ES2375465T3 - Composición, equipo y método para la separación de células. - Google Patents

Abstract

SE DESVELAN UNA COMPOSICION, UN EQUIPO Y UN PROCEDIMIENTO PARA SEPARAR CELULAS. EL EQUIPO INCLUYE UN RECIPIENTE CENTRIFUGABLE Y UNA SUSPENSION SEPARADORA DE CELULAS BASADA EN PARTICULAS DE SILICE ORGANOSILANIZADA QUE SIRVE PARA LA SEPARACION DEL GRADIENTE DE DENSIDAD, QUE CONTIENE UN POLIACTAM Y ESTA ESTERILIZADA POR TRATAMIENTO CON RADIACION IONIZANTE. LA COMPOSICION INCLUYE UNA SUSPENSION BASADA EN PARTICULAS DE SILICE PARA LA SEPARACION DE CELULAS QUE CONTIENE AL MENOS EL 0,05% DE UN POLIACTAM Y ESTA TRATADA PREFERENTEMENTE POR RADIACION IONIZANTE. TAMBIEN SE DESVELA UN PROCEDIMIENTO PARA AISLAR CELULAS SANGUINEAS RARAS DE UNA MEZCLA DE CELULAS SANGUINEAS.

Description

Composición, equipo y método para la separación de células

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones, equipos y métodos para la separación celular.

Antecedentes de la invención

La separación de células y de componentes celulares, que ha sido durante tiempo una herramienta importante en la investigación básica y las aplicaciones de diagnóstico, está recibiendo cada vez más importancia en el ámbito clínico. El uso de métodos de trasplantación de células, tales como el trasplante de médula ósea, en la terapéutica humana, exige procedimientos de separación de células que no sólo sean rápidos y reproducibles, sino que también produzcan una composición celular viable, segura y no tóxica. También es deseable que dichos procedimientos de aislamiento sean adecuados para el aislamiento de células que son relativamente escasas. Por ejemplo, después de la quimioterapia para ciertos tipos de cáncer, muchos pacientes reciben ahora "trasplantes de células madre", que consisten en una fracción enriquecida de células progenitoras hematopoyéticas, aisladas a partir de diversos tejidos, tales como la médula ósea, la sangre periférica o la sangre del cordón umbilical. Tales células progenitoras constituyen solo aproximadamente el 1% del número total de células presentes en estos tejidos.

La centrifugación en gradiente de densidad es una técnica muy utilizada para separar y aislar células y componentes celulares. Este método utiliza el fenómeno de división de las células en un medio con una densidad definida de acuerdo con su densidad de flotación. Un medio tal puede ser una solución o una suspensión de micropartículas. Ejemplos de los medios de uso común en la separación por gradiente de densidad incluyen sacarosa, dextrano, albúmina sérica bovina (BSA), diatrizoato de FICOLL (Pharmacia), metrizoato de FICOLL (Nycomed), PERCOLL® (Pharmacia), metrizamida y sales pesadas, tales como cloruro de cesio. La exposición de las células a muchos de estos medios produce una alteración de la función biológica de las células y/o una contaminación de la preparación por los componentes tóxicos. Por ejemplo, de BSA y FICOLL se sabe que causan una agregación celular no deseada, a pH fisiológico. Además, estos medios no son generalmente susceptibles de esterilización en autoclave o de radiación en "forma definitiva" - es decir, en una concentración, una solución iónica y un recipiente que está listo para su uso en el aislamiento de un tipo de célula particular.

Un medio de separación celular que ha sido ampliamente utilizado en la preparación de fracciones de células sanguíneas es el PERCOLL® (una marca registrada de Pharmacia Fine Chemicals). El PERCOLL® es una partícula de sílice coloidal, tratada por un proceso de curado para formar una capa de recubrimiento de polivinilpirrolidona sobre cada partícula. Mientras que el PERCOLL® es bastante estable a pH fisiológico, hay algunas limitaciones de su utilidad general en el aislamiento de células para fines terapéuticos. Por ejemplo, el medio es difícil de esterilizar, ya que no es estable frente al autoclave o la radiación ionizante, después de que se diluye en una solución salina fisiológica. Estas propiedades limitan la utilidad del producto para aplicaciones clínicas que implican la reintroducción de células separadas en seres humanos o en cualquier otro lugar en donde se requiere finalmente material esterilizado.

El documento de patente de EE.UU. nº 4.927.749 proporciona una preparación de partículas de sílice coloidal organosilanizado (PSCO) para la separación en gradiente de densidad, que supera algunos de los problemas descritos anteriormente. Aunque es estable frente a la esterilización con calor y la radiación ionizante cuando se diluye en una solución salina fisiológica, cuando se esteriliza con radiación ionizante, las preparaciones de partículas de SCO son tóxicas para ciertos tipos de células raras, tales como las células dendríticas, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales, los linfocitos T citotóxicos y en particular, las células progenitoras hematopoyéticas (CD34+). Puesto que la esterilización final mediante radiación ionizante puede ser preferible para ciertas aplicaciones, en especial las relacionadas con la inclusión del material en recipientes de plástico fungibles, el uso de este material para aplicaciones clínicas puede estar limitado. Además, se ha comprobado que el material induce la aglutinación o la agregación de las células, lo que reduce significativamente el rendimiento en estas células raras en forma funcional.

La presente invención proporciona composiciones y métodos que son especialmente adecuados para el aislamiento de fracciones de células "raras" - por ejemplo, tipos de células que constituyen menos de aproximadamente el 1% del total de células en una población celular. En particular, la invención incluye un medio de separación celular con sílice coloidal que mejora el rendimiento y el potencial funcional de las células, mediante la reducción de la agregación celular y la toxicidad celular. El descubrimiento de la presente invención es que la inclusión de una polilactama, tal como la gamma polilactama polivinilpirrolidona (PVP), en la solución en la que se suspende el material del gradiente de densidad con sílice coloidal, reduce notablemente la agregación de las células sanguíneas poco frecuentes, dando lugar a mejores rendimientos. Otro descubrimiento de la presente invención es que la adición de la polilactama al medio, evita la pérdida de potencial clonogénico durante el aislamiento en gradiente de densidad, de ciertas células progenitoras hematopoyéticas, mediante la reducción de la toxicidad inducida por radiación de las soluciones de SCO.

La invención también proporciona métodos para el aislamiento de determinados tipos celulares que son importantes en los métodos diagnósticos y terapéuticos - incluyendo, por ejemplo, células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) aisladas a partir de la médula ósea, células tumorales seleccionadas, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales (NK, del inglés “natural killer”), linfocitos T citotóxicos (CTL) y linfocitos supresores naturales. La invención también proporciona el agotamiento de los tipos de células que pueden interferir con un resultado clínico particular, tales como los CTL.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención incluye composiciones para uso en la separación celular que consisten en un medio para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado, que contiene al menos aproximadamente 0,05% de polilactama, tal como polivinilpirrolidona (PVP), presente en una concentración entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 por ciento. En una realización preferida, el medio de separación se compone de una suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado. Una ventaja de esta composición es que se puede esterilizar, mediante esterilización en autoclave o mediante radiación ionizante, sin transmitir efectos tóxicos a las células que se separan posteriormente en la misma.

Aunque las partículas que comprenden los medios de la invención pueden tener un diámetro que varía desde aproximadamente 0,003 a 50 micrómetros, las partículas de sílice coloidal tienen por lo general un diámetro promedio de 10-50 nm.

Las composiciones de la invención son especialmente adecuadas para el uso en el aislamiento de una célula sanguínea rara seleccionada, a partir de una mezcla de células. De acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, en estos casos, el medio se prepara de tal manera que la suspensión de partículas tiene una densidad específica de aproximadamente 0,0005 g/ml de dicha célula seleccionada. Ejemplares de tipos de células raras incluyen las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, las células dendríticas, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales, los linfocitos T citotóxicos, las células tumorales y las células nucleadas del feto.

Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ se pueden aislar a partir de células mononucleares de la sangre periférica, en cuyo caso la suspensión preferida de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1,0605 g/ml. Cuando las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ se aíslan a partir de células de la médula ósea, la suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1,0685 g/ml.

Las células dendríticas también se aíslan utilizando las composiciones descritas anteriormente. En este caso, se pueden utilizar suspensiones que tienen densidades de 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml y 1,0565 g/ml.

La invención también incluye un equipo para la separación de células. El equipo se compone de un recipiente centrifugable y una suspensión para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal organosilanizado, tal y como se describió anteriormente.

También se incluye en la presente invención un método para la esterilización de un medio para la separación de células a base de partículas de sílice silanizado, en donde el medio de separación se somete a esterilización en autoclave o a radiación ionizante, en presencia de al menos aproximadamente 0,05 por ciento, y preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y 10 por ciento de polilactama.

En términos más generales, la invención incluye un método para el aislamiento de una célula sanguínea rara seleccionada a partir de una mezcla de células, en donde en primer lugar se dispone una capa de la mezcla sobre un medio para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado que tiene una densidad específica de aproximadamente 0,0005 g/ml de la célula seleccionada. La mezcla se centrifuga a continuación. De acuerdo con una realización preferida, la centrifugación se lleva a cabo en el llamado tubo a modo de trampa para células, del inglés "cell-trap", que contiene: (i) paredes laterales y una parte inferior cerrada, y (ii) un miembro de constricción dispuesto dentro del tubo, en donde el miembro de constricción se sitúa y se monta de modo que retenga líquido en la parte inferior del tubo, por debajo del miembro de constricción, cuando el tubo se invierte. Además, en esta configuración, antes de la centrifugación, el tubo se llena con el medio de separación hasta un nivel que se extiende por encima de dicho miembro de constricción, hasta un nivel superior a una abertura formada por dicho miembro de constricción, de tal manera que las células que se capturan después de la centrifugación en una interfase entre el medio de separación de las células y un medio con densidad menor, se descargan con el medio de menor densidad cuando el tubo se invierte. El tubo también puede incluir una parte superior cerrada, un primer orificio en la parte superior a través del cual se puede introducir material líquido en el tubo, un segundo orificio en la parte superior y un canal cerrado para fluido que comunica el segundo orificio con la parte inferior del tubo, por debajo del miembro de constricción.

Esta configuración se puede utilizar para aislar células progenitoras hematopoyéticas funcionales, con unas concentraciones del medio de separación de 1,0605 g/ml (a partir de mezclas de células de sangre periférica) y 1,0685 g/ml (a partir de la médula ósea). Las células tumorales también se aíslan por medio de este método utilizando un medio de separación de células con una densidad específica seleccionada en el intervalo de 1,0490-1,0580 g/ml. Del mismo modo, las células dendríticas se pueden aislar utilizando medios de separación que tienen densidades específicas de 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml y 1,0565 g/ml.

Los linfocitos T citotóxicos se pueden aislar empleando una densidad específica de 1,0720 g/ml, 1,0610 g/ml o 1,0565 g/ml.

Los métodos de separación anteriores se pueden mejorar mediante la adición de una suspensión que incluye una partícula de sílice silanizada a la que se fija una molécula que se une a un antígeno de forma específica. Esta adición también se puede emplear para agotar los tipos de células no deseadas de una preparación, tales como los linfocitos T.

Breve descripción de las Figuras

La Fig. 1 muestra la recuperación de células progenitoras hematopoyéticas funcionales (unidades formadoras de colonias, UFC), después de la incubación con 0,5% de PVP radiada con rayos gamma en PBS, material del gradiente de densidad a base de partículas de SCO radiado con rayos gamma (PSCO) o material del gradiente de densidad a base de partículas de SCO radiado con rayos gamma, suplementado con 0,5% de PVP (PSCO + 0,5% de PVP);

La Fig. 2 muestra el efecto de diferentes concentraciones de PVP presentes durante la esterilización de partículas de SCO (PSCO) sobre la restricción inducida con radiación gamma de la función (UFC) de las células progenitoras hematopoyéticas;

La Figa. 3 muestra la distribución de las células progenitoras de sangre periférica (PBPC) en la interfase y en las fracciones de sedimento de los gradientes de densidad, formadas a partir de partículas de sílice coloidal en ausencia (PSCO) y en presencia de 0,5% de PVP (PSCO + PVP);

La Fig. 4 muestra la distribución de las células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) en la interfase y en las fracciones de sedimento de los gradientes de densidad, formadas a partir de partículas de sílice coloidal (PSCO) en ausencia y en presencia de 0,5% de PVP (PSCO + PVP);

La Fig. 5 muestra una comparación del agotamiento no específico de las células mononucleares de la sangre periférica (CMSP) asociadas con perlas para la separación de células con densidad ajustada (DACS), recubiertas con dos tipos de preparaciones GAM-IgG;

La Fig. 6 muestra la pérdida no específica de células CD34+ con DACS recubiertas con IgG de cabra anti-ratón (GAM) o F(ab)2 GAM-IgG;

La Fig. 7 muestra la pérdida no específica de células CD34+ con perlas de DACS recubiertas con GAM-IgG intacta, con una orientación aleatoria o específica del sitio;

La Fig. 8 muestra el porcentaje de recuperación del total de células, de células CD34+, de CTLs y de glóbulos rojos (RBC), desde la interfase + sedimento combinados, después de la centrifugación de células de la médula ósea en un gradiente de SCO;

La Fig. 9 muestra el porcentaje de recuperación del total de células, de células CD34+, de CTLs y de glóbulos rojos (RBC), desde la interfase del gradiente después de la centrifugación;

La Fig. 10 muestra la distribución de la actividad de los linfocitos supresores naturales en diferentes fracciones de densidad;

La Fig. 11 muestra la distribución de los linfocitos citolíticos naturales en fracciones de diferente densidad;

La Fig. 12 muestra los resultados de experimentos en los que se agotaron muestras de la capa leucocitaria de sangre periférica de linfocitos B de linfoma humano mediante DACS;

La Fig. 13 muestra la recuperación de células CD34+ en muestras de la capa leucocitaria de sangre periférica agotada de la Fig. 12;

La Fig. 14 muestra un equipo esterilizado para centrífuga, ensamblado de acuerdo con la invención, y

La Fig. 15 muestra un dispositivo de centrifugación en sistema cerrado, apropiado para la inclusión en un equipo de la invención.

Descripción detallada de la invención

La invención abarca medios de separación de células por densidad, adecuados para la separación de células y, en particular, para la separación o el aislamiento de células que se van a trasplantar en seres humanos. La invención también incluye métodos para aislar tipos específicos de células, utilizando preferentemente la nueva composición del medio.

Tal y como se describe en las secciones siguientes, los medios de la invención se han desarrollado a la vista del descubrimiento de los solicitantes, de que la toxicidad celular se reduce significativamente cuando una solución de una gamma polilactama, tal como polivinilpirrolidona, se añade a una suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado (SCO), utilizada en la separación de las células en gradiente de densidad.

En particular, la inclusión de la polilactama evita la pérdida de potencial clonogénico en poblaciones raras de células progenitoras hematopoyéticas, lo que ocurre cuando estas células se suspenden en una suspensión de partículas de sílice silanizado estéril. Además, la presente invención incluye el descubrimiento de que la inclusión de polilactamas, tales como polivinilpirrolidona, en el medio del gradiente de densidad, también reduce la agregación y la pérdida de potencial clonogénico de las células progenitoras hematopoyéticas, lo que se produce sin radiación ionizante.

I. Definiciones

"Sílice coloidal" se refiere a una suspensión acuosa de partículas coloidales formadas por la polimerización de ácido monosilícico a partir de SiO2 disuelto en agua.

"Partículas de sílice silanizado" se refiere a una composición de partículas de sílice a la que está unida covalentemente una capa de silano. "Partículas de sílice coloidal organosilanizado (SCO)" se refiere a una composición de sílice coloidal a la que se fija covalentemente un recubrimiento de organosilano. El documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749, describe cómo preparar tal composición.

"Poblaciones de células raras" se refiere a células que constituyen menos de aproximadamente el 1% del total de los leucocitos (WBC, del inglés “white blood cell”) contados en la sangre de una persona sana. Ejemplos de células sanguíneas raras, incluyen las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, que constituyen aproximadamente el 1% de los leucocitos, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales, las células dendríticas y los linfocitos T citotóxicos. También se incluyen en esta definición, las células procedentes de fuentes exógenas, que incluyen las células fetales circulatorias en la sangre materna.

