにインキュベートし、ついで （ｃ）試験試料中のＨＩＶ−１ｐ２４に対する抗体の存
在または壜の指標として、固相支持体に結合したまたは
結合していない３１−９０−２５の存在または虫を決定
する ことをも認識する方法を提供するものである。

本発明により、ＨＩＶ−１ｐ２４に対するマウスモノク
ローナル抗体が提供される。本発明のモノクローナル抗
体は、高い特異性を有する試薬であり、ＨＩＶ−１９２
４を検出および／または捕捉するように設計されたイム
ノアッセイにおいて用いる。ＨＩ　Ｖ　−１感染の性質
および社会的重要性についでの利用できる情報から、Ｈ
Ｉ　Ｖ　−１ｊこ感染した人々における血清変換に先立
ってＨＩ　Ｖｌ抗原、とりわけＩ）２４抗原を初期に検
出する必要性が確立されている。

本発明により、２種のモノクローナル抗体の混合物をブ
ロー・ブとして用いた、ＨＩＶ−１ｐ２４を検出するた
めの高感度診断アッセイ法が提供される。そのうらの１
つのモノクローナル抗体（３１−４２４９）は、血清陽
性個体からの血清によっては認識されないＨＩＶ−１９
２４上の独特のエピトープを認識する。加えて、ＨＩＶ
−１９２４の高免疫原性領域内のエピトープを認識する
もう１つのモノクローナル抗体（３１−９０−２５）も
また本発明のアッセイに用いられる。これら２つのモノ
クローナル抗体は、ＨＩＶ−ｐ９２４に相乗的に結合す
る、すなわち、一方のモノクローナル抗体の結合が他方
のモノクローナル抗体の結合を促進することがわかった
。この相乗作用は、ＨＩＶ−１感染患者の血清、血漿ま
たは他の体液中のＩ（ＩＶ−１ｐ２４を検出するための
酵素イムノアッセイにおいて活用されている。

本発明の特に好ましいアッセイにおいては、捕捉抗体と
しての抗ＨＩＶ−１ヒトＩｇＧをコーティングしたポリ
スチレンビーズを用い、ＨＩＶ−１９２４を検出するた
めのプローブとしてモノクローナル抗体３１−４２４９
および３１−９０２５を溶液中で一緒に用いる。３１−
４２４９が基本的なモノクローナル抗体であり、これが
モツクローナル抗体３１−９０−２５と組合わされてＨ
ＩＶ−１ｐ２４の検出のための最適のアッセイ感度が得
られることがわかった。また、所望の感度およびスピー
ドを得るために、種々の別の手順を用いることができる
。別の態様において、これら２つのモノクローナル抗体
は、ポリスヂレンピーズ十、にコーティングしたときに
ＨＩＶ−１ｐ２４に対する捕捉抗体として首尾よく用い
ることができるっ さらに、モノク［７−ナル抗体３１−４２４９はまたＨ
ＩＶ−２ｐ２４をも認識する。この１１１Ｖｉｐ２’４
およびＨＩＶ−２ｐ２４の両方を検出するという３１　
−４２４９の独特の性質は、１−（Ｉ　Ｖ感染を無識別
にスクリーニング−４−ろよう設計したイムノアッセ−
１′において活用することか−ζきる。加えて、モノク
ローナル抗体３１　４２１９は、ｆｌ［Ｖ−２ｐ２４の
検出のためのブＯ−ブとして用いることかできる、。

さらに、モノク〔Ｊ−ナル抗体３１−９０−２５は、生
物学的試料中の抗ＨＩ　Ｖ−用コア抗体を検出するため
の競合プローブとして用いることができる。

以Ｆに本発明をさらに詳しく説明する。

本発明は、２つのモノクローナル抗体をブ［１−ブとし
、て用い、感染患者の体液中にビコタラム噴で存在する
ＩＩＩＶ−１ｐ２４を検出４゛るための新規な手段を提
供するしのである。本発明のこの高感度酵素イｌ、ノア
ッセイは、モノクローナル抗体３１−４２４９の特性の
ゆえに独特のものである。モノクローナル抗体３１−、
、、４２４９によ・・て認識されるエピトープは、ＨＩ
Ｖ−１９２４のカル七゛ギンル末端の方にマツピンク述
ておＱ、ヒトにおいては免疫原性を（ｆしない３３本発
明のアソセ（に用いる第一二、のモノクローナル１１１
一体は、１−（ＩＶ、−、Ｉｐ２４の商免疫原性ｆＩ負
域内の」、ビ）・−プを＝ｇ識し、ｌ１ｌＶ−１ｐ２４
のアミノ末端の方にマノビッグしている。モノクローナ
ル抗体３１−＝１２１９および３１−９０−２５は、ｔ
（ＩＶ−ｉＰ２４に相乗的に結合する。別法として、本
発明のアー・セイに用いたモノク［７−ナル抗体の少な
くとも１つのＦ　（ａｂ’　）？もしくは他の抗原結合
断片を用いることかできる。

加えて、生合成的に標識したＨ　Ｉ　Ｖ　−２感染細胞
から３１４２４９がＩ−ｆ　Ｉ　Ｖ−２ｐ２　、ｉを免
疫沈降させることかできることから示されるように、モ
ノクローナル抗体３１−４２４９によって認識されるエ
ビ１−−ブハ［ｉ　Ｉ　Ｖ−２ｐ２４　にノエビトーブ
と抗原的に交差反応性である。

ＨＩＶ−１ｐ２４のノニめのプローブの１戊分の１つと
して用いることに加えて、モノクローナル抗体ｊ３１−
９０−２５は、適当に標識したと、きは、♀ＩＩ換え由
来Ｉ−■■Ｖ−１ｐ２４への結合についで血清試料中の
トＩＩｖ−１コア抗体に対４″る競合ブ〔！−ブとして
用いろ、二とかできる。ｊ二とえば、］・−ｒ　＞　（
Ｉ）ａｗｓｏｎ）らの木国特Ｊ′に出願第０２０．２８
２ぢ°明細吉（ｉ、９８フイｆ２Ｊｊ２７日出願）に開
示されているように、ＨＩ　Ｖに対する抗体のイムノア
ッセイにおいてＨＲＰ　Ｏ標識３［−９０−２５を用い
ることができる。

他の観点１−おいて、本発明は、マウス由来細胞株ＡＴ
ＣＣ１１９７２６および７　ラフ、山米ｄｌ　ｌＩＦ！
１株Ａ　Ｔ　ＣＣＩ−Ｉ　Ｉ３９７２５　テ例示すレル
新規ナハイブリドーマ細胞株、および該細胞株から分泌
された、それぞれ３１ｉ２　１９および３１−９０−２
５で例示される新１．ｔｌｊイモ７ノタＩ：ｌ−ナル抗
体を提供計る。

本発明の特に好ましいｆＱ様において、Ｉ−１１Ｖ１ｐ
２４を含んでいると思われる生物学的試ｔ［を、モノタ
ローナル抗体３１−□□　４２−ｌ　９とモ５ツタ［Ｊ
−ナル抗体’、３１−９０　２５との混合物、わよび抗
ｌ１１ｖ−１ＩｇＧ（ＩＩＩＶ　−１ｐ２４Ｌ：ついで
面端陽性の（ｌ＾１体の而ｔ１１ｆから精製）でコーテ
ィングしたポリス子Ｌ７ノヒーズとともにインギコヘー
ト４″る。、洗浄悴、結合したマウスモノクしｌ−ナル
抗体のＩｒｔ（ヒーズトに捕捉されたＩＮＶ−１ｐ２４
の４ｉｔに比例上る）を西洋ワサビペルオキノグーセ標
識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて決定する。別法としては
、上記モノクロ−＋ル抗体混合物を固相上にコーティン
グして抗体を捕捉するようにオろことらできる。たとえ
ば、米国特許第４，７４８゜１１０号明細書（１９８８
年５月３■日発行）に開示されているように、この混合
物をイムノアッセイの固相支持体にコーティングしてＩ
（ＩＩ−１（ＨＴＬＶ−１１１）を検出ずろために用い
ることかできる。

加えて、上記モノクローナル抗体３１−４２４９および
３１−９０−２５は、各モノクローナル抗体に適当な標
識を施して、固定化細胞を用いた検出系において用いる
ことができる。これらの抗体はまた、アフィニティーク
ロマトグラフィ〜によりＨＩＶ−１ｐ２４を精製するた
めに用いることができ、特にモノクローナル抗体３１−
４２１９はｌ−１１Ｖ−２１）２４を精製するために用
いることができる。

本発明の方法により容易に試験することができろ生物学
的試料の例としては、全血、血清、血漿、脳を髄液およ
びリンパ球らしくは細胞培養上清なとのヒトおよび動物
の体液が挙げられる。加えて、試験試料は、不活化した
全ウィルスまたは部分的に精製した天然らしくは組換え
ＨＩＶ−１ｐ２４でもよかった。本発明のイムノアッセ
イに用いることのできる固相支持体としては、反応トレ
イのウェル、試験管、ポリスチレンビーズ、ストリップ
、膜、微細粒子、および当業者に知られた他の固体マト
リックスが挙げられる。検出可能なシグナルを生じさせ
ることのできるあらゆる標識または酵素増幅系を、本発
明のイムノアッセイに用いることができる。代表的な標
識としては、酵素標識、放射性同位体標識、蛍光標識お
よび化学発光標識がある。さらに、ビオチン／標識抗ビ
オチン系のようなハプテン／標識抗ハプテン系を本発明
のアッセイに用いることもできる。加えて、上述したモ
ノクローナル抗体を検出するために、標識抗イデイオタ
イプ抗体を用いることらできる。

本発明のアッセイのための試薬は、キットの調製に申し
分なく適している。そのようなキットは、バイアル、び
ん、試験管などの１または２以上の収容手段を密に詰め
て入れるための区画化されたキャリヤ手段を含んでいて
よい。各収容手段は、本発明の方法に使用する要素を別
々に含んでいてよい。

