DE10035433A1

DE10035433A1 - Schonende Hochanreicherung von fetalen Zellen aus pripherem Blut und Verwendung derselben

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Publication number: DE10035433A1
Application number: DE10035433A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Alere Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-07-20
Filing date: 2000-07-20
Publication date: 2002-02-07
Anticipated expiration: 2020-07-21
Also published as: WO2002008751A3; EP1301798A2; US20030180762A1; JP2004504818A; AU2001285683A1; WO2002008751A8; WO2002008751A2; DE10035433C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hohen Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeugnis aus vorzugsweise peripherem, mütterlichem Blut, wobei nach einer Entnahme von mütterlichem Blut die Blutfraktion zwecks Anreicherung einer Zellfraktion mit zellkernhaltigen fetalen Zellen zentrifugiert werden, nach Zentrifugation ein Antikörper-Cocktail aus Antikörpern des polyklonalen und/oder monoklonalen Typs mit Antikörper Anti-w, Antikörper Anti-r, die an Transferrin-Rezeptor-Moleküle als Antigene der Oberflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und Antikörper Anti-i, die an Antigen-i als Antigene der Oberflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, aus dem Zell-Ansatz fetale Zellen mit 10·5· bis 10·7·-facher Anreicherung abgetrennt werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeugnis aus, vorzugsweise peripherem, mütterlichem, Blut, wobei im Schritt a) nach einer Entnahme von mütterlichem Blut in Gegenwart von einer ein oder mehrere Antikoagulatien enthaltenden Lösung zur Bereitstellung einer Blutfraktion das Blut mit einer isotonischen Lösung verdünnt sowie im Schritt b) die Blutfraktion zwecks Anreicherung ei ner Zellfraktion mit zellkernhaltigen fetalen Zellen zentri fugiert werden, die Verwendung der Erzeugnisse zur Behandlung von Krankheiten und zur Bestimmung von Gen- und/oder Genom analysen.

Im Stand der Technik sind Verfahren bekannt, die der Iso lierung von fetalen Zellen dienen. Diese werden anschließend analysiert auf Genomdefekte, Erbkrankheiten oder dergleichen. Die Isolierung der fetalen Zellen aus dem peripheren Blut der Mutter ist erwünscht, um unerwünschte schwere Nachteile her kömmlicher Verfahren zur möglichst frühzeitigen Erkennung vorhandener Krankheiten oder Entwicklungsstörungen zu vermei den zu verhelfen, da die auf Grundlage von Amniocentese oder Chorionzottenbiopsie beruhenden herkömmlichen Methoden das Risiko des Abortus und Infektionen nicht ausschließen.

Zudem ist es erwünscht, fetale Zellen möglichst schonend zu gewinnen ohne Veränderung ihrer Oberfläche, z. B. ohne Ver änderung der Primärstrukturen, Sekundärstrukturen und weiterer Strukturen der an der Oberfläche, in der Zellwand bzw. Zellmembran angeordneten Verbindungen, deren Unveränderbar keit als Maß für die schonende Aufarbeitung der Zellen dienen kann.

Die isolierten fetalen Zellen und deren Genom können zur Analyse von Erbschäden, wie Punktmutationen, Chromosomanoma lien, Chromosomenaberationen verwendet werden, ohne dass im Gegensatz zum Stand der Technik die Notwendigkeit besteht, zuvor Zellen aus den Fruchtwasser oder dem Gebärmutterapparat zu entnehmen, so dass die Risiken des Abortus weitestgehend verringert werden sollen.

Die Ceramid-Verbindungen sind Oberflächenmoleküle von Vorläuferzellen roter Blutzellen. Es wird angenommen, dass es während der postnatalen Entwicklung zur Verzweigung der Polylactosaminoglycane kommt. Dieser Reifungsvorgang der Koh lenhydratketten, der sich auch in Vorstufen der Erythrocyten im Knochenmark von Erwachsenen vollzieht, führt zur Verminde rung der Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid-Verbindung als i- Antigen (oder auch Antigen-i genannt) und zur Verstärkung der Lacto-N-iso-octaosyl-Ceramid-Verbindung als Antigen-I oder auch I-Antigen genannt. Das Antigen-I ist folglich bei Gebur ten nur schwach, wenn überhaupt, ausgebildet. Erst mit etwa 18 Monaten erreicht es die Menge und Konzentration, die es beim Erwachsenen aufweist. Das i-Antigen ist beim Neugebore nen voll ausgebildet. Es geht folglich in den ersten 18 Mona ten nach der Geburt verloren und wird durch Antigen-I er setzt.

Es besteht nunmehr das Bedürfnis, Verfahren bereitzustel len, welche eine hohe Anreicherung von fetalen Zellen unter Beseitigung mütterlicher Blutzellen und eine schonende Anreicherung derselben ermöglicht. Die hoch angereicherten fetalen Zellen können Aufschluß geben über die Primärstruktur bis Quartärstrukturen der Gensequenzen, ohne dass die Analyseer gebnisse durch Genom der mütterlichen Blutzellen beeinflusst oder gar verändert werden. Darüber hinaus besteht auch der Wunsch, rasch und jederzeit Erzeugnisse bzw. Zellen aus Föten ohne unmittelbaren Eingriff in dieselben bereitzustellen, welche zur Behandlung von Krankheiten, wie Erbkrankheiten, und deren Früherkennung und Therapie dienen können.

So wird in der US-PS 54 37 987 ein Verfahren beschrieben, bei welchem fetale rote Blutzellen aus mütterlichem Blut an gereicht werden und Komplexe aus polyklonalen Antikörper und fetalen Zellen nach Zusatz des Antikörpers Anti-i abgetrennt werden; hierbei binden die polyklonalen Antikörper an die O berflächenantigene i der fetalen Zellen.

