CN103946373B - 细胞分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于从含有红细胞的样品中分离细胞的方法和组合物。该方法用于从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中回收所需的细胞，包括：a)将样品与组合物相接触，所述组合物包含：i)红细胞凝集试剂，ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；b)同时应用i)用于红细胞沉降的重力沉降和ii)磁场梯度于所述样品以用于固定所述磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，和c)从上清液相回收所需的细胞。还公开了用于本发明方法中的组合物。

Description

细胞分离方法
发明领域
本发明一般地涉及免疫学领域，特别涉及用于细胞分离的方法和组合物。
发明背景
细胞分离方法被广泛用在进行研究、诊断或临床应用的科学和临床实验室中。细胞分离的大多数策略是基于不同的物理性质，例如大小和密度。
通常在处理目标细胞(白细胞)之前必需除去红细胞。这可以通过使用例如，梯度密度离心法、外周血单核细胞(PBMC)样品制备或通过红细胞裂解(其全部是本领域公知的)分离细胞而通过其他方法来实现。
在除去红细胞后，利用与识别细胞上的表面抗原的抗原结合部分结合的固相颗粒进行的方法可用于将白细胞分离成亚群。这类方法可以用磁珠(例如，来自MiltenyiBiotec GmbH,Germany的基于柱的MACS技术；US5411863、US5543289、US6020210、US6417011；或非基于柱的：Life Technologies,Carlsbad,California)或不用磁珠进行，例如，利用高密度珠(US6730230、US5576185、US6900029、US6004743)进行，其利用致密珠的重力沉降来从生物样品分离所需的或不需要的细胞群体。
有几种方法允许直接从全血中正向选择细胞，如使用全血微珠与MACS技术(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)。但这些方法仅限于少量的细胞。
当非离子聚合物如多糖和合成聚合物在体内输注或在体外添加到红细胞在缓冲液或血浆中的悬浮液中时促进红血细胞(即红细胞)聚集。诱导人红细胞聚集的聚合物的例子是分子量60,000-500,000的葡聚糖、分子量360,000的聚乙烯吡咯烷酮和分子量20,000的聚氧乙烯(POE)。
如果将抗凝的血液静置在管中，红细胞在白血细胞之前沉降且白细胞富集的血浆层可以在1个半小时或更长时间后分离。由于红细胞凝集的自发倾向，红细胞沉降比白细胞更迅速。有可能通过添加之前提及的聚合试剂(Skoog和Beck,1956,Blood,11:436)之一来加速红细胞的沉降。
密度梯度离心是允许细胞根据它们的大小、形状和密度分离的技术。密度梯度是在离心管中通过不同密度的溶液分层建立的，使得致密端在管的底部。细胞通常在浅的蔗糖或其他惰性碳水化合物梯度上分离，甚至在相对低的离心速度下分离。
不连续密度梯度离心通常用于将外周血单核细胞与粒细胞和红细胞分离。例如在所谓的Ficoll密度分离中，全血在FICOLL-上分层，然后离心。红细胞、粒细胞和约50％的单核细胞沉降到细胞沉淀物，而其余50％的单核细胞沉降到Ficoll血浆界面。所有的密度分离技术具有相同的基本限制：它们不能分离具有重叠密度分布的细胞亚群如淋巴细胞亚集，且它们包括费时和费力的离心步骤。
具有对细胞表面抗原的亲和力的单克隆抗体被用于在密度梯度离心后进一步分离特定的细胞。抗体特异性技术和密度梯度离心技术可同时使用。一些公开出版物(US5,840,502、US5,648,223、US5,646,004、US5,474,687和US7,316,932)描述了使用不连续密度梯度分离通过选择性地靶向和沉淀(pelleting)所需的/不需要的细胞类型而将致密颗粒用于正向或反向选择。