つぎに、本発明を実施例に居づいてさらに詳しく説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。これら
の実在例は、本発明の同点を示すしのであり、（ａ）Ｈ
Ｉ　Ｖ　−１ｐ２４コアタンパク質のある種のエピトー
プに特異的に反応ずろモノタローナル抗体の開発および
特徴付け、ａびに（ｂ）生物学的流体中のＨＩＶ−１ｐ
２４を検出するための高感度診断試験の開発に関するも
のである。

さらに、各実施例を筒型に説明すると、実施例１および
２は、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細
胞株を生成する手順に関する。実施例３は、モノクロー
ナル抗体３１−４２４９および３１９０−２５のスクリ
ーニング、クローニングおよび特徴付けに関する。実施
例４は、抗体産生を増幅させるために用いた方法に関す
る。

実施例５は、モノクローナル抗体３１４２４９および３
１−９０−２５の活性、特異性およびエピトープマツピ
ングを決定するために行ったアッセイに関する。実施例
６は、上記モノクローナル抗体を用い、生物学的流体中
のＨＩＶ−１ｐ２１１を検出するための酵素イムノアッ
セイ（Ｅｌ、Ａ）の開発に関する。実施例７は、これら
モノクローナル抗体のＡＩＤＳ診断における臨床的有用
性を説明するための別のアッセイ手順に関する。

実施例し マウスの免疫 ハイブリドーマ細胞株３１−４２４９および３１９０−
２５を産生させる手順において、ＢＺＨ−７’ウス［キ
ラ・デーピッド（Ｃｈｅｌｌａ　Ｄａｖｉｄ）、免疫部
門、マヨ・クリニック（Ｍａｙｏ　Ｃ１１ｎｉｃ）、ロ
チニスター、ミネソタから入手コを、最初に部分的に精
製し界面活性剤で破砕したＨＩＶ−１［ガロ（Ｒ、Ｃ、
Ｇ　ａｌｌｏ）、ナショナル・インスヂチュート・オブ
・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　
ｏｒ［Ｉｅａｌｔｈ）から人手したＨ　’ｒ　Ｌ　Ｖ　
−ＩＩＩ原ｇ株］で免疫し、融合直前に組換え由来の精
製ｐ２．４をブースター投与する。感染Ｈ９細胞からの
ｔ■ｒ　Ｖ　−１の部分精製は、（ａ）メンブランフィ
ルタ−によ１・月１１Ｖｌを細胞から分離し、（ｂ）Ｉ
−（Ｉ　Ｖ　−１を含む細胞培養液を濃縮し、（ｃ）超
遠心／；Ｆ離により・：ノイルスを集め、（ｄ）ウィル
スを再懸濁して２０％ンヨ１糖パッドへの遠心分離によ
り集め、（ｃ）約１．１６の密度でＨＩ　Ｖ　　ｌのシ
ョ糖密度勾配バンドを生成させ、ついで（ｒ）バント生
成したウィルスを超遠心分離して濃縮＋１１　Ｖ−川を
回収−４”ることにより行った。１目〜７１の破砕は、
０．５％トリトンＸ−１ｏｏをｊ）１１え、−）いで激
しく超ン五波処理４′ることにより４ｉ−・た。全長組
換えＨＩＶ−１ｐ２４は組換えＤＮｚＮ法にｊ；り大腸
菌中で製造し、アフィニティータ【！マドグラフィーに
より精製しノニ（米国特許出願下０２０，２８２号明Ｕ
ｎ−Ｙ参、照）３、簡単に説明オると、ｐＢｌと命名し
、たＰｖｕ（１からｎｇｌｌよでの９５１ｂｐ制＋＋ｌ
ｄ酵素断片を＾むプラスミドを全長ｔｌｌＶ−１ｐ２，
１を製造・Ｐへく誘導し１、ライで組換えＨＩＶ−１ｐ
２４を精製１−タ。

第一１」目に、フロイント完全アノコバン）−（：、’
フコ・ラボラトリーズ：　０　、４　ｚ＆）中の破砕［
１１Ｖｌ（１０７ｚ９）を、０　、　ｌ　ｍＱずつ４つ
の顕なる部位にマウスに皮Ｆ（ｓ、ｃ、）ｊ；よび腹腔
内（ｉ、ｐ、）投与した。２回目の免疫は１４Ｉ」後に
行い、フ〔１イント不完全ア：）、：Ｉパン）（０，３
ｍ＋り中のＨＩ　Ｖ　−、、Ｉ　Ｃｌ０１１９）をマウ
スに皮下（ｓ、ｃ、）および腹腔内（ｉ、ｐ）投与した
。２　”ｌ　［１［１にマウスを、）［ｊインド完全ア
ジコバシト（０，２ｙ１２）中のｉＮ！Ｖ−１，（１０
１）およびニス°ヂフイムリウム（Ｓ　、ｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ）抽出物［ＲＩ　Ｌ（Ｉイムノケミカルズ（
ｌ　ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａＩｓ）３（４ツノ９）で
免疫した。６３　Ｅｌ　ｔｉにマウスを、フ（１インド
完全γツユ］パン！・（０、２Ｒ＆）中ノＨＩＶ−ｉ　
（１（ｌ　ｔｉいで免疫１．た１、１５１」、３６ト１
および７０　Ｅｌ　［ｌに“２ウスを採血さｌた。免疫
したマウスの免疫応答は、酵素結合イノ−２，ノアＪゼ
？お３ＬびウェスタンプＣ’ｌ−）ティー・グ法により
抗１日■Ｉ抗体についで血清をアｌセイ＋ろごとにより
）ｉ・ド価した１、杓１４箇月後、マウスを組換えＩＩ
　Ｉ　Ｖｌ　ｐ２４抗原の前融合（ｐｒｅ　−ｆ’ｕｓ
ｉｏｎ）ブースター投ｌすにより免疫１−ｆこ。

（Ａ）酵素結合イノ・ノアノセイ（ＥＩＡ）免疫してい
ないマウスまたは免疫したマウスからの血清を、ｐＯｍ
Ｍリン酸カリ・′ノ１、（ｐＨ７，４）、０１５〜ｌＮ
ａＣ１，１２０％正常ヤギ血、青、１００ｂウン胎仔血
清、５ｍＭ　Ｌ＞ＤＴ　、Ａ、　　ｌ　ＯｍＭ　ＥＧ　
Ｔ八、５０ｍＭ　　トリスバ・！ファー（ｐ［−１８，
０）、０２％ツイーン２０、および防腐剤としてのアノ
化す）、すｒ゛ツム含ｆＪ−、（−る苗択・くＩツー？
−中て系列局ｆｋｌした。希釈１］１１清を、部分精製
１ｉ１ＶＩを油接コーティングしｆこ１／′４“ボリス
チレンドーズ、まｊ：：　！Ｊ：　ヒｈ　ｆ＞’ｆｆ　
Ｉｔ　Ｉ　Ｖ−１抗体（Ｉ（ＩＶ−１陽Ｐｉ：　（Ｍ１
体力而面から精製）を介しごドーズに結合、３ｄたＨＩ
Ｖ−１ど反応さｔｉ−１こ、、４０℃で２時間後、ピズ
を洗浄し、ヤギ抗、マウスｌ　ｇＧ　（Ｈ４−Ｌ　）西
〆ＴワサヒヘＩＬ４；’ｉ’−ノア’−ゼ（１−１ｎ　
Ｐ　Ｏ）ｉＪｉｌＭＡ：体［キＡリーガール・アント・
べり−・ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｃｇａａｒｄ＆Ｐｅ
ｒｒｙ　Ｌ、ａｂｏｒａｔ、ｏｒｉｃｓ）］を加えた。

し−ズを４０℃で２時間インギコーベー１・し、洗浄１
７．０−’ノ工二Ｆ、・ニジアミン　２　［Ｉ　ＣＩ（
ＯＰ　Ｉ）　）発色試薬を含む反応！！′、：、：にｆ
’６　Ｌ　）コ、、室温、暗所にて反応を３０分間行い
、ついでＩ　Ｎ　）［ｔ　Ｓ　Ｏ４（ｌ　ｍＱ）を加え
ることにより反応を停止［−させ、４９２／６００膝に
お＋する吸光度を記録（また。吸光度は、ドーズに結合
１７八ＩＩ　Ｔ　Ｖ−１特ｌ聞的マウス抗体のＩＩｔに
正比例した３、ビーズ十、の１４１　Ｖ−１抗原に２１
するマウス抗体の持毘性ば、ドーズ１−のＩｔ　！　Ｖ
−１への結合に関する競合剤キしてヒ＋−ｏ　１　％ｉ
′−１血清陽性血清（２０〜５０１ｉＱ）を反応中に１
ｊ１１えることにより確認さイまた。

（１，３）ウェスタンプし２１ティンｔ、ｆ法部分精製
＋−ｉ　Ｉｖ−＋　（約５００μリタ・トデ、／ル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）お上び２−メルカプトＪタノ・−
ルで９５℃にて姐理ｌ−１１２％ポ１じ？バリルアミド
Ｓ　Ｄ　Ｓゲル中で−１に気体動にかけ、ｉｌ、：　（
レムリ（Ｌ、ａｐｍｍｌｉ）らのＮａｔｕｒｅ（ｉ　９
７０　）２２７　：６８０〜６８５Ｌケルから二ｌ・〔
！セルロースへ・・９タシペク質の（３動を、２５ｍ＼
・目・リス（ヒト〔ｌキノメチルアミノメタン）、１９
２ｍ！ν１グリノンおよび２（）％メタノールからなる
標へｆ″柊動ハソ：ｙ　−、−−−（ｐ＋＋８３）中、
１０（ｌリアンペアで−”ｒｌ　；ｔｉ気泳動にかける
か、またはｌ　Ｏア〉ベアで１〜２時間電気泳動にか（
することによりイ１つたしトウヒ〉（′Ｉ″ｏｗｂｉｎ
）らのＰ　ｒ＜）ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、（１９７９）７３：４３５０〜４３５４］。ウィルス
タンパク質を移し、Ｏ，ｌ５ＭＮａＣ１を含む１０＋ｎ
Ｍトリスバッファー（ｐＨ８，０）中で希釈した２０％
０％ラン血清でニトロセルロースをブロッキングした後
、ニトロセルロースをストリップ（各ストリップはウィ
ルスタンパク質を約１５μ９含有する）にカッティング
し、ついで、これを試験血清（または他の試料）中の抗
ｔ（ｔ　Ｖ　−１抗体の存在を決定するために用いた。