"Toxicidad celular", "tóxico para las células" y otras expresiones similares de esta memoria, se refieren a cualquier disminución de la viabilidad celular o de la función biológica que se puede medir en una población de células. Con referencia a las células progenitoras hematopoyéticas descritas en esta memoria, el término se refiere más generalmente a la disminución del potencial clonogénico, tal y como se demuestra por la reducción del rendimiento de células capaces de formar colonias hematopoyéticas (UFC).

Una "polilactama" es un polímero que contiene grupos lactama colgantes (amida cíclica) fijados a la cadena principal del polímero. El polímero puede ser un homopolímero o un copolímero. Los grupos lactama colgantes tendrán generalmente un tamaño del anillo que contiene de 3-6 átomos de carbono. Un tipo preferido de polilactama para uso en la presente invención, es una polivinil lactama, tal como polivinilpirrolidona, que tiene un anillo de 4 carbonos.

"Células dendríticas" o "DC" son células inmunes que son negativas para la expresión de CD3, CD4, CD8, CD14, CD16 y CD20, y positivas para la expresión de HLA-DR (es decir, la clase II del CMH). Las células dendríticas presentan una morfología característica - es decir, son células con grandes prolongaciones que se extienden en dendritas cuando se cultivan in vitro.

Un "antígeno de las células tumorales", es una molécula, por lo general una proteína, que se expone en la superficie de una célula tumoral en particular. Ejemplos de antígenos de células tumorales son CD9, CD10, CD19 y CD20 presentes en los linfocitos B de linfoma; los antígenos de las células tumorales que son específicos de ciertos tumores de mama, incluyen HER2/Neu y receptores de estrógeno.

En el contexto de la presente invención, el término "isotónico" significa tener una osmolaridad que está dentro del rango tolerado por la célula, por lo general aproximadamente 280-340 mOsm/kg de H2O, y preferentemente, para las células humanas, aproximadamente 280 mOsm/kg de H2O, dependiendo del tipo de célula y de la fuente.

II. Medio de separación de células

Esta sección describe diferentes medios de separación de células que se pueden utilizar para aislar células a partir de una mezcla de células. Los métodos preferidos para la separación celular descritos en las secciones que siguen, incluyen el uso de un material para la separación de células, tal como un material de gradiente de densidad, que tiene un peso específico entre 1,0000 g/ml y 2,0000 g/ml, preferentemente entre 1,0300 g/ml y 1,2000 g/ml, que tiene una precisión de ± 0,0005 g/ml, preferentemente ± 0,0002 g/ml del peso específico de la célula deseada.

A. Medios para el gradiente de densidad

Los medios preferidos para el gradiente de densidad son suspensiones de sílice coloidal que tienen partículas en el intervalo de 0,002 a 50 micrómetros. Un medio útil es PERCOLL®, una suspensión de partículas de sílice coloidal que no se silaniza y que está disponible en Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ). Más preferida es una suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado, tal y como se describe en el documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749, y tratada con PVP, tal y como se describe a continuación.

De acuerdo con una característica importante de la invención, la solución para el gradiente de densidad debe estar preparada y ajustada a una densidad predeterminada. Además, la osmolaridad se debe ajustar en el intervalo de 280 a 320 mOsm/kg de H2O para preservar la integridad celular, y el pH debe estar preferiblemente en el intervalo de 6,8 a 7,8, y más preferiblemente pH 7,4, para el mantenimiento de un gradiente de densidad fisiológicamente isotónico, antes de su uso. La osmolaridad y el pH pueden variar dependiendo de las condiciones particulares bajo las que se realiza el método de separación con gradiente de densidad. Por ejemplo, la temperatura a la cual se mantienen o se centrifugan las muestras, puede requerir modificaciones en la osmolaridad y/o el pH del material del gradiente de densidad, con el fin de mantener una densidad adecuada. Estas modificaciones de la osmolaridad y el pH serán evidentes para los expertos en la técnica.

Un material para gradiente de densidad, preferido para el uso en la separación de las células, de acuerdo con la presente invención, es una suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado (SCO), tal como las que se describen en el documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749 de Dorn.

En una realización preferida, el material del gradiente de densidad de SCO se diluye hasta una densidad específica apropiada en una solución salina fisiológica complementada con polivinilpirrolidona (PVP), tal como PVP-10, disponible en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). De acuerdo con una característica importante, tal y como se detalla a continuación, se ha encontrado que la inclusión de al menos 0,5% de PVP mejora el rendimiento en tipos funcionales de células sanguíneas raras. Además, una concentración tal de PVP facilita la esterilización del material para el gradiente de densidad de SCO, mediante radiación ionizante, tal como haz de electrones o radiación gamma. En ausencia de PVP, las células expuestas al medio, experimentan una pérdida de la capacidad funcional - en el caso de células CD34+, evidenciada por la pérdida de la capacidad de formar colonias (reducción de UFC). En general, la cantidad de PVP que se va a añadir a una suspensión para la separación celular de SCO, dependerá de la finalidad y del tratamiento posterior de la preparación. Para preservar la actividad funcional de las células expuestas a la preparación de SCO durante períodos de tiempo relativamente cortos, generalmente es suficiente una concentración de 0,5% (p/p) de PVP. Para exposiciones más largas y la exposición a radiaciones ionizantes, pueden ser necesarias concentraciones de PVP más elevadas, tan elevadas como aproximadamente 3-8% (p/p).

B. Partículas de sílice silanizado

Los métodos y las composiciones que se describen en esta memoria son aplicables a un número de usos de partículas de sílice silanizado, junto con la separación de células. Las partículas se pueden silanizar por cualquiera entre una serie de métodos conocidos en la técnica. El documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749, describe la preparación de partículas de SCO que son particularmente útiles en la preparación de las composiciones utilizadas en la presente invención. En una realización, las partículas de SCO que varían en tamaño desde 3 hasta 22 nm, y en particular de 13 a 18 nm, forman una suspensión estable que actúa como un medio en el gradiente de densidad para la separación de mezclas heterogéneas de células, basándose en la densidad de flotación.

Además de formar materiales para el gradiente de densidad, las partículas de sílice silanizado también se pueden utilizar en otros aspectos de la separación de células. Por ejemplo, las partículas usadas en ciertas etapas de la selección positiva o negativa, se pueden tratar de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria. Estas partículas son típicamente microesferas o perlas de sílice silanizado que tienen diámetros de hasta 50 !m (micrómetros), y de forma convencional, dentro del intervalo desde aproximadamente 1-5 !m. Estas part

ículas son silanizadas acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando 3-aminopropiltrietoxisilano, (3yodopropyl)trimetoxisilano, [1-9-trimetoxisilil)-2(m-(o p)clorometil)-fenil]etano o 3-glicidil-oxipropiltrimetoxisilano (GPMS). Por lo general, estas partículas tienen como apéndices covalentes, moléculas que se unen de forma específica a antígenos, tales como anticuerpos, lectinas y otros agentes de unión celular. Cuando se añaden a una mezcla de células, las microesferas se unen a células que tienen un antígeno o antígenos diana específicos, y modifican (aumentan o disminuyen) la densidad de las células.

La polivinilpirrolidona (PVP) se ha añadido a suspensiones de partículas de sílice coloidal no silanizado (Pertoft, y col., Exp. Cell Res. 46: 621-623 (1966); Pertoft, y col., Exp. Cell Res. 50: 355-368 (1968), Wolff y col., J. Cell Biol.,

55: 579-585 (1972); Pertoft, y col., Exp. Cell Res., 110: 449-457 (1977)). Sin embargo, se ha descrito que la PVP libre en la solución, tiene efectos no deseados sobre algunos tipos de células (Pertoft, y col., Exp. Cell Res. 50: 355368 (1968)). Esto llevó al desarrollo de un proceso de curado térmico que produce una capa PVP adsorbida a la partícula de sílice coloidal, y que está sustancialmente exenta de PVP libre. (Pertoft y col., Anal. Biochem. 88: 271282 (1978)). Esta composición está disponible comercialmente como PERCOLL®.

Sin embargo, el PERCOLL® no se puede esterilizar por medios convencionales (autoclave o radiación ionizante) cuando se diluye en una solución salina fisiológica, hasta una concentración final adecuada para la separación celular. Esto limita su utilidad en aplicaciones que requieren un material para el gradiente de densidad, finalmente esterilizado, en un medio fisiológico.

Como se ha señalado anteriormente, una preparación basada en partículas de sílice coloidal que tiene un recubrimiento covalente de organosilano, se ha encontrado que tiene utilidad en la separación de diversas células sanguíneas (documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749).

El recubrimiento de organosilano reduce la toxicidad celular y elimina la agregación entre sí de las partículas de sílice coloidal, en presencia de suero fisiológico y proteínas. Sin embargo, las partículas de sílice coloidal recubiertas con organosilano (SCO), tienen ciertas desventajas cuando se utilizan para separar o purificar células sanguíneas raras específicas, a partir de la sangre y de otras fuentes. El uso de tales partículas puede dar como resultado una reducción en la recuperación de estas células raras. Esto se ejemplifica a continuación junto con el aislamiento de una célula progenitora hematopoyética primordial, caracterizada antigénicamente como una célula CD34+, que se puede aislar a partir de la sangre o de la médula ósea. En concreto, estas células progenitoras sanguíneas poco frecuentes, se agregan o incrementan de otra manera la densidad, cuando se suspenden en material para la densidad a base de partículas de SCO. Por otra parte, la esterilización de una suspensión a base de partículas de SCO mediante radiación ionizante, da como resultado una composición que es tóxica para estas células. Experimentos que demuestran estos resultados y las mejoras aportadas por los descubrimientos de la presente invención, se presentan en las secciones siguientes.

C. Protección con polilactamas contra la toxicidad inducida por radiación de las partículas de sílice silanizado

Hay una serie de métodos para la esterilización de materiales para el gradiente de densidad. Los materiales para el gradiente de densidad a base de partículas de sílice se pueden esterilizar en autoclave o por filtración, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Un método que es particularmente útil, es la esterilización mediante radiación ionizante. Este método puede ser preferible cuando el material preparado para la densidad se tiene que distribuir en recipientes de plástico fungibles, como por ejemplo en tubos de centrífuga precargados, bolsas o jeringas y similares para separaciones clínicas, o cuando se va a distribuir en cualquier recipiente termosensible, tal como botellas de plástico. A diferencia de otros métodos de esterilización, los métodos de esterilización basados en la radiación se pueden llevar a cabo en el recipiente del producto final, como un proceso de una sola etapa. Es decir, cuando es necesario esterilizar tanto un recipiente como un líquido o suspensión en el recipiente, no hay necesidad de esterilizar por separado el propio recipiente, tal y como se requiere cuando se utilizan métodos de filtración, y no hay necesidad de transferir el material desde un tanque de esterilización hasta los recipientes individuales, como normalmente ocurre con la termoesterilización (autoclave).

Las técnicas para la esterilización de dispositivos médicos mediante radiación ionizante, son conocidas en la técnica. Los métodos de uso general aplicables a la presente invención, incluyen la radiación gamma y la radiación de haces de electrones (E-beam). Si bien cada uno de estos métodos implica un tipo diferente de fuente de energía, ambos métodos implican hacer pasar el dispositivo a través de un campo de radiación, para lograr una dosis de radiación específica para el dispositivo. Por lo general, la esterilización de un dispositivo médico requiere una dosis de entre 10 y 30 kiloGrays (kGy). Sin embargo, tal y como se describe más adelante, cuando cualquiera de estos métodos se usa para esterilizar sílice coloidal organosilanizado, el material se vuelve tóxico para las células hematopoyéticas, a menos que una polilactama, tal como PVP, esté presente en la suspensión de partículas durante la radiación.

Las polilactamas utilizadas en la presente invención son preferentemente polímeros solubles, como la serie KOLLIDON® de polivinilpirrolidonas (BASF, Ludwigshafen, Alemania). Estos polímeros están generalmente disponibles en pesos moleculares del polímero en el intervalo desde 2.000 hasta 350.000, y se clasifican por sus viscosidades intrínsecas o "valores K". En experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se utilizaron preparaciones que tenían pesos moleculares promedio de aproximadamente 10.000.

La polivinilpirrolidona (PVP) se conoce por ser sensible a la radiación gamma. Por lo general, se observa un aumento en el peso molecular promedio del polímero, cuando una solución de PVP se expone a 10-50 kGy de radiación gamma. En consecuencia, el fabricante no recomienda que el material sea expuesto a radiación ionizante con fines de esterilización (Kollidon: Polivinilpirrolidona para la Industria Farmacéutica, BASF Aktiengesellschaft, Feinchemie, D67056 Ludwigshafen).

En experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se ha observado que la incubación de células mononucleares de la sangre periférica (PBPC), en un material para gradiente de densidad a base de partículas de SCO, esterilizado por filtración (0,2!m) 0 median te termoesterilización (autoclave, 15 min. a 120ºC) no afecta significativamente a la recuperación de células progenitoras hematopoyéticas viables, según se determina con un ensayo de células funcionales, el ensayo de unidad formadora de colonias (UFC), que mide el potencial de estas células para formar colonias hematopoyéticas. Sin embargo, cuando un material para gradiente de densidad a base de partículas de SCO, se esteriliza por exposición a radiación gamma (2,5-3,5 megaRads) de acuerdo con métodos convencionales, las células incubadas en este medio según el protocolo descrito como Método 2, en el Ejemplo 4 (incubación con SCO + 0,5% de PVP durante 30 minutos, más 10 minutos de tiempo de centrifugación), mostraron una actividad funcional reducida (hasta aproximadamente un 25% de la actividad UFC añadida). El resultado fue aún más sorprendente para las células tratadas de acuerdo con el protocolo descrito como Método 4 en el Ejemplo 4, en el que no se incluyó ninguna etapa de cultivo. En este caso, las células fueron incubadas durante 30 minutos en un material para gradiente de densidad a base de partículas de SCO, partículas de SCO + 0,5% de PVP o tampón + 0,5% de PVP, seguido de una centrifugación durante 10 minutos y seguido de 24 horas de incubación en medio ISCOVES, suplementado con suero de células fetales al 10%. La inclusión de 0,5% de PVP en la suspensión de partículas de SCO durante la esterilización preparatoria, daba como resultado una recuperación de aproximadamente el 65% del valor de UFC añadida (Fig. 1), mientras que las células que se incubaron en un material para gradiente de densidad a base de partículas de SCO, solo mostraban aproximadamente 1% de la actividad funcional original. Si bien este experimento utilizaba células obtenidas a partir de CMSP, las células obtenidas a partir de la médula ósea y del cordón umbilical, mostraban las mismas susceptibilidades.

Se ha investigado cuál es la cantidad de polilactama necesaria para proporcionar protección a las células, en experimentos adicionales realizados como apoyo de la presente invención. La Fig. 2 muestra los resultados del material para el gradiente de densidad a base de partículas de SCO que se complementó con varias concentraciones de PVP antes de la radiación gamma (2,5-3,5 megaRads). En este estudio, las células PBPC se procesaron de acuerdo con el protocolo identificado como Método 6 en el Ejemplo 4 (incubación en presencia de una suspensión de gradiente de densidad y 10% de suero fetal bovino durante 24 horas, a temperatura ambiente). Un exceso de PVP del 3% de la concentración final en el medio del gradiente de densidad, proporcionaba una protección importante contra la toxicidad inducida por radiación, con la dosis (2,5-3,5 megaRads) de radiación aplicada. La adición de PVP después de la esterilización del medio, no proporcionaba un efecto protector similar.

De lo anterior se desprende que la presente invención incluye una composición mejorada para el gradiente de densidad de células, para uso en la separación de células sanguíneas poco frecuentes. La composición del producto es una partícula de sílice silanizado tratada por el procedimiento de radiación ionizante, en presencia de al menos aproximadamente 0,05% de polilactama, y más específicamente, entre aproximadamente 0,1 y 10% de polivinilpirrolidona. Tal composición es particularmente adecuada para aislar células progenitoras de la sangre poco frecuentes, tales como las células progenitoras hematopoyéticas (CD34+), que son sensibles a la exposición a sílice coloidal organosilanizado irradiado.