WO00/73794公开了一种利用免疫玫瑰花结(immunorosette)分离细胞的方法。该方法包括将含有有核细胞和红细胞的样品与抗体组合物相接触，这使得有核细胞和红细胞形成免疫玫瑰花结。该抗体组合物包含双功能抗体或四聚体抗体复合物。这里的概念是(1)将样品与抗体组合物在允许有核细胞和红细胞形成免疫玫瑰花结的条件下相接触，其中抗体组合物包含(a)至少一种结合待分离的有核细胞上的抗原的抗体，其连接于(b)至少一种结合红细胞的抗体，和(2)通过离心从样品中除去免疫玫瑰花结。优选地，红细胞特异性的抗体是抗血型糖蛋白A。在出版的Stem Cell Technologies手册中描述了使用Ficoll在具有和没有羟乙基淀粉(Hetastarch)的情况下的免疫玫瑰花结方案。这种方法的缺点是，它包括费时和费力的离心步骤。
在US7160723中公开了一种方法，它包括将含有血细胞的样品与细胞分离组合物相接触。该组合物是i)葡聚糖，ii)抗血型糖蛋白A抗体，以及iii)一种或多种抗细胞表面抗原的抗体。在某些情况下，抗体是基质结合的以固定这种分子。将含有血细胞样品和分离试剂的混合物轻轻混合30到45分钟。允许凝集的细胞与悬浮液中保留的非凝集细胞分离30至50分钟。该方法的问题是经过1个多小时的耗时过程才能得到所需的细胞以用于进一步的处理步骤。此外不利的是所需细胞的回收率相当低。
本发明是鉴于上述的现有技术而作出的，并且本发明的目的是提供一种用于从生物样品如全血样品、脐带样品和骨髓样品中分离所需细胞和除去不需要的细胞的改进的方法。
发明概述
本发明人已经开发一种用于直接从含有红细胞的样品(例如全血)中分离细胞的磁力增强沉降方法和组合物。该方法和组合物与现有技术的方法相比改善了从样品中分离所需细胞和除去不需要的细胞，也就是说，在本发明的方法中既不需要首先从样品中除去红细胞，也不需要执行任何费力的样品离心步骤，从而产生对待分离的细胞具有最小应激的非常快速的细胞分离方法。整个过程在一个单一步骤中进行，产生加速的全血细胞分离方法。本文所公开的方法比本领域中已知的方法更快，从而由于细胞上有限的应激而防止细胞的损害。此外，本发明的过程与本领域中已知的方法相比得到更高的细胞回收率和纯度。
用本发明的方法和组合物获得的细胞可以被用于例如高效地制备用于细胞培养、进一步纯化、诊断测试或治疗施用的细胞。通常地，通过本发明获得的所需细胞是原始的细胞(untouched cell)，也就是说，它们处于其自然状态。该细胞与本发明组合物的成分(例如与细胞表面抗原结合的抗体)的相互作用不改变，例如刺激，所需的细胞。此外，通过使用本发明使得分离所需的时间减少进一步降低了在处理过程中细胞通常遭受的应激。因此，本发明提供了对所需细胞的最小心的处理，使它们成为有利于后续应用的最小应激的细胞。
出人意料地发现，如果同时(1)红细胞通过试剂(例如，红细胞叠连(rouleaux)形成剂，即红细胞聚集试剂如羟丙基甲基纤维素(HPMC))聚集，和(2)一种或多种细胞成分(即其他的血细胞和/或血小板)被磁性颗粒特异性地结合，其中磁场梯度被施加于所述磁性颗粒，从而固定与磁颗粒结合的细胞而产生细胞团块和上清液相(液体部分)，则样品中细胞的沉降加速。团块包含通过红细胞聚集试剂和已经结合细胞成分的磁性颗粒沉淀的细胞。上清液相基本上不含颗粒而包含还没有提供用于沉淀或固定的细胞。通常，这些是所需的细胞。因此，样品的上清液相可以被移除，并用于进一步的分析和/或在随后的步骤中所需细胞的处理。
细胞成分(如红细胞及其他细胞和/或血小板)的同时沉降和固定是对作用在其上的力的反应。这些力可以是由于例如重力沉降，离心加速度和电磁力。各种力可以单独地或与一种或两种其他的力组合发挥作用。优选地，细胞成分(如红细胞及其他细胞和/或血小板)的同时沉降是在1-20×g，更优选地在1-2×g，最优选地在1×g(即没有额外的离心加速度)下进行的。如果包含待处理样品的容器处于静止状态，即没有摆动或离心，则发生1×g的重力沉降，以使得在流体中的颗粒或细胞，即具有细胞组分的样品，沉降至该容器的底部。在任何变型中，红细胞在白血细胞之前沉降。