ニトロセルロースストリップからなる反応混合物を、バ
ッファー（２０ｍＭトリス、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２
Ｍ　ＮａＣ１，０，３％トリトンＸ−１００およびラン
血清アルブミン２ｍｇ／ｍ（１、ｐＨ７，５８２，５ｘ
１２）中の適量の試験試料とともに室温にて１〜２時間
インキュベートした。ストリップを緩衝洗浄液（０，１
％ＳＤＳおよび０．５％トリトンＸ−１００を含有する
ｌ０ｍＭリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，
５）で洗浄し、ついでＴ−Ｉ　ＲＰ　Ｏに結合したヤギ
抗マウス１ｇＧ抗体を加えた。ストリップを室温にて１
〜２時間インキュベートし、ついで緩衝洗浄液で洗浄し
た。最後に、新たに調製したＨ　ＲＰ発色試薬（バイオ
ラド）（１２０ｘｇ；水冷メタノール４０肩σ中に溶解
し、ついで３０％過酸化水素１２０μＱを含有するトリ
スバッファー食塩水２００ｍ（１，ｐＨ７，８中に希釈
したもの）を加えることにより、ウィルスタンパク質に
結合した抗体を視覚化した。このアッセイにより、特定
のＨＩＶ−１タンパク質に対する抗体の存在が示された
。

実施例２（細胞融合） 免疫マウスの血清中に特異的な抗ＨＩ　Ｖ　−１抗体が
妥当な力価で存在することが示されたら、抗原を面融合
ブースター投与する前にマウスを休ませた。抗原の前融
合ブースター投与は、精製した組換えＨＩＶ−１ｐ２４
（約２００μ０．）を静脈（尾静脈）注射することによ
り行った。３日後にマウスを層殺し、牌臓（抗ＨＩ　Ｖ
　−１抗体産生細胞を含む）を取り出し、単一の細胞ま
で破砕した。単一細胞の懸濁液を０．８３％Ｎ　Ｈ、Ｃ
Ｉで処理して赤血球を除き、ついで５Ｐ２１０細胞とｌ
Ｏ：Ｉ（ＳＰ２１０：牌臓細胞）の比で混合した。混合
した細胞を遠心分離にかけ、無血清培地で１回洗浄し、
ついで再び遠心分離にかけた。融合剤（「ｕｓｏｇｅｎ
）としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用い、免
疫トナー牌臓細胞とミエローマ細胞株Ｓ　Ｐ　２１０（
ＩＩＰＲＴ陰性）とのハイブリットを生成させた［コー
ラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）のＮａｔｕｒｅ（１９７５）２５６　：４９４
、およびモノクローナル・ハイブリトーマ・アンチホデ
ィーズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）：テクニークス・アンド・アプ
リケーソヨノズ（Ｔ’ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、バレル（１−（ｕｒｒｅｌ
　１）編（ＣＲＣプレス、Ｉ　９８２）に概説されてい
る］。

簡単に説明すると、脾臓細胞と５Ｐ２１０細胞との融合
は、無血清イスコー改変ダルベツコ培地（Ｉｓｃｏｅ’
ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄ
ｉｕｍ、　　ＩＭ　Ｄ　Ｍ　）中の４０％ＰＥＧ（ＡＴ
ＴＣ１分子量１３３〜＋６００）にペレットを２分間浸
すことにより行った。無血清［ＭＤＭ（２０ｚ（りを５
分間かけて加えることにより、ＰＥＧと細胞懸濁液をゆ
っくりと希釈し、ついで遠心分離により細胞を集めた。

上清をデカントし、Ｈ／〜Ｔ（ヒボキサンチン、アミノ
プテリンおよびチミジン）添加２０％０％ラン血清（ハ
イクローン）を含有するＩＭＤＭ（３０ｍＱ）で置き換
えてハイブリドーマを選択した。

１匹の非免疫Ｂａ１ｂ／ｃマウスからの牌臓細胞もまた
、供給細胞層として加えた。３つの９６ウ工ル組織培養
プレート中に細胞を０．１ｍＱ／ウェルにてブレーティ
ングした。３日後に、さらに０．１．＋１ＱのＨＡ　Ｔ
培地を各ウェルに加えた。その後１週間毎に、培地の半
分を１−（Ｔ　（ヒボキサンチンおよびチミジン）添加
２０％ウシ胎仔血清（ハイクローン）を含有するＩＭＤ
Ｍで置き換え、ハイブリトーマをさらに７〜１４日間増
殖させた。

ハイブリドーマのあるものは、ＨＩ　Ｖ　−１に対する
抗体を産生ずる牌臓細胞が５Ｐ２１０細胞に融合したら
のからなっていた。簡単に説明すると、融合剤は牌臓細
胞膜と５Ｐ２１０細胞膜との間の融合を促進し、両細胞
の核を含有するヘテロカリオンを生成する。結局、異な
る核か融合して同調有糸分裂の可能な単一の核が生成さ
れる。融合細胞が分裂すると、ハイブリトーマは古核の
染色体を失うことによって安定化する。多数の９６ウエ
ルプレート中に融合細胞を１０５〜ｌＯ６細胞／ウエル
にてブレーティングする。、５Ｐ２１０：牌臓細胞融合
から生成したハイブリドーマ細胞は、■１ＡＴ培地中で
培養することにより選択的に増殖させる。すべての非融
合Ｓ　Ｐ　２１０細胞または５Ｐ２１０・Ｓ　Ｐ　２１
０融合細胞はアミノプテリンにより増殖が妨げられ、非
融合牌臓細胞または牌臓牌臓融合細胞は培養液中で次々
と死に絶えてゆく。５Ｐ２１０：脾臓細胞ハイブリドー
マのみが、１−Ｉ　Ａ　ｉ’選選択培地室増殖するであ
ろう。

実施例３（モノクローナル抗体３１４２４９および３ｉ
９０−２５のスクリーニン グ、クローニングおよび特徴付け） １０−１＝１０後、実施例１に記載し八ＥＩＡおよびウ
ェスタンブロッティング手順を用い、ハイブリドーマ細
胞増殖物を含有するウェルからの培養液を、ＨＩＶ−１
ｐ２４に対する抗体に−）いてスクリーニングした。加
えて、組換えＤＮＡ法により大腸菌中で産生させたＩＩ
ＩＶ−１ｐ２４（ｒｐ２４）を用いたＥ［Ａをもスクリ
ーニングに使用した。簡単に説明すると、ヒトＩｇＧ（
抗ｐ２４血清陽性の個人から精製）をコーティングした
ポリスヂレンビーズを、全長組換え由来ＨＩＶ−１ｐ２
４の粗製の大腸菌抽出物と反応させた。その結果得られ
たヒース（ヒトＨＩ　Ｖ−１抗体を介して結合したｒｐ
２４を有している）を、ハイブリドーマ培養液と４０°
Ｃで４時間、または室温で一夜反応させ、洗浄し、ＨＲ
Ｐ　Ｏ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）と４０°Ｃで２
時間反応させた。再び洗浄した後、ヒースを反応管に移
し、実施例１に記載したように（Ｉ　Ｐ　Ｄ基質を加え
た。

単一の融合（＃３１）から、ハイブリドーマ細胞が増殖
しコロニーの生成した２１個のウェルが同定された。各
ウェルからの培養液を、ＥＲＡおよびウェスタンブロッ
ティング法によりＨＩ　Ｖ−１ｐ２４に対する抗体につ
いでスクリーニングした。

２１個のウェルのうち、１５個のウェルか１１１　Ｖ１
ｐ２４に対する抗体を含有−４゛るハイブリトーマとし
て同定された。これら１５個のｈウェルからの細胞を複
数の２４ウエルプレート中に広げ、抗ＨＩＶ−１９２４
抗体の存在についで培＃：ＩＬ１Ｋを再びアッセイし、
実施例１に記載したようにヒト抗１（Ｉ　Ｖ　−１血清
を用いた競合ＩＩ−，Ｉ　Ａにより確認した。１５個の
ウェルのすべてが抗ト目ｖ−＋ｐ２・１抗体に関して陽
性であり、限界希釈法によるクローニングのため各ハイ
ブリトーマをＴ２５フラスコ中にさらに広げた。広げた
各ハイブリドー−７を、！０５〜＋０６の希釈にて９６
ウエルマイクロタイタープレート中にブレーティングし
、１０〜２１日間増殖させた。ｌ−１１Ｖ　−１に対す
る抗体を産生すると同定されたクローンを有する１３の
ハイブリドーマのうち、融合＃３１のハイブリトーマ＃
４２からのクローン＃ｌ９（ｒ３１−４２１９」と命名
）および励合岑３１のハイブリドーマ＃９０かラックａ
−：／＃２５（ｒ３１−９０−２５　Ｊと命名）があっ
た。クローンは、ゴーディング（ＪＷ　、　Ｇ　ｏｄｉ
ｎｇ）の［モノクローナル・アンチボディーズ：プリン
ノブルズ・アンド・プラクディス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）ｊ（アカデミツクプレ
ス、ＮＹ、１９８３）に略述されているカイトラインを
用いた限界希釈法により得た。

モノクローナル抗体３ｉ４２４９のイソタイプはＩｇＧ
Ｉであることが決定され、モノク（Ｊ−ナル抗体３１−
、−９０−２５のイソタイプはＩｇＧ２ａであることが
決定された。ＥｒＡイソタ５イブ手順にはヤギ抗マウス
免疫グロブリンをコーティングしたマイクロタイターブ
レー１・を用い、これをクローンの培養液ととしにイン
キュへ一トシて分泌されたマウス抗体を捕捉した。２時
間後ＩＪプレートを洗浄し、ウサギ抗マウスイソタイプ
をさらに２時間かけて加えた。プレートを再び洗浄し、
Ｆｔ　Ｒｐ　ｏ結合ヤギ抗つサギＩｇＧを１時間かけて
加えた。過剰の結合体を洗浄により除き、ついでＯＰＤ
基質を加えた。マウス免疫グロブリンに結合したウサギ
抗マウスイソタイプのｈｌは、・１９２ｎｍにおける吸
光度と正比例した。両モノクロ−づル抗体の特徴付けを
、マウス腹水からの抗体を用いてさらに行った。