Als Antikörper werden solche verwendet, deren Antigen- Bindungsregion mit der Gal β-4-GlcNAc β-1-3-Gal β-1-4-GlcNAc β-1-3-Gal β-1-4-Glc-Kette des Antigens als Antigen- Determinate spezifisch bindet. Dieser gegen die lineare Koh lenhydratkette gerichtete Antikörper benötigt mindestens zwei repititierende N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten zur Bindung. Die einfachste i-aktive Struktur ist demnach Lacto-N-nor- hexaosyl-Ceramid. Der Antikörper, welcher sich an Lacto-N- nor-hexaosyl-Ceramid und/oder Derivaten desselben als Anti gen zu binden vermag, wird im Sinne der Erfindung Anti-i ge nannt.

In dem herkömmlichen Verfahren werden zwecks Abtrennung des Antikörper-Antigen-Komplexes magnet-aktivierte Zellsor tierungsverfahren angewendet, die aber nur in wenig hinreichendem Ausmaß die fetalen Zellen anzureichern vermögen, da die fetalen Zellen in einem verschwindend die fetalen Zellen in einem verschwindend geringen Verhältnis und Ausmaß in dem Antikörper-Antigen-Komplex vorhanden sind.

Die gesuchten Zellen sind extrem selten in einem Über schuß maternaler Zellen, so dass die fetalen Zellen nur in einem geringen Grad angereichert werden, aber nicht bis zur Reinheit. Durch das Fehlen fetusspezifischer Eigenschaften der bisher erhältlichen Antikörper sind nennenswerte, soge nannte zelluläre Verunreinigungen mit mütterlichen im wesent lichen Blutzellen nicht zu verhindern. Außerdem ist mit mag netaktivierten Zellsortierungsverfahren die Vereinzelung von Zellen nicht möglich.

Aufgabe ist es auch folglich, ein schonendes Reinigungs verfahren bzw. ein Anreicherungsverfahren darzustellen, wel ches einen hohen Anreicherungsgrad an fetalen Zellen ermög licht. Diese fetalen Zellen können als Erzeugnisse in einem Diagnostizierverfahren eingesetzt werden.

Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch den Hauptan spruch und den Nebenanspruch. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterentwicklungen der Erfin dung.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur hohen Anreiche rung von fetalen Zellen als Erzeugnis aus, vorzugsweise peri pherem, mütterlichem Blut, wobei im
Schritt a) nach einer Entnahme von mütterlichem Blut in Gegenwart von einer Antikoagulatien enthaltenden Lösung zur Bereitstellung einer Blutfraktion das Blut mit einer iso tonischen Lösung verdünnt sowie
Schritt b) die Blutfraktion zwecks Anreicherung einer Zellfraktion mit zellkernhaltigen fetalen Zellen, vorzugswei se mittels Dichtegradienten, zentrifugiert werden, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass im
Schritt c) zu der Zellfraktion ein Antikörper- Cocktail aus Antikörpern des polyklonalen und/oder monoklo nalen Typs, vorzugsweise im Überschuß, bei RT für 5 bis 30 min, vorzugsweise 10 bis 20 min, noch mehr bevorzugt 5 oder 10 min, lang, welcher
Antikörper Anti-w, die an Antigene der Oberflächen von weißen Blutkörperchen spezifisch binden,
Antikörper Anti-r, die an Transferrin-Rezeptor-Moleküle als Antigene der Oberflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und/oder
Antikörper Anti-i, die an Antigen-i als Antigene der O berflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörper chen spezifisch binden, und vorzugsweise
Antikörper Anti i plus, die an Membranbruchstücken von fetalen Vorläuferzellen spezifisch binden, enthält,
unter Bildung eines Zell-Ansatzes, welcher Antikörper- Komplexe enthält, die an fetale Zellen gekoppelte Antikörper Anti-r und/oder Anti-i, und gegebenenfalls Anti-i plus, um fassen,
zugegeben wird, und
Schritt d) aus dem Zell-Ansatz fetale Zellen mit an denselben gekoppelten Antikörpern Anti-r und/oder Antikörpern Anti-i, vorzugsweise und/oder Antikörper Anti-i plus, aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften, nach den Eigenschaften von Oberflächen und/oder von Zellinnerem und/oder der Größenverteilung der fetalen Zellen mit 10⁵ bis 10⁷-facher Anreicherung der fetalen Zellen, vorzugsweise bis zur deren zellulären Reindarstellung, abgetrennt wird.

Ein Gegenstand der Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung der Zellfraktion als Erzeugnis, welches nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar ist, zur Behandlung von Erbkrankheiten, vorzugsweise im fetalen Alter, zum Ein satz in Diagnoseverfahren, durch beispielsweise Genomuntersu chung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung umfasst fetale Zel len aus venösem Blut, herstellbar durch im
Schritt a) Verdünnung von nach einer Entnahme von mütterlichem bereitgestelltem Blut in Gegenwart von einer An tikoagulatien enthaltenden isotonischen Lösung zur Bereit stellung einer Blutfraktion sowie
Schritt b) Zentrifugation der Blutfraktion, vorzugsweise Dichtegradientenzentrifugation, zwecks Anreicherung einer Zellfraktion mit zellkernhaltigen fetalen Zellen,
Schritt c) Inkubation der Zellfraktion mit einem An tikörper-Cocktail aus Antikörpern des polyklonalen und/oder monoklonalen Typs bei RT für 5 bis 30 min, vorzugsweise 10 bis 20 min, noch mehr bevorzugt 5 oder 10 min, lang, welcher
Antikörper Anti-w, die an Antigene der Oberflächen von weißen Blutkörperchen spezifisch binden,
Antikörper Anti-r, die an Transferrin-Rezeptor-Moleküle als Antigene der Oberflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
Antikörper Anti-i, die an Antigen-i als Antigene der O berflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörper chen spezifisch binden, und/oder
Antikörper Anti i plus, die an Membranbruchstücke von fe talen Vorläuferzellen spezifisch binden, enthält,
unter Bildung eines Zell-Ansatzes aus Antikörper- Komplexen, welche an fetale Zellen gekoppelte Antikörper Anti -r und Anti-i umfassen, enthält,
Schritt d) Abtrennung fetaler Zellen mit den an den selben gekoppelten Antikörpern Anti-r und Antikörpern Anti-i, vorzugsweise und/oder Antikörper Anti i plus, aus dem Zell- Ansatz aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaf ten nach den Eigenschaften von Oberflächen und/oder von Zellinnerem und/oder der Größenverteilung mit 10⁵ bis 10⁷- facher Anreicherung der fetalen Zellen, vorzugsweise bis zur deren zellulären Reindarstellung.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird aus mütterlichem, vorzugsweise peripherem, wie venösem und/oder arteriellem, Blut, beispielsweise aus der Armvene, eine Blutfraktion ent nommen und in ein Gefäß überführt, welches einen oder mehrere herkömmliche Komplexbildner als Antikoagulantien aufweist. Als Komplexbildner können Ethylendiamintetraessigsäure- Verbindungen, Heparin-, Citronensäure-Verbindungen und/oder Salze derselben und/oder Derivate derselben Verwendung finden. Ethylendiamintetraacetat-Verbindungen bzw. deren Deriva te in für den Fachmann bekannter Konzentrationen dienen als geeignete Gerinnungshemmer ohne Zwischenwirkungen bei den sich anschließenden Aufarbeitungsschritten.