本发明的优点是不需要施加用于细胞快速沉降的离心力。优选地，所述方法利用仅施加重力沉降(1×g)和磁性力的协同效果。优选地将磁力源定位在包含待处理样品的容器的侧面。这种安排的结果是两种力作用于细胞上，一种是至底部的重力沉降，和另一种是至包含待处理样品的容器的侧面的磁力。但是一个或多个磁力源的位置可以变化从而导致力作用于细胞的不同方向。
此外出乎意料地发现，如果同时(1)红细胞通过红细胞聚集试剂(如HPMC-15)聚集和(2)一种或多种不需要的细胞成分由具有100和1400nm的大小的磁性颗粒特异性结合，其中磁场梯度被施加到所述的磁性颗粒上，从而固定与磁性颗粒结合的细胞，则样品中细胞的沉降被加速。
此外令人惊异地发现，细胞团块的形状可以受所选择的与磁性颗粒偶联的抗原识别部分以及所选择的磁力源相对于包含待处理样品的容器的位置的影响。如果使用了识别一种或多种不需要的细胞成分的表面蛋白质而不识别红细胞的表面蛋白质的抗原识别部分，那么团块被分成两个部分。在磁力源如图13中所示定位于含有待处理样品的容器的侧面的位置上的情况下，只产生轻微的迁移。使用识别红细胞的表面蛋白质以及一种或多种不需要的其它细胞组分的表面蛋白质(例如CD36)的一种或多种抗原识别部分导致希望被沉淀和/或固定的全部细胞成分的磁力增强沉降。如果磁力源以如图13中所示的相同的方式被定位，在这样的情况下团块形成不同的形状，类似于如图14中所示的产生平滑过渡的指数函数曲线。如果，例如，使用移液管，团块的这种或类似的形状有利于移除上清液，其导致可以被回收的上清液的体积增加(实施例27)。
本发明的组合物包含：i)红细胞聚集试剂，和ii)一种或多种单-和/或多-特异性磁性颗粒的集合，该磁性颗粒具有至少一个与该颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一个抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合一种或多种不需要的细胞成分特有的至少一种抗原。
附图简要说明
图1：与1:1比例的单克隆抗体CD61和CD15偶联的不同大小的磁珠的血小板耗竭效率
图2：与1:1比例的单克隆抗体CD61和CD15偶联的不同大小的磁珠的粒细胞耗竭效率
图3：与1:1比例的单克隆抗体CD61和CD15偶联的250nm磁珠的粒细胞和血小板耗竭效率
图4：与1:1比例的单克隆抗体CD61和CD15偶联的1400nm磁珠的降低的粒细胞和血小板耗竭效率
图5：与CD15和CD61抗体偶联的100nm磁珠的偶联物的粒细胞和血小板耗竭效率
图6：与CD19抗体偶联的240nm磁性颗粒的偶联物的B细胞耗竭效率
图7：与CD56抗体偶联的240nm磁性颗粒的偶联物的NK细胞耗竭效率
图8：磁珠已经与多特异性的抗体偶联和耗竭性能已经按照实施例1、2和3中所述的方案进行评价。
图9：已经通过在Beckman Coulter Delsa Nano仪器上测量而测定与CD56抗体偶联的磁性颗粒偶联物的大小。
图10：含有与非NK细胞抗体偶联的220nm磁珠和HPMC的NK细胞试剂盒在液体中或以冻干形式储存后的分离效率
图11：用不同缓冲液重构的含有与非NK细胞抗体偶联的220nm磁珠和HPMC的冻干NK细胞试剂盒的分离效率
图12：与50nm磁性颗粒偶联的CD19抗体的不足的分离效率
图13：当使用不识别红细胞的表面蛋白质但识别其他不需要的细胞成分的无CD36或其他抗原识别部分的抗体混合物时团块的形状。该团块由两部分组成。上部包含吸附至磁体的磁性标记的细胞。下部包含无或具有弱磁性标记的聚集体(红细胞、血小板、细胞聚集体)，其通过沉降分离。
图14：与在图13中的情况相比，当使用结合红细胞和其它不需要的细胞成分(即非目标白细胞)两者的抗体如CD36时，红细胞和磁性标记细胞的团块形成不同的形状。
图15：当磁体被布置远离管的底部时，团块破裂成两部分。上部团块包含吸附至磁体的磁性标记细胞。下部团块包含无或具有弱磁性标记的聚集体(红细胞、血小板、细胞聚集体)。
图16：容纳2个长方体稀土磁体(88*24*10mm)的磁轭的设计。离心管可以被放置在垂直定向的磁体之间用于细胞分离。