％−，ｊｉｆｊＰＩ　４　（腹水法による抗体収率の増
幅）−層多量のモノクローナル抗体を得るため、前以て
ブリスタン（２，６，Ｉ　Ｏ，１４−テトラメチルペン
タデカン）（０、５ｚＣ）て腹腔内処理したＢａ１ｂ／
Ｃマウス中に所望の抗体（３１−４２４９または３ｉ９
０−２５）のクローン細胞（１〜２ｘｌＯ′個）接種し
た（バレルらの上記文献に概説された方法）。ブリスタ
ン処理によりマウス腹腔内でのマウスミエローマハイブ
リトーマの増殖が高められ、生じた腹水液はハイブリト
ーマ細胞により分泌さイまたモノクローナル抗体に富ん
でいる。モノクローナル抗体を豊富に含んだ腹水を生成
させた後（約７日）、マウスを層殺し、腹水を腹腔から
取り出し、遠心分離により清澄化し、−２０℃で貯蔵ｌ
、た。培養液、清澄化腹水または腹水からのＭ　製抗体
についで、プロティンＡセファロース（バレルらのＬ記
文献）を用い、他の特徴付は手順（下記）を行った。腹
水中のモノクローナル抗体の力価の決定をＥＴＡにより
行った（実施例５）。

実施例５（活性、特異性およびエピトープマツピング） 以下の実験を両方のモノクローナル抗体３１４２４９お
よび３１−９０−２５についで行い、これらの活性、特
異性およびエピトープ認識の大略を評価した。

（Ａ）Ｅ　Ｉ　Ａ 実施例１および３に記載したアッセイを用いてモノクロ
ーナル抗体の力価を決定した。簡単に説明すると、清澄
化腹水液またはプロティンＡ精製［ｇＧを、ヒト［ｇＧ
（Ｉ（Ｉ　Ｖ−１血清陽性の個人の血清から精製）を介
して結合した組換えＨＩＶｌ　ｐ２４をコーティングし
たポリスチレンビーズに対して系列希釈中で反応させた
。第１表に示すように、代表的なデータは、陰性コント
ロールと比較したときにモノクローナル抗体の特異的な
反応性を示している。加えて、確立した血清陽性の個人
からの精製１ｇＧを競合インヒビターとして用い、モノ
クローナル抗体３１−４２４９および３１−９０−２５
により認識されるエピトープのヒト免疫原性を決定する
２つのアッセイを行った。１つの手順においては、３１
−４２４９かまたは３１−９０−２５の一定量を含有す
る希釈バッファー（実施例１５２載）中にヒト抗１−１
１　Ｖ　−ＩＩｇＧを系列希釈した。他の手順において
は、各モノクローナル抗体の系列希釈にヒト抗ＨＩ　Ｖ
ＩｇＧを一定濃度（ＩＢ／次Ｑ）で加えた。ヒトＩｇＧ
は、マウスモノクローナル抗体かビーズＪ−のＩＩＩＶ
−１ｐ２４に結合するに際して競合インヒビターと１２
で働いた。抗ＩＮＶ−１ＩｇＧと各モノクローナル抗体
の競合は、競合ヒｔ−１ｇＧを含まないコントロールと
比較したときにビーズに結合するモノクローナル抗体の
量か減少するごとにより示された。第２表および第３表
に示すように、代表的なデータは、モノクローナル抗体
３１４２４９はヒトにおいては直ちに免疫原性ではない
エピトープを認識するのに対して、モノクローナル抗体
３１−９０−２５はＨＩＶ−１ｐ２４の高免疫原性領域
内のエピトープを認識することを示している。しかしな
がら、第３表は、大過剰ノヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧが３
１−．１２１９の結合をある程度妨害し得ることを示し
ている。

第１表（Ｉ（Ｉ　Ｖ　−１，ｐ２４に対するモノクロー
ナル抗体３１−４２４９および３１ 含んでおり、試薬ブランクとして働いた。

（以下余白） ｌ−人（ヒト抗ＨＩＶ−１１μＱの系列希釈を第３表（
３１−４１−１９および３１−９０（注）ａ：３１−４
２４９はＯＮμｍ７／ｊ！ｆ！で加え、抗ＨＩ　Ｖ−１
ヒｌ−１μＱは最初のウェルにはｌＯμｙ／　ｍ（ｌで
加え、つぎの８つのウェルでは系列希釈した。

ｂ：３１−９０−２５は２．Ｏμｉ／ｍＱで加え、抗Ｈ
Ｉ　Ｖ　−、−１ヒトＩｇＧは最初のウェルには２０μ
９．／ｑ（Ｑで加え、つぎの８つのウェルでは系列希釈
した。

（以五余白） （Ｂ）放射性免疫沈降アッセイ ｊ：３ｓｓ］メチオニン／［”Ｓｌノステインで生合成
的に標識したＩ−ｉ　１　Ｖ　−１感染Ｉ−（９細胞溶
解物からのウィルスｐ５５（ｇａｇ前駆体タンパク質）
を免疫沈降させることにより、モノクローナル抗体３１
４２４９および３１−９０−２５の特異性を確認した。

ウィルスタンパク質の免疫沈降アッセイについでは、す
でに記載されている［トバール（１１）ｅｖａｒｅ）ら
のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ、Ｓ　
、Ａ、（１９８６）８３・５７１８〜５７２２］。これ
らの研究に用いた細胞株は、非感染１−１９細胞、ＨＩ
　Ｖｌ感染Ｈ９細胞、または感染ｆ１９細胞に由来する
クローニング細胞株８５Ｇ７であった。クローニング細
胞１ｓ５Ｇ７は、犬Ｆ」のウィルスを産生じた。培谷物
からｔａｌｌ　ｔｌａを集め、メヂオニンとンス→−イ
ンを含まないＲＰＭ　Ｉ　Ｉ　６４０（ギブコ・ラボラ
トリーズ）で１回洗浄し、ついで同培地中に１〜２．５
ｘ　Ｉ　０６細胞／ｍ（ｌで懸濁させた。洗浄した細胞
を６％Ｃ０２中、３７°Ｃで３０〜４５分間インキユヘ
ートし、ついでこの培地にビ５（−１メチオニンおよび
「３５ｓｌノステイン（アマーンヤム）各５０〜１００
μＣ１を加えた。細胞を３７８Ｃで４〜８時間放射性標
識し、遠心分離により回収１２４ｍＭＰＭｓＦ、アブ［
Ｊヂニン（バッファー１１当たり＋００力リクレイン不
活化単位）、１０％トリトンＸ−１００、Ｏ１％ＳＤＳ
および０．５％デオキンコール酸すｌ・リウム（すべて
の試薬はノグマ社からのらのを用いた）を含資４゛るＰ
　Ｂ　Ｓ　（ｐ）１７　、４　）中で溶解させた。溶解
物を１０００００×９で遠心分離にかけることにより清
澄化し、７０℃で貯蔵した。

免疫沈降は、細胞溶解物のアリコート（１００μＱ）を
精製上２ツク〔ｌ−ナル抗体（５０μ９．１０Ｒｙ／ｍ
Ｑストック）、組織培養−１−清（１００７ｉ）マタは
血清（３μＱ、）とと６に４℃で３０〜６０分間インキ
ュベートｉ−ることにより行った。抗体／抗原複合体の
回収は、ウノ血清アルブミン（１，０α９／′ｍ（１）
を合資する溶解バッファー中で旧恩て洗浄し重態て膨潤
させたブ〔ＪティンＡ−セファロース（ファルマンア）
（ｉｇＧ結合能は５０〜２００μ９／２００μρプロテ
インＡ）（２００μ（１）を力１１える５二どにより行
った。反応混合物を・１°Ｃで１時間激Ｕ７・く振盪し
、ついで溶解バッファーを用いてプロティンＡ−セファ
ロースを３回洗浄した。ついでブ［１ティンＡ−セファ
ロースを遠心分離により集め、２−メルカプトエタノー
ルを含ｆｈ４−るＳＤＳ＆ル試料バッファー中、９５℃
で加熱４゛ることにより免疫卜（合体を解離させた（レ
ムリらの１−記文献）。

試ネ４をＳＤＳ　ｌ　０％ポリアクリルアミドゲル１１
工気泳動にかけた。プ゛ルをエンハンス（Ｅ　ｎｈａｎ
ｃｅ、デユポン）中で３０分間インキュベートし、乾燥
さ１−）、免疫沈降した放射性標識タンパク質のオート
ラジオグラフィーのためにＸ線フィルムにさらした。

その結果を第１図に示す。第１図において、パネル八で
は非感染Ｈ９細胞からの標識細胞溶解物を、パネルＢで
は）−ｆ　Ｉ　Ｖ　−１感染１−１９細胞（Ｓ　５　Ｇ
　７細胞株）からの標識細胞溶解物を、（１）正常マウ
ス血ｔ＃、（２）正常ヒト血清、（３）Ｉ−ＴＩＶ−１
免疫ヒト血清、（４）モノクローナル抗体３１−４２１
９組織培養上清、および（５）モノクローナル抗体３ｉ
９０−２５組織培養上清と混合した。その結果、両モノ
クローナル抗体は、ＨＩＶ−１感染細胞からｇａｇ前駆
体ｐ５５を免疫沈降させることが示された。池の放射性
標識したウィルス性または細胞性タンパク質のいずれと
も、検出可能な交差反応性は観察されなかった。従って
、両モノクローナル抗体は、ＨＩＶ−１ｐ５５に特異的
に結合した。

