ES2602500T3

ES2602500T3 - Método de separación celular

Info

Publication number: ES2602500T3
Application number: ES11190850.5T
Authority: ES
Inventors: Burgund Kauling; Volker Huppert
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2011-11-25
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2031-11-25
Also published as: WO2013076070A1; US10006840B2; JP2014533957A; CA2854240A1; DK2597153T3; CN103946373B; JP6126619B2; US20140302483A1; EP2597153B1; CN103946373A; EP2597153A1; CA2854240C

Abstract

Un método para enriquecer y/o recuperar las células objetivo de una muestra que contiene las células objetivo, los eritrocitos y otras células sanguíneas y/o trombocitos, que comprende: a) poner en contacto la muestra con una composición, dicha composición que comprende: i) un reactivo de agregación de eritrocitos, en donde el reactivo de agregación de eritrocitos se selecciona del grupo que consiste en dextrano, hidroxietilo de almidón, metilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) ii) al menos un fragmento de unión al antígeno acoplado a una partícula magnética, en donde dicha partícula con dicho al menos un fragmento de unión a antígeno se une específicamente con al menos un antígeno específico para uno o más de dichas otras células sanguíneas y/o trombocitos; b) aplicar simultáneamente i) sedimentación por gravedad para la sedimentación de los eritrocitos; y ii) un gradiente de campo magnético a dicha muestra para la inmovilización de dicha partícula magnética generando de ese modo un sedimento y una fase de sobrenadante, y c) recuperar las células objetivo de la fase de sobrenadante.

Description

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reconocimiento del antígeno que reconoce un antígeno en la superficie celular de los eritrocitos y, además, un antígeno de al menos otro componente celular no deseado.

No se prefiere el uso de una fuente magnética en la parte inferior del contenedor que contiene la muestra a procesar. Esto resulta en una distancia superior que los agregados magnéticos tienen que moverse, es decir, 10 cm (altura del tubo) en comparación con 3 cm (diámetro del tubo).

La presente invención utiliza un gradiente de campo magnético generado por una fuente magnética, por ejemplo, por un imán permanente o electroimán. Cualquier tipo y forma de imán puede usarse dentro de la presente invención, como el Separador MACSiMAG™ disponible en el mercado por Miltenyi Biotec GmbH, Alemania. Diferentes diseños de imanes se han evaluado con la presente invención. El separador MACSiMAG™ se modificó además, con imanes superiores para atraer las partículas magnéticas y las células magnéticamente marcadas en la pared del tubo sobre la altura completa del tubo. Imanes disponibles en el mercado para tubos de centrífuga de 50 ml se han evaluado incluyendo un imán de SensScreen Technologies (Alemania) y de Stem Cell Technologies (imán Easy Sep "Easy 50"). Limpiadores magnéticos de vidrio acuario se han evaluado en la presente invención. Estos limpiadores consisten en imanes fuertes permanentes combinados con un yugo magnético, embebidos en un material protector de plástico y que tienen un material de limpieza unido a la superficie del imán interior para limpiar el cristal del acuario. Varios diseños se han desarrollado para el uso de imanes de tierras raras cuboides permanentes con un tamaño de 88 mm * 24 mm * 10 mm en diferentes yugos magnéticos, incluyendo yugos en forma de U y yugos perpendiculares (ver Figura 16 y Figura 17). Las matrices de Halbach se han usado exitosamente también con la presente invención.

Además de colocar los imanes fuera de la pared del tubo, los imanes pueden sumergirse también en el tubo, ya sea de tipo cilíndrico, cuboide o esférico.

Una composición de separación de células para su uso en el presente método comprende un reactivo de agregación de eritrocitos y una o más partículas magnéticas mono y/o multiespecíficas. La especificidad de las partículas es para un antígeno de una célula que se sedimenta o inmoviliza, es decir, una célula no deseada. Las composiciones de la separación de células contienen porciones de reconocimiento del antígeno, por ejemplo, anticuerpos, contra los antígenos de superficie de células sanguíneas, incluyendo, por ejemplo, CD11b. CD123, CD14, CD15, CD16, CD19, CD193, CD2, CD25, CD27, CD3, CD335, CD36, CD4, CD43, CD45RO, CD56, CD61, CD7, CD8, CD34, CD1c, CD23, CD304, CD235a, anti Fc_epsilon, anti receptor de células T alfa/beta, anti receptor de células T gamma/delta, anti biotina, anti IgE, anti HLA-DR y sus combinaciones.