图17：容纳1个长方体稀土磁体(88*24*10mm)的磁轭的设计，磁体和50ml离心管的位置。
图18：用于测定HPMC-15与不同大小的与磁珠偶联的抗体混合物的组合的沉淀速度的实验结果(实施例26)
图19：与磁性颗粒偶联的抗体混合物和不同的红细胞聚集试剂的组合中分离的NK细胞的纯度和产率
定义
除非另有定义，在本文中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。
本文所用的术语“细胞成分”是指通常在全血样品、外周血样品、白细胞分离(leukapheresis)样品、血沉棕黄层样品、脐带样品和骨髓样品中共有的细胞，包括，例如，红细胞、白细胞和血小板。尤其是白细胞由许多细胞亚群组成，如，例如T细胞、调节性T-细胞、B-细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、粒细胞、造血干细胞。
本文所用的术语“颗粒”是指固体相如胶体颗粒、微球、纳米颗粒或珠。用于生成这样的颗粒的方法是该领域众所周知的。本发明中的颗粒是磁性颗粒。该颗粒可以是处于溶液或悬浮液中，或如实施例16中所示的，可以在本发明中使用之前处于冻干的状态。冻干的颗粒然后在与按照本发明进行处理的样品接触之前在适当的缓冲液中重构。优选地，所述颗粒的直径尺寸可以为最小100nm和最大1400nm，更优选地，所述颗粒具有200至500nm直径的尺寸。至少一种抗原识别部分与磁性颗粒偶联，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性结合对于细胞成分特异性的至少一种抗原。
本文所用的“磁性颗粒”中的术语“磁性”是指可以用本领域技术人员熟知的方法制备的磁性颗粒的所有亚型，特别是铁磁性颗粒、超顺磁性颗粒和顺磁性颗粒。“铁磁性”材料非常易受磁场的影响，并且能在移除磁场时保持磁性特性。“顺磁性”材料只具有弱的磁化率，并且当磁场被移除时很快失去其弱磁性。“超顺磁性”材料是高度磁敏感的，也就是说，当它们被放置在磁场中时成为强磁性的，但是像顺磁材料那样，迅速地失去其磁性。
如本文所用的术语“红细胞聚集试剂”是指在本领域中已知的在含有血细胞的样品中引起红血细胞聚集的任何分子。优选地，该红细胞聚集试剂选自于高分子量蛋白(如纤维蛋白原和免疫球蛋白)和非离子聚合物如多糖和合成聚合物。更优选地，该红细胞聚集剂是选自于葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)的非离子型聚合物。最优选地，红细胞聚集试剂是HPMC-15。
如本文所使用的术语“抗原识别部分”是指抗体或抗原结合片段。如本文所用的术语“抗体”指多克隆或单克隆抗体。该抗体也可以是修饰的抗体(例如，低聚体、还原的、氧化的和标记的抗体)。术语“抗体”包括完整分子以及抗体片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和单链抗体。另外，术语“抗原结合片段”包括优先与在该方法中将被沉淀的细胞的所需靶分子结合的任何部分。合适的部分包括，但不限于，被称为结合与所需靶分子结合的称为适体的寡核苷酸(Hermann和Pantel(2000)Science289:820-825)、碳水化合物、凝集素或任何其它抗原结合蛋白(如受体-配体相互作用)。
如本文所用的术语“单特异性颗粒”和“多特异性微粒”分别是指，在单特异性颗粒的情况下，一种抗原识别部分与颗粒的偶联，和在多特异性颗粒的情况下，两种或更多种抗原识别部分与颗粒的偶联。多特异性颗粒的两种或更多种抗原识别部分(例如不同的抗体)分别地优先结合对于不同细胞亚群特异性的抗原。在下文中，“单特异性颗粒”和“多特异性微粒”由他们所偶联的抗原部分指称。例如，与抗-抗原CD61和CD15的抗体结合的颗粒被称为“CD61.CD15.颗粒”。
抗CD61抗体结合于血小板和CD15结合于粒细胞，即多特异性颗粒结合两个细胞亚群。抗体与颗粒之间的连接可以是共价的或非共价的。共价连接可以是，例如与聚苯乙烯珠上的羧基基团连接，或者与改性珠上的NH2或SH2基团的连接。非共价连接是例如，如实施例12中所示的通过生物素-抗生物素蛋白或与抗荧光团抗体连接的荧光团偶联颗粒。