D. La polilactama mejora la recuperación de las células sanguíneas poco frecuentes a partir de gradientes de densidad

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se ha descubierto que la suplementación de una suspensión de partículas de sílice organosilanizado con 0,05% (p/vol) de polilactama, da como resultado la mejora de los rendimientos en células sanguíneas poco frecuentes de forma funcional. Más específicamente, la inclusión de la polilactama impide la agregación o la agrupación de las células, para proporcionar una composición de células que tiene un perfil de densidad más uniforme y unas propiedades funcionales mejoradas. En comparación con las células aisladas a partir de material de SCO por gradiente de densidad, en ausencia de una polilactama, estas composiciones se caracterizan por el incremento de la recuperación de células raras en fracciones enriquecidas, y el aumento de la recuperación de células raras que tienen potencial clonogénico.

Las Fig. 3 y 4 muestran los resultados de experimentos en los que las PBPC aisladas de acuerdo con métodos convencionales, se cargaron en un gradiente de densidad de sílice coloidal organosilanizado (material del gradiente de densidad a base de partículas de SCO, 1,0605 g/ml, 280 mOsm/kg de H2O, pH 7,4) y se centrifugaron de acuerdo con el protocolo detallado en el Ejemplo 3. La Fig. 3 muestra que en ausencia de PVP, la mayoría de las células presentes en el material de partida se recuperaron a partir del sedimento. La inspección visual reveló que esta sedimentación de las células parecía ser el resultado de la agregación o agrupación de las células. Por el contrario, cuando el material de densidad de SCO se suplementó con 0,5% de PVP, un mayor porcentaje de células se mantuvieron en la interfase, tal y como se había previsto en base a la densidad determinada previamente de estas células.

Esta observación fue más pronunciada cuando se analizaron las mismas preparaciones celulares para detectar la presencia de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+) de acuerdo con los métodos detallados en los Ejemplos 5 y 6 (FACS y análisis de UFC). Los resultados mostrados en la Fig. 4 indican que en ausencia de PVP, aproximadamente el 90% de las células CD34+ migraron al sedimento. La presencia de 0,5% de PVP en la suspensión del gradiente de densidad invertía esta tendencia. Aquí, la mayoría de las células CD34+ permanecía en la interfase, como es deseable a efectos de aislamiento y enriquecimiento de estas células para el trasplante y otros fines clínicos.

III. Métodos de aislamiento de tipos celulares específicos

En vista de lo anterior, se puede apreciar que la presente invención incluye no sólo una composición del gradiente de densidad que mejora la recuperación de las células de la sangre poco comunes, sino también un método para aislar células funcionales de la sangre poco frecuentes y, en particular, células tales como las células progenitoras hematopoyéticas (por ejemplo, CD34+), las células dendríticas, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales y similares procedentes de una mezcla de células.

Generalmente, las células progenitoras hematopoyéticas se pueden aislar a partir de muestras de la médula ósea, la sangre del cordón umbilical o de sangre periférica, obtenidas a partir de un individuo, particularmente un ser humano. Es deseable en primer lugar movilizar las células en el individuo, administrando agentes tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), VP-16 o una combinación de los dos factores, de acuerdo con protocolos bien conocidos en la técnica. Después del tratamiento, el paciente se somete a aféresis para recoger las PBPC o para aspirar la médula ósea para recoger médula ósea.

De acuerdo con el presente método, las células recolectadas se disponen en capas sobre un material de gradiente de densidad y, preferentemente una suspensión para gradiente de densidad para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal organosilanizado que tiene una densidad específica que es aproximadamente igual a la de las células que se van a aislar. El medio incluye preferiblemente al menos aproximadamente 0,05% de PVP, y más preferiblemente, al menos aproximadamente 0,5% de PVP. La suspensión se centrifuga a continuación para precipitar las células que tienen una densidad específica que es superior a la densidad específica de la célula hematopoyética seleccionada. Una composición tal de gradiente de densidad tiene también la ventaja de poderse esterilizar por los métodos descritos anteriormente.

El método anterior también se puede mejorar añadiendo a la mezcla de células inicial, una suspensión que incluye una partícula de sílice organosilanizado, a la que se fija una molécula que se une específicamente a un antígeno celular, para la selección positiva o negativa. Como ejemplo de selección negativa, la molécula que se une de forma específica con el antígeno, se une a un tipo de célula no deseada en la mezcla de células, para provocar que la célula migre al sedimento. A modo de ejemplo, a veces es conveniente agotar los linfocitos T procedentes de una mezcla de células, tal como una mezcla de células madre hematopoyéticas, antes de introducir de nuevo las células seleccionadas en el cuerpo. Tales linfocitos T se pueden agotar, por ejemplo, mediante el tratamiento de la mezcla de células con perlas a las que está unido un antígeno específico de los linfocitos T. Las perlas se separan después de la mezcla de células deseadas por centrifugación. Ejemplos de reactivos que se unen a antígenos específicos de linfocitos T, que se pueden unir a las perlas, incluyen los anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8.

Se puede utilizar cualquier tubo adecuados para su uso en la centrifugación, para la puesta en práctica de la invención. En una realización preferida de la presente invención, el aparato para la centrifugación de las trampas para células, descrito en el documento de Patente WO 96/07097, se utilizará para la separación por densidad de células CD34+.

A. Aislamiento de células progenitoras hematopoyéticas CD34+

El documento de solicitud PCT del mismo cesionario PCT/95/11169 publicación WO 96/07097, describe estudios en los que se utiliza PERCOLL® con osmolaridad fisiológica de 280 ± 10 mOsm/kg de H2O y pH 7,4, como el material del gradiente de densidad para aislar células CD34+ a partir de sangre sometida aféresis. De acuerdo con la invención descrita en esa memoria, con esa osmolaridad, la recuperación de las células CD34+ era óptima, con una densidad específica de 1,0605 g/ml.

En estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención, células de la médula ósea recogidas por aspiración de acuerdo con procedimientos clínicos convencionales, procedentes de donantes sanos, se obtuvieron del Laboratorio de Trasplante de Médula Ósea de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, Palo Alto, CA. Las células CD34+ se enriquecieron desde la fracción celular de la médula ósea por centrifugación en un gradiente de SCO, con una densidad específica de 1,0685 g/ml, a 280 mOsm/kg de H2O pH 7,4, preparadas y formadas de acuerdo con los métodos de la presente invención, tal y como se describe en el Ejemplo 10.

Las Figs. 8 y 9 resumen los resultados de los estudios de aislamiento sobre células de la médula ósea, procesadas en la suspensión con 1,0685 g/ml de SCO. La Fig. 8 muestra el porcentaje de recuperación del total de células, las células CD34+, los linfocitos T y los glóbulos rojos (RBC) a partir de todo el gradiente (interfase + sedimento). La Fig. 18 muestra el porcentaje de recuperación de las mismas fracciones celulares a partir de la interfase del gradiente después de la centrifugación. Los datos presentados en ambas figuras se calcularon dividiendo cada fracción por el número total de células cargadas inicialmente en el gradiente.

En la Fig. 8 se puede observar que más del 90% de las células cargadas inicialmente en el gradiente, se recuperaron desde la interfase y el sedimento. Puesto que la pérdida de células CD34+ era similar a la pérdida aproximada del total de células (10%), no hubo una pérdida destacada de estas células.

La Fig. 9 muestra que aunque sólo el 26 ± 10% del total de las células se recuperaba de la interfase, esta fracción contenía 91 ± 9% de las células CD34+, 10% de los linfocitos T y, en principio, ningún glóbulo rojo. Estos estudios demuestran un enriquecimiento sustancial de las células CD34+, junto con el agotamiento de los linfocitos T, por el procedimiento de gradiente de densidad de la presente invención. Tal y como se describe en la sección siguiente, para estas características se recomienda la preparación para uso en el trasplante alogénico de células madre.

B. Linfocitos Supresores Naturales

Estudios in vitro han mostrado que la médula ósea humana contiene células de baja densidad que bloquean in vitro las alorrespuestas en las reacciones mixtas de linfocitos (MLR). Basándose en el hecho de que esta actividad supresora no tenía restricciones del HLA, en la bibliografía se hacía referencia a la misma como actividad supresora natural (NS). Un gradiente de densidad de PERCOLL® se ajustó a una densidad de 1,0605 ± 0,0005 g/ml para someter a ensayo su capacidad para enriquecer células con actividad NS. Muestras de sangre sometidas a aféresis procedentes de pacientes con linfoma o de personas sanas que habían recibido un tratamiento con G-CSF, se centrifugaron en un gradiente discontinuo de cinco capas, y las interfases y los sedimentos se escrutaron en busca de su potencial para suprimir el cultivo mixto de linfocitos. La Fig. 10 muestra que las células con actividad NS tenían una densidad igual o menor que 1,0605 g/ml. En consecuencia, más del 90% de la actividad NS estaba presente en la preparación final de las células, después de la centrifugación en un gradiente de 1,0605 g/ml.

C. Linfocitos citolíticos naturales

Se ha mostrado que los linfocitos citolíticos naturales (NK) destruyen las células tumorales autólogas. Desde una perspectiva clínica, puede ser beneficioso tener un mayor número de linfocitos NK en el trasplante para reducir la recidiva tumoral. En experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, la densidad de los linfocitos NK fue determinada en un gradiente discontinuo de cinco capas de PERCOLL®. Los linfocitos NK también mostraron una densidad igual o menor que 1,0605 g/ml. En consecuencia, más del 90% de los linfocitos NK estaba presente en la preparación final de las células, después de una centrifugación en un gradiente de 1,0605 g/ml, tal y como se muestra en la Fig. 11.

D. Enriquecimiento de las células dendríticas y los linfocitos T citotóxicos

Las células dendríticas (células presentadoras de antígeno) son células que se han obtenido a partir de las fracciones sanguíneas. Estas células actúan in vivo para presentar antígenos a los linfocitos T, para inducir una respuesta primaria de los linfocitos T citotóxicos (CTL). Estas células tienen utilidad clínica para uso en la inducción o la mejora de las respuestas inmunes celulares.

Según otro aspecto de la presente invención, las células dendríticas y los linfocitos citotóxicos se aíslan empleando gradientes de densidad definidos, en un procedimiento en tres etapas. Este procedimiento incluye la centrifugación a través de tres soluciones diferentes de gradiente de densidad, tal y como se detalla en el Ejemplo 12. De acuerdo con la presente invención, el material del gradiente de densidad de SCO con densidades de 1,0770, 1,0720 y 1,0610 ó 1.0720, 1,0610 y 1,0565 y g/ml, cada una a un pH de 7,4 y una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O, se utiliza en las tres etapas, que se llevan a cabo de forma conveniente pero no necesaria, en un tubo trampa para células. Los profesionales reconocerán también que se pueden utilizar densidades equivalentes de otros medios. Por ejemplo, la primera etapa se puede llevar a cabo en Lymphoprep (Nycomed Laboratories, Oslo, Noruega) o en PERCOLL®, equivalente de Ficoll (densidad 1,0770, 310 mOsm/kg de H2O, pH 7,4); la segunda etapa se puede realizar en una solución de PERCOLL® (densidad 1,0650, pH 7,4, 300 mOsm/kg de H2O); y la tercera etapa se puede llevar a cabo en una solución de PERCOLL® con una densidad de 1,0800 g/ml, pH 7,4, 540 mOsm/kg de H2O, o en una solución de PERCOLL® con una densidad de 1,0550 g/ml, 290 mOsm/kg de H2O, pH 7,4. Sin embargo, las densidades anteriores determinadas utilizando una separación de células a base de partículas de SCO y los métodos de enriquecimiento de la presente invención, tienen la ventaja de que se llevan a cabo en osmolaridades fisiológicas, en lugar de bajo las condiciones hiperosmóticas, descritas anteriormente.

E. Separación de células con densidad ajustada (DACS)

La presente invención también proporciona la depuración de células de la médula ósea o de otra fuente de células progenitoras, para eliminar células tumorales contaminantes u otras células indeseables. A los efectos de la depuración, la densidad de una célula tumoral dada se determina mediante la centrifugación de una muestra que contiene células tumorales en un gradiente de densidad discontinuo, en el intervalo de 1,0490 hasta 1,0640 g/ml. La mayoría de las células indeseables, no tumorales, representan células del sistema inmune y hematopoyético, y tienen una densidad en el intervalo de 1,0610 a 1,0770. La densidad de las células tumorales, se encuentra en general en el intervalo de densidad de 1,0490 hasta 1,0580 g/ml. La densidad del medio de separación celular se determina con una precisión de entre ± 0,0005 g/ml, preferiblemente ± 0,0002 g/ml del peso específico de las células deseadas. Por tanto, la depuración de células tumorales se puede lograr mediante un procedimiento en dos etapas, en el que las células deseadas primero se sedimentan a través de un medio de separación de células, capaz de retener las células tumorales. Por otra parte, la técnica de depuración se puede utilizar para eliminar las células tumorales en un procedimiento de una sola etapa, de acuerdo con los métodos descritos a continuación.

Experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, han mostrado que las células CD34+ se enriquecieron mediante el procedimiento de DACS, junto con el método de densidad de la invención, eliminando de las células contaminantes con un AcMo anti-CD45, acoplado a un vehículo pesado (por ejemplo, perlas magnéticas o perlas de vidrio de aminopropilo). El número total de células se redujo un 82% y el rendimiento en CD34+ fue de aproximadamente 40%. La pureza de las células CD34+ se incrementó desde 2% a aproximadamente 20%. Puesto que el anticuerpo anti-CD45 también eliminaba algunas de las células CD34+, se aprecia que este método se podría mejorar mediante el uso de una mezcla de otros anticuerpos que agoten las células que no sean madre.

Para examinar las pérdidas no específicas de células durante la DACS, se realizaron experimentos con células mononucleares de sangre periférica (PBM) de la capa leucocitaria y perlas de DACS, en ausencia de anticuerpos monoclonales. Como se detalla en el Ejemplo 10, las perlas de DACS se prepararon utilizando GAM-IgG intacta o F(ab)2 GAM-IgG, para someter a ensayo la teoría de que la unión, mediada a través del receptor Fc, de las células a perlas de DACS recubiertas con IgG, contribuía a un agotamiento no específico. Los resultados en la Fig. 5 muestran que no hubo un agotamiento no específico de las células cuando se emplearon perlas de DACS recubiertas con GAM-IgG F(ab)2, en comparación con perlas de DACS con GAM-IgG intacta. Las perlas de DACS recubiertas con GAM-IgG, enlazada a través del sitio glicosilado en la región Fc, también han mostrado un agotamiento no específico reducido de las células, en comparación con las perlas de DACS con GAM-IgG en una orientación al azar. Estos resultados muestran que la eliminación o el bloqueo de la región Fc de GAM-IgG, conduce a una reducción del agotamiento no específico de las células.

Los resultados anteriores muestran que la unión de las células a perlas de DACS, mediada a través de los receptores de Fc (FcR), puede ser responsable de algunos de los agotamientos no específicos de las células CD34+, observados durante el tratamiento por DACS. Esto se ilustra adicionalmente por el acoplamiento específico del sitio que da como resultado una reducción de la pérdida no específica de células, debido al bloqueo de las áreas glicosiladas de la porción Fc de la molécula de inmunoglobulina, tal y como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, el uso de perlas de DACS recubiertas con BSA ha mostrado que la unión mediada con FcR no suele ser responsable de todo el agotamiento no específico de las células. Interacciones iónicas entre la célula y la superficie de las perlas también es probable que estén involucradas. Para investigar esta posibilidad, se prepararon perlas de DACS recubiertas con PEG intercalado entre la superficie de la perla y la GAM-IgG. Esto se hizo para aprovechar la capacidad del PEG para reducir las interacciones iónicas entre proteínas y superficies cargadas. En un experimento en el que se comparaban perlas de DACS recubiertas con PEG-GAM-IgG, con perlas de DACS con GAM-IgG en ausencia de PEG, se descubrió que el uso de PEG está asociado con una reducción del agotamiento no específico de las células.