Preferentemente, las partículas magnéticas de dicha composición tenga un diámetro promedio de tamaño entre 100 y 1400 nm, preferentemente entre 200 y 500 nm.

Dichas composiciones pueden comprender un tipo de partícula mono o multiespecífica, o pueden comprender más de una partícula mono o multiespecífica o una mezcla de partículas mono o multiespecíficas. Una composición conveniente para la separación de células intactas de una subpoblación específica de células debe comprender las porciones de reconocimiento del antígeno acoplados a una partícula magnética en donde tales porciones de reconocimiento del antígeno no reconocen el subconjunto de células, que son las células de interés, es decir, las células deseadas o células objetivo que deben permanecer intactas. Por ejemplo una porción de reconocimiento del antígeno contra CD61, CD62, CD41, respectivamente, se puede usar si se desean eliminar las plaquetas del sobrenadante. Las porciones de reconocimiento del antígeno contra CD66b, CD15, CD16, respectivamente, pueden usarse si se desean eliminar los granulocitos. Pueden usarse CD14, CD33, respectivamente, si se desean eliminar los monocitos/macrófagos. Pueden usarse CD19, CD20, respectivamente, si se desean eliminar las células B. Pueden usarse CD3, CD4, CD8, receptor de células T alfa/beta, respectivamente, si se desean eliminar las células T. Pueden usarse CD56, CD335, respectivamente, si se desean eliminar las células NK.

En general, el uso de una porción de reconocimiento del antígeno, por ejemplo, un anticuerpo, acoplado a las partículas resulta en la separación constante de las células deseadas dentro de la presente invención (Ejemplo 2). El uso de dos o más porciones de reconocimiento del antígeno, por ejemplo los anticuerpos, acoplados a las partículas, preferentemente a partículas de tamaño promedio de diámetro entre 100 y 1400 nm, con mayor preferencia entre 200 y 500 nm, resulta en una separación superior de las células deseadas o no deseadas en comparación con los métodos de la técnica anterior (ver Ejemplo 3).

El uso de al menos una porción de reconocimiento del antígeno, por ejemplo, el anticuerpo, acoplado a las partículas dentro de la presente invención incluye -pero no se limita a -las partículas acopladas con 2, 3, 4, 6, 8,10 ó 12 porciones de reconocimiento del antígeno, por ejemplo, los anticuerpos, respectivamente, lo que resulta en propiedades de separación equivalentes o incluso superiores de las partículas, como se muestra en el Ejemplo 3.

La relación de diferentes porciones de reconocimiento del antígeno, por ejemplo los anticuerpos, acoplados a una partícula puede variar. Preferentemente, la relación es entre 1:1 y 1:50, con mayor preferencia entre 1:1 y 1:20 (ver Ejemplo 3). Si porciones adicionales de reconocimiento del antígeno se acoplan a la partícula, cada porción adicional de reconocimiento del antígeno está en una relación de 1:1 a 1:20 con respecto a la primera o segunda porción de reconocimiento de antígeno.

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se separan en un campo magnético durante 8 -15 minutos. Durante este tiempo los eritrocitos sedimentan en la parte inferior del tubo. Las células pueden recuperarse del sobrenadante. Durante una segunda ronda de separación las partículas conjugadas con el anticuerpo (por ejemplo, partículas CD235a y/o CD15) se añaden al sobrenadante, esta mezcla se incuba durante 5 minutos, el tubo se coloca en posición vertical en una gradilla y las células marcadas magnéticamente se separan en un campo magnético durante 5 minutos. Las células se recuperan del sobrenadante.

En algunas modalidades de la presente invención, una composición de separación celular para su uso en el presente método comprende un reactivo de agregación de eritrocitos y un conjunto de una o más partículas magnéticas mono y/o multiespecíficas, con al menos una porción de reconocimiento del antígeno acoplada a las partículas, en donde dichas partículas con dicha al menos una porción de reconocimiento del antígeno se unen específicamente al menos a un antígeno específico de uno o más componentes celulares no deseados.