如本文所用的术语“样品”指的是含有红细胞的样品，例如外周血样品、白细胞分离收获物、血沉棕黄层制备物、脐带样品和骨髓抽吸物，如实施例13中示例性示出的。样品可以来自动物，尤其是哺乳动物。优选地，所述样品来自人类。
如本文所用的术语“细胞修饰剂(cell modification agent)”是指例如，细胞刺激剂如细胞因子、抗体或肽。此外，细胞修饰剂可以是与用于随后使用如MACS技术进行细胞分离的磁珠(例如超顺磁性珠)偶联的抗体。进一步的细胞修饰剂是荧光染料偶联的抗体，它随后可用于本发明的细胞分离以用于细胞分析。可选地，与细胞修饰试剂(例如抗体)结合的磁珠(例如超顺磁性珠)可以给予使用本发明后的最终细胞组合物以用于使用MACS技术(见实施例25)的进一步细胞分离。
本文所用的术语“团块”或“细胞团块”是指本发明所得的非液体相。团块由红细胞沉淀(至少部分地通过由于向样品中施加红细胞聚集试剂而导致的重力沉降产生)和至少部分地包含细胞成分的固定的磁性颗粒(由于向样品施加磁场梯度而产生)组成。团块或细胞团块是在含有使用本发明的方法处理的样品的容器中通过细胞沉淀和磁力产生的细胞固定所生成的所有团块的实体。如果在本发明中使用识别红细胞的表面蛋白以及一种或多种其他细胞成分的表面蛋白的抗原识别部分，则红细胞也被磁性颗粒固定。团块的形状可以随磁体的位置而变化，从经过两个团块的平滑过渡的一个封闭团块到两个或更多个分离的团块。如果由于磁力源的布置而存在两个或更多个团块，本文所使用的术语团块是指所有的团块，即该团块是通过应用本发明所产生的容器内的所有部分的团块的总和。磁性颗粒积聚在最接近于磁场梯度源(即磁体)的表面的附近。颗粒是本发明的单特异性或多特异性颗粒，并因此团块中的一部分颗粒可以具有附着的细胞，另一部分可以没有细胞。
本文所用的术语“上清液”或“上清液相”是指本发明所得的与团块相对的液体相。上清液相由不属于本发明所产生的聚集复合物的部分的所有细胞成分组成。可以通过选择本发明中使用的单特异性或多特异性颗粒的特异性来选择细胞的哪些亚集不聚集。通常，上清液相的细胞是原始的细胞，并且是分离方法的所需细胞，即靶细胞。
本文所用的术语“靶细胞”是指作为通过本发明分离的所需细胞的细胞。术语“靶细胞”和“所需细胞”在本发明中是可互换的，并且有相同的含义。通常，靶细胞是通过本发明的方法所产生的上清液的原始细胞。在上清液中所需细胞(即靶细胞)的选择可以通过在本发明的方法中使用的抗原识别部分的选择来定义。通常，靶细胞没有用于本发明方法中使用的与(多种)颗粒偶联的抗原识别部分的抗原。
本文所用的术语“不需要的细胞”是指由至少一种与本发明的磁性颗粒偶联的抗原识别部分特异性结合的细胞。这些细胞形成通过本发明所产生的团块的一部分。
发明详述
本发明提供了用于从含红细胞的样品中分离、富集和/或纯化细胞的方法和组合物。
与现有技术中已知的方法相比，本发明加速了含血细胞的样品中细胞的沉降。令人惊讶的是通过同时分离在存在红细胞聚集试剂的情况下聚集的红细胞和分离在存在分别具有对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的单特异性和/或多特异性磁性颗粒的情况下沉淀和固定的其它不需要的细胞成分而实现这一目的。
红细胞聚集试剂负责产生红细胞和一些血小板(即凝血细胞)聚集体形成，从而导致红细胞和血小板的沉降。磁性颗粒负责在磁场梯度中不需要的细胞成分(其被该颗粒识别)的聚集，导致这些细胞的同型和/或异型凝集。磁场梯度是由磁力源产生的，例如通过永磁体或电磁体。这两种聚集复合物正向干预并导致两种聚集复合物快速沉降和/或固定。
可以在两个独立的步骤中执行关于重力沉降和通过由应用于包含待处理样品的容器的磁力源产生的磁力固定磁性颗粒的本发明步骤，这也在本发明的范围内。但是，由于利用协同效应以产生最佳的结果(即纯度)和节省用于分离过程的时间，同时进行这两个步骤是高度优选的。