加えて、各モノクローナル抗体を、ＨＩ　Ｖ　−１感染
ＨＵＴ７８細胞株の標識細胞溶解物（パネルＡ）、ＨＩ
　Ｖ　−２感染ＨＵＴ７８細胞株の標識細胞溶解物（パ
ネルＢ）、および非感染ＨＵＴ７８細胞株の標識細胞溶
解物（パネルＣ）とも反応させた。

その結果は、第２図に示しである。第２図において、こ
れらそれぞれの細胞溶解物を（１）正常マウス血清、（
２）正常ヒト血清、（３）ＨＩＶ−１血清陽性の個人か
らの血清、（４）ＨＩ　Ｖ　−２血清陽性の個人からの
血清、（５）モノクローナル抗体３１４２４９、および
（６）モノクローナル抗体３１−９０−２５と反応させ
た。第２図の結果は、モノクローナル抗体３１−４１−
１９がＨＩ　Ｖ２ｐ２４を特異的に免疫沈降させること
を示した。

ＨＩＶ−２１）２４との交差反応性は、モノクローナル
抗体３１−９０−２５とも、正常マウス血清とも観察さ
れなかった。このことは、ＨＩＶ−１ｐ２４上のエピト
ープと交差反応し得るというモノクローナル抗体３１−
４２４９の独特の特質を示している。

（Ｃ）ウェスタンブロッティング分析 特異性をさらに確立し、エピト−プマツピングするため
に、それぞれ部分的に精製したＨ　Ｉ　Ｖ１ウィルス、
および組換え全長ｐ２４とｐ２４欠失クローンを抗原と
して用い、精製モノクローナル抗体３１−４２４９およ
び３１−９０−２５のウェスタンブロッティング（実施
例１に記載のごく）を行った。部分的に精製したＩ−Ｔ
　Ｉ　Ｖ　−１または大腸菌由来組換えｌ−１ｒＶ−１
ｐ２４クローン（用いたクローンを図式している第３図
を参照）の粗製細胞抽出物を、還元条件下に１２％ポリ
アクリルアミドゲル中で電気泳動にかけた後、各ニトロ
セルロースストリップに電気泳動的に移した。第４図に
示すように、パネルＡは大腸菌（非形質転換）細胞溶解
物のコントロールであり、パネルＢでは全長組換えクロ
ーンｐＢＩを抗原として用い、パネルＣでは１目Ｖ〜１
ウィルス溶解物を、パネルＤては組換え欠失クローンｐ
ＲＡ１０を、パネルＥでは組換え欠失クローンｐＲＡＩ
３を用いた。

その結果、部分的に精製したウィルスに対して試験した
ときに、両モノクローナル抗体がＨＩ　Ｖ　−１ｐ２４
と特異的に反応することか確認された。

さらに、各モノクローナル抗体とＨｒＶ−１ｐ２４の組
換え欠失クローンとの反応により、３１４２４９はＨＩ
Ｖ−１ｐ２４のカルボキシル側半分に向かってマツピン
グしており、一方、３■９０−２５はＨＩＶ−１ｐ２４
（ｚ’）７ミ／末端へ向かってマツピングしていること
が示された。これらの結果はまた、血清学的データおよ
び他のｌ」ＩＶ−１ｐ２４モノクローナルパネルを用い
た競合ｆｌｌＡ（ラジオイムノアッセイ）を比較するこ
とによっても確認された（ここではデータは示していな
い）。

（Ｄ）免疫細胞化学アッセイ（１０Ａ）ＨＩ　Ｖ　−１
に対する特異性をさらに示すため、非感染およびＩ−１
１Ｖ　−１感染１４９細胞に対する免疫細胞化学アッセ
イにモノクローナル抗体３１４２４９および３１−９０
−２５を用いた。簡単に説明すると、非感染またはＨＩ
　Ｖ−１感染Ｈ９細胞を１００％アセトンを用いて顕微
鏡スライドに１０分間固定化し、ついで空気乾燥し、−
２０℃で貯蔵した。染色するため、細胞をＰＢＳ中に１
０分間再び水和し、正常ヒトＩｇＧ（１００μｙ／ｍｉ
Ｄを含有するＰ［３Ｓ中の２％正常ヤギ血清（１００μ
Ｑ）を１０分間で加えた。過剰の試薬を除き、加湿室に
保持したスライドに３１３１−４２４９Ｉまたは３１−
９０−２５　ＩｇＧ（＋　１１’！／ｙｉＱ、　　１０
０μρ）を３０分間で加えた。スライドをＩ）　Ｂ　Ｓ
中で洗浄し、ついで第二抗体と１．てヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ（ベル・フリーズＸ１００）ｉＱ’）を１・４００希
択にて３０分間−ご加えた。スライドをＰＢＳで洗浄し
、ついで２％正常ヤギ血清および正常ヒト血清（１００
μ９□７′１）を含有−４“ろ■）１０か中で１．３０
０に希釈したベルオキノダーゼ／抗ペルオキノダーゼン
ｕ１）（本［り〔１−ナル（Ｃ１ｏｎａｌ）Ｐ　Ａ　Ｉ
ン、スターンバーガー−アント−マイヤー（Ｓ　ｔｅｒ
ｎｂｅｒｇｅｒａｎｄ〜Ｉｅｙｅｒ”１Ｆ（１００ｕ　
Ｑ）を加えた。スライドを加湿室中でインキ、へ一トシ
た（りａ−ナルＦＡＩ）とと乙に）。Ｉ−）　［（Ｓ中
で洗浄した後、色原体（ＰＬ３Ｓ中の００６％過酸化水
素水中のノアミノヘンンジン四塩酸塩０　、６３　ｍ！
７／　ｍＯ＞を加えろごとにより発色を開始した。６分
後にスライドを水道水で洗浄する二とにより発色を停仕
、さＵた。スライドを水和さけ、検査のために検鏡板に
固定した。

その結果、両モノクローナル抗体は正常な細胞性成分の
いずれとし交差反応しないことが示された。特異的な染
色は、［（［Ｖ−１感染Ｈ９細胞でのみ検出され、これ
はＩ−１１Ｖ〜１抗ｐ２４モノクローナル抗体に特徴的
なしのであった。

未−牽剋長（生物学的流体中のＨＩＶ−１ｐ２４の検出
のための酵素結合イムノアッセイ（ＥｉＡ）） （Ａ）モノクローナル抗体の組合わ口の選択抗１ＩＩＶ
−Ｉ　ｐ２４モノクローナル抗体のパネルを、３工程ア
ッセイ手順で試験した。筒中に説明すると、ＨＩ　Ｖ　
−１抗原試料（部分的に精製し）：ＨＩＶ−１ウィルス
溶解物１．ｏｎｙ／ｍθ、正常ヒト血漿［Ｎ　ＩＩ　Ｐ
　）中で希釈Ｘ２００１２）を、抗１（［Ｖ−１ヒｌ−
ＩｇＧを前置てコーティングした１／４゛ポリスヂレン
ビーズとともに室温で一夜インキノベートした。洗浄し
た後、単一のモノクローナル抗体溶液かまたはモノクロ
ーナル抗体混合溶液（各モノク「ノーナル抗体を等しい
割合で）（２００１１Ｃ）を、Ｎ　＋、−（Ｐ中で希釈
１．て最終濃度５ｔｉｙ／ｍＱにて加えた〇、反応混合
物を４℃で１時間イレギ、ベートした５、洗浄後、ビー
ズに結合したｈモノ／７［ノーナル抗体の」ｉｌを、）
ｌ　ＲＰ　Ｏ標識ヤギ１ノ゛［マウスＩｇＧを用いて検
出しノー９、検出■程は、実施例１に記載のよ：）にし
て行−・た。・１９２ｎｍにお（する吸光度は、ドーズ
七ｊ−捕捉されたＨｌＶ−１ｐ２１に結合しｊニマウス
モノクｃｙ　・−ナル抗体の量に正比例した。第・１表
および第５表Ｑ’）結果は、モノク（！−サル抗体３１
−４２−、−１９かモノクＣ’ｌ−ナルわ゛し体３１−
９０−２５とともに（１１東的な結合を示４−ことを示
１．で０る。というのは、３１−９０２５の６Ｊｉ　域
中のいかなるモアバクロー千・ルマッピ、ノブｔａ、３
１−４２４９の存在ト−ＣＩ−１１Ｖ　−１ｐ２４に相
東的に結合したからである。モノクロール抗体３１−７
−２０．３１−３２−９．３１−７７−８．３１−８９
−８．３２−５１６および３１−９０−２５は、４゛へ
、ζｌ−（Ｉ　Ｖ−１ｐ２・１上の同じエビ１−−−プ
を認識する。従１２、て、３１　４２４９は３１−９０
−２５とともに相乗的に結合するＪ、（本釣なモノクロ
ーナル抗体Ｆ　アリ、その結果、ビーズ七のヒト抗ＨＩ
Ｖ−１！ｇｃ、、＋−＋　１ｖ−１ｐ２４およびモノク
ローナル抗体の間で最適の結合か１号ら（すること（こ
なろ。

第４表（ＩＩＩＶ−１１）２４抗原ｒノセイのプローブ
として試験した場合におけるｉｌＩ　Ｖｌ　ｐ２４にス
・１するモノクローナル抗体３１−９０−２５と同じエ
ピトープを認識したか、異なる融合実験から得られた。