En algunas modalidades de la presente invención, una composición de separación celular para su uso en el presente método comprende un reactivo de agregación de eritrocitos y un conjunto de una o más partículas magnéticas mono y/o multiespecíficas, con al menos una porción de reconocimiento del antígeno acoplada a las partículas, en donde dichas partículas con dicha al menos una porción de reconocimiento del antígeno se unen específicamente al menos a un antígeno específico de uno o más componentes celulares no deseados, en donde dicho conjunto comprende especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno en los granulocitos, por ejemplo, CD15, y en las plaquetas, por ejemplo, CD61. Esto resulta en una composición celular en el sobrenadante de la presente invención que se reduce de eritrocitos, trombocitos y granulocitos (Ejemplo 18).

En algunas modalidades de la presente invención, una composición de separación celular para su uso en el presente método comprende un reactivo de agregación de eritrocitos y un conjunto de una o más partículas magnéticas mono y/o multiespecíficas, con al menos una porción de reconocimiento del antígeno acoplada a las partículas, en donde dichas partículas con dicha al menos una porción de reconocimiento del antígeno se unen específicamente al menos a un antígeno específico de uno o más componentes celulares no deseados, y en donde dicho conjunto comprende uno o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno seleccionadas del grupo que consiste en CD2, CD14, CD15, CD36, CD43, CD56, CD61, aIgE. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura de células B en el sobrenadante de la presente invención (Ejemplo 19).

En otras modalidades de la presente invención, una o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno usadas en el presente método se seleccionan del grupo que consiste en CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura de células T en el sobrenadante de la presente invención (Ejemplo 20).

En otras modalidades de la presente invención, una o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno usadas en el presente método se seleccionan del grupo que consiste en CD3, CD4, CD14, CD15, CD19, CD36, CD61, CD123, CD193, aIgE, aTCRab. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura de células NK en el sobrenadante de la presente invención (Ejemplo 21).

En otras modalidades de la presente invención, una o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno usadas en el presente método se seleccionan del grupo que consiste en CD8, CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRg/d. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura de células T colaboradoras en el sobrenadante de la presente invención (Ejemplo 23).

En otras modalidades de la presente invención, una o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno usadas en el presente método se seleccionan del grupo que consiste en CD4, CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRg/d. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura de células T citotóxicas en el sobrenadante de la presente invención (Ejemplo 24).

En otras modalidades de la presente invención, uno o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno usadas en el presente método se seleccionan del grupo que consiste en CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRg/d. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura del receptor de células T de células T α/β positivas en el sobrenadante de la presente invención.

En otras modalidades de la presente invención, uno o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de las porciones de reconocimiento del antígeno usadas en el presente método se seleccionan del grupo que consiste en CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRab. El uso de todas las especificidades resulta en una composición celular pura del receptor de células T de células T γ/δ positivas en el sobrenadante de la presente invención.

En otras modalidades de la presente invención, uno o más, preferentemente todas, las especificidades antigénicas de

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Los cócteles de perlas magnéticas conjugadas con los anticuerpos (tamaño de 200 nm, ver Ejemplos 19 y 21) se usaron de conformidad con los protocolos descritos en los ejemplos 1, 2 y 3 para comparar la sedimentación mediante la sedimentación por gravedad y mediante la sedimentación magnéticamente forzada.

Las células NK se enriquecieron de 6,4 % en la sangre entera a 8,1 % y 70,2 %, respectivamente. Las células B se enriquecieron de 4,5 % a 23,4 % y 85,5 %, respectivamente.

Por lo tanto, el enriquecimiento de las células objetivo es posible, en general, mediante la sedimentación no magnéticamente forzada pero es claramente peor que si se aplica la sedimentación magnéticamente forzada. La pureza de las células objetivo se mejora significativamente, si la sedimentación es magnéticamente forzada.