因此，本发明的目的是提供一种用于从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中富集和/或回收所需细胞的方法，其包括：
a)将样品与组合物相接触，其中所述组合物包含：
i)红细胞聚集试剂
ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合至少一种对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的抗原；和任选地
iii)修饰所需细胞的一种或多种细胞修饰剂；
b)对所述样品同时应用
i)用于红细胞沉降的重力沉降；和
ii)用于固定所述磁性颗粒的磁场梯度，从而产生沉淀和上清液相，并
c)从上清液相回收所需细胞
此外我们惊奇地发现，在本发明中使用的颗粒的尺寸对本发明具有进一步影响。我们发现，如果同时地(1)红细胞被红细胞聚集试剂如HPMC-15聚集和(2)一种或多种不需要的细胞成分被磁性颗粒特异性结合，该磁性颗粒具有100至1400nm之间的直径大小，优选200至500nm之间，其中磁场梯度施加到所述磁性颗粒，从而固定与磁性颗粒结合的细胞，则样品中细胞的沉降加速。在本发明中使用具有100至1400nm的平均尺寸，优选200至500nm的平均尺寸的颗粒，相比于较小或较大的颗粒分别产生更优的细胞分离(实施例1)。
50nm平均直径的小的磁性颗粒相比于200nm的颗粒对于加速红细胞沉降具有较少的影响(图18)，并对于一些结合的抗体产生次佳的耗竭效率(CD19，图12)。具有260nm至290nm平均直径的颗粒在与所有评估的抗体结合时显示出良好的耗竭效率(实例参见图6和图7)，并具有其中约95％是在100nm到1400nm的范围内和约90％在200nm至500nm的范围内的粒度分布(图9)。对于粒细胞和血小板，当与CD15和CD61抗体结合时，直径的平均尺寸超过1400nm的颗粒显示不足的耗竭效率。
在本发明中没有必要包括仅识别红细胞的表面蛋白如抗血型糖蛋白A的抗原识别部分。使用仅针对红细胞的表面蛋白的抗原识别部分如抗血型糖蛋白A抗体，在本发明中既不具有正面效应也不具有负面效应，这与在WO00/73794和US7160723中公开的方法相反(实施例15)。
更令人惊讶地发现，由本发明产生的细胞团块的形状可以受到两个参数的影响，i)与磁性颗粒偶联的抗原识别部分的选择，和ii)磁力源相对于包含待处理样品的容器的位置的选择。
如果使用识别一种或多种不需要的细胞成分的表面蛋白而不识别红细胞的表面蛋白的抗原识别部分，则团块被分成两个部分。如果磁力源的位置如图13所示的定位于含有待处理样品的容器的侧面，则在这种情况下只产生轻微的过渡。与此相反，使用一种或多种抗原识别部分(其识别红细胞的表面蛋白，但也识别一种或多种其它不需要的细胞成分(即非靶白细胞)的表面蛋白)对细胞团块的形状产生影响。这样的识别红细胞和其它细胞成分的表面蛋白的标志物是例如CD35、CD36、CD44、CD45RB、CD47、CD49e、CD55、CD58、CD59、CD75、CD75S、CD99、CD108、CD111、CD139、CD147、CD220和CD222。使用这样的抗原识别部分，例如CD36，导致想要被沉淀的所有细胞成分的磁力增强的沉降。如果具有磁场梯度的磁力源被定位在如图14所示的包含待处理样品的容器的侧面，团块的形状类似于指数函数曲线。但一般地，团块可以根据磁力源的位置形成不同的形状。通过本发明的方法获得的细胞团块的形状是作用于细胞上的力的结果。红细胞沉降部分地由于重力作用和部分地由于磁力作用。如果在本发明中使用一种或多种抗原识别部分(其识别红细胞的表面蛋白，但也识别一种或多种其它不需要的细胞成分的表面蛋白)，则红细胞被磁化。因此，如果将磁体如图14所示的接近含有待处理样品的容器的底部定位，则产生两种类型的细胞团块(即，通过重力沉降产生的一个细胞团块和通过磁力产生的另一个团块)的平滑过渡。如果，例如使用移液管，团块的这种形状或类似的形状对于除去上清液是有利的。团块的这种形状允许更容易和更完全地移除非沉淀相，即通常包含所需细胞的上清液相。但是，磁场梯度可在相对于包含待处理样品的容器的任何位置定向，从而产生不同形式的团块。如果磁体的位置更远离含有待处理样品的容器的底部，则产生两个独立的团块，如图15中所示。上部团块包含由于用磁性颗粒标记而被强磁化的细胞。如果使用识别红细胞上的表面蛋白的抗原识别部分，则该团块含有红细胞和其它不需要的细胞成分。如果没有使用识别红细胞上的表面蛋白的抗原识别部分，则该团块含有其它不需要的细胞成分，但没有红细胞。下部的团块包含由于用磁性颗粒标记而弱磁化的细胞，即大部分剩余的红细胞。