La reducción del agotamiento no específico mediante la modificación del recubrimiento de la perla de DACS es particularmente importante en el contexto del enriquecimiento negativo de células raras, tales como las células CD34+, los linfocitos NK, los linfocitos supresores naturales, las células dendríticas, las células fetales nucleadas y similares, en las que es importante aumentar el rendimiento de las células. Por ejemplo, experimentos para definir la pérdida no específica de las células CD34+, han mostrado que el uso de perlas de DACS recubiertas con F(ab)2 conduce a una reducción en la pérdida no específica de células CD34+ (Fig. 6). Del mismo modo, usando perlas de DACS recubiertas con GAM-IgG1 unida a través del sitio de glicosilación de la región Fc, también se reduce el agotamiento no específico de las células CD34+, en comparación con perlas de DACS con GAM-IgG en una orientación aleatoria (Fig. 7).

E. Agotamiento de los linfocitos T

La enfermedad de injerto contra hospedador (EICH) se induce con los linfocitos T que están presentes en los aloinjertos de donantes, a pesar de la eliminación completa de tales células, también se produce un fallo del injerto y la recidiva tumoral. Por tanto, puede ser necesaria la presencia de un número limitado de linfocitos T para obtener un trasplante alogénico con éxito. En experimentos llevados a cabo en apoyo de la presente invención, se emplearon perlas de DACS para agotar los linfocitos T a partir de preparaciones de PBSC sometidas a aféresis, de donantes movilizados con G-CSF. Los linfocitos T se agotaron a partir de una preparación movilizada de PBSC, añadiendo a la preparación una mezcla de anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8, seguido de perlas de DACS con IgG de cabra anti-ratón, y centrifugando a través de un gradiente de SCO con una densidad de 1,0605 g/ml a 280 mOsm, pH 7,4. Los linfocitos T fueron supervisados por la reacción con anticuerpos monoclonales anti-CD2, con el fin de evitar posibles artefactos asociados con el uso de anticuerpos que reconocen los mismos epítopos sobre los antígenos de diferenciación.

El anterior método de agotamiento de linfocitos T con DACS daba como resultado una reducción del 97% en linfocitos T, con sólo una reducción del 70% en el rendimiento en células CD34+. El sesenta por ciento de las células CD34+ se mantuvieron en la interfase después del tratamiento con DACS. Los resultados muestran que el método de enriquecimiento de células y de DACS combinados, reduce específicamente el contenido en linfocitos T del material del aloinjerto en un 97%, con menos de un 40% de pérdida de células CD34+. Dicha preparación es adecuada para la prevención de la EICH en material para trasplantes.

F. Enriquecimiento y depuración de las células tumorales

1. Enriquecimiento de las células tumorales para diagnóstico

Se emplean células de tumor de mama para ilustrar los métodos de enriquecimiento de la presente invención. Para enriquecer estas células, se debe ajustar un gradiente a una densidad de 1,0490 a 1,0580 ± 0,0005 g/ml, dependiendo del tipo específico de célula tumoral de mama, a una osmolaridad fisiológica de 270-290 mOsm/kg de H2O y a pH fisiológico 6,8-7,8. En una realización específica a modo de ejemplo, las células del tumor de mama se cargan directamente en un tubo de centrifugación de tipo trampa para células, que contiene un medio de separación de células apropiado, tal como un medio de separación de células a base de partículas de SCO o la solución PERCOLL®, rellenado hasta un nivel superior a la constricción.

En los ejemplos específicos que se describen en esta memoria, el enriquecimiento con éxito de las células tumorales se llevó a cabo con material para gradiente de densidad de PERCOLL® que se había ajustado a la densidad específica de entre 1,0490 a 1,0580 ± 0,0002 g/ml, dependiendo del tipo específico de célula tumoral de mama, a una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O y a pH 7,4. La densidad de la solución de PERCOLL® se puede ajustar con un densitómetro para definir con precisión su exactitud.

Las células enriquecidas por los métodos descritos anteriormente, se pueden examinar después para estudiar la presencia de células tumorales de mama. El rendimiento resultante en células aisladas o células enriquecidas a partir de los métodos de separación de células de la presente invención, se puede utilizar con fines de diagnóstico, por ejemplo, ensayos morfológicos, moleculares, bioquímicos o inmunofenotípicos. Por ejemplo, el ADN se puede preparar a partir de las células recogidas y sometidas a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), tal y como se describe a continuación en la sección de depuración de células tumorales, o las células recogidas se pueden determinar morfológicamente a fin de evitar el uso de procedimientos quirúrgicos, invasivos y costosos, pertinentes para tal determinación.

Diversos antígenos del tumor de mama y marcadores del tumor de mama son conocidos por los expertos en la materia o están disponibles comercialmente, incluyendo pero no limitados a la catepsina D, EGF-R, el receptor de estrógeno, Ki-67, el receptor de la progesterona y TGF-a. L0s anticuerp0s dirigid0s c0ntra est0s antígenos o marc adores se pueden utilizar para determinar el tipo de tumor de las células recogidas.

Una gran ventaja de los métodos descritos en esta memoria, es que un gran volumen de sangre completa se puede colocar directamente en el gradiente de densidad. La sangre periférica se puede recoger en tubos que contienen anticoagulante o mediante aféresis o leucoféresis. La sangre completa no tiene que ser procesada o diluida antes de la centrifugación. Sin embargo, puesto que los métodos enriquecen las células de tumor de mama en función de su densidad de flotación específica, es importante que las células se sometan a separación en un plazo relativamente corto después de su recolección a partir de una fuente in vivo, debido a que la densidad de las células cambia de acuerdo con sus condiciones de cultivo o de almacenamiento. Por lo tanto, con el fin de obtener un enriquecimiento óptimo de las células tumorales de mama procedentes de la sangre, es preferible que las muestras de sangre se utilicen en un plazo de 48 horas desde su recolección. Más preferiblemente, las muestras de sangre se tienen que someter a centrifugación en gradiente de densidad varias horas después de su recogida.

2. Depuración de las células tumorales

La depuración de las células tumorales se realiza convenientemente usando los métodos de enriquecimiento de células tumorales mencionados anteriormente, o más preferiblemente, los métodos de separación de células incrementados con DACS, descritos anteriormente. A modo de ejemplo, cuando se mezclan células tumorales de mama marcadas radiactivamente, con una capa leucocitaria de sangre periférica, hasta un 80% fueron retenidas por centrifugación de la mezcla en un gradiente que tenía una densidad específica de 1,0580 g/ml y una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O. Además, sólo una pequeña fracción (<10% del número de células inicial) de células no tumorales se encontraron en la fracción tumoral recogida.

El documento de solicitud PCT del mismo cesionario PCT/95/11169, publicación WO 96/07097, describe el enriquecimiento de células de tumor de mama, de acuerdo con los métodos de la invención. Este método también se puede utilizar junto con el procedimiento de DACS descrito en esta memoria. Por ejemplo, la sangre completa se puede incubar directamente con partículas soporte recubiertas con anticuerpos anti-CD45, que reaccionan con la mayoría de los leucocitos. Dado que las células tumorales de mama no reaccionan con anticuerpos anti-CD45 en un grado significativo, la gran mayoría de las células sanguíneas que no eran eritrocitos, leucocitos y otras células, se vuelven más pesadas que el material de densidad y se sedimentan durante la centrifugación, mientras que las células tumorales de mama permanecen en el compartimiento superior. Una variedad de otros agentes que se unen de forma específica a tipos celulares, se pueden utilizar para dirigir a la diana de tipos de células específicas en la sangre, tal y como se ha descrito en las secciones anteriores.

Por otra parte, de acuerdo con un procedimiento preferido de depuración, el procedimiento de selección positiva con DACS se puede utilizar para hacer que las células tumorales sean más pesadas que sus densidades normales, por lo que se sedimentan durante el centrifugado. Los agentes que se unen de forma específica a tipos de células, útiles en el procedimiento de selección positiva, incluyen, pero no se limitan a anticuerpos contra antígenos tumorales de mama y anticuerpos contra marcadores tumorales de mama, por ejemplo, HER2/Neu, CA 15-3, CA 549, catepsina D, EGF-R, receptor de estrógeno, Ki-67, receptor de progesterona y TGF-a. Much0s de est0s anticuerpos están disponibles comercialmente.

Las células enriquecidas por los métodos descritos en esta memoria, se pueden examinar posteriormente para estudiar la presencia de células tumorales de mama. El rendimiento resultante en células aisladas o enriquecidas procedentes de los métodos de separación de células de la presente invención, se puede utilizar con fines de diagnóstico,

p. ej., ensayos morfológicos, moleculares, bioquímicos o inmunofenotípicos. Por ejemplo, el ADN se puede preparar a partir de las células recogidas y someter a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o las células recogidas se pueden determinar morfológicamente, a fin de evitar el uso de procedimientos quirúrgicos invasivos y costosos, que hasta la fecha son pertinentes para tal determinación. Por otra parte, las células tumorales se pueden identificar por la presencia de marcadores de células tumorales, conocidos por los expertos en la materia, tal y como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos dirigidos contra estos antígenos o marcadores se pueden utilizar para determinar el tipo de tumor de las células recogidas.

3. Depuración tumoral de muestras de sangre periférica

La presencia de células tumorales en los injertos de células madre y la imposibilidad de agotar específicamente las células tumorales procedentes de la médula ósea de pacientes con linfoma no Hodgkin, puede ser un indicador importante en la predicción de la recaída en la enfermedad, después de un trasplante autólogo. Los métodos de separación de células, de conformidad con la presente invención, se pueden aplicar para eliminar células tumorales de los productos de la sangre periférica, antes de introducir de nuevo estos productos en el paciente.

En estudios llevados a cabo en apoyo de la presente invención, la línea celular de linfoma de linfocitos B humanos SU-DHL4, se utilizó como modelo para la contaminación con células tumorales de la sangre periférica. Esta línea celular contiene una traslocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas humanos 14 y 18, dando como resultado una yuxtaposición del proto-oncogen bcl-2 con la región de unión del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig). Esta traslocación, que conduce a niveles elevados del producto del gen bcl-2, se encuentra en el 85% de los linfomas foliculares con células pequeñas hendidas y en el 25% de los linfomas de células grandes difusas. El punto de ruptura en la traslocación en el gen bcl-2, se localiza en la región de ruptura principal (MBR) que abarca aproximadamente 150 pb en la región 3' no traducida (UTR) del gen bcl-2 o la región del complejo génico menor de 500 pb (MCR), ubicada aproximadamente 20 kb aguas abajo del gen bcl-2. Utilizando parejas de cebadores específicos para la traslocación y PCR cuantitativa, limitando las técnicas de análisis por dilución conocidas en la técnica, se controló el agotamiento de las células SU-DHL4 en experimentos de depuración con DACS.

Del mismo modo, la línea celular de adenocarcinoma humano SK-BR3 se utiliza como modelo para la infiltración de células de cáncer de mama de la sangre periférica. Esta línea celular reacciona con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano Her2/Neu. Antes de ser añadidas en las capas leucocitarias normales, las células SK-BR3 se cargaron previamente con calceína AM, un sustrato fluorogénico, de modo que se podían contar mediante análisis con FACS. Los detalles de los métodos experimentales utilizados en la realización de los experimentos de depuración tumoral, se proporcionan en los Ejemplos.

Un ensayo con PCR se utilizó para vigilar los niveles de células tumorales en mezclas de células sanguíneas. Inicialmente, mezclas de ADN genómico procedente de SU-DHL4 y una línea celular humana (K562) negativa para la traslocación (14; 18), se utilizaron como moldes de partida para determinar el nivel de sensibilidad del ensayo con PCR. Una electroforesis en gel de agarosa se utilizó para separar los productos de la PCR procedentes de una ronda o de dos rondas de amplificación, tal y como se muestra. Los productos de la PCR obtenidos específicamente a partir del ADN de SU-DHL4 se identificaron sobre el gel. Los resultados de estas pruebas preliminares mostraban que un ensayo de PCR anidada puede detectar aproximadamente de 1 célula SU-DHL4 por 150.000 células.

Además, el ADN genómico se preparó a partir de partes alícuotas congeladas de sangre sometida a aféresis de 24 pacientes con linfoma no Hodgkin (LNH), que habían recibido quimioterapia y G-CSF, de acuerdo con métodos convencionales conocidos en la técnica. Los productos de la PCR anidada utilizando parejas de cebadores específicos para la traslocación de la región de ruptura principal (MBR), se encontraron en 4 pacientes, lo que demuestra que este ensayo puede detectar células portadoras de la traslocación a partir de muestras clínicas auténticas.

Otros experimentos se llevaron a cabo para validar el uso del análisis con PCR en condiciones de dilución limitante, para la cuantificación de la frecuencia de células tumorales en una muestra. Se realizaron reacciones repetidas de PCR utilizando cantidades conocidas de ADN genómico cargado de SU-DHL4. Se utilizaron parejas de cebadores de la PCR anidada para t(14; 18) (una secuencia diana presente una vez en cada célula SU-DHL4) y p53 (una secuencia diana presente dos veces en cada célula SU-DHL4). La frecuencia observada de reacciones PCR positivas, ha mostrado que las frecuencias experimentales son similares a las frecuencias esperadas, basándose en las estadísticas de Poisson. Por lo tanto, el análisis con PCR empleando dilución limitante mostró que se proporcionaba un método preciso y cuantitativo para el seguimiento de células tumorales.

Como modelo de la contaminación con células tumorales de PBPC, muestras de sangre sometida a aféresis de pacientes movilizados con G-CSF, se sembraron con un número conocido de células SU-DHL4. Este material añadido se utilizó para determinar la eliminación de células tumorales mediante DACS. Este método implica una incubación de la sangre con anticuerpos monoclonales de ratón, específicos contra antígenos de superficie, expresados sobre la célula diana (CD9, CD10, CD19, CD20). A esta etapa siguió a continuación una incubación con microesferas de alta densidad recubiertas con IgG de cabra anti-ratón (perlas de DACS). La subpoblación de células unidas a estas micropartículas se separó entonces de las células no unidas, mediante centrifugación a través de una suspensión de SCO suplementada con 0,5% de PVP, con una densidad específica de 1,0605 g/ml y esterilizada por radiación gamma. Las células se recuperaron de la interfase (IF) y del sedimento (PT), después de una centrifugación en gradiente y se cuantificaron por electroforesis en gel, tal y como se detalla en el Ejemplo 5. Los resultados de un experimento representativo de depuración, se muestran en la Fig. 12 y la Fig. 13.

La Fig. 12 muestra el número de células SU-DHL4 añadidas en A) una muestra no fraccionada (determinada por conteo visual), B) una muestra no fraccionada, C) la interfase sin DACS, D) la interfase después de usar perlas de DACS con GAM-IgG, y E) la interfase después de usar perlas de DACS con GAM-IgG y una mezcla de AcMos antilinfocito B. El número de células SU-DHL4 en B, C, D y E se determinó mediante PCR cuantitativa.

La Fig. 13 representa la recuperación de células CD34+ en la interfase (IF) y en el sedimento (PT) de C, D y E. El agotamiento de las células tumorales se cuantificó por análisis con PCR con dilución limitante para las muestras B-E, tal y como se ilustra. La recuperación de células madre hematopoyéticas CD34+ se vigiló mediante citometría de flujo de tres colores. La recuperación del total de células y las células madre se muestra en relación con la recuperación de las células de la interfase. Un solo ciclo de depuración empleando una mezcla de anticuerpos, daba como resultado un agotamiento específico de 100 a 200 veces de las células SU-DHL4. La recuperación de las células CD34+ después de la DACS era superior al 70% y comparable con el número de células CD34+ recuperadas de la interfase en ausencia de DACS. Las células mononucleares de la sangre periférica se reducen en un 70-80% mediante centrifugación en densidad con o sin DACS.