Ejemplo 7: Separación de diferente volumen de la muestra

Diferentes escalas de separación celular se compararon usando protocolos similares a los Ejemplos 1, 2 y 3. Se usó la capa leucocitaria de sangre entera humana, la escala de separación fue 2 mL vs 13,5 mL vs. 45 mL usando 1,3 mL / 9 mL / 30 mL de la capa leucocitaria diluida con la mitad del volumen de solución salina tamponada con fosfato. Los conjugados de anticuerpos usados fueron los anticuerpos CD61 y CD15 conjugados biespecíficamente con las perlas magnéticas de 100 nm y 200 nm.

La eliminación de eritrocitos, plaquetas y granulocitos fue equivalente en las tres escalas. La eliminación fue > 99 % para los eritrocitos, > 99 % para las plaquetas y > 95 % para granulocitos.

Ejemplo 8: Separación con el medio en vez de con tampón

La separación se realizó con medio de cultivo celular RPMI 1640 en vez de con tampón PBS para las etapas de dilución, resultando en una suspensión celular en 67 % de suero autólogo y 33 % de medio de cultivo celular, una configuración que puede usarse directamente para el ensayo de cultivo celular. La separación se evaluó en escala de 2 mL en tubos FACS de 5 mL, usando sangre entera humana, 200 uL de solución concentrada de HPMC 15 y perlas magnéticas de 200 nm conjugadas a un cóctel de anticuerpos dirigidos contra anticuerpos CD3, CD4, CD14, CD15, CD19, CD36, CD61, CD123. La pureza y el rendimiento de las células NK aisladas fueron equivalentes usando tanto medio de cultivo celular RPMI 1640 como tampón PBS suplementado con 0,5 % de albúmina de suero bovino.

Ejemplo 9: Variación del rendimiento inducido por diferentes muestras de pacientes

Se aislaron células NK a partir de 10 donantes usando la presente invención y el rendimiento de la separación se comparó con un kit de aislamiento de células NK en la sangre entera disponible en el comercio (kit de aislamiento de células NK Rosette Sep, Stem Cell Technologies).

La presente invención se evaluó usando un cóctel de conjugados de perlas magnéticas con anticuerpos biespecíficos (200 nm de diámetro) que consiste en perlas CD61.CD3, perlas CD61.CD14, perlas CD61.CD15, perlas CD61.CD19, perlas CD61.CD4, todas ellas con una relación de anticuerpos de 1:19. Se usó 200 ul de una solución concentrada de HPMC15 al 2 %. Los reactivos se incubaron durante 15 minutos, la sedimentación magnéticamente forzada se realizó durante 20 minutos usando un separador MACSiMAG™ (Miltenyi Biotec). La pureza de las células NK aisladas entre los linfocitos fue de 76,1 % ± 10,2 % en comparación con 74,1 % ± 11 % usando el sistema Rosette Sep. El rendimiento de células NK fue 66±11 % (presente invención) vs. 44±19 %.

La pureza y el rendimiento de las células NK son equivalentes o superiores a los productos disponibles en el comercio, la variabilidad del rendimiento es significativamente menor.

Ejemplo 10: Independencia de la concentración de las plaquetas

En la presente invención se realiza la reducción paralela de los eritrocitos, las plaquetas y las células no deseadas, es decir, los leucocitos no objetivos. Se ha evaluado si el contenido alto o bajo de las plaquetas en la sangre entera impacta el rendimiento de la separación y la pureza de las células objetivo. Las muestras de sangre se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos, sedimentando los eritrocitos y leucocitos y dejando la mayor parte de las plaquetas en el sobrenadante. El sobrenadante de las muestras de sangre o bien se eliminó o añadió a otras muestras para reducir o aumentar la concentración de las plaquetas. La separación de las células se realizó de conformidad con los protocolos descritos en los Ejemplos 1, 2 y 3. La pureza y el rendimiento de las células objetivo (células NK) fueron idénticas. Por lo tanto, la concentración de las plaquetas de la muestra que se procesa no afecta el rendimiento de la separación de la presente invención.