因此，在本发明的另一个实施方式中，提供了具有至少一种抗原识别部分的磁性颗粒，该抗原识别部分识别红细胞的细胞表面上的抗原，以及至少一种其它不需要的细胞成分的抗原。
在含有待处理样品的容器的底部处使用磁力源不是优选的。这导致磁性聚集体必须移动更长的距离，即相比于3cm(管直径)的10cm(管高度)的距离。
本发明利用通过磁力源(例如通过永久磁体或电磁体)产生的磁场梯度。可以在本发明中使用任何类型和形式的磁体，如购自德国Miltenyi Biotec GmbH的MACSiMAGTMSeparator。本发明已经评价了不同的磁体设计。MACSiMAGTM Separator也已经用更高的磁体进行改进以将磁性颗粒和磁性标记的细胞吸引至整个管高度的管壁上。已评估了用于50ml离心管的市售的磁体，包括购自SensScreen Technologies(德国)和购自Stem CellTechnologies("Easy50"Easy Sep Magnet)的磁体。已评估了用于本发明的磁性水箱玻璃清洁器(magnetic aquarium glass cleaner)。这些清洁器由与磁轭组合、嵌入塑料外壳中和具有附接到内磁体表面上的清洁材料以清洁水箱玻璃的强永磁体组成。已经开发了几种设计，其使用在不同的磁轭(包括U型磁轭和垂直磁轭)中的88mm*24mm*10mm的长方体稀土永磁体(见图16和图17)。Halbach阵列已成功地用于本发明。
除了被放置在管壁外的磁体外，磁体也可浸入管中，无论是圆柱形、长方形或球形。
本发明的另一个目的是提供用于从例如，细胞外周血、脐带血和骨髓分离、富集和/或回收在治疗上或诊断上或科学上有价值的细胞的组合物。
根据本发明的组合物包含：
i)红细胞聚集试剂
ii)一种或多种单特异性和/或多特异性的磁性颗粒的集合，至少一种抗原识别部分与该颗粒偶联，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；和任选地
iii)一种或多种细胞修饰剂，其修饰所需的细胞。
根据本发明的细胞分离组合物包含红细胞聚集试剂和一种或多种单特异性和/或多特异性磁性颗粒。颗粒的特异性是针对于待沉淀或固定的细胞(即不需要的细胞)的抗原。细胞分离组合物包含针对血细胞表面抗原(包括如CD11b、CD123、CD14、CD15、CD16、CD19、CD193、CD2、CD25、CD27、CD3、CD335、CD36、CD4、CD43、CD45RO、CD56、CD61、CD7、CD8、CD34、CD1c、CD23、CD304、CD235a、抗Fc_ε、抗T细胞受体α/β、抗T细胞受体γ/δ、抗生物素、抗IgE、抗HLA-DR和它们的组合)的抗原识别部分，如抗体。
优选的，所述组合物的磁性颗粒的平均直径大小在100和1400nm之间，优选在200和500nm之间。
这样的组合物可包含一种类型的单特异性或多特异性颗粒，或者可以包含一种以上的单特异性或多特异性颗粒或者单特异性和多特异性颗粒的混合物。便于分离特定细胞亚群的原始细胞的组合物应包含与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中这样的抗原识别部分不识别作为应该保持不变的所关注细胞(即所需细胞或靶细胞)的细胞子集。例如，如果需要从上清液中除去血小板，可以使用分别针对CD61、CD62、CD41的抗原识别部分。如果需要除去粒细胞，可以使用分别针对CD66b、CD15、CD16的抗原识别部分。如果需要除去单核细胞/巨噬细胞，可以分别使用CD14、CD33。如果需要除去B细胞，可以分别使用CD19、CD20。如果需要除去T细胞，可以分别使用CD3、CD4、CD8、T细胞受体α/β。如果需要除去NK细胞，可以分别使用CD56、CD335。