Unter fetalen Zellen, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angereichert werden können und anreicherbar sein können, werden auch im Sinne der Erfindung fetale zellkern haltige Vorläuferzellen der Erythrocyten verstanden. Diese fetalen Zellen sind keine aus den Vorläuferzellen ausgereif ten fetalen Zellen, da diese ausgereiften fetalen Zellen kei nen Zellkern enthalten und keinen Transferrin-Rezeptoren an ihrer Oberfläche aufweisen.

Unter Transferrin-Rezeptoren werden im Sinne der Erfin dung auch solche Verbindungen verstanden, die der Funktion des Eisen-Überträgers in die Zelle dienen und auf den Zell oberflächen der ausgereiftem Erythrocyten nicht mehr zu fin den sind. Transferrin ist ein Eisen-Überträger in die Zelle.

Die ausgereiften Zellen aus den Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen, nämlich die Erythrocyten, weisen im wesentli chen keine Transferrin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche und keinen Zellkern auf.

Die Blutfraktion wird einem Dichtegradientenzentrifugati onsschritt unterworfen. In dem Dichtegradientenverfahren kön nen im wesentlichen die kernhaltigen fetalen Vorläuferzellen aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte, von den anderen Zel len aus der Fraktion angereichert, jedoch finden sich gleich falls auch in der Zellfraktion wegen der in allen Fraktionen auftretenden sogenannten Schlierung Erythocyten.

Die kernhaltigen Zellen konzentrieren sich unter dem Einfluß der Schwerkraft entsprechend ihrer Dichte in einer Grenzschicht, auch buffy-coat-Schicht genannt, zwischen der oberen Fraktion, dem verdünnten Blutplasma der Blutfraktion, und der unteren Fraktion mit einem Anteil aus Saccharose- Polymeren als Kissen an.

Der Saccharose-Polymeren-Anteil kann beispielsweise ein synthetisches Polymer aus Saccharose mit einem Molekularge wicht von 70.000 bis 400.000 Dalton, vorzugsweise 400.000 Dalton, z. B. Ficoll, vorzugsweise kolloidale, Polyvinylpyrro lidon beschichtete Silica Partikel, wie Percoll, oder der gleichen sein. Der Saccharose-Polymeren-Anteil befindet sich in einer isotonischen Lösung aus gepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit pH-Werten zwischen 7,2 bis 7,4, vorzugs weise 7,2.

Als Puffer können herkömmliche Natriumchlorid enthaltende verwendet werden, wie Kaliumphosphat- und/oder Natriumphos phatpuffer, NaH₂PO₄, Na₃HPO₄ mit oder ohne NaN₃.

So kann das Kissen aus isotonischer Saccharose-Polymeren- Lösung mit der Blutfraktion, gegebenenfalls nach deren vor hergehenden Verdünnung mit einem Volumenverhältnis von 1 : 1 (Vol : Vol) mit phosphatgepufferter Kochsalz-Pufferlösung über schichtet werden; zu 1 Volumenteil Saccharose-Polymeren- Lösung werden 1 Volumenteil Blutfraktion gegeben.

Nach einer Zentrifugation von bis zu 60 min, vorzugsweise ca. 15 bis 60 sec, noch mehr bevorzugt 45 sec, lang bei 800 × g sedimentieren die roten, aber physikalisch dichteren E rythrocyten in das Saccarosekissen. Die weniger dichten kern haltigen fetalen Zellen sammeln sich als sogenannte buffy- coat-Schicht an der Grenzschicht zwischen der verdünnten o berhalb des Kissens sich befindlichen Blutfraktion und dem dichteren unteren Kissen an. Die buffy-coat-Schicht, regelmä ßig sichtbar als weißer Ring, wird in ein Gefäß überführt, und die Zellfraktion der buffy-coat-Schicht mit phosphatge pufferter Kochsalz-Pufferlösung gewaschen.

Dann wird das die gewaschenen Zellfraktion einer Antikör per-Inkubation zugeführt. Die Zellfraktion kann enthalten:
fetale zellkernhaltige Vorläuferzellen der roten Blutkör perchen, welche i-Antigen und die Transferrin-Rezeptoren auf weisen,
z. T. fetale rote zellkernlose Blutkörperchen, also ausge reifte, welche i-Antigen und keine Transferrin-Rezeptoren enthalten,
z. T. maternale zellkernhaltige Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen, welche I-Antigen und die Transferrin- Rezeptoren aufweisen, und noch
z. T. maternale rote zellkernlose Blutkörperchen, also ausgereifte, welche I-Antigen und keine Transferrin- Rezeptoren aufweisen.