Ejemplo 11: Reactivo de agregación de eritrocitos

Diferentes cantidades y concentraciones del reactivo de sedimentación de los eritrocitos HPMC-15 se evaluaron como componentes de un procedimiento de selección de las células NK: 100, 200, 300, 400, 500, 600 ul de una solución concentrada de HPMC15 al 2 % se usaron por mL ya sea de sangre entera o capa leucocitaria humana en una escala

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de 2 mL. Mayor concentración de HPMC 15 redujo el rendimiento de las células objetivo (células NK) y aumentó la pureza de las células NK. La cantidad óptima de solución concentrada de HPMC15 al 2 % fue 200-250 ul/mL de sangre entera o de capa leucocitaria, resultando en una concentración final de aproximadamente HPMC15 al 0,2 %.

HPMC15 se comparó con otros reactivos de sedimentación de eritrocitos, a saber, Dextrano T250, Dextrano T500, PVP 360 usando un cóctel de anticuerpos CD3, CD4, CD14, CD15, CD19, CD36, CD61 y CD123 conjugados a perlas magnéticas de 200 nm. Todas las combinaciones resultaron en el enriquecimiento de las células NK, el HPMC15 resultó en la más alta pureza y rendimiento de las células NK (61,8 % de pureza y 86 % de rendimiento vs 53,8 %, 52,0 %, 49,4 % de pureza y 63 %, 63 %, 66 % de rendimiento para Dextrano T250, Dextrano T500 y PVP, respectivamente; Figura 19)

Los reactivos de agregación de eritrocitos se compararon además cuando no se combinaron con partículas magnéticas conjugadas con anticuerpo. El contenido en plaquetas se redujo en 76 % usando HPMC-15, sólo en 8 % usando Dextrano T250, sólo en 13 % usando Dextrano T500 y sólo en 47 % usando PVP. La alta eficacia de eliminación de las plaquetas del HPMC-15 puede combinarse de forma sinérgica con el anticuerpo de unión a las plaquetas (tal como CD61) conjugado con partículas magnéticas.

Ejemplo 12: Partículas acopladas indirectamente con los anticuerpos

Las perlas magnéticas (diámetro <100 nm) conjugadas con anticuerpos que reconocen las regiones constantes de un anticuerpo secundario o fluorocromos de anticuerpos conjugados se cargaron con anticuerpos secundarios / anticuerpo conjugados que reconocen los antígenos CD3 y CD 19. Las células T y B, respectivamente, se redujeron en 91,5 % y 99,1 % usando CD3-PE y CD19-PE, en 94 % y 99,9 % usando CD3-APC y CD19-APC, en 95,3 % y 98,6 % usando CD3-FITC y CD19-FITC, en 94,1 % y 99,4 % usando anticuerpos CD3 y CD19 (y perlas magnéticas anti IgG), en 88 % y 98,6 % usando CD3-Biotina y CD19-Biotina, respectivamente.

Todos los sistemas indirectos de separación mostraron rendimientos de separación equivalentes en comparación con el uso de los anticuerpos que se conjugaron directamente a las perlas magnéticas.

Ejemplo 13: Uso de diferentes muestras

La presente invención se evaluó en diferentes productos celulares que contienen eritrocitos, a saber, cosecha de leucoféresis, cordón umbilical, aspirados de médula ósea usando anticuerpos CD 15 y anticuerpos CD61 conjugados a perlas magnéticas de 200 nm. En todos los casos se eliminaron >99 % de granulocitos y >96 % de las plaquetas.

La presente invención se evaluó en aspirados de médula ósea usando anticuerpos CD19 y CD56 conjugados a las perlas magnéticas de 200 nm. Se eliminaron 99 % de células B y 87 % de células NK.

La presente invención se evaluó en las preparaciones de la capa leucocitaria de la sangre entera usando anticuerpos CD61 y CD 15 conjugados a las perlas magnéticas de 100 nm y anticuerpos CD61 y CD 19 conjugados a las perlas magnéticas de 100 nm. Se eliminaron 99,7 % de las plaquetas y 97 % de los granulocitos y 99,4 % de las plaquetas y 97 % de las células B.

La presente invención puede usarse con éxito por lo tanto, para las muestras tales como sangre entera, preparaciones de la capa leucocitaria, cosechas de leucoféresis, sangre del cordón umbilical y aspirados de médula ósea, pero no se limita a estas muestras. La presente invención funcionará con cualquier muestra que contiene eritrocitos y otros componentes celulares. Estas muestras además pueden generarse artificialmente, por ejemplo, añadiendo eritrocitos a una muestra que no contiene originalmente eritrocitos, por ejemplo, el cultivo de células.