ｂ、モノクローナル抗体３１−７１−２２は、ＨＩＶ−
１ｐ２４のアミノ末姥１近くではあるか３１９０＝２５
のエピトープとは異なるエピトープを認識し７た。

Ｃモノクローナル抗体３１　７９ｉ８は、Ｈ１Ｖ−１ｐ
２４のカルホキノル末端の近くのエピトープをした。

第５表（３ｉ４２−ｔ９の相乗的特性および３１４２４
９とＨＩＶ−１ｐ２４に 対する一群のモノクローナル抗体との間さらに研究を進
めるために、ＨＩＶ−１ｐ２４の検出のための２工程（
−夜／２時間）アッセイの開発に上記モノクローナル抗
体を用いた（以下に詳細に記す）。ｐ２４に富んだ抗原
の感度パネルを、５００〜３１．２５９ｇタンパク質／
ｍ（ｌ）濃度範囲にＮＨＰ中で希釈した部分精製Ｈ１ｌ
−１ウィルス溶解物を用いて調製した。下記第６表に示
したモノクローナル抗体をプローブとして用い、各パネ
ルをアッセイした。陰性コントロールの吸光度より０．
０５吸光単位大きな吸光度をアッセイのカットオフ値と
し、このカットオフ値よりも高い吸光度を示す試料を陽
性とした。感度は、陰性コントロールの吸光度より０．
０５吸光単位大きな吸光度を与えろＩ＋Ｑ当たりのＨＩ
Ｖ−１ｐ２４のピコグラム散として定義し、直線回帰法
により決定した。モノクローナル抗体３１−９０−２５
からは、第６表に示すように、２工程アツセイにおいて
最も感度の良い結果が得られたので、これをｆ−ＩＩＶ
−１ｐ２４の同じ一般的な領域をマツピングする一群の
モノクローナル抗体から選択した。

１６３（３１−９０−２５およびこれと同じエピトープ
をマツピングする他のモノクローナル抗体を用いた場合
の、２］−程Ｈ１（Ｂ）ＨＩ　Ｖ−１ｐ２４の検出のた
めのアッセイ態様 ここに詳記する実験データは、生物学的流体中の１（Ｉ
Ｖ−１ｐ２４の検出のための好ましいアッセイ態様を記
載するものである。インキュヘーノヨン時間および温度
などの時間条件は、アッセイのスピードおよび感度によ
り要求される条件に従って変えることかできる。

アッセイに用いるモノクローナル抗体３１−４２４９お
よび３１−９０〜２５の精製は、組織培養上清またはマ
ウス腹水液からプロティンＡセファロースを用いて行っ
た。精製１ｇＧのタンパク質決定は、２８０ｎｍにおけ
る吸光度を測定することにより行った。

（１）溶液中のモノクローナル抗体のプローブとしての
使用 モノクローナル抗体の混合物を、２０ｍＭリン酸バゾフ
ｙ　　（ｐＴ（７，４）、Ｏ，ｌ　５Ｍ　ＮａＣ１，２
５％Ｎ　１４　Ｐ　（ｖ／　ｖ）、１％ウシ血清アルブ
ミン（ｗ／■）および０．２５％トリトンＸ　＝！　０
０　（ｖ／ｖ）からなる希釈液中にモノクローナル抗体
（２５μ９ＩｇＧ／ｘ＆Ｘ３　ｌ−４２４９と３１−９
０−２５の比−４６）を含存するストック溶液として調
製した。この溶液５０μＱをアッセイ試料２００μａに
加えたときは、モノクローナル抗体混合物のアッセイ容
量中における最終濃度は５μ９／１ρとなる。モノクロ
ーナル抗体調製物のロット毎の変化に応じてモノクロー
ナル抗体混合物を変化さＵ“ることはできるが、両モノ
クローナル抗体の上記比率およびＩｇＧａ度は、用いた
アッセイ条件下では満足のいくものであることがイつか
った。

アッセイの手順についで筒中に説明すると、モノクロー
ナル抗体混合物（５０μＱ）を反応トレイウェルに加え
、ついで（ａ）ト１１Ｖ−１ｐ２４を自存していると思
われる試料、（ｂ）陽性コントロールとして、ＮＨＰ中
に希釈した部分精製）−１１Ｖｌウィルスかまたは天然
のＩ）２４の既知Ｍを有する感度パネル、または（ｃ）
陰性コントロールとして、確立された非感染個人からの
血漿を２００μａ加えた。ついで、前辺て抗ＨＩ　Ｖ　
−１ヒｔ１ｇＧをコーティングした１／４“ポリスチレ
ンドーズを反応ウェルに加えた。反応、昆合物を室温に
て−＆（１２〜１８時間）インキュベートした。ビーズ
を水で洗浄した後、コンノユゲ−１・溶液（２００μＱ
）を各反応ウェルに加えた。コンジコゲー）・溶液の、
、１．’、１製は、ＨＲＰ　Ｏ標識ヤギ抗マウス（Ｙ）
ＩｇＧ［ギルケガール・べり−（Ｋ　ｉｒｋｃｇａａｒ
＋Ｉ＆　Ｐ　ｃｒｒｙ）　］またはト＋ｎｐｏｔｆｆｌ
識ヤギ抗マウス（Ｆ　ｃ）　ｌ　ｇＧ　［）Ａ。

クソン・イムノケミカルズ（Ｊ　ａｃｋｓｏｎ　Ｉ　ｍ
ｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｌを、２０ｍＭリン酸バッ
フ７　　（ｐｔ（７，４）、Ｏ１５〜Ｉ　　ＮａＣｌ、
ｌＯ％ウノ１拾仔曲ｉ？ｔ　（ｖ／　ｖ）、１　：３　
％正常ヤギ血清（ｖ／　ｖ）、２　ａ　′？ｂ　ｘ　Ｈ
ｐ　（Ｖ／ｖ）、５°ｂ正常ウサギ血ｌｌｔ　（ｖ／　
ｖ）、００２５％ベンジルアルコール（ｖ／ｖ）、０５
％トリトンＸ−１００（ｖ、／ｖ）Ｊ’；よび２０ｍＭ
　Ｉ−ＩＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒＩＪ’　ｃｒキノエチル
ビベラノン−Ｎ’　　；２−エタンスルポン酸）を含む
希釈液に希釈」ることにより行−）た３、反応混合物を
水浴中、４０’Ｃにて２時間インキユヘートした。洗浄
後、（−−ズを反しδ：管に移し、実施例１に記載のよ
うにしてＯＰ　Ｉ）を加えノー。

加えて、抗原試料、モノクローナル抗体混合物およびビ
ーズを本浴中またはグイナミノグインギュヘーター中、
４０’Ｃで４〜６時間インキュベート（２、フンノコゲ
ート溶液を４０℃で１時間インキコヘートすることによ
り、アッセイのインギュベート時間を短くすることが可
能である。第７表は、本発明の両モノクローナル抗体ア
ッセイが、従来のポリン［１−ナル１（ＩＶ−１抗原ア
ツセイに比べて感度か良好てＪうろことを示している。

（２）別のアッセイ法 別のやり方として、モノクローナル抗体３１．１２４９
お、１、び３１−９０−２５をｌ／４”ポリスヂレンビ
ーズに市゛尾よくコーティングしでＨ［■−１ｐ２１に
対する捕捉抗体として用いることかできる。簡単に説Ｉ
り目−ると、モノクローナル抗体混合物を適当な濃度で
ポリス手Ｌ７ノヒーズ土。

にコーティング（５だ。結合部位をさらにウシ血清アル
ブミンてオー、ｒ＜−コーティ／ζ′シＬこ。アッセイ
Ｔ’　ＫＩＮ　ニおイ＝、７、［１ｌＶ−１ｐＨを９　
（Ｔ　＋４抗１１Ｔ（試ｔ１を二Ｉ−’ｊ　、（ングド
ーズととし、□こ（ノーヤで７へ−１・した、適゛ノ１
な時間インキっへ−１・した後、ビーズを洗浄し、桔、
′撃しｆこ１（ＩＶ−ＩＰ２４を必ちなプロ・−ブを用
いて検出し人二。Ｉｌｌい７ｒニア”　ＣＩ−ブて特に
好ましいものとし、では、スチ：１．’Ｔ７−）（Ｊ４
うｔｅｗａｒｔ）９ζ、・）米国特許出願（＋　９８８
Ｆ［１Ｊ−１１ｏト１出願、発明の名ゼ嫉：イムノアソ
セイ・）、ｊ＞′・１ＩＩＶＩ・アンチノゴンズ・ユー
ノ〉り・Ｆ　（ａｂ’　）。

・フラクメンッ・アズ・ブ〔ｌ−ブ（Ｉ　ｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙｆｏｒ　Ｉｔ　ｌ　Ｖ　Ｉ　　Ａｎｔｉｇｅｎ
ｓ　Ｌｌｓｉｎｇ　Ｆ（ａｂ’：Ｌ　Ｆｒａｇｍｃｎｔ
、ｓ　ａｓ　Ｐｒｏｂｅ）ｊ）に開示さイ１てし’　％
　、ｋ　ｆｒに、精製抗ＩＮ￥Ｉウーｔ゛ギ１ｇＧから
、ｄ９製し１：　Ｆ　（ａｂ’　）、断片、／７糎５る
。

モ／′夕〔Ｊ−ナル抗体３１−４２４９は、溶液中のプ
ローブど［２て上たはビーズ＋・））捕捉抗体と（７て
モノクローナル抗体３１−９０−２５と相）か合わＵて
）ＩＢ）たときに回生：ｐの相乗的特＋’ｉ′ｋを示し
た。

（Ｃ＞ＩＩ　Ｉ　Ｖ　−２の検出 」−記（ＢＯ２）に記載したアッセイを用い、情装置Ｉ
Ｉ〜’−２ｐ２４を検出Ｉ−タ。＝’　　、９　Ｆ／）
　示−・、ｌ−トコｔ−）（二よ！−５ば２、二〇）ア
ッセイｆ恵様ては、ドーズｊ二・パ）捕捉抗体として抗
ＨＩ　Ｖ　−１ヒトＩｇＧを用いて８００ｐＬ’＋（Ｅ
］！　ｌ　Ｖ−２を検出」゛る二とかでき７＝、１ＩＩ
Ｖ−２持毘的な捕捉抗体をＩｌｌいるごとにより、アッ
セイα）感度を増強４゛ろことかてさる、。

＋１０えて、３１−４２４９モアノー２〔７一−＋′ル
抗体を５）ｌｙ／りのアッセイ濃度でブｃｙ−ブと（、
てｔ）１独で用いた場合に、モ、ツク【゛ノーナル抗体
の混合物を用いた場合と同等の感度か得られた１、モノ
タローナル抗体３１−９０−２５はＩ［ｌ〜ｒ−２ｐＱ
４ど交差反応しないので、これらの活用は千７則さイ１
１ニことであった。