Die aufgrund des Dichtegradientenverfahrens angereicher ten kernhaltigen Zellen der Zellfraktion weisen in der Regel eine hohe Anzahl an mütterlichen Zellen (1 bis 4 × 10⁷ Zel len) im Vergleich zu 20 bis 50 fetalen Zellen in der Zell fraktion auf. In dem folgenden Anreicherungsschritt wird ein Antikörper-Cocktail verschiedener Antikörper des polyklonalen Typs und/oder monoklonalen Typs zugegeben, um einen Zell- Ansatz aus Antikörper-Komplexen bereitzustellen.

Der Antikörper-Cocktail des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Antikörper des monoklonalen Typs und/oder polyklonalen Typs umfassen:
Antikörper Anti-w gegen Oberflächenantigene, die für wei ße Blutkörperchen, wie Leukocyten, Lymphocyten, spezifisch sind, und
Antikörper Anti-r gegen Oberflächenantigene, hier gegen die Transferrin-Rezeptoren für rote noch kernhaltige Vorläu ferzellen der roten Blutkörperchen spezifisch sind
Antikörper Anti-i gegen Oberflächenantigene, gegen das Antigen-i und/oder
Antikörper Anti-i plus gegen Membranbruchstücke von feta len Vorläuferzellen, die für fetale zellkernhaltige Zellen spezifisch sind.

Aufgrund der Zugabe des Antikörper-Cocktails werden hier durch kernhaltige Leukocyten mit den Antikörpern Anti-w mar kiert, durch die Bindung der Antikörper Anti-w an weiße Blut körperchen, wie Leukocyten, Lymphocyten, welche verworfen werden.

Weiterhin werden fetale, kernlose rote Blutkörperchen durch die Bindung der Antikörper Anti-i an das Antigen-i mar kiert, welche verworfen werden können.

Weiterhin werden die anzureichernden fetalen Zellen, die noch kernhaltigen Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen,
durch die Bindung der Antikörper Anti r wegen deren Bin dung an die Transferrin-Rezeptoren und/oder
durch die Bindung der Antikörper Anti-i an das Antigen-i und/oder
gegebenenfalls, um vorzugsweise die spezifische Anreiche rung der fetalen Zellen noch zusehends erhöhen zu können,
durch die Bindung der Antikörper Anti i plus an Membran bruchstücke von fetalen Vorläuferzellen markiert.

So kann die anzureichernde fetale Zellen, also die noch kernhaltige Vorläuferzelle eines roten Blutkörperchens, bei spielsweise an und/oder auf ihrer Oberfläche sowohl Anti körper Anti-i und Antikörper Anti-r aufweisen. Ebenso kann die anzureichernde fetale Zelle, also die noch kernhaltige Vorläuferzelle eines roten Blutkörperchens, beispielsweise an und/oder auf ihrer Oberfläche sowohl Antikörper Anti-i, An tikörper Anti-r und Antikörper Anti-i plus aufweisen, um bei spielsweise in dem nachfolgenden Schritt d) die spezifische zelluläre Abtrennung zu erhöhen.

Die Bindung aller zwei, vorzugsweise aller drei, Antikör per-Spezies, nämlich des Antikörpers Anti-i und des Antikör pers Anti-r, vorzugsweise und des Antikörpers Anti-i plus, monoklonalen und/oder polyklonalen Typs an und/oder auf der Oberfläche der zu isolierenden fetalen Zelle kann für die erfindungsgemäße schonende zelluläre Anreicherungsmethode der Zellen stehen.

Die maternalen ausgereiften Erythrocyten werden wegen Mangels an Transferrin-Rezeptoren und Antigen-i nicht durch die Antikörper Anti-w, Anti-r, Anti-i und/oder Anti plus markiert bzw. an diese können die Antikörper Anti-w, Anti-r, Anti-i und/oder Anti plus nicht spezifisch binden, welche verworfen werden sollen.

Die fetalen ausgereiften Erythrocyten werden wegen Man gels an Transferrin-Rezeptoren nicht durch die Antikörper An ti-w und Anti-r markiert.

In einem weiteren Verfahrensschritt wird der Zell-Ansatz Durchfluß-Cytometer-Verfahren unterworfen. Bei diesen Verfah ren können verschiedene mittels Antikörper markierte Zellen auf Grundlage der den markierten Antikörpern Anti-r, Antikör pern Anti-i, Antikörpern Anti-i plus und den Zellen zu eige nen unterschiedlichen Lichtstreuungs- und/oder verschiede nen emitierten Fluoreszenzeigenschaften unterschieden und voneinander getrennt werden.

Die Fluoreszenzeigenschaften sind z. B. durch die an die se, vorzugsweise fetalen, Zellen gebundenen fluoreszenzmar kierten Antikörper Anti-r, Anti-i und/oder Anti-i plus, ab hängig.

Die entsprechend mit Antikörper markierten Zellen werden im Mantelstromverfahren als Einzelzellsuspension in einer Meßkammer mit Laserlicht angeregt und das Licht anschließend mittels Durchlicht-, Streulicht- und Fluoreszenzdetektoren charakterisiert. Weiterhin passiert der Flüssigkeitstrom Ablenkplatten und die Mithilfe der oben angegebenen Eigenschaf ten als fetal charakterisierten Zellen erhalten einen elekt rischen Impuls, der sie seitlich aus dem Flüssigkeitstrahl ablenkt. Hiermit lassen sich die fetalen Zellen bis zur Rein heit unter anderem als Einzelzellen in entsprechenden Behält nisse wie z. B. Microtiterplatten sortieren.

Aufgrund des Durchfluß-Cytometerverfahrens werden fetale Erythrocyten-Vorläuferzellen als fetale Zellen mit dem Ober flächenantigen i in hinreichender Weise schonend angerei chert.