En otro modelo para la contaminación con células tumorales, se sembraron células SK-BR3 en capas leucocitarias normales con una frecuencia del 2%. Células tumorales marcadas con calceína AM se retiraron de la suspensión celular mediante centrifugación en una suspensión de densidad de SCO que tenía una densidad específica de 1,0605 g/ml, con DACS utilizando anticuerpos monoclonales anti-Her-2/Neu humano. El agotamiento se determinó mediante análisis con FACS. Se realizaron ventanas de análisis con las células marcadas con calceína AM y su porcentaje se determinó según el programa LYSYS II. Aunque las células SK-BR3 no se agotan en la capa leucocitaria después del procesamiento en la suspensión de SCO, en presencia o en ausencia de perlas de DACS, se eliminaron casi en su totalidad de la mezcla de células cuando se utilizaban perlas de DACS en combinación con el anticuerpo monoclonal anti-Her-2/Neu específico del cáncer de mama. Estos datos muestran que el tratamiento con DACS reduce la contaminación con células tumorales de 10 a 100 veces, cuando el porcentaje de FACS se deduce a partir del número de células tumorales iniciales añadidas en la muestra.

En resumen, los experimentos anteriores ejemplares como modelo que emplean linfocitos B de linfoma humano y PCR cuantitativa muestran que se puede lograr una reducción de 100 a 1000 veces de las células tumorales, en una ronda de DACS, conservando la mayoría de las células madre hematopoyéticas CD34+. Utilizando una línea celular de adenocarcinoma humano SK-BR3 y análisis con FACS, se consiguió una reducción de 10 a 100 veces de las células tumorales. De manera más general, el descubrimiento de la presente invención es que este método puede ser utilizado para depurar la sangre o poblaciones celulares enriquecidas terapéuticamente, de células tumorales no deseadas.

IV. Equipo de Separación de Células Esterilizado

Una aplicación importante del descubrimiento de la presente invención es un equipo estéril para la separación celular. Dicho equipo es especialmente útil para separaciones celulares clínicas. Dicho equipo incluirá generalmente un recipiente centrifugable y un material de gradiente de densidad para separar células, que ha sido esterilizado como una unidad cargada mediante la exposición a radiaciones ionizantes. El recipiente centrifugable será comúnmente una unidad fungible y desechable, constituida a partir de plástico, tal como polipropileno, policarbonato, polisulfona, polimetilpenteno, polietileno, polialomero, poliestireno, etc. Sin embargo, tal y como se expone más adelante, las ventajas de la esterilización del equipo como una unidad precargada, también hace que este procedimiento sea deseable para equipos que incluyen tubos moldeados a partir de otros materiales. En una realización preferida, el recipiente se cierra, tal y como se ilustra a continuación, para facilitar la recogida aséptica del material de partida y la conservación y la manipulación del material en condiciones estériles.

La Fig. 14 ilustra un equipo 10 constituido de acuerdo con la presente invención. Tal y como se ilustra, el equipo 10 incluye un tubo de centrífuga 12 mostrado en la misma, cargado con material de gradiente de densidad 14. El material del gradiente de densidad está formado por una suspensión de partículas de sílice organosilanizado, tal como las partículas 16. También se incluye en el material del gradiente de densidad, al menos 0,05% de PVP, y preferiblemente entre aproximadamente 0,1% y 10% de PVP para reducir la toxicidad frente a las células sanguíneas poco frecuentes, aisladas en el equipo, lo que mejora el rendimiento de estas células en el equipo.

El recipiente y el gradiente de densidad contenido en el mismo, se esterilizan mediante radiación ionizante, tal como la radiación gamma o el haz de electrones. El equipo resultante también puede incluir una cubierta de protección, tal como la tapa 18, para proteger el contenido del tubo de la contaminación después de la esterilización. El equipo también puede incluir un soporte, tal como un porta-tubos 20, para evitar el desplazamiento del contenido de los tubos durante el transporte y el almacenamiento.

Equipos tales como los descritos anteriormente, se pueden preparar de acuerdo con los requisitos requeridos para la separación de una cantidad de tipos celulares. El tamaño del tubo utilizado, así como su resistencia química y estructural se pueden variar dentro de los límites de la presente invención, para emplear en la ultracentrifugación, así como en aplicaciones con centrifugación a velocidad relativamente baja, tal y como se describe en esta memoria. Dichas modificaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

Del mismo modo, el equipo se puede diseñar para diferentes tipos de células, variando la composición del material del gradiente de densidad. El Ejemplo 9 describe un equipo que se formula especialmente para el aislamiento de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ a partir de PBPC. En la realización descrita, la suspensión del gradiente de densidad de las partículas de SCO se ajusta a una determinada densidad de 1,0605 g/mol y una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O. Esta densidad es aproximadamente igual a la densidad de las células CD34+ deseadas, de modo que después de la centrifugación, estas células "flotan" en la interfase entre el material de carga y el material de densidad presentes en el tubo.

Se aprecia que el enriquecimiento de otros tipos poco frecuentes de células sanguíneas, tales como las células dendríticas, los linfocitos T citotóxicos, los linfocitos citolíticos naturales, los linfocitos supresores naturales y las células nucleadas fetales, se puede lograr mediante el ajuste de la densidad específica y la osmolaridad del material del gradiente de densidad. Este ajuste se puede realizar de modo que las células deseadas floten o se sedimenten, de acuerdo con la densidad de las células deseadas y la densidad relativa de las células no deseadas presentes en la mezcla de células, a partir de la cual se van a aislar las células.

Una configuración preferida del tubo para centrífuga para emplear en el equipo y el método de la invención, es la que tiene un miembro de constricción dispuesto dentro del tubo, formando una "trampa para células". Dicho tubo se describe en el documento de Solicitud PCT con el mismo cesionario PCT/95/11169 (número de publicación WO 96/07097). Una forma modificada de este tubo se muestra como parte de un sistema cerrado en la Fig. 14 en esta memoria, y se describe a continuación.

En el tubo trampa para células, el miembro de constricción está situado y construido para retener el líquido en la parte inferior del tubo, por debajo del miembro de constricción cuando el tubo se invierte. El tubo también incluye un medio de separación de células que se encuentra en la parte inferior del tubo y que se extiende por encima del miembro de constricción hasta un nivel superior a la abertura formada por el miembro de constricción. Las células que se capturan en la interfase entre el medio de separación de células y un medio de menor densidad, después de la centrifugación, se descargan con el medio de menor densidad cuando el tubo se invierte. Este medio simple de recogida de células es particularmente conveniente en el contexto de la presente invención, en donde es deseable una manipulación mínima de las células.

También se aprecia que, para aplicaciones clínicas, el equipo se puede configurar como un "sistema cerrado" para restringir el acceso de agentes patógenos externos a los materiales biológicos, tal y como se describe en esta memoria.

La Fig. 14 muestra un recipiente centrifugable que tiene un miembro de constricción incorporado en un sistema cerrado. Tal y como se ilustra, el sistema cerrado 70 incluye un depósito 71, mostrado como una bolsa estéril que contiene sangre 72, recogida previamente mediante técnicas conocidas, está conectado mediante un tubo de conexión estéril 74 a un recipiente de centrífuga 76, que se muestra como un tubo de centrífuga de estilo que tiene una parte superior cerrada 77. La parte superior cerrada tendrá por lo menos, y preferiblemente al menos dos orificios de entrada, útiles para la introducción y extracción de la muestra, y para la ventilación, tal y como se describe a continuación. En la realización mostrada, el borde sólido 79 que sobresale hacia afuera por encima de la parte superior cerrada 77, se incluye para formar una barrera protectora para los orificios de entrada, y como un punto de fijación para una tapa de protección, retirable para el aparato que sirve para reducir la posible contaminación durante el transporte y el almacenamiento .

Con referencia adicional a la Fig.14, el tubo 74 se fija a un recipiente 76 a través del orificio de entrada 78, adaptado con un ajuste 80, que puede ser cualquier tipo de terminación de fijación adaptada para una conexión estéril, por ejemplo, un conector de jeringa Luer-Lock®. Por otra parte, el ajuste 80 puede ser un tabique estéril adaptado para la conexión con las bolsas y los tubos de líquido estéril, por ejemplo, un dispositivo de extensión de cables auxiliares SAFSITE® con válvula de reflujo y un adaptador Spin-Lock® disponible en Burron Medical Inc., Bethlehem, Pennsylvania. Para facilitar el flujo de líquido hacia el interior del tubo de centrífuga 76, la cubeta contiene un orificio de entrada 82 de ventilación de aire. Tal y como se muestra, el filtro de aire 84 está fijado al orificio de entrada 82 para evitar la contaminación.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el recipiente 76 incluye un miembro de constricción 88. Aunque es posible una variedad de conformaciones, tal y como se ilustra, el miembro de constricción 88 tiene forma de embudo en su superficie superior. Tal y como se ilustra, el miembro de constricción 88 está constituido integralmente con el recipiente 76 que forma una hendidura 89 en la superficie exterior del tubo. El miembro de constricción está sujeto por soportes 90 para evitar la compresión durante la centrifugación. El recipiente también contiene material de gradiente de densidad con partículas de SCO 91, dispuesto en el tubo por encima y por debajo del miembro de constricción 88. Todo el sistema, tal y como se ilustra, se esteriliza por radiación gamma o haz de electrones, de acuerdo con métodos convencionales.

Una característica adicional del recipiente 76, es el orificio de entrada 92. Este orificio de entrada comunica a través del canal cerrado para fluido 94 con la porción inferior 95 del recipiente 76. El orificio de entrada y el canal se utilizan para cargar la parte inferior del tubo 95, por ejemplo, con medio de separación de células en gradiente de densidad antes de la esterilización. Por otra parte, el orificio y el canal se pueden utilizar para eliminar materiales, incluyendo materiales de la sedimentación de células, desde la parte inferior del tubo después de la centrifugación. Esta característica del tubo no es ni necesaria ni debe limitarse al contexto del sistema cerrado en el que se ilustra.

El flujo de líquido procedente del depósito 70 hacia el interior del recipiente 76, se puede iniciar mediante la aplicación de succión sobre el orificio de entrada 82 de ventilación de aire, o puede iniciarse por otros medios conocidos en la técnica, incluida la gravedad. La velocidad del flujo se ajusta, ya sea mediante la alteración de la caída de presión entre los dos recipientes o mediante la regulación de una válvula colocada en el tubo o en el orificio de entrada en un punto entre el depósito 70 y el orificio de entrada 78. El caudal se regula de manera óptima para cargar

o cargar parcialmente la parte superior del recipiente 76, por encima del nivel de la solución del gradiente de densidad. Cuando entra suficiente muestra de líquido en el tubo, el flujo puede ser rescindido por cualquiera de una serie de medios conocidos en la técnica, tales como la regulación mediante una válvula o mediante la reducción de la caída de presión. El tubo se retira a continuación de la cubeta, el orificio 78 se sella, y el recipiente cerrado se somete a centrifugación tal y como se ha descrito anteriormente.

En otra realización preferida que es particularmente útil para la realización del método de la presente invención, el tubo de constricción puede tener la forma de una jeringa centrifugable, tal como la jeringa centrífuga se descrita en el documento de Solicitud PCT del mismo cesionario PCT/US95/11162 (WO 96/06679). Esta realización es muy adecuada para el uso en un sistema cerrado, tal y como se ha descrito anteriormente.

Otra configuración del dispositivo que es adecuada para el uso en la invención, es una bolsa centrifugable. Tal configuración es especialmente adecuada para el uso en el procesamiento de muestras clínicas de sangre que se pueden recoger directamente en la bolsa.

Los siguientes ejemplos ilustran, pero no pretenden en absoluto limitar la presente invención.

Ejemplos

Materiales

A. Materiales de gradiente de densidad

Las partículas de sílice coloidal organosilanizado (rango de tamaño: 15-30 nm) utilizadas en los ejemplos siguientes, se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en el documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749 usando gammaglicidoxipropil-trimetoxisilano (GPMS). La polivinilpirrolidona (PVP-10) se obtuvo de Sigma (St. Louis, MO).

B. Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales (AcMos) dirigidos contra antígenos de superficie específicos de células progenitoras hematopoyéticas (anti-CD34; anti-HPCA-2) y leucocitos (anti-CD45, anti-HLE-1) se obtuvieron de Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA). Los diferentes anticuerpos monoclonales se marcaron directamente con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE). Los anticuerpos policlonales testigos de isotipo IgG1, marcados con PE se obtuvieron de Becton Dickinson, Inc. (San Jose).

Ejemplo 1

Preparación de la solución de gradiente de densidad

El material para el gradiente de densidad a base de partículas de SCO, preparado tal y como se ha descrito en "Materiales" más arriba, se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para proporcionar una suspensión con una osmolaridad definida y una densidad específica, a pH 7,4, tal y como se ha indicado.

El material para el gradiente de densidad a base de partículas de SCO se diluyó en agua hasta tener la densidad específica aproximada requerida. Se añadieron sales sólidas para proporcionar una solución salina fisiológica final (solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; Gibco). La suspensión se complementó con diferentes concentraciones finales (0% -10% p/p) de polivinilpirrolidona (PVP-10), añadiendo el polvo sólido ajustado para la densidad de la suspensión final. La suspensión diluida se esterilizó finalmente con radiación ionizante (rayos gamma y haz de electrones, 2,5-3,5 megaRads; Isomedix, Morton Grove, IL), autoclave (15 min. a 120ºC) o filtración a través de un filtro de 0,2!m de acuerd0 c0n métodos convencionales conocidos en la técnica y utilizados a temperatura ambiente.

Ejemplo 2

Preparación de células progenitoras hematopoyéticas

A. Mezclas de células sanguíneas

Las células mononucleares de sangre periférica (CPSP) se recogieron por aféresis a partir de pacientes con linfomano Hodgkin (LNH), linfoma de Hodgkin (LH) y con cáncer de mama, en el Laboratorio de Trasplante de Médula Ósea de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, Palo Alto, California, EE.UU. Las PBPC se movilizaron en pacientes con LNH mediante tratamiento con ciclofosfamida (4 g/m2, por vía intravenosa), seguido por el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) (10 !g/kg, p0r vía intravenosa, diariamente). Las PBPC se movilizaron en pacientes con cáncer de mama mediante tratamiento con etopósido (VP-16; 2 g/m2, por vía intravenosa, diariamente), seguido de G-CSF (10 !g/kg, p0r vía intravenosa, diariam ente). Las PBPC se movilizaron en pacientes LH mediante tratamiento solo con G-CSF. Los protocolos de la movilización utilizados son protocolos convencionales, conocidos en la técnica.

Veinticuatro horas después de la inyección final, cada paciente fue sometido a aféresis. Las PBPC se recogieron de la sangre sometida a aféresis, de acuerdo con métodos convencionales.

B. Mezclas de células de la médula ósea

Las células aspiradas de la médula ósea se dispusieron en capas lentamente sobre una suspensión de SCO, preparada tal y como se ha descrito anteriormente, hasta una densidad de 1,0685 g/ml, con una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O. Un máximo de 2x109 células se dispusieron en capas y se procesaron por cada tubo de centrífuga. El tubo se centrifugó durante 30 minutos a 850 x g, a temperatura ambiente. Las células de la interfase y del sedimento se recogieron separadamente, a partir de un tubo trampa para células, de acuerdo con la presente invención. Las fracciones celulares se caracterizaron mediante análisis por FACS, utilizando anticuerpos anti-CD34 conjugados con FITC y PE (anti-HPCA-2), anti-CD45 (anti-HLe-1), anti-CD3 (Leu-4) y anticuerpos IgG1, obtenidos de Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA). Para el análisis, las células se marcaron con el colorante nuclear LDS 751 (Exciton, Inc., Dayton, OH). El análisis estadístico se llevó a cabo sobre 104 casos de flujo, utilizando un sistema de FACSCAN equipado con un programa LYSYS II (Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA).

Ejemplo 3

Separación por gradiente de densidad de PBPC

Las células PBPC (025 ml), recogidas según el Ejemplo 2 y diluidas en PBS a una concentración de aproximadamente 5 x 107 células/ml, se dispusieron en capas sobre una suspensión en gradiente de densidad a base de partículas de SCO (15 ml en un tubo de centrífuga de 50 ml). La suspensión tenía una densidad específica de 1.0605 g/ml, una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O y un pH de 7,4. La estratificación se realizó lentamente para evitar la mezcla de la muestra con la solución. Se estratificaron un máximo de 2 x 109 células por tubo. La centrifugación se realizó durante 30 min. a 850 x g, a temperatura ambiente. Para evitar la mezcla de las células y la solución del gradiente de densidad, la centrífuga se detuvo sin fuerza de frenado.