Ejemplo 14: Principio de Rosette sep sin centrifugación

Para evaluar si la tecnología actual es factible para la separación celular directamente de la sangre entera sin etapas de centrifugación, se evaluó un método de formación de rosetas con eritrocitos (RosetteSep, Stem Cell Technologies) de conformidad con los Ejemplos proporcionados en la patente de los Estados Unidos 6.872.567 B2 usando Dextrano o HPMC15 como reactivos de agregación de eritrocitos. El cóctel para el aislamiento de monocitos RosetteSep se incubó con 5 mL de la Capa Leucocitaria de sangre entera humana y, Dextrano T 500 o HPMC15 durante 10 minutos. Los glóbulos rojos no sedimentaron aunque lo hicieron en los experimentos de control sin el cóctel de anticuerpos.

La suspensión se centrifugó a 50 × g durante 5 minutos. El sobrenadante se recuperó y se analizó por citometría de flujo. Los monocitos se enriquecieron de 8,92 % a 37,9 % (Dextrano) y 35,2 % (HPMC), respectivamente, con un rendimiento de 28,3 % / 11,5 %, en comparación con los valores de referencia proporcionados por el proveedor del 71±9 % de pureza y 57±23 % de rendimiento, al usar el Kit con un procedimiento de Ficoll.

La combinación de la sedimentación de eritrocitos y la formación de rosetas con los eritrocitos de células no objetivo no funcionó en absoluto sin centrifugación y no proporcionó suficiente rendimiento de separación después de la centrifugación.

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Ejemplo 15: Método de separación de la sangre entera con y sin anticuerpos CD235a

Un cóctel de anticuerpos (ver Ejemplo 3, especificidades ver Ejemplo 21) se conjugó con las partículas magnéticas (> 200 nm) y se usó de conformidad con los protocolos proporcionados en los Ejemplos 1, 2 y 3 y el rendimiento de la separación se comparó con un experimento donde un anticuerpo CD235a (Glicoforina) se conjugó con el mismo tipo de partículas magnéticas y se usó ya sea en una segunda etapa para reducir además el contenido de eritrocitos o en combinación con el cóctel de anticuerpo conjugado. La pureza de las células NK aisladas no se mejoró significativamente con la adición del conjugado CD235a (94,2 % vs. 92,8). El contenido de eritrocitos en la preparación celular final se redujo sólo por 44 % (4,6E + 06 RBC vs. 8.2E+06, es decir, 0,073 % vs. 0,130 % de la cantidad inicial). Por el contrario, el contenido de eritrocitos puede reducirse en una segunda etapa, por debajo del límite de detección mediante la reducción de eritrocitos positivos a CD235a . Es decir, además de las perlas conjugadas con CD235a no es necesario obtener purezas altas y no es suficiente eliminar completamente los eritrocitos. La eliminación completa de los eritrocitos puede lograrse usando perlas magnéticas con CD235a en una segunda etapa de separación.

Ejemplo 16: Reactivo liofilizado vs. líquido

Un kit de aislamiento de células NK se configuró para su uso en la presente invención (ver Ejemplo 21). Los reactivos se almacenaron ya sea a 4°C, a -70°C después de la congelación o se liofilizaron con suplementos y procedimientos como es conocido en la técnica. Los reactivos liofilizados se reconstituyeron con 0,75x de solución salina tamponada con fosfato. Las composiciones se usaron para el aislamiento de las células NK de conformidad con la presente invención. Las células NK se purificaron a 90 %, 92 %, 90 % de pureza, respectivamente, con un rendimiento de 72 %, 71 %, 83 %, respectivamente. (ver Figura 10)

Ejemplo 17: Reactivo liofilizado reconstituido con diferentes tampones

Un kit para el aislamiento de las células NK se configuró basado en la presente invención (ver Ejemplo 21). Los reactivos se liofilizaron con suplementos y procedimientos como es conocido en la técnica. Los reactivos liofilizados se reconstituyeron con 0,75x de fosfato con diferentes suplementos:

 0,3125 % de BSA/ 0,75 % de HPMC  0,3125 % de BSA/ 0,75 % de HPMC/ 0,03 % de Pluronic/ 0,05 % de Azida Na  0,75 % de HPMC/ 0,03 % de Pluronic/ 0,05 % de Azida Na  0,75 % de HPMC/ 0,03 % de Pluronic  0,75 % de HPMC/solución salina tamponada.