Die für den Antikörper-Cocktailschritt bereitzustellenden Antikörper sind solche, die
als Antikörper Anti-i spezifisch mit Lacto-N-nor- hexaosyl-Ceramid-Verbindungen oder mit Derivaten derselben des synthetischen und/oder nativen Typs und/oder
als Antikörper Anti i plus spezifisch
mit Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid-Verbindungen und/oder mit Derivaten derselben des nativen Typs und/oder
mit Membranbruchstücken von nach herkömmlichen Verfahren isolierten fetalen Vorläuferzellen der fetalen roten Blutkör perchen, wobei die Membranbruchstücke Lacto-N-nor-hexaosyl- Ceramid-Verbindungen und/oder mit Derivaten und/oder wei tere für fetale Zelloberflächen spezifische Oberflächenmole küle aufweisen können,
zu reagieren vermögen.

Unter Antikörper wird im Sinne der Erfindung auch ver standen, solche, welche z. B. mit dem Antigen i spezifisch re agieren können. Spezifische Antikörper können Immunglobuline darstellen, die als Ergebnis antigener Stimulation produziert werden.

Mit Hilfe der monoklonalen Antikörper sind solche Im munglobuline gemeint, welche spezifisch nur gegen die einzige antigene Determinante, wie der Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid- Verbindungen und/oder Derivate derselben, gerichtet sind. Die monoklonalen Antikörper Anti-w, Anti-r, Anti-i und Anti-i plus sind mit herkömmlichen Hybridomtechniken synthetisier bar. Hierbei wird ein einziger Antikörper-produzierender B- Lymphocyten in Kultur kloniert, so dass (uniforme) monoklona le Antikörper Anti i, Anti-r oder Anti-w oder Anti-i plus in großen Mengen erhalten werden können. Die B-Lymphocyten einer gegen die Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid-Verbindung als Antigen z. B. immunisierten Maus und/oder Kaninchen oder dergleichen werden mit Zellen eines unbegrenzt teilungsfähigen B- Lymphocytentumors fusioniert. Aus den entstandenen Fusions produkten werden durch Verwendung herkömmlicher Selektionsme dien diejenigen Hybridzellen selektioniert, die einerseits z. B. den Antikörper Anti-i produzieren und andererseits die Fähigkeit erworben haben, sich in Kultur unbegrenzt zu tei len. Jede einzelne dieser hybridomen Zellen ist Ausgangspunkt eines individuellen Zellklons, der permanent wächst und dabei einen bestimmten monoklonalen Antikörper herstellt.

Die monoklonalen Antikörper Anti-w, Anti-r, Anti-i und/ oder Anti-i plus können gleichzeitig mit Fluorescein- Isothiocyanat-Verbindungen (FITC), PE oder dergleichen zur Bereitstellung von fluorochromen Antikörper gekoppelt sein. Auch bei großer Verdünnung sind die Antikörper, welche an dem Antigen koppelbar sind, aufgrund der Fluoreszenzmarkierung feststellbar und erhöhen die Ausbeute der Zellsortiererver fahren.

Als Antikörper Anti-w, Antikörper Anti-i, Antikörper An ti-r, Antikörper Anti-i, Antikörper Anti-i plus können auch polyklonale verwendet werden, welche in Säugern, wie Mäusen, Kaninchen, Schafen, Pferden usw., nach dem Fachmann bekannten Methoden induziert und isoliert werden können. So kann der Antikörper Anti-i durch Zugabe von Lacto-N-nor-hexaosyl- Ceramid-Verbindung und/oder deren Derivaten des nativen und /oder synthetischen Typs in Säugern, wie Mäusen, Kaninchen, Schafen, Pferden usw., nach den dem Fachmann bekannten Metho den induziert und isoliert werden.

Ebenso können polyklonale Antikörper Anti-i plus eine Mi schung aus verschiedenen Spezies von Antikörpern sein, wobei diese durch Verabreichung von Membranbruchstücken fetaler, vorzugsweise kernhaltiger, Zellen, wie fetaler Vorläuferzel len der roten Blutkörperchen, in Säugern, wie Mäusen, Kanin chen, Schafen, Pferden usw., induziert und angereichert oder rein auf herkömmliche Weise dargestellt wurden. Die Mischung kann z. B. eine Spezies als Antikörper sein, welche spezifisch gegen Antigen-i ist bzw. mit Antigen-i bindet und eine oder weitere Spezies enthalten, die spezifisch an ein Oberflächen molekül bzw. an Oberflächenmolekülen der Membranbruchstücke fetaler Zellen, wie fetaler Vorläuferzellen der roten Blut körperchen, zu binden bzw. mit diesen zu reagieren vermögen.

Der Antikörper-Cocktail kann Fluorescein-, Phycoerythrin und/oder Peridinin Chlorophyll Protein (PERCP) markierte Antikörper (20 µl je Antikörper) des monoklonalen Typs, des polyklonalen Typs oder Mischungen derselben mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugsweise 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl Antikörper-Cocktail, vorzugsweise in PBS, ent halten.

Als Antikörper enthält der Antikörper-Cocktail:
20 µl Antikörper Anti-w mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugswei se 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl An tikörperlösung, vorzugsweise in PBS, die an Antigene der O berfläche von weißen, maternalen Blutkörperchen spezifisch binden,
20 µl Antikörper Anti-r mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugswei se 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl An tikörperlösung, vorzugsweise in PBS), die an Antigene der O berflächen von maternalen und fetalen kernhaltigen Vorläufer zellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
20 µl Antikörper Anti-i mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugswei se 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl An tikörperlösung, vorzugsweise in PBS, die an das fetale Anti gen-i spezifisch binden.

Das Mischungsverhältnis von Antikörper-Cocktail zu Zell- Ansatz kann betragen 0,1 bis 100,0 µl, vorzugsweise 10,0 bis 60,0 µl, vorzugsweise 20,0 bis 40,0 µl noch mehr bevorzugt 20,0 µl, Antikörper-Cocktail zu im wesentlichen 10⁵-10⁹, vorzugsweise 10⁷ zellkernhaltigen Zellen im Zell-Ansatz.