Después de la centrifugación, las células se dividieron en una fracción de baja densidad situada en la interfase y una fracción de alta densidad que formaba el sedimento. Cada fracción celular se recogió y se trasladó a otro tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml. Las células se lavaron una vez y se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco exenta de Ca++ y Mg++ (D-PBS) a temperatura ambiente, hasta su posterior manipulación. El número y la funcionalidad de las células progenitoras hematopoyéticas (células CD34) se determinó en ambas fracciones celulares, mediante análisis con FACS y ensayos clonogénicos (UFC), tal y como se detalla en los Ejemplos 5 y 6, a continuación.

Ejemplo 4

Efecto sobre las células del mezclado con partículas de sílice coloidal silanizado

La determinación del efecto del mezclado y posterior incubación de sangre periférica humana en soluciones de gradiente de densidad a base de partículas de de sílice coloidal silanizado, se llevó a cabo mediante uno o varios de los métodos descritos a continuación.

Después de las respectivas incubaciones, tal y como se detalla a continuación, las células se recogieron y se lavaron una vez con PBS. Su capacidad para formar colonias hematopoyéticas eritroides (UFC-E, BFU-E), granulocito/macrófago (UFC-GM) y mixtas (UFC-GEMM), de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, y tal y como se describe en el Ejemplo 6, a continuación, se escrutó al final de cada método. En la realización de los experimentos, los Métodos 1, 3 y 5 son condiciones de incubación testigo para los Métodos 2, 4 y 6, respectivamente.

Método 1: una parte alícuota que contenía 107-108 células en 5 ml de 1 X D-PBS (exenta de Ca++ y Mg++), se añadió a un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se anotó el número de células iniciales. Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave a intervalos de 15 minutos.

Método 2: una parte alícuota que contenía 107-108 células en 5 ml de suspensión de gradiente de densidad con SCO, se añadió a un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se anotó el número de células iniciales. Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave, a intervalos de 15 minutos.

Método 3: una parte alícuota que contenía 107-108 células en 5 ml de 1 X D-PBS (exenta de Ca++ y Mg++), se colocó en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se anotó el número de células iniciales. Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave a intervalos de 15 minutos. La mezcla de células se centrifugó a continuación a 550 x g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, se retiró el material sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 5 ml de medio de Iscove suplementado con suero bovino fetal al 10%. La mezcla de células se incubó a continuación durante 24 horas a temperatura ambiente.

Método 4: una parte alícuota que contenía 107-108 células en 5 ml de suspensión de gradiente de densidad con SCO, se colocó en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se anotó el número de células iniciales. Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave a intervalos de 15 minutos. La mezcla celular se centrifugó después a 550 x g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, se retiró el material sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 5 ml de medio de Iscove suplementado con suero bovino fetal al 10%. La mezcla de células se incubó a continuación durante 24 horas a temperatura ambiente.

Método 5: una parte alícuota que contenía 107-108 células en 5 ml de 1 X D-PBS (exento de Ca++ y Mg++), complementado con suero bovino fetal al 10%, se añadió a un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se anotó el número de células iniciales. La mezcla de células se incubó a continuación durante 24 horas a temperatura ambiente.

Método 6: una parte alícuota que contenía 107-108 células en 5 ml de suspensión de gradiente de densidad con SCO complementada con suero bovino fetal al 10%, se añadió a un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se anotó el número de células iniciales. La mezcla de células se incubó a continuación durante 24 horas a temperatura ambiente.

Ejemplo 5

Tinción y cuantificación de células CD34+ por FACS

La cantidad de células CD34+ se determinó mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), después de que se hubieran marcado las células con un colorante nuclear y haber dirigido los AcMos hacia CD34 y CD45. El porcentaje de células CD34 presentes se determinó en la puerta de las células nucleadas. Este enfoque se escogió para evitar la interferencia del material en partículas no nucleado, con la precisión del análisis de las células CD34 en la FACS.

Se preparó una suspensión de 2x107 células/ml, utilizando D-PBS exento de Ca++ y Mg++ como diluyente. Cincuenta microlitros de esta suspensión celular que contenía 1x106 células, se añadió a cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Cincuenta microlitros de una solución de suero de conejo/D-PBS termoinactivada al 20% y 10 micr0litr0s de 10 !g/ml de LDS 751 (c0l0rante para la tinción nuclear) en solución D-PBS, también se agregaron a cada pocillo, seguido de mezcla. La placa se cubrió con papel aluminio y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A cada pocillo testigo se añadieron 10 microlitros de IgG1-PE. A cada pocillo del ensayo, se añadieron 10 microlitros de anti-CD34-PE, seguido de mezcla. La placa se cubrió con papel de aluminio y se incubó durante 15 minutos a 4ºC. La placa se centrifugó a continuación a 850 x g, durante 5 minutos a 4ºC. El material sobrenadante se eliminó con una sacudida rápida.

Cada sedimento celular se resuspendió en 200 !l de 1xDPBS frío (4ºC) (exento de Ca ++ y Mg++). La placa se centrifugó a continuación a 850 x g durante 5 minutos a 4ºC, y el material sobrenadante resultante se separó mediante una sacudida rápida de la placa. Cada sedimento celular se resuspendió en 50!l de s0lución de suero de conejo termoinactivado al 20%. Se añadió anti-CD45-FITC (10 !l) a cada p0cill0 testig0 y cada p0cill0 del ensay0 y se mezcló. La placa se cubrió con papel de aluminio y se incubó durante 30 minutos a 4ºC. Un centenar de microlitros de 1xD-PBS frío (4ºC) (exento de Ca++ y Mg++) se añadieron a continuación a todos los pocillos testigos y a los pocillos de las muestras, y la placa se centrifugó a 850 x g durante 5 minutos a 4ºC. La placa se sacudió rápidamente para eliminar el material sobrenadante, y cada sedimento celular se resuspendió en 200!l de 1xD -PBS frío (4ºC) (exento de Ca++ y Mg++). La placa se centrifugó a 850 x g durante 5 minutos a 4ºC, luego se sacudió rápidamente para eliminar el material sobrenadante. Cada sedimento celular se resuspendió a continuación en 200 ml de paraformaldehído al 1% (4ºC). La placa se cubrió a continuación con papel aluminio y se almacenó a 4ºC hasta el análisis con FACS de las muestras.

El análisis con FACS se realizó en 104 casos de flujo utilizando un sistema de FACSStar Plus equipado con un programa de análisis estadístico LYSYS II (Becton Dickinson, Inc.). Para efectos de análisis, una puerta (Región 1) se colocó alrededor de las células nucleadas determinadas por la tinción con LDS 751 en FL3, con el fin de discriminar los glóbulos rojos, las plaquetas y los residuos. FL1 y FL2 se mostraban como un gráfico de puntos empleando la Región 1. Una puerta (Región 2) se colocó alrededor de la población de células que se teñía con los anticuerpos monoclonales anti-CD45 y anti-CD34. Para efectos de análisis, el porcentaje de células que se teñía con los anticuerpos monoclonales anti-CD34 (FL2) y anti-CD45- (FL1), se determinó en la Región 2. Esto representa el número de células CD34 positivas como un porcentaje del número total de células nucleadas. El número total de células CD34 positivas se determinó en la muestra sin procesar y en la fracción celular obtenida a partir de la interfase y del sedimento, después del procesamiento de las muestras de PBPC en la solución de gradiente de densidad.

Ejemplo 6

Ensayo de Formación de Colonias (UFC)

Las características funcionales de las células CD34+ en una muestra de células, se determinaron mediante el ensayo de formación de colonias (UFC). Este ensayo proporciona una cuantificación del número de células progenitoras hematopoyéticas comprometidas en la solución de células.

Las células se diluyeron hasta una concentración de 105 células en 2 ml de metil celulosa semisólida, preparada comercialmente, que contenía varios factores estimulantes de colonias y eritropoyetina (medio H4433 de MethoCult®, Terry Fox Laboratories, Vancouver).

Después de 14 días de cultivo a 37ºC, se hizo un recuento de las colonias eritroides (UFC-E, BFU-E), de granulocitos/macrófagos (UFC-GM) y mixtas (UFC-GEMM), bajo un microscopio invertido (40x), de acuerdo con métodos convencionales. El número total de UFC presentes en una mezcla de células se define por la suma de los diferentes tipos de colonias contadas.

Ejemplo 7

Determinación de la recuperación total de células

El porcentaje de recuperación celular se determinó mediante la fórmula:

Nº de células después de la manipulación % de recuperación = 100 x --------------------------- Nº de células al inicio

El porcentaje de recuperación de células CD34 se determinó mediante la fórmula:

Nº de células CD34+ después de la manipulación % de recuperación = 100 x ------------------------------- Nº de células CD34+ al inicio

El porcentaje de recuperación de células clonogénicas se determinó mediante la fórmula:

Nº de células clonogénicas (UFC) después de la manipulación % de recuperación = 100 x ----------------------------------------Nº de células clonogénicas (UFC) al inicio

Ejemplo 8

Efecto de la radiación sobre la recuperación de células hematopoyéticas

El efecto de las partículas de sílice coloidal organosilanizado irradiadas sobre la integridad de las células hematopoyéticas se sometió a ensayo, utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 4 como "Métodos 3 y 4". Partículas de SCO, partículas de SCO suplementadas con 0,5% de PVP, o PBS suplementado con 0,5% de PVP (5 ml del volumen total), se sometieron a radiación en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml, mediante una dosis de radiación gamma (2,5-3,5 megaRads). En estos experimentos, la densidad de la suspensión de partículas de SCO utilizada era de 1,0605 g/ml, una densidad que es inferior a la de las células que se van a aislar, para facilitar la posterior sedimentación y cuantificación de las células presentes en el tubo.

Una parte alícuota que contenía 3 x 107 células PBPC, aisladas tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1, se añadió a cada tubo, y se anotó el número de células iniciales. Las células se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación suave a intervalos de 15 minutos. La mezcla de células se centrifugó después a 550 x g durante 10 minutos. Tras la centrifugación, se retiró el material sobrenadante y el sedimento de células se resuspendió en 5 ml de medio lscove suplementado con suero bovino fetal al 10%. La mezcla de células se incubó durante 24 horas a temperatura ambiente, y luego se sometió al ensayo de UFC, descrito en el Ejemplo 6. Los resultados de este experimento se muestran en la Fig. 1.

Ejemplo 9

Equipo de centrifugación estéril

Se preparó un equipo para centrífuga estéril, para la separación de células progenitoras hematopoyéticas CD34+ de células mononucleares de sangre periférica (CPSP), de la siguiente manera: una suspensión de gradiente de densidad con partículas de densidad basada en partículas de SCO, se preparó tal y como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se preparó una solución madre mezclando 12 partes de la suspensión de partículas de SCO con 1 parte de 10 x solución salina tamponada con fosfato (PBS), exenta de calcio y magnesio y PVP concentrada (PVP-10, Sigma), para preparar un medio que tenía una densidad de 1,0605 ± 0,0005 g/ml, pH 7,4, una osmolaridad de 280 mOsm/Kg de H2O, y una concentración de 4% de PVP. La densidad de la solución de partículas de SCO se puede ajustar en un densitómetro para definir con precisión su exactitud hasta al menos la cuarta posición decimal.

Quince mililitros de esta suspensión se añadieron a un tubo de centrífuga cónico de 50 ml de polipropileno (Baxter). El tubo se selló con el tapón de rosca estándar, suministrado con el tubo. El tubo y su contenido fueron expuestos a continuación a 2,5-3,5 megaRads de radiación gamma colocándolo en una cámara. El equipo para centrífuga estéril resultante se utilizó para separar células CD34+ a partir de PBPC, tal y como se ha descrito en el Ejemplo 4 en esta memoria.

Ejemplo 10

Enriquecimiento de células CD34+ a partir de mezclas de células

A. Preparación de gradientes de densidad

A.1. Gradiente de densidad de PERCOLL®

La solución de PERCOLL® se adquirió de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia) y se almacenó a 4ºC, de acuerdo con las recomendaciones del vendedor. Una solución madre se preparó mezclando 12 partes de PERCOLL® con 1 parte de 10 x solución salina tamponada con fosfato (PBS), exenta de calcio y magnesio. El pH de la solución se ajustó a 7,4 y la osmolaridad a 280 mOsm/Kg de H2O. Para el uso en la separación de células CD34+ en una mezcla de células, la solución madre se diluyó adicionalmente con PBS exenta de calcio y magnesio, hasta una densidad de 1,0605 ± 0,0005 g/ml y se utilizó a temperatura ambiente. Era crucial ajustar la densidad del gradiente con una precisión de entre ± 0,0005 g/ml de 1,0605 g/ml, con el fin de asegurar la reproducibilidad y la precisión de la separación celular. Esto se hizo mediante un densitómetro digital de alta precisión, tal como DMA 48 (Anton PAAR EE.UU., Ashland, VA).Todos los procedimientos se realizaron bajo condiciones estériles y a temperatura ambiente.

A.2. Gradiente de densidad con sílice coloidal organosilanizado (SCO)

Una suspensión de partículas de SCO es una suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado que se prepara tal y como se describe por Dorn (documento de Patente de EE.UU. nº 4.927.749). Las partículas de SCO que varían en tamaño desde 3 hasta 22 nm, y en particular de 13 a 18 nm, forman una suspensión estable que actúa como un medio de gradiente de densidad para la separación de mezclas heterogéneas de células, basándose en la densidad de flotación. A menos que se indique lo contrario, la suspensión de partículas de SCO se preparó en una solución salina fisiológica, para obtener una densidad de 1,0605 g/ml, con una osmolaridad de 280 mOsm/kg de H2O, tal y como se ha definido para el enriquecimiento de las células CD34+ procedentes de muestras de PBSC. La suspensión se produjo bajo condiciones de GMP y se esterilizó con radiación gamma, en presencia de al menos 0,05% de polivinilpirrolidona (PVP-10, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La PVP se añadió como un polvo seco a una suspensión de partículas de SCO ajustada previamente hasta la densidad específica final deseada, aproximada. Se prefieren concentraciones de PVP de al menos 0,05% y como máximo el 10%, para uso en los métodos, aparatos y equipo de la invención.

B. Centrifugación en gradiente de densidad de capas leucocitarias de sangre y de médula ósea

Sangre periférica sometida a aféresis se aplicó directamente sobre el gradiente de densidad. Sin embargo, a menos que se indique lo contrario, la sangre completa y el material aspirado de la médula ósea se procesaron a una capa leucocitaria (eliminación de los glóbulos rojos), de acuerdo con métodos convencionales, antes de que se aplicaran sobre el gradiente de densidad.

Muestras de sangre sometida a aféresis se dispusieron en capas sobre un gradiente de PERCOLL® ajustado previamente a una densidad de 1,0605 ± 0,0005 g/ml, una osmolaridad de 280 mOsm/Kg de H2O, y un pH de 7,4, en un tubo cónico de 50 ml a modo de trampa para células o un tubo disponible en el comercio. El tubo trampa para células contenía una constricción en un lugar, de modo que aproximadamente 15 ml de PERCOLL® estaban en el compartimiento inferior y 5 ml de PERCOLL® estaban por encima de la constricción. Era fundamental llenar completamente el volumen por debajo de la constricción, con PERCOLL® para evitar la formación de burbujas de aire. Por lo general, 20 ml de muestras de sangre sometida a aféresis, se dispusieron en capas en la parte superior de este gradiente. El tubo se centrifugó a 850 x g durante 30 minutos, a temperatura ambiente. Las células presentes en la interfase del gradiente, es decir, en la parte superior del PERCOLL®, se recogieron mediante el vertido de todo el contenido del compartimiento superior del tubo, en otro tubo de 50 ml. Se evitó que el sedimento celular en la región por debajo de la constricción, se eliminara por vertido cuando el tubo se invirtió.