Las composiciones se usaron para el aislamiento de las células NK de conformidad con la presente invención. Las células NK se purificaron hasta 87-88 % de pureza con un rendimiento de 63 -71 % (ver Figura 11).

Ejemplo 18: Combinación del kit de células mononucleares de sangre periférica

Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con anticuerpos que reconocen CD15 y CD61. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los anticuerpos conjugados con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Las células mononucleares de sangre periférica aisladas se analizaron en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 19: Combinación del kit de células

Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con anticuerpos que reconocen CD2, CD 14, CD15, CD36, CD43, CD56, CD61 y aIgE. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los conjugados de anticuerpo con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Las células B aisladas se analizaron en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 20: Combinación del kit de células T

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Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con anticuerpos que reconocen CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los conjugados de anticuerpo con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Las células T aisladas se analizaron en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 21: Combinación del kit de células NK

Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con anticuerpos que reconocen CD3, CD4, CD14, CD15, CD19, CD36, CD61, CD123, CD193, aIgE, aTCRab. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los conjugados de anticuerpo con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Las células NK aisladas se analizaron en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 22: Combinación del kit de Monocitos

Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con los anticuerpos que reconocen CD3, CD7, CD15, CD19, CD56, CD61, CD123, CD193, CD304, CD335, aIgE. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los conjugados de anticuerpo con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Los monocitos aislados se analizaron en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 23: Combinación del kit de células T colaboradoras

Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con los anticuerpos que reconocen CD8, CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRg/d. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los conjugados de anticuerpo con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Las células T colaboradoras aisladas se analizaron en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 24: Combinación del kit de células T citotóxicas

Las partículas magnéticas (Ejemplo 4) se conjugaron con anticuerpos que reconocen CD4, CD11b, CD14, CD15, CD19, CD36, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRg/d. Los conjugados de perla con anticuerpos se titularon en sangre entera humana y se determinó la concentración óptima. Los conjugados de anticuerpo con perla magnética se combinaron con un cóctel en las cantidades previamente determinadas.

El cóctel de anticuerpos se proporcionó a 1,5 mL de sangre entera humana, mezcló, incubó durante 5 minutos en un rotador de tubo MACSmix™ (Miltenyi Biotec GmbH) y colocó en un imán (Figura 17) durante 8 minutos. El sobrenadante se recuperó pipeteando en un tubo nuevo. Las células T citotóxicas aisladas se han analizado en un citómetro de flujo analizador MACSQuant (Miltenyi Biotec) usando una combinación de anticuerpos conjugados con fluorocromo.

Ejemplo 25: Clasificación de dos parámetros

Las células mononucleares de sangre periférica se aislaron de 20 ml de sangre entera humana usando la invención descrita de conformidad con el Ejemplo 18. Las células mononucleares de sangre periférica aisladas se lavaron mediante una etapa de centrifugación 300 x g y se apliacron a una columna LS MACS equilibrada (Miltenyi Biotec). El flujo que atraviesa se recogió, se contaron las células y los glóbulos blancos 1E7 se marcaron magnéticamente en 100 ul usando microperlas CD 19 de conformidad con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec GmbH). Las células B se purificaron hasta 81,2 % de pureza con un rendimiento del 79,8 % usando una columna MS MACS. Para la

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comparación se aislaron las células mononucleares de sangre periférica usando la presente invención de conformidad con el ejemplo 18. Las células mononucleares de sangre periférica aisladas 1E7 se marcaron magnéticamente en 100 ul usando un kit MACS de aislamiento de células B. Las células B se purificaron a 89,7 % con un rendimiento de 95 %.