In einem weiteren bevorzugten Ansatz kann der Antikörper- Cocktail enthalten:
20 µl Antikörper Anti-w mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugswei se 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl An tikörperlösung, vorzugsweise in PBS, die an Antigene der O berfläche von weißen, maternalen Blutkörperchen spezifisch binden,
20 µl Antikörper Anti-r mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugswei se 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl An tikörperlösung, vorzugsweise in PBS, die an Antigene der O berflächen von maternalen und fetalen kernhaltigen Vorläufer zellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
20 µl Antikörper Anti-i mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugswei se 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl An tikörperlösung, vorzugsweise in PBS, die an das fetale Anti gen-i spezifisch binden, und/oder
Antikörper Anti-i plus mit 0,1 bis 10,00 µg, vorzugsweise 0,2 bis 5,0, noch mehr bevorzugt 0,2 µg, Protein/µl Anti körperlösung, vorzugsweise in PBS, gegen, vorzugsweise auch Antigen-i auf der Membranoberfläche enthaltende, Membran bruchstücke von fetalen Vorläuferzellen, die für fetale zell kernhaltige Zellen spezifisch sind. Die Antikörper Anti-i plus können spezifisch reagieren mit Antigen-i; ebenso kann Antikörper Anti-i plus eine Mischung aus verschiedenen Spe zies von Antikörpern sein, wobei z. B. der eine Antikörper spezifisch gegen Antigen-i und weitere Antikörper spezifisch an Oberflächenmolekülen der Membranbruchstücke fetaler Zel len, wie fetaler Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen, zu binden bzw. mit diesen zu binden vermögen. Auch in dieser be sonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Mischungsverhältnis von Antikörper-Cocktail zu Zell- Ansatz 0,1 bis 100,0 µl, vorzugsweise 10,0 bis 60,0 µl, vorzugsweise 20,0 bis 40,0 µl noch mehr bevorzugt 20,0 µl, Anti körper-Cocktail zu 10⁵-10⁹, vorzugsweise 10⁷ zellkernhalti gen Zellen, im Zell-Ansatz betragen.

Die Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid-Verbindung ist eine na türlich vorkommende Substanz und im wesentlichen ein Oberflä chenantigen, die entweder als nativer Typ aus Vorläuferzellen isolierbar oder als synthetischer Typ chemisch herstellbar und ein Indikator für fetale Zellen sein kann, welche bei ge sunden erwachsenen Menschen im Blut regelmäßig nicht nachge wiesen werden kann. Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid-Verbindung wird in der Regel mit der Bezeichnung i bezeichnet. Es han delt sich um eine Kette aus Zuckermolekülen, welche eine li neare, unverzweigte Kohlenhydratkette ist aus sich wiederho lenden N-Acetyllactosamin-Einheiten. Das einfachste i-aktive Glucosphingolipid ist Lacto-N-nor-hexoosyl-Ceramid.

Ebenso ist es möglich, Antikörper in dem Antikörper- Cocktail einzusetzen, welcher als gegen Lacto-N-iso-octaosyl- Ceramid-Verbindungen und/oder deren Derivate spezifisch re agiert.

Da bei gesunden erwachsenen Personen das Antigen i, also Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid-Verbindung, nicht nachzuweisen ist, ist dieses Antigen i ein geeigneter fetaler Marker für Zellen des peripheren Blutes. Alle Versuche zeigen, dass Er wachsene kein Antigen i aufweisen, wohl aber Feten, Neugebo rene und Kleinkinder, aber auch im Blut schwangerer Frauen ist Antigen i als Oberflächenverbindung zu finden.

Die in dem Antikörper-Cocktail enthaltenen Antikörper sind monoklonale Antikörper mit einheitlicher Monospezifität. Diese monoklonalen Antikörper werden nach herkömmlichen dem Fachmann bekannten Schritten synthetisiert. Da das Antigen i als Zuckermolekül begrenzte immunogene Wirkung haben kann, werden wie folgt Antikörper gegen das Antigen i in einem Ver suchstier hergestellt:

1. Gegen die native Form der humanen Lacto-N-nor- hexaosyl-Ceramid-Verbindung
Hierzu werden reine Zellen aus dem Blut eines Neugebore nen mittels eines herkömmlichen Hochleistungszellsortierer auf zeitraubende Weise (z. B. Becton Dickinson, Vantage SE) isoliert, die i als das Antigen Lacto-N-nor-hexaosyl-Ceramid- Verbindung auf der Oberfläche der Zellen aufweisen. Diese Zellen werden sowohl für die Produktion von polyklonalen An tiseren, z. B. in Kaninchen, als auch für die Produktion von monoklonalen Antikörpern, z. B. in der Maus, benutzt.
2. Ebenso ist es möglich, Antikörper gegen die chemisch synthetisierte Form des Antigens i Lacto-N-nor-hexaosyl- Ceramid-Verbindung herzustellen nach dem Fachmann bekannten Methoden, wobei Antigen i in Reinform hergestellt und wie un ter 1. beschrieben verwendet werden kann

Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens im Gegen satz zu dem herkömmlichen Verfahren sind unter anderem,
die Möglichkeit der Anreicherung fetaler Zellen ohne Ver unreinigungen mit mütterlichen Zellen,
die Isolierung der fetalen Zellen aus dem, vorzugsweise peripheren, mütterlichen Blut durch einfache Venenpunktion ohne Gefahr der Infektion der Bauchhöhle,
die Bereitstellung von nach dem erfindungsgemäßen Verfah ren bereitgestellten Zellen zur Verwendung in Prüfverfahren der Gensequenzen, zur Behandlung von Krankheiten, zur präna talen Prüfung, beispielsweise auf Erbschäden, wie Punktmuta tionen, Chromosomanomalien, Aneuploidien, ohne dass die Not wendigkeit besteht, Zellen aus den Fruchtwasser oder dem Ge bährmutterapparat zu entnehmen,
die Bereitstellung von Zellen zur Verwendung in Früher kennungsuntersuchungen zur möglichst frühzeitigen Erkennung vorhandener Krankheiten oder Entwicklungsstörungen, unter Wegfall risikobehafteter Verfahren, z. B. Amniocentese, Chor docentese oder Chorionzottenbiopsie, sowie
die Verringerung der Risiken von Abortus.