A fin de comparar el método de separación de células descrito en el párrafo anterior, con los métodos convencionales de separación, las muestras del ensayo también se dispusieron en capas sobre "Ficoll Hypaque" (Pharmacia). La densidad de la solución madre de Ficoll era de 1,077 ± 0,001 g/ml y la osmolaridad de 320 mOsm/kg de H2O, según lo publicado por el vendedor.

Las células de la médula ósea se prepararon tal y como se ha descrito en el Ejemplo 2.

C. Separación de células con densidad ajustada (DACS)

C.1. Preparación de las partículas portadoras

Perlas de sílice (1,4 micrómetros) obtenidas de los Laboratorios Bangs, Carmel, IN, se lavaron con HCl concentrado durante 2 horas a temperatura ambiente y se mezclaron intensamente cada 15 minutos para romper los agregados de perlas. Después del lavado, las perlas se centrifugaron a 850 x g durante 5 minutos. El material sobrenadante que contenía HCl se decantó y las perlas se lavaron con H2O desionizada mezclando intensamente para disolver los agregados.

Las perlas se incubaron a temperatura ambiente durante una noche en ácido nítrico concentrado, con agitación constante, empleando un agitador magnético. Las perlas se centrifugaron a continuación a 850 x g durante 5 minutos y se lavaron tres veces con agua desionizada, empleando 50 ml de H2O desionizada en cada etapa. Las perlas se mezclaron intensamente entre cada lavado para evitar la aglomeración de las perlas. Para evitar la contaminación microbacteriana, las perlas se almacenaron a 0-4 grados centígrados en H2O desionizada hasta su uso posterior.

Para silanizar las perlas, se utiliza ya sea 3-aminopropiltrietoxisilano, (3-yodopropil)trimetoxisilano o [1-9trimetoxisilil)-2(m-(o p) clorometil)fenil]etano. Cuarenta ml de solución de silano (una solución al 10% en etanol al 95%/ H2O desionizada) se añadieron por cada 4 g de perlas. La mezcla de perlas se sometió a una mezcladora vertical durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se centrifugaron a 850 x g durante 5 minutos y el exceso de silano se separó por lavado con etanol al 95%/H2O desionizada, en un volumen de 100 ml. Las perlas se mezclaron intensamente entre cada etapa de lavado para evitar la aglomeración de las perlas. Después de la etapa de lavado, las perlas se pueden secar y almacenar. Por otra parte, las perlas se pueden almacenar en etanol al 95%/H2O desionizada en frío, lo que impide la aglutinación de las perlas.

Las perlas silanizadas se incubaron durante una noche en 2,5% de glutaraldehído a temperatura ambiente. Al día siguiente, las perlas se centrifugaron a 850 x g durante 5 minutos y el glutaraldehído libre se lavó con H2O desionizada en un volumen de 100 ml por cada 5 g de perlas. Las perlas se mezclaron intensamente entre cada etapa de lavado para evitar la aglomeración de las perlas.

El anticuerpo se añadió a las perlas de aminopropilo en un exceso, de por lo menos 3 mg/m2 de superficie total de las perlas y se realizó una mezcla de tipo vertical durante una noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, las perlas se centrifugaron a 850 x g durante 5 minutos y la proteína libre se eliminó por lavado con 100 ml de H2O desionizada. Las perlas se mezclaron intensamente entre cada etapa de lavado para evitar la aglomeración de perlas. Las perlas se almacenaron en H2O desionizada que contenía 0,1% de azida sódica en frío. La suspensión final de las perlas debe contener un 70-90% de perlas individuales y 10-30% de perlas, predominantemente en forma doble y triple.

La eficacia de la unión de las perlas conjugadas con anticuerpos (en términos de porcentaje de perlas que están recubiertas) se puede determinar mediante el análisis de citometría de flujo y un anticuerpo fluoresceinado dirigido contra el anticuerpo acoplado. Por otra parte, el anticuerpo se puede agregar directamente a las perlas silanizadas, sin el enlace de glutaraldehído.

C.2. Perlas recubiertas con anti-CD45

El producto de sangre sometida a aféresis se incubó con perlas de vidrio de aminopropilo de 1,4 ! (Bangs Lab0rat ories Inc., Carmel, IN) que se recubrieron a través de glutaraldehído con un anticuerpo anti-CD45 (clon ALB-12, Biodesign International, Kennebunk, ME) durante 45 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de células de sangre completa se dispuso en capas sobre SCO + 0,5% de Pip (1,0605 ± 0,0005 g/ml, 280 mOsm/Kg de H2O, pH 7,4) en un tubo de 50 ml.

C.3. Perlas recubiertas con IgG (GAM-IgG) de cabra anti-ratón

Las células de la muestra de PBSC se contaron por exclusión con azul tripano, se lavaron y se resuspendieron en PBS suplementado con 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA), a una concentración de 107 células/ml. Se añadieron AcMos anti-CD3, CD4 y CD8 para proporcionar una concentración final de 3-10 !g/ml. Las células se incubaron durante 30 minutos sobre hielo y luego se centrifugaron. El sedimento celular se resuspendió en 0,1% de BSA en PBS, hasta tener una concentración de 107 células/ml. Las perlas de DACS recubiertas con IgG (GAM-IgG) de cabra anti-ratón se contaron y se añadieron a las células para proporcionar una relación de perlas:células entre 4:1 y 8:1. Las perlas y las células se incubaron durante 15 minutos. Durante la incubación, la mezcla de células:perlas se volvió a suspender suavemente cada 5 minutos. La mezcla de células y perlas se extendió a continuación en capas sobre una suspensión en gradiente de densidad de SCO y se centrifugó a temperatura ambiente a 850 x g durante 30 minutos. Las células en la interfase se recogieron mediante la decantación del tubo de centrifugación, se hizo el recuento y se prepararon para el análisis FACS. Para examinar el agotamiento no específico, se utilizó un procedimiento similar, pero se omitió la incubación con los anticuerpos monoclonales.

Experimentos para examinar la eficacia de la DACS para eliminar los linfocitos T, se realizaron utilizando preparaciones de PBSC movilizadas y AcMos anti-CD3, CD4 y CD8. El rendimiento en linfocitos T se vigiló utilizando un AcMo anti-CD2 para evitar los artefactos asociados con los AcMos que reconocen los mismos epítopos sobre los antígenos de diferenciación.

D. Conjugación de moléculas de adhesión celular a las partículas portadoras

D.1. Anticuerpos monoclonales

Anticuerpos monoclonales anti-CD34 conjugados con ficoeritrina (PE-CD34) (marcador de las células progenitoras hematopoyéticas) y anticuerpos monoclonales anti-CD45 conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC-CD45) (marcador pan-leucocitario), se obtuvieron de Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA). Anticuerpos no conjugados dirigidos contra CD45, CD16 (granulocitos, monocitos), CD3 (linfocitos T), CD14 (monocitos), se prepararon en el laboratorio, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica.

Los AcMos anti-CD3 (clon Leu4), CD4 y CD8 se obtuvieron por cortesía del Dr. E. Engleman del Banco de Sangre del Hospital Universitario de Stanford. Además, FITC-CD2, PE-CD34 y FITC-CD45 se compraron al mismo vendedor.

Los anticuerpos se conjugaron con cualquiera de las perlas magnéticas recubiertas con anticuerpo de cabra antiratón o perlas de vidrio de aminopropilo recubiertas con anticuerpo de cabra anti-ratón, mediante incubación durante una noche a temperatura ambiente. Por otra parte, los anticuerpos se podían unir directamente a estas perlas sin el puente de cabra anti-ratón o se podían unir a través de una reacción de acoplamiento avidina-biotina. Además, los anticuerpos se podían escindir en fragmentos Fab2 con el fin de reducir la unión no específica de las células a las perlas, a través de sus porciones Fc.

D.2. IgG de cabra anti-ratón (GAM-IgG)

La IgG1 de ratón conjugada con FITC o PE se obtuvo de Becton Dickinson (San Jose, CA) y se utilizó como testigo del isotipo.

Se utilizaron diferentes tipos de procedimientos para preparar perlas de DACS recubiertas con IgG de cabra antiratón (GAM-IgG) (Biodesign International). El objetivo era maximizar el agotamiento específico y minimizar el agotamiento no específico durante la DACS. Las perlas de DACS estaban recubiertas de forma covalente, ya sea con GAM-IgG o F(ab)2 GAM-IgG (East Cost Biological) con una orientación aleatoria o GAM-IgG con una orientación específica para maximizar la disponibilidad de los sitios de unión de Ig para fijar el antígeno. Además, algunas preparaciones de perlas se recubrieron con polietilenglicol (PEG) (Shearwater) para reducir la afinidad no específica de las perlas hacia proteínas o células. Las composiciones químicas diferentes se describen a continuación.

GAM-IgG o F(ab)2 GAM-IgG aleatorias

Las perlas de sílice se recubrieron con aminopropiltrietoxisilano (Sigma) que tenía grupos -NH2 disponibles para la conjugación con el grupo -CHO del glutaraldehído (Sigma). De acuerdo con la química empleada, el glutaraldehído forma a continuación un puente y se une al grupo -NH2 de las lisinas en todas las moléculas de GAM-IgG o F(ab)2 GAM-IgG, cuando el anticuerpo y el glutaraldehído se añadieron a la preparación. La orientación de la molécula de proteína en relación con la perla, se considera que está al azar, basándose en que cualquier lisina con una cadena lateral de -NH2 se conjugará potencialmente con el -CHO del glutaraldehído. Esto proporciona una cadena ATESGLUT-IgG con la IgG o la IgG-F(ab)2 en una orientación aleatoria.

GAM-IgG en una orientación específica

Las perlas de sílice se recubrieron con aminopropiltrietoxisilano que tenía grupos -NH2 disponibles para la conjugación con el grupo -CHO de los hidratos de carbono en la región glicosilada de la porción Fc de la molécula GAM-IgG. La molécula GAM-IgG solo está glicosilada en la porción Fc, de manera que la unión de GAM-IgG con la superficie de la perla a través de esta región, tendrá el efecto de orientar la molécula de IgG con la porción Fc próxima a la superficie de la perla y los sitios de unión a IgG alejados de la superficie. Este tratamiento incrementa teóricamente el número de sitios de unión disponibles para unir el antígeno y disminuye la disponibilidad de la porción Fc para unirse a receptores de Fc. Esto proporciona una cadena ATES-CHO-IgG con la IgG en una orientación específica.

GAM-IgG aleatoria con PEG-aldehído

Perlas de sílice se recubrieron con aminopropiltrietoxisilano que tiene grupos -NH2 disponibles para la conjugación con un grupo -CHO de una molécula de aldehído-PEG-aldehído, en donde el PEG se encuentra intercalado entre dos residuos de aldehído. La GAM-IgG se une a continuación con el otro residuo -CHO para proporcionar una cadena ATES-CHO-PEG-CHO-IgG con la IgG en una orientación aleatoria.

E. Análisis

La tinción de los anticuerpos, el análisis con FACS y los ensayos de CF se llevaron a cabo tal y como se ha descrito en los Ejemplos 5 y 6.

F. Ensayo de células iniciadoras de cultivo a largo plazo (LTC-IC)/Determinación funcional de las células CD34+ no comprometidas

El número de células progenitoras hematopoyéticas no comprometidas en una mezcla de células se determinó mediante la iniciación del cultivo a largo plazo. Las células se sembraron sobre una capa alimentadora de estroma irradiada y una determinación de las UFCs se hizo en función del tiempo. Las células madre hematopoyéticas eran capaces de autorrenovarse y daban lugar a UFCs en este sistema durante un período que excedía las 5 semanas. Cultivos a largo plazo de estroma de médula ósea se iniciaron en placas de 96 pocillos (106 células en 200 !I p0r p0cill0) en un medi0 a-MEM suplementado con 12,5% de suero de caballo, 12,5% de suero fetal bovino, L-glutamina 2 mM, i-inositol 0,2 mM, ácido fólico 20 !M, 2 -mercaptoetanol 10-4 M y se mantuvieron a 33ºC en una atmósfera humidificada. A intervalos semanales, se retiró la mitad del medio y se reemplazó por un volumen igual de medio de nuevo aporte. Después de 2 semanas de cultivo, las capas de estroma confluentes se irradiaron con rayos gamma (2000 rad) para destruir las células hematopoyéticas endógenas. Muestras fraccionadas y preparaciones de células después de la separación, se sembraron sobre las capas de estroma irradiado en el mismo medio, suplementado con hidrocortisona 10-6 M. Después de cinco semanas de cultivo, se recogieron las células adherentes y las no adherentes y se escrutaron con el ensayo de UFC como en la Parte G, anterior.

G. Ensayo con linfocitos citolíticos naturales

Las células diana K562 se marcaron con 100!Ci de 51Cr durante 1 hora a 37°C y a continuación se lavaron cuatro veces y se realizó el recuento. Las células diana se cocultivaron durante 4 horas en placas multipocillo con 96 pocillos de fondo en V, con sangre sometida a aféresis no fraccionada y células procedentes de diferentes fracciones después de la separación celular. Las células efectoras y diana se mezclaron en diferentes proporciones, 100:1, 50:1, 25:1 y 12:1. Por ejemplo, la proporción 100:1 contenía 5 x 105 células efectoras y 5 x 103 células diana. Después del período de incubación, se recogier0n 100 !l del material s0brenadante y se hiz0 el recuent0 en un c0ntad0r de centelleo. La liberación máxima y espontánea de 51Cr se midió contando 50 !l de la s0lución madre diana y el material sobrenadante procedente de los efectores por sí mismos, respectivamente. El porcentaje de citotoxicidad se determinó de acuerdo con la fórmula:

cpm del experimento - cpm de liberación espontánea

Porcentaje de citotoxicidad = ------------------------------------

liberación máxima de cpm – liberación espontánea de cpm

J. Cultivo de linfocitos mixtos y actividad de los linfocitos supresores naturales

Las células procedentes de dos capas leucocitarias diferentes, se mezclaron en una placa con múltiples pocillos, con 96 pocillos de fondo plano, con 105 células en cada uno. Una de las capas leucocitarias recibió 3.000 rad y se denominó "estimuladora". La otra capa leucocitaria se utilizó sin tratar y se denominó "respuesta". Productos de sangre periférica no fraccionada sometida a aféresis (APBL) o células procedentes de fracciones de diferente densidad, se añadieron a estos cocultivos, con 105 células por pocillo. Estas células se denominaron "supresoras", y recibieron

1.500 rads antes de ser agregadas a la MLR. Las células se cultivaron durante 5 días y a continuación se sometieron a impulsos con [3H]-timidina (1 !Ci/p0cill0). Las células se recogieron 18 horas más tarde, y la cantidad de tim idina incorporada se determinó en un contador de centelleo. El porcentaje de supresión inducida por las células supresoras se determinó mediante la fórmula:

cpm del testigo - cpm del experimento Porcentaje de supresión = --------------------------cpm del experimento

Ejemplo 11

Depuración de células tumorales de la sangre periférica

La línea de linfocitos B de linfoma humano SU-DHL4 (Banco de Sangre de la Universidad de Stanford, Stanford, California) se utilizó como modelo experimental convencional de la contaminación con células tumorales de la sangre periférica. Esta línea celular contiene una traslocación recíproca entre los brazos largos de los cromosomas humanos 14 y 18, dando como resultado una yuxtaposición del proto-oncogen bcl-2 con la región de unión del gen de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig). Esta traslocación, que conduce a unos niveles elevados del producto del gen bcl-2, se encuentra en el 85% de los linfomas foliculares de células pequeñas hendidas y el 25% de los linfomas de células grandes difusas. El punto de ruptura de la traslocación en el gen bcl-2 se localiza en la región de ruptura principal (MBR) que abarca aproximadamente 150 pb en la región 3' no traducida (UTR) del gen bcl-2 o en la región del complejo génico menor (MCR) de 500 pb, ubicada aproximadamente 20 kb aguas abajo del gen bcl-2. Utilizando parejas de cebadores específicos de la traslocación y PCR cuantitativa mediante análisis por limitación de la dilución, se puede vigilar el agotamiento de las células SU-DHL4 en experimentos de depuración con DACS.