（１））モノクローナル抗体を用いたＨ　Ｉ　Ｖ　　ｌ
抗原アッセイの臨床的ａ剛性 モノクローナル抗体を用いたＨ　Ｉ　Ｖ−用抗原アソセ
イの臨床的ｒ「用件を、臨床的有効性の確立されたアボ
ットＨＩＶ−１抗原アッセイ（ボールらの上記文献参照
）と比較することにより評価した。

ＡＲＣ，ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳのハイリスク無症候性
の患者からの約４８５の臨床的試料を、ラッシュ・プレ
スビテリアン・セント・リュークス・メディカル・セン
ター（ｆｌｕｓｈ　Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ　Ｓｔ。

Ｌｕｋｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　　ＣｅｎｔｅｒＸシカ
ゴ、イリノイ）から人手し、１年間の期間をかけて試験
した。各試料についで、アボットＨＩ　Ｖ−１抗原アツ
セイおよび一夜・室温／２時間・４０℃のモノクローナ
ル抗体アッセイで試験した。陰性コントロールの吸光度
よ。９０．０５吸光単位大きい吸光度の値を、両アッセ
イにおけるカットオフ値とし、このカットオフ値よりも
大きな吸光度値を示す試料を陽性とした。

すべての陽性の試料についで、アホットＨＴＶｌ中和ア
ッセイ手順により確認した。簡単に説明すると、Ｉ−（
Ｉ　Ｖ　−１抗原陽性試料を、高いＨＩＶ−１抗１）２
４力価を有する確立されたＩ（Ｉ　Ｖ１血清陽性の個人
からの過剰量の血清または精製ＩｇＧとともにインキュ
ベートした。室温でブレインキュベートした後、残留し
ている（中和されていない）ｐ２４をアボットＨＩＶ−
１抗原ア、セイかまたはモノクローナル抗体アッセイを
用いて検出した。真のＩ（［Ｖ　−１陽性試料は、４９
２ｎｍにおける吸光単位が急激に減少した。コントロー
ル（同じ量の正常ヒト１ｇＧまたは血漿を含有）に比べ
て抗ＨＩＶ−１抗体の存在下で５０％を上回る中和を示
したすべての試料は、陽性か確立したと考えた。中和し
得ない陽性の試料は、ＨＩＶ１抗原についで陰性とした
。そのデータを第８表にまとめて示す。

（注）ａ；モノクローナルアッセイは７つの試料を検出
し損なった。そのうち４つの試料は、２人の患者からの
連続採血（ｓｅｒｉａｌ　ｂｌｅｅｄｓ）であった。

ｂ、アボット抗原アッセイは３１の試料を検出し損なっ
た。そのうち２２の試料は、連続採血であった。すなわ
ち、２つの試料は患者へから、３つの試料は低音Ｂから
１、・１つの試料はル音Ｃから、２つの試料は患者りか
ら、そしてＩＩの試料は但者Ｅからのらのである。

第８表に示すように、大部分の試料はアボットＨＩＶ−
１抗原アッセイの結果とよく一致した。

一致しなかった試料は、以下の類型に従う乙のと思われ
た。すなわち、（ａ）モノクローナルアッセイにより検
出し損なった陽性試料の大部分（７のうち４）についで
は、その吸光度の値はアボットＨＩＶ−１抗原アッセイ
のカットオフ値に非常に近いものであった。（ｂ）モノ
クローナルアッセイは、−層優れた感度により（第７表
参照）、アボットＩ（ＩＶ−１抗原アツセイでは検出し
損なった試料を（中和アッセイにより）確認することが
できた（３１の試料のうち２８．３つの試料についでは
試料容量の不足のため確認することができなかった）；
（Ｃ）＠者特異的な類型がみられた、すなわち、特定の
川音からの試料についでモノクローナルアッセイかまた
はアボットＨＩ　Ｖ　−１ｔｉ’ｉ、原アッセイにより
検出し損なったときには、その但者からの試料はすべて
検出し損なった。

加えて、幾つかの確立された血清変換のパネルを試験し
た。これらのパネルはまた、Ｉ−Ｉ　Ｉ　Ｖ　−１抗体
および抗原についでの他の幾つかの市販のらしくは一集
団内の（ｉ　ｎ　−ｈｏｕｓｅ）試験によっても試験し
た。これらの比較は、長期的な研究において＋ｍ清変換
を検出する上でモノクローナル抗原アッセイが非常に何
効であることを示している。たとえば、第９表に示すよ
うに、−集団内血清変換パネルを用いた場合、アボット
ｌ−Ｉ　Ｉ　Ｖ−１抗原アツセイおよびモノクローナル
アッセイはともに、ＩＩＩＶ−１ｅｎｖタンパク質に対
する抗罎がＨＩ　Ｖｌ抗体イムノアッセイにより検出さ
れたときと同時に、またＨ　Ｉ　Ｖ　−１コア抗体が検
出される前に、ＡＩＤＳ感染患者の血清変換を検出した
。同様に、ボストン・バイオメゾイカ（Ｂｏｓｔｏｎ　
Ｂ　ｉｏｍｅｄｉｃａ）から購入した他の血清変換パネ
ルにおいてら、モノクローナルアッセイは、ＥＮＩ抗原
アッセイによりＨＩ　Ｖ　−１抗原が検出されたとき（
ＥＮＩ抗原アッセイの結果はボストン・バイオメゾイカ
から得た）と同時に該抗原の存在を検出した。

実施例７（３１−４２４９および３Ｉ−９０２５を用い
た別のアッセイ手順） （７いモノクローナル抗体３１−４．２−、　ｌ　９実
施例６に記載のように、ＨＩ　Ｖ−１を捕捉するよう特
別に設計したアッセイ手順は、ＨＩＶｌおよびＨＩ　Ｖ
　−２のコア抗原間で観察される高イ交差反応性＋、：
、、Ｊ：　リ、８００ｐｙ／ｘ（ｌらの低ｉ’？１０）
　Ｉ　ＩＩＶ−２９２４を検出する。これらの所見に基
づいて、高感度ＨＩ　Ｖ〜２ｐ２４抗原アッセイにモノ
クローナル抗体３１−４２４９を首尾よく用いることが
できろ。加えて、抗体は、ｌ−１［Ｖ　−１およびＩ−
Ｔ　Ｉ　Ｖ　−２の両方のｐ２４エピトープを含む天然
のタンパク質、合成ベブヂドまたは組換えタンパク質に
対して産生させることができる。固相１−にあるかまた
はプローブとして溶液中にあるそのような抗体は、それ
ぞれプローブとしてまたは固相−Ｌにあるモノクローナ
ル抗体３１ｉ２１９とともに、Ｉ（Ｉ　Ｖ　−１とＨＩ
Ｖ−２ｐ２４の両方を同じ有効性で検出することのでき
るイムノアッセイを設計すへく用いることができる。従
って、モノクローナル抗体３１−４１１９は、Ｉ］ＩＶ
−１およびＨＩ　Ｖ−２の両方を検出するアッセイにお
いて、または適当な酵素イムノアッセイ態様で用いたと
きにＨＩ　Ｖ　−１とＨＩ　Ｖ　−２とを識別−４−る
アッセイにおいて用いることかて、きる。

（Ｂ）モノクローナル抗体３１−９０−２５本発明の他
の態様において、モノクローナル抗（、ｔ−３１−９０
−２５を、生物学的試料中の抗Ｉｌ！■−用コア抗体の
検出のための標識プローブとしご用いろことかできる。

標識は西洋ワザビベルオキングーゼを用いて行うことか
できる。筒型に説明４−ろと、５．ｖｙ／ｚＱのＨＲＰ
Ｏ（シグマ）（１，６，ｘｃ）を１７ｚｇ／ａＱのＮａ
ｌ　０４（１，６＊０に加えることによりｌ−［ＲＰ　
Ｑを活性化した。この混合物を暗所にて３０分間インキ
ュベートし、ついでＧ２５セフアデツクスケル濾過にか
けた。活性化１１１１　Ｐ　Ｏを含ｈ′４−ろフラクシ
ョンをプールし、タンパク質濃度を約０．６ａｇ／ｍＱ
に調節した。（１を以て５０ｍＭ１’Ｊ　ａ　２　ＣＯ
３バツフｙ　　（ｐＨ９，５）に対して透析しておいた
１　ｘｇ　／　ｖ（Ｑの３１−９０３１−９Ｏ−２５１
＆）を、活性化ＨＲＩ）０（１、１ｔＣ）に３０°Ｃて
加え、暗所にて２時間インキコベー１−シ、ついで４℃
にて３０分間インキュベートしたつ反応混合物中のＨＲ
ＰＯ：ＩｇＧの理論的な結合比は４・Ｉてあった。新た
に調製したＮａｔＢ）（４（冷１０ｍＭ　ＮａｔＣ０３
、ｐｉ−（９、５中の５ｍｙ／ｌ！Ｑ溶液、０．０８．
ｔＱ、）を混合物に加え、４℃にて一夜放置し、ついで
アセトノＣ０，０８ｗＱ）を加え、３０°Ｃにて３０分
間反応させた。最後にＰＢＳ（ｐＨ７，２）中の１．４
３％ウソ血清アルブミン（７７胃のを加えてＩｇＧの最
終濃度を＋００μｑ／ｍ（ｌとした。アリコートを７０
℃で貯蔵した。この結合抗体を適当な希釈液中で適当に
希釈し、下記に示すアッセイに用いた。

まず、抗１（ＩＶ−１１）２１Ｉを含仔していると思わ
れる試験試料を部分精製組換えｐ２　＝１．　（実施例
！参照）を混合し、ついでインキュベートシた。つぎに
、この混合物を、ｒ−ｘ　ｔ　ｖ　−ｓ　＋ｆｉｈ清陽
性の個人の血清から精製した抗ＨＩ　Ｖ−１ｐ２・１抗
体を前辺てコーティングしたヒースおよびｔｇ　ｌ−Ｉ
　ＲＴ）０　］　３１−９０−２５ととムに同時にイン
キュベートした。結合した組換えｐ２・１ｈ＜（％在し
ないと一１９２ｎｍにおける吸光Ｉｆの値は減少・）−
ろ結果となり、試験試料中の抗ＨＩＶ−１ｐ２４抗体の
存在を示した。