Ausführungsbeispiel

Bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der erfin dungsgemäßen Lehre werden im übrigen in Verbindung mit den Erläuterungen der bevorzugten Ausführungsbeispiele in schema tischer Weise erläutert:
Entnommenes venöses mütterliches Blut wird in einer Anti koagulatien enthaltenden isotonische Phosphatpufferlösung pH 7,2, 0,9% (w/v) NaCl, 150 mM NaH₂PO₄/Na₃HPO₄, vorzugsweise mit NaN₃ zur Konservierung, (PBS) bei 25° Celsius verdünnt zur Bereitstellung einer Blutfraktion. Die Blutfraktion wird bei 800 × g für 45 sec lang zwecks Anreicherung der Zellfrak tion mit kernhaltigen fetalen Zellen als buffy-coat-Schicht bei Raumtemperatur zentrifugiert werden.

Dann wird die weißliche buffy-coat-Schicht als Zellfrak tion (z. B. 1-4 × 10⁷ Zellen) mit einem Antikörper-Cocktail aus Antikörpern des monoklonalen Typs bei Raumtemperatur für 20 min lang inkubiert zur Darstellung des Zell-Ansatzes.

Der Antikörper-Cocktail enthält Fluorescein-, Phycoe rythrin und/oder Peridinin Chlorophyll Protein (PERCP) markierte Antikörper (20 µl je Antikörper) des monoklonalen Typs mit 0,2 µg Protein/µl Antikörper-Cocktail in PBS.

Als Antikörper enthält der Antikörper-Cocktail in einem Ausführungsbeispiel:
20 µl Antikörper Anti-w mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung, vorzugsweise in PBS, die an Antigene der Oberflä che von weißen, maternalen Blutkörperchen spezifisch binden,
20 µl Antikörper Anti-r mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung in z. B. PBS, die an Antigene der Oberflächen von maternalen und fetalen kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
20 µl Antikörper Anti-i mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung, vorzugsweise in PBS, die an das fetale Antigen-i spezifisch binden.

Das Mischungsverhältnis beträgt 20,0 µl, Antikörper- Cocktail zu 10⁵-10⁹, vorzugsweise 10⁷ zellkernhaltigen Zel len im Zell-Ansatz.

In einem weiteren Ansatz eines Ausführungsbeispiels ent hält der Antikörper-Cocktail:
20 µl Antikörper Anti-w mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung, vorzugsweise in PBS, die an Antigene der Oberflä che von weißen, maternalen Blutkörperchen spezifisch binden,
20 µl Antikörper Anti-r mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung, vorzugsweise in PBS, die an Antigene der Oberflä chen von maternalen und fetalen kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
20 µl Antikörper Anti-i mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung, vorzugsweise in PBS, die an das fetale Antigen-i spezifisch binden, sowie
Antikörper Anti-i plus mit 0,2 µg Protein/µl Antikör perlösung, vorzugsweise in PBS gegen, vorzugsweise auch An tigen-i auf der Membranoberfläche enthaltende, Membran bruchstücke von fetalen Vorläuferzellen, die für fetale zell kernhaltige Zellen spezifisch sind. Das Mischungsverhältnis beträgt 20,0 µl, Antikörper-Cocktail zu 10⁷ zellkernhaltigen Zellen im Zell-Ansatz.

Als Antikörper Anti-i wird ein Antikörper mit einer spe zifischen Bindung an Lacto-N-nor-hexaosylceramid und ein An tikörper Anti-i, welcher aus B-Lymphocyten einer gegen Lacto- N-nor-hexaosylceramid des nativen Typs und gegen Membran bruchstücke fetaler Zellen immunisierten Maus und/oder Ka ninchen bereitgestellt ist, und ein weiterer, welcher aus B- Lymphocyten einer gegen Lacto-N-nor-hexaosylceramid des che misch synthetisierten Typs immunisierten Maus und/oder Ka ninchen bereitgestellt ist.

In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird die weißliche buffy-coat-Schicht als Zellfraktion (z. B. 1-4 × 10⁷ Zellen) mit einem Antikörper-Cocktail aus Antikörpern des polyklona len Typs bei Raumtemperatur für 20 min lang inkubiert zur Darstellung des Zell-Ansatzes. Der Antikörper-Cocktail mit aus Kaninchen, Schafen oder Pferden angereicherten bzw. iso lierten polyklonalen Antikörpern enthält Fluorescein-, Phy coerythrin und/oder Peridinin Chlorophyll Protein (PERCP) markierte Antikörper (20 µl je Antikörper) des polyklonalen Typs mit 0,2 µg Protein/µl Antikörper- Cocktail in PBS mit den oben genannten Zusammensetzungen und die Inkubationsbe dingungen erfolgen wie oben bei denen mit monoklonalen Anti körpern.

Nach der Inkubation mit polyklonalen und/oder monoklo nalen Antikörpern werden aus dem Zell-Ansatz mit Hilfe eines Durchflußzytometers (Typ Becton Dickinson; Vantage SE) unter Verwendung der Durchlicht-, Streulicht- und Fluoreszenzeigen schaften der mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper gebun denen fetalen Zellen sowie auch bedingt nach deren Zellgröße und deren vorhandenen Zellkompartimente mit bis zu 10⁵ bis 10⁷-facher Reindarstellung derselben abgetrennt.