La línea celular de adenocarcinoma humano SK-BR3 (American Type Culture Collection (ATTC), Rockville, MD) se utilizó como un modelo experimental convencional de la infiltración de células de cáncer de mama de la sangre periférica. Estas células reaccionan con el anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano Her2/Neu, lo que indica que poseen un antígeno Her2/Neu. Antes de ser añadidos en las capas leucocitarias normales, las células SK-BR3 fueron se cargaron previamente con calceína AM, un sustrato fluorogénico, de modo que se pueda hacer un recuento de las mismas por análisis con FACS. Como alternativa o como complemento, las células tumorales de mama contienen receptores de estrógeno y reaccionan con anticuerpos contra tales receptores y otras moléculas que se unen al receptor, tales como estrógeno y agonistas de estrógeno. A los efectos de la presente invención, dichas células pueden ser capturadas, como en los métodos para depurar células tumorales descritos en esta memoria, por cualquier molécula que se una con afinidad suficiente a un antígeno tal de las células tumorales, incluyendo pero no limitado a anticuerpos, estrógeno o agonistas de estrógeno. En este contexto, una afinidad suficiente de la unión, es una afinidad aproximadamente igual o dentro de 100 veces las unidades de afinidad de la unión del anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano Her2/Neu (HB 8694, 520C9, ATCC, Rockville, MD).

Análisis con PCR

ADN genómico de peso molecular elevado se preparó utilizando el equipo sanguíneo de QIAamp (Qiagen, Chatsworth, CA.) y se cuantificó mediante densidad óptica a 260 nm. Las reacciones con PCR se realizaron utilizando un termociclador de Perkin-Elmer modelo 9600, durante 35 ciclos. Cada ciclo de amplificación consistió en 94ºC (15"), 55ºC (60") y 72ºC (15 "), con una extensión a 72ºC (6 min.) después del último ciclo. Para las reacciones anidadas, 1 ml de la reacción de la primera ronda se utilizó como molde. Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron para el análisis de las muestras: (i)5-CAGCCTTGAAACATTr-GATGG-3 (MBR) (ii)5-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3 (consenso JH) (iii)5-ATGCTGT-GGTTGATATTTCG-3 (MBR anidada) (iv) 5-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3 (consenso JH anidado). Los productos de la amplificación se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa.

Análisis por FACS

Células SK-BR3 se cargaron previamente incubándolas en calceína AM y luego sembrándolas en células mononucleares normales de sangre periférica, con una frecuencia final del 2%. La DACS se realizó tal y como se describe a continuación, utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón para Her-2/Neu humano. Partes alícuotas de las muestras experimentales se analizaron por FACS utilizando el programa LYSYS II. Para el análisis se recogieron 100.000 casos para cada muestra.

Separación de células con densidad ajustada

Células progenitoras de sangre periférica (CPSP) y capas leucocitarias se obtuvieron a partir del Laboratorio deTrasplante de Médula Ósea de la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford, Palo Alto, California y a partir del Banco de Sangre de la Universidad de Stanford, Palo Alto, California. Los anticuerpos monoclonales para CD9, CD10, CD19 y CD20 se obtuvieron de los Laboratorios Caltag (So. San Francisco, CA). El AcMo anti-CD20 (clon IF5) y el AcMo anti-Her2/Neu humano (HB 8694, 520C9) y la línea celular de adenocarcinoma SK-BR3 se obtuvieron de la ATCC (Rockville, MD). IgG1 de ratón conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anticuerpos anti-CD45 humano de ratón, así como IgG1 de ratón conjugada con ficoeritrina (PE) y anticuerpos anti-CD34 humano de ratón, se obtuvieron de Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA.). El procedimiento de FACS y el análisis por citometría de flujo de las muestras, se realizó tal y como se ha descrito anteriormente.

Depuración y análisis electroforético de células de la sangre periférica

Una capa leucocitaria de sangre periférica, adicionada (5%) con la línea celular de linfocitos B + t(14, 18) SUDHL-4, se incubó con una mezcla de AcMo anti-linfocito B específico para células CD9, CD10, CD19 y CD20. Después del lavado, la mezcla de células se incubó con perlas de DACS recubiertas con GAM-IgG, con una relación 8:1 de perlas:células y luego se cargaron sobre la suspensión de SCO con densidades en el intervalo de 1,0605 hasta 1,0720, con resultados comparables. Después de la centrifugación durante 30 minutos a 850 x g, el ADN se preparó a partir de las células en la interfase y se analizó por métodos convencionales de electroforesis en gel, a diferentes concentraciones (1 mg, 0,1 mg, 0,01 mg, 0,001 mg) mediante dos rondas de PCR utilizando cebadores específicos de t(14; 18). El número de traslocaciones t(14; 18) se determinó, además, por PCR con dilución limitante. Como testigo, se utilizó el mismo protocolo sobre células no adicionadas, la muestra adicionada con SUDHL-4 y la muestra adicionada con SUDHL4 tratada con perlas de DACS sin incubación previa con la mezcla de AcMos anti-linfocito B.

La centrifugación de la mezcla de células en suspensión de SCO, no dio como resultado una reducción de la señal de la PCR. Mientras que las perlas de DACS solas inducían una ligera reducción de la señal de PCR, la señal de PCR estaba completamente ausente en la muestra adicionada con SUDHL que se había tratado tanto con la mezcla de AcMos anti-linfocitos B y las perlas de DACS. La determinación de la cantidad de traslocaciones t(14; 18) por PCR con dilución limitante, mostró que en el último grupo experimental, el número de células SUDHL4 se reducía de 100 a 1000 veces. Los experimentos preliminares indican que una ronda adicional de DACS en este contexto, disminuye aún más el número de células SUDHL-4 en aproximadamente un orden decimal adicional de magnitud.

Ejemplo 12

Aislamiento de células dendríticas

Capas leucocitarias preparadas a partir de una unidad de sangre de donantes sanos voluntarios, positivos para HLA-A0201, se obtuvieron del “Blood Center” de la Universidad de Stanford (Stanford, CA). Las células se recogieron de los paquetes leucocitarios, se diluyeron hasta 60 mL, empleando solución salina tamponada con fosfato exenta de Ca++/Mg++ (D-PBS; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) y se dispusieron en capas sobre dos columnas de 15 ml de medio de separación de SCO (densidad 1,0720 g/ml, pH 7,4, 280 mOsm/kg de H2O) en tubos de 50 ml para centrífuga, preferentemente tubos de tipo trampa para células. Los tubos se centrifugaron a 1000 x g durante 35 minutos a temperatura ambiente. La centrífuga en marcha se detuvo sin frenado y se recogieron las células mononucleares de la sangre periférica (CMSP), presentes en la interfase.

Las CMSP se resuspendieron en D-PBS, se centrifugaron una vez a 650 x g durante 10 minutos y dos veces más a 200 x g durante 5 minutos para extraer las plaquetas. Las CMSP sin plaquetas se resuspendieron en 60 ml de D-PBS, se dispusieron en capas en la parte superior de dos columnas de 15 ml de SCO (densidad 1,0610 g/ml, 280 mOsm/kg de H2O) en un tubo de tipo trampa para células de la presente invención y se centrifugaron a 650 x g durante 25 minutos a 4ºC sin frenado. La interfase resultante (principalmente monocitos) y las células del sedimento (principalmente linfocitos) se recogieron y se lavaron con D-PBS mediante centrifugación a temperatura ambiente (una vez a 650 x g durante 10 minutos y dos veces después a 200 x g durante 5 minutos).

En los casos en los que se utilizan células dendríticas para generar linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de péptidos, para efectos de dilucidar su función presentadora de antígeno, la fracción de la interfase (la mayoría de los monocitos) se resuspendió en suero AB humano reunido y frío (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) al que se añade gota a gota un volumen igual de 80% de suero AB y 20% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO). La suspensión celular resultante se dividió en partes alícuotas en crioviales y se congeló en nitrógeno líquido. Los monocitos se pueden utilizar para estimular de nuevo los CTLs para expansión.

La fracción sedimentada se resuspendió en 100 ml de medio de cultivo AB, se inoculó en dos frascos de cultivo de tejido T-75 y se cultivó en una incubadora humidificada con 5% CO2, durante 40 horas. Tras la incubación, se recogen las células no adherentes, pipeteando de forma moderada, se lavan y se resuspenden hasta una concentración de 2-5 x 106 células/ml en medio de cultivo AB. La suspensión celular se dispone en capas sobre cuatro columnas de 4,0 ml de medio de separación de SCO (densidad 1,0565 g/ml, pH 7,4, 280 mOsm/kg de H2O), en medio de cultivo AB y se centrifuga a 650 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente, sin frenado.

Las células de la interfase y del sedimento se recogen y se lavan en medio de cultivo AB (medio RPMI-1640 Basal, Gibco Laboratories, Grand Island, NY) mediante centrifugación, una vez a 650 x g durante 10 minutos y dos veces después a 200 x g durante 5 minutos cada vez, a temperatura ambiente. El rendimiento y la viabilidad de las dos fracciones celulares se estiman mediante recuento con un hemocitómetro empleando exclusión con azul tripano.

La pureza de las células dendríticas en la fracción de la interfase se cuantifica después del análisis en un citómetro de flujo (FACS). Las células dendríticas se caracterizan como negativas para los marcadores de los fenotipos celulares CD3 (linfocitos T), CD14 (monocitos), CD16 (linfocitos NK) y CD20 (linfocitos B) y como positivas para la expresión del HLA de clase II empleando una tinción doble con HLA-DR (en el canal FITC) y una mezcla de CD3, CD14, CD16, CD20 (en el canal PE). Una tinción doble con IgG2a en los canales FITC y PE, se puede utilizar como testigo del isotipo.

La morfología de las células también se puede evaluar utilizando fotomicroscopía. La fracción enriquecida de DC contiene células con prolongaciones de gran tamaño, con procesos citoplásmicos que se extienden desde la superficie celular, rasgos característicos de las DC.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una composición para uso en la separación celular, que comprende un medio de separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado que contiene al menos aproximadamente 0,05% de polilactama, en donde dicho medio de separación que contiene dicha polilactama está esterilizado.

2. 2.

   La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho medio de separación de células a base de partículas de sílice coloidal está compuesto de partículas de sílice organosilanizado.

3. 3.

   La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha composición se esteriliza en un autoclave o mediante radiación ionizante.

4. 4.

   La composición de acuerdo la reivindicación 3, en donde dicha radiación ionizante se selecciona entre la radiación gamma y la radiación por haz de electrones.

5. 5.

   La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha polilactama es polivinilpirrolidona presente a una concentración entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 por ciento.

6. 6.

   La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha partícula es una microesfera que tiene un diámetro entre aproximadamente 0,003 y 50 micrómetros.

7. 7.

   La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para uso en el aislamiento de una célula sanguínea rara seleccionada a partir de una mezcla de células, en donde dicha suspensión de partículas de sílice coloidal silanizado tiene una densidad específica dentro de aproximadamente ± 0,0005 g/ml de dicha célula seleccionada.

8. 8.

   La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la célula sanguínea rara se selecciona entre el grupo consistente en células progenitoras hematopoyéticas CD34+, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos supresores naturales, linfocitos T citotóxicos, células tumorales y células fetales nucleadas.

9. 9.

   La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula sanguínea rara es una célula progenitora hematopoyética CD34+, dicha mezcla celular comprende células mononucleares de sangre periférica, y dicha suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1,0605 g/ml.

10. 10.

    La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula sanguínea rara es una célula progenitora hematopoyética CD34+, dicha mezcla de células consiste en células de la médula ósea, y dicha suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica de 1,0685 g/ml.

11. 11.

    La composición de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha célula sanguínea rara es una célula dendrítica, dicha mezcla celular comprende células mononucleares de sangre periférica y dicha suspensión de partículas de sílice coloidal organosilanizado tiene una densidad específica seleccionada entre el grupo consistente en 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml y 1,0565 g/ml.

12. 12.

    Un equipo para la separación de células que comprende un recipiente centrifugable y una suspensión para la separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. 13.

    Un método para estilizar un medio de separación de células a base de partículas de sílice silanizado que comprende someter dicho medio de preparación a autoclave o a radiación iónica en presencia de al menos aproximadamente 0,05 por ciento de polilactama.

14. 14.

    El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha polilactama es polivinilpirrolidona presente en una concentración entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 por ciento.

15. 15.

    El método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde dicha partícula de sílice es una partícula de sílice coloidal organosilanizado.

16. 16.

    Un método para aislar una célula sanguínea rara seleccionada a partir de una mezcla de células que comprende disponer en capas la mezcla que contiene dicha célula hematopoyética rara sobre un medio de separación de células a base de partículas de sílice coloidal silanizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y centrifugar dicha mezcla con una fuerza centrífuga suficiente para sedimentar las células que tienen una densidad específica que es superior a la densidad específica de la célula seleccionada.

17. 17.

    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha mezcla que contiene dicha célula rara y dicho medio de separación de células está contenida en un tubo de centrifugación que tiene paredes laterales y un parte inferior cerrado, un miembro de constricción dispuesto dentro del tubo, estando dicho miembro de constricción situado y montado de modo que retenga líquido en la porción inferior del tubo por debajo del miembro de constricción, cuando el tubo se invierte, y en donde dicho medio de separación de células tiene una densidad específica dentro de ± 0,0005 g/ml de la densidad específica del tipo celular seleccionado y dicho medio está contenido en la

    parte inferior del tubo y se extiende por encima de dicho miembro de constricción hasta un nivel superior a una abertura formada por dicho miembro de constricción, de modo que estas células que se capturan después de la centrifugación en una interfase entre el medio de separación celular y un medio de densidad inferior, se descargan con el medio de densidad inferior cuando el tubo se invierte.

18. 18.

    El método de acuerdo con la reivindicación 17, en donde dicho tubo incluye una parte superior cerrada, un primer orificio en dicha parte superior a través del cual se puede introducir material líquido en el tubo, un segundo orificio en dicha parte superior y un canal cerrado para fluido que comunica el segundo orificio con la parte inferior del tubo, por debajo de dicho miembro de constricción.

19. 19.

    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula rara seleccionada es una célula progenitora hematopoyética funcional, la mezcla de células es una mezcla de células mononucleares de sangre periférica y la densidad específica de la suspensión del gradiente de densidad para la separación de las células es 1,0605 g/ml.

20. 20.

    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula rara seleccionada es una célula progenitora hematopoyética funcional, la mezcla de células es una mezcla de células de la médula ósea y la densidad específica de la suspensión del gradiente de densidad para la separación de células es 0,0685 g/ml.

21. 21.

    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula sanguínea rara seleccionada es una célula tumoral, la mezcla de células se obtiene a partir de la sangre o de la médula ósea, y en donde el medio para la separación de células tiene una densidad específica seleccionada en el intervalo de 1,0490-1,0580 g/ml.

22. 22.

    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula sanguínea rara seleccionada es una célula dendrítica y en donde dicho medio para la separación de células tiene una densidad específica seleccionada entre el grupo consistente en 1,0770 g/ml, 1,0720 g/ml, 1,0650 g/ml, 1,0610 g/ml y 1,0565 g/ml.

23. 23.

    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la célula sanguínea rara es un linfocito T citotóxico y en donde dicho medio de separación de las células tiene una densidad específica seleccionada entre el grupo consistente en 1,0720 g/ml, 1,0610 g/ml y 1,0565 g/ml.

24. 24.

    El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, que incluye adicionalmente la adición a la mezcla de células de una suspensión que incluye una partícula de sílice silanizada a la que se fija una molécula que se une específicamente a un antígeno celular.

25. 25.

    El método de acuerdo con la reivindicación 24, para uso en el agotamiento de linfocitos T, en donde dicha molécula que une específicamente a un antígeno celular, se une a un antígeno presente sobre dichos linfocitos T.

26. 26.

    El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde dicha molécula que se une específicamente a un antígeno celular se selecciona entre el grupo consistente en anticuerpos monoclonales de ratón anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8.