Ejemplo 26: Velocidad de sedimentación

La velocidad de sedimentación de la sangre entera humana suplementada ya sea con la solución de agregación eritrocitaria (HPMC-15) o solución de agregación eritrocitaria y perlas magnéticas de diferentes tamaños (50 nm, 200 nm, 3500 nm) conjugadas con un cóctel de anticuerpos monoclonales (CD3, CD14, CD15, CD19, CD36, CD61, CD123, anti IgE) se evaluaron mediante la determinación del volumen del sobrenadante que puede eliminarse. Sorprendentemente, la combinación de HPMC-15 y las perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos de tamaño 200 nm resultaron en la sedimentación completa de los eritrocitos dentro de los 3 minutos en comparación con 8,5 minutos cuando sólo se usó la solución de agregación eritrocitaria (HPMC). La sedimentación fue más lenta cuando se usaron perlas magnéticas más pequeñas o más grandes. La Figura 18 muestra los resultados del experimento.

Ejemplo 27: Uso de perlas magnéticas conjugadas con CD36

2,5 mL de sangre entera se usaron para el aislamiento de linfocitos citotóxicos CD8 positivos por la presente invención, usando HPMC-15 y un cóctel de partículas magnéticas monoespecíficas (220 nm) conjugadas con anticuerpos CD4, CD11b, CD14, CD15, CD19, CD56, CD61, CD123, aIgE, aTCRg/d. Las perlas conjugadas con el anticuerpo CD36 se añadieron ya sea al cóctel o el cóctel se usó sin la adición del anticuerpo CD36. 2,4 mL del sobrenadante pudo recuperarse con el enfoque sin partículas conjugadas con el anticuerpo CD36, que contiene 73 % de la cantidad inicial de células CD8 positivas a una pureza del 80,4 %. La forma de los sedimentos fue como se representa en la Figura 13, que proporciona una interfaz plana entre la píldora sedimentada y la fase de sobrenadante. Cuando se usaron los conjugados de anticuerpos CD36 con partículas magnéticas, la forma exponencial de la píldora sedimentada (Figura 14) permitió un mayor volumen de sobrenadante (2,6 ml; + 8 %) que se recupera, aumentando el rendimiento de 78 % a una pureza de 80,7 %.

Ejemplo 28: Comparación de los diseños de imanes

A 8 mL de la capa leucocitaria de la sangre entera se le redujeron los eritrocitos, las plaquetas y los granulocitos usando la presente invención (anticuerpos CD61 y CD15 conjugado con las partículas magnéticas de 200 nm en una relación 1:1, el HPMC-15 que contiene tampón para la dilución con 4 mL) combinada con diferentes imanes. El separador MACSiMAG redujo el 99,1 % de los granulocitos y 99,2 % de las plaquetas, el limpiador magnético de cristales de acuario el 97,6 % y 98,7 % respectivamente, un diseño con 3 imanes en un yugo en forma de U el 99,7 % y 98,0 % respectivamente, el imán SensScreen el 96,7 % y 98,6 %, respectivamente.

El imán según la Figura 17 se comparó con el separador MACSiMAG usando 1 mL de sangre entera, el HPMC-15 que contiene tampón de PBS, un kit de aislamiento de células NK que consiste en anticuerpos de unión a las células no NK se conjugó con partículas magnéticas de 240 nm. La sangre se incubó con los reactivos durante 5 minutos, el tiempo de sedimentación fue de 8 minutos. Las células NK se purificaron a 81 % de pureza en un rendimiento del 67 % usando el imán de acuerdo con la Figura 17 y en 77,6 % de pureza en 66 % de rendimiento usando el separador MACSiMAG.

Ejemplo 29: Reducción de las células B usando partículas magnéticas de 50nm

Un anticuerpo monoclonal que reconoce CD 19 en las células B se conjugó con las perlas magnéticas (Ejemplo 4, diámetro promedio de 50 nm, MicroBeads, Miltenyi Biotec). El anticuerpo conjugado a perlas se proporcionó a 1,3 mL de la capa leucocitaria de la sangre entera, 0,7 ml de tampón PBS y 200 ul de solución madre de HPMC15. Las células B se redujeron sólo insuficientemente con más del 75 % de las células B restantes en la muestra (ver Figura 12).

Claims

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