Claims

1. Verfahren zur Anreicherung von fetalen zellkernhaltigen Zellen als Erzeugnis aus peripherem mütterlichem Blut, wobei im
Schritt a) nach einer Entnahme von mütterlichem Blut in Gegenwart von einer Antikoagulatien enthaltenden Lösung zur Bereitstellung einer Blutfraktion das Blut mit einer isotonischen Lösung verdünnt sowie
Schritt b) die Blutfraktion zwecks Anreicherung einer Zell fraktion mit zellkernhaltigen fetalen Zellen zentrifu giert werden, dadurch gekennzeichnet, dass im
Schritt c) zu der Zellfraktion ein Antikörper-Cocktail aus Antikörpern des polyklonalen und/oder monoklonalen Typs bei RT für 5 bis 30 min, vorzugsweise 10 bis 20 min, lang, welcher
Antikörper Anti-w, die an Antigene der Oberflächen von weißen Blutkörperchen spezifisch binden,
Antikörper Anti-r, die an Transferrin-Rezeptor-Moleküle als Antigene der Oberflächen von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
Antikörper Anti-i, die an Antigen-i spezifisch binden, ent hält, und vorzugsweise
Antikörper Anti-i plus gegen Membranbruchstücke von fetalen Vorläuferzellen, die für fetale zellkernhaltige Zellen spezifisch sind, enthält,
unter Bildung eines Zell-Ansatzes aus Antikörper-Komplexen zugegeben wird,
Schritt d) aus dem Zell-Ansatz fetale Zellen mit an den selben gekoppelten Antikörpern Anti-r und Antikörpern An ti-i, und vorzugsweise Antikörpern Anti-i plus, aufgrund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften nach den Eigenschaften von Oberflächen und von Zellinnerem sowie der Größenverteilung mit 10⁵ bis 10⁷-facher Anreicherung der fetalen Zellen abgetrennt werden.

2. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach Anspruch 1, da durch gekennzeichnet, dass im Schritt a) venöses und/ arterielles mütterliches Blut entnommen wird.

3. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt a) das Blut mit einer NaCl haltigen Lösung mit einem Puffer von pH 7,2 bis 7,4 verdünnt wird.

4. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt b) die Blutfraktion bei 800 × g für 0,1 bis 60 min, vor zugsweise 15 bis 60 sec, lang zentrifugiert wird.

5. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Anti körper polyklonale aus Pferden, Schafen und/oder Kanin chen verwendet werden.

6. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Anti körper monoklonale aus Mäusen verwendet werden.

7. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt aus dem Zell-Ansatz mit Hilfe eines Durchfluß- Cytometers fetale mit an der Zelloberfläche gebundenen Antikörper Anti-r und Antikörper Anti-i, und vorzugsweise Antikörpern Anti-i plus, verbundene fetale Zellen abge trennt werden.

8. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Anti körper Anti-i ein Antikörper mit einer spezifischen Bin dung an Lacto-N-nor-hexaosylceramid verwendet wird.

9. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Anti körper Anti-i ein solcher verwendet wird, welcher aus B- Lymphocyten einer gegen Lacto-N-nor-hexaosylceramid des nativen Typs und/oder gegen Membranbruchstücke fetaler Zellen immunisierten Maus und/oder Kaninchen bereitge stellt wird.

10. Verfahren zur Anreicherung von fetalen Zellen als Erzeug nis aus peripherem mütterlichem Blut nach einem der An sprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Anti körper Anti-i ein solcher verwendet wird, welcher aus B- Lymphocyten einer gegen Lacto-N-nor-hexaosylceramid des chemisch synthetisierten Typs immunisierten Maus bereit gestellt wird.

11. Verwendung des Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Behandlung von Krankheiten, vorzugsweise Erb krankheiten.

12. Verwendung des Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Behandlung von Erbkrankheiten im fetalen Al ter.

13. Verwendung des Erzeugnisses nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Genomuntersuchung, vorzugsweise von Föten.

14. Fetale Zellen aus venösem und/oder arteriellem, mütter lichem Blut, herstellbar, durch im
Schritt a) Verdünnung von nach einer Entnahme von mütter lichem gewonnenem Blut in Gegenwart von einer ein oder mehreren Antikoagulatien enthaltenden isotonischen Lösung zur Bereitstellung einer Blutfraktion sowie
Schritt b) Zentrifugation der Blutfraktion zwecks Anreiche rung einer Zellfraktion mit zellkernhaltigen fetalen Zel len,
Schritt c) Inkubation der Zellfraktion mit einem Antikör per-Cocktail aus Antikörpern des polyklonalen und/oder monoklonalen Typs bei RT für 15 bis 30 min, vorzugsweise 10 bis 20 min, lang, welcher
Antikörper Anti-w, die an Antigene der Oberfläche von weißen Blutkörperchen spezifisch binden,
Antikörper Anti-r, die an Transferrin-Rezeptor-Moleküle als Antigene der Oberfläche von kernhaltigen Vorläuferzellen roter Blutkörperchen spezifisch binden, und
Antikörper Anti-i, die an Antigen-i spezifisch binden,
wobei als Antikörper Anti-i ein Antikörper mit einer spezifi schen Bindung an Lacto-N-nor-hexaosylceramid verwendet wird, und vorzugsweise
Antikörper Anti-i plus, welche an Membranbruchstücke von fe talen Vorläuferzellen spezifisch binden, die für fetale zellkernhaltige Zellen spezifisch sind, enthält,
unter Bildung eines Zell-Ansatzes aus Antikörper-Komplexen, welche an fetale Zellen gekoppelte Antikörper Anti-r und Antikörper Anti-i, sowie vorzugsweise Antikörper Anti-i plus, umfassen,
Schritt d) Abtrennung der fetalen Zellen mit den an den selben gekoppelten Antikörpern aus dem Zell-Ansatz auf grund ihrer Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften nach den Eigenschaften von Oberflächen und von Zellinnerem so wie der Größenverteilung mit 10⁵ bis 10⁷-facher Anreiche rung der fetalen Zellen.

15. Fetale Zellen aus venösem und/oder arteriellem, mütter lichem Blut nach Anspruch 14, wobei als Antikörper Anti-i ein solcher verwendet wird, welcher
aus B-Lymphocyten einer gegen Lacto-N-nor-hexaosylceramid des nativen Typs immunisierten Maus und/oder
aus B-Lymphocyten einer gegen Lacto-N-nor-hexaosylceramid des chemisch synthetisierten Typs immunisierten Maus herge stellt wird.