アッセイの特異性を決定するために、ＨＩ　Ｖｌに暴露
されたという既知の危険因子を全く有しない供血者の集
団をアッセイにおいて試験した。

データを、ポリクローナルヒト抗Ｔ−１［Ｖ　−１［ｇ
Ｇをプローブとして用い臨床的有効性か確認されたアッ
セイ［エンバコア（ＥＮｖＡＣＯＲ）アッセイ、アボッ
ト・ラボラトリーズ、ノースジカゴ、イリノイ」のデー
タと比較した。両アッセイからのデータは、完全に一致
した。両アッセイで試験した＋６０の試料のうち、すべ
ての試料がＨＩ　Ｖ１ｐ２４に対する抗体についで陰性
であった（エンバコアアッセイにより試験したＨＩＶ−
１ｇｐ４１に対する抗体についでも同様に陰性であった
）。

アッセイの感度を決定するために、ウェスタンブロンテ
ィングまたは他の１−（［Ｖ　−１検出アツセイにより
ＨＩ　Ｖ　−１に対する抗体を有していることが知られ
ている患者からの１１の試料を、Ｎ　Ｉ−ｆＰ中で系列
希釈した。これらの各希釈液からの試料を上記アッセイ
により試験し、結果を比較した。

その結果、第１Ｏ表に示しであるように、本発明のモノ
クローナルプローブアッセイはエンバコアアノセイに比
べて明らかに有為に高い終点力価を有することかわかる
。このことは、本発明のモノクローナルアッセイの感度
か優れていることを明らかに示している。

第１０表（ＨＩＶ−１抗ｐ２４抗体の検出のためのモノ
クローナルプローブイムノアノ Ｖ−１ｐ２４に対する抗体についで陽性の結果を示す患
者血清の最大の希釈として定義した。

ｂ：ＨＩＶ−１ｐ２４に対する抗体についで陰性ｃ：Ｎ
　Ｄ−検出不能（アッセイにより検出するには抗体の力
価が余りにら小さい） ＊・ＡＳＹＭ−無症候性 以上の実験は、本発明の好ましいアッセイ態様を示すし
のであるが、これらは単に例示を示すものに過ぎず、こ
れらに本発明を限定するらのではない。加えて、当業者
であれば、上記モノクローナル抗体を種々の条件下（イ
ンキュベーション、時間および温度なと）の種々のアッ
セイ形態において天然または組換え由来ＨＩＶ−１ｐ２
４を検ｊｌ′するために用いて最適のアッセイ感度およ
びスピードを達成することができることを認識するであ
ろう。本発明の範囲に含まれるイムノアッセイには、溶
液中か固相上かを問わず、これらの抗体を個々にまたは
混合して用い、抗原／抗体複合体の生成に依存するあら
ゆるアッセイ形態か包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、代謝的に放射性標識したＨ　Ｉ　Ｖ　−１ｐ
５５の免疫沈降によりモノクローナル抗体３１４２〜１
９および３１−９０−２５のｆ（Ｉ　Ｖｌ　ｐ２４に対
する特異性を示すオートラジオグラフィー 第２図は、モノクローナル抗体３１−４２９および３１
−９０−２５の標識抗原としての［−１［Ｖ−１および
ＨＩ　Ｖ−２との反応性、さらに詳しくは、モノクロー
ナル抗体３１−４２４９の１（ＩＶ−２ｐ２４との交差
反応性を示すオートラジオグラフィー 第３図は、エピト−プマツピングに用いた組換え欠失ク
ローン、およびモノクローナル抗体３１４２４９および
３１−９０−２５により認識されるエピトープのおおよ
その位置を示す模式図、第４図は、モノクローナル抗体
３ｍ−４２４９および３　Ｉ　−９０−２５のＨＩＶ−
ｉ　　ｐ２４に対する特異性およびエピトープ認識プロ
フィルを示すウェスタンブロッティングである。 特許出願人　アボット・ラボラトリーズ代　理　人　弁
理士　青　山　葆はか１名図面の浄ご（内６ゴに亥てな
し） 第４図

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧによっては認識されない
   ＨＩＶ−１ｐ２４上のエピトープに対する特異性を有す
   るモノクローナル抗体。
2. （２）ＨＩＶ−１ｐ２４のカルボキシル側半分の方にマ
   ッピングされた請求項（１）記載のモノクローナル抗体
   。
3. （３）ＨＩＶ−２ｐ２４上のエピトープをも認識する請
   求項（１）記載のモノクローナル抗体。
4. （４）請求項（１）、（２）または（３）記載のモノク
   ローナル抗体を産生する不死性哺乳動物抗体産生細胞株
   。
5. （５）ＨＩＶ−１で免疫させたマウス脾臓細胞をミエロ
   ーマ細胞株ＳＰ２／０に融合させて得られたハイブリド
   ーマ細胞である請求項（４）記載の細胞株。
6. （６）マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ９
   ７２６。
7. （７）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ９７２６によ
   り産生され３１−４２−１９と命名されるモノクローナ
   ル抗体。
8. （８）マウス由来ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ９
   ７２５。
9. （９）ハイブリドーマ細胞株ＡＴＣＣＨＢ９７２５によ
   り産生され３１−９０−２５と命名されるモノクローナ
   ル抗体。
10. （１０）生物学的試料中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原を検出
    するためのイムノアッセイ法であって、抗体部分がモノ
    クローナル抗体の混合物からなる抗体／抗原複合体を生
    成させ、その際、該混合物の少なくとも１つの抗体がヒ
    ト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧによっては認識されないエピトー
    プと結合することができ、該混合物の他の少なくとも１
    つの抗体がＨＩＶ−１ｐ２４の異なるエピトープと結合
    することができるようにし、生成した抗体／抗原複合体
    の存在または量を決定することを特徴とする方法。
11. （１１）生成した抗体／抗原複合体の存在または量の決
    定を、該複合体を該モノクローナル抗体に特異的な標識
    抗種抗体とともにインキュベートすることにより行う請
    求項（１０）記載のイムノアッセイ法。
12. （１２）標識が、放射性同位体、酵素、蛍光化合物、化
    学発光化合物および特異的結合ペアの一方よりなる群か
    ら選ばれたものである請求項（１１）記載のイムノアッ
    セイ法。
13. （１３）ヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧによっては認識されな
    いエピトープに結合する抗体モノクローナル抗体３１−
    ４２−１９であり、異なるエピトープに結合する抗体が
    モノクローナル抗体３１−９０−２５である請求項（１
    ０）記載のイムノアッセイ法。
14. （１４）モノクローナル抗体３１−４２−１９および３
    １−９０−２５が溶液中にある請求項（１３）記載のイ
    ムノアッセイ法。
15. （１５）モノクローナル抗体３１−４２−１９および３
    １−９０−２５が固体支持体上にコーティングされてい
    る請求項（１３）記載のイムノアッセイ法。
16. （１６）複合体の抗体部分に、固体支持体上にコーティ
    ングしたヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧがさらに含まれる請求
    項（１４）記載のイムノアッセイ法。
17. （１７）複合体の抗体部分に、抗ＨＩＶ−１抗体または
    その断片がさらに含まれる請求項（１５）記載のイムノ
    アッセイ法。
18. （１８）複合体の抗体部分に、抗ＨＩＶ−１Ｆ（ａｂ′
    ）＿２がさらに含まれる請求項（１７）記載のイムノア
    ッセイ法。
19. （１９）複合体の抗体部分に、抗ＨＩＶ−１ｐ２４Ｆ（
    ａｂ′）＿２がさらに含まれる請求項（１８）記載のイ
    ムノアッセイ法。
20. （２０）生物学的試料中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原を検出
    するためのイムノアッセイ法であって、 （ａ）固相支持体をヒト抗ＨＩＶ−１ＩｇＧでコーティ
    ングし、 （ｂ）該コーティング支持体を生物学的試料と接触させ
    、インキュベートし、洗浄し、 （ｃ）該支持体を、モノクローナル抗体３１−４２−１
    ９とモノクローナル抗体３１−９０−２５とからなるモ
    ノクローナル抗体混合物と接触させ、インキュベートし
    、洗浄し、（ｄ）該支持体を、西洋ワサビペルオキシダ
    ーゼを結合した抗マウス抗体またはその断片と接触させ
    、インキュベートし、洗浄し、 （ｅ）該支持体をｏ−フェニレンジアミン−過酸化水素
    溶液と接触させ、ついで （ｆ）発色生成物の４９２ｎｍにおける吸光度を測定し
    て試料中のＨＩＶ−１ｐ２４抗原の存在を検出する、こ
    とを特徴とする方法。
21. （２１）試験試料中のＨＩＶ−１ｐ２４に対する抗体の
    存在または１を決定するためのイムノアッセイ法であっ
    て、 （ａ）試験試料を、ウィルス性ＨＩＶ−１ｐ２４タンパ
    ク質または組換えＨＩＶ−１ｐ２４タンパク質内にある
    標的エピトープと混合し、該混合物をインキュベートし
    、 （ｂ）該混合物を、固相支持体に結合したヒト抗ＨＩＶ
    −１ｐ２４ＩｇＧ、およびモノクローナル抗体３１−９
    ０−２５とともにインキュベートし、ついで （ｃ）試験試料中のＨＩＶ−１ｐ２４に対する抗体の存
    在または量の指標として、固相支持体に結合したまたは
    結合していない３１−９０−２５の存在または量を決定
    する ことを特徴とする方法。
22. （２２）請求項（３）または（７）記載のモノクローナ
    ル抗体を含むＨＩＶ−２ウィルス性ｐ２４抗原の検出の
    ための診断試薬。
23. （２３）請求項（２２）記載の診断試薬を用いるイムノ
    アッセイ法。