一般地，在本发明中使用与颗粒偶联的一种抗原识别部分，例如抗体，导致所需细胞的一致分离(实施例2)。使用两种或更多种与颗粒偶联，优选与平均直径的大小为100至1400nm之间，更优选地200至500nm之间的颗粒偶联的抗原识别部分，例如抗体，相比于现有技术的方法导致所需的或不需要的细胞的更好分离(参见实施例3)。
在本发明中使用至少一种与颗粒偶联的抗原识别部分(例如，抗体)包括-但不限于-分别与2、3、4、6、8、10或12种抗原识别部分(例如抗体)偶联的颗粒，导致与实施例3中所示的这些颗粒等效或甚至更好的分离性能。
与颗粒偶联的不同的抗原识别部分(例如抗体)的比率可以不同。优选地，该比率是在1:1至1:50之间，更优选地在1:1至1:20之间(见实施例3)。如果附加的抗原识别部分与所述颗粒偶联，每个附加的抗原识别部分相对于第一或第二抗原识别部分的比率为1:1至1:20。
本发明将耗竭不需要的细胞的孵育期减少到5分钟或更少(见实施例5)。此外，沉降期可被减少到8分钟或更少，结果是与本领域中的已知方法相比，靶细胞在约15分钟内总体更快地分离(实施例5)。
通过使用磁性颗粒和向它们施加磁场梯度，本发明被强烈加速。与施加磁场梯度相比，不使用磁场梯度，该方法效果较差，结果是需要额外的沉降时间和较差的细胞纯度(见实施例6)。
本发明在大样品体积范围内工作很好，例如，在1.5ml或50ml样品下工作(见实施例7)。
不论待分离的细胞是否用细胞培养基或在常规缓冲液中稀释，本发明工作良好(见实施例8)。
本发明是可再现的，并在不同样品之间显示很小的性能变化(见实施例9)。该方法与样品中可得的血小板(凝血细胞)的浓度也不相关(见实施例10)。
红细胞聚集试剂可以选自于葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)，如实施例11中所示。如实施例11所示，HPMC-15优于其它红细胞聚集试剂。本发明中使用的HPMC-15的最佳浓度是0.2-0.5％HPMC15，例如，在全血中或血沉棕黄层中(实施例11)。
在本发明的一些实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且单特异性颗粒是与例如，抗CD61单克隆抗体偶联的磁性颗粒，优选大小介于100和1400nm之间，更优选地介于200至500nm之间。抗CD61抗体特异性地结合血小板。该CD61.颗粒、红细胞聚集试剂和全血样品被合并在容纳如1.5至45ml体积的样品的管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上且磁性标记的细胞在磁场内分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。原则上，可以从上清液或从细胞团块回收细胞，其中该团块由在试管底部的红细胞团块和通过磁体保持在所述管的侧壁上的磁性标记的细胞组成。通常，所需细胞处于上清液相中。
在本发明的一些实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且所用的颗粒是分别与如抗CD61单克隆抗体和抗CD15单克隆抗体偶联的至少两种单特异性磁性颗粒，优选大小介于100和1400nm之间，更优选地介于200至500nm之间，。该CD15.颗粒、CD61.颗粒和红细胞聚集试剂以及全血样品被合并容纳如1.5至45ml体积样品的管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记的细胞在磁场内分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。
在本发明的一些实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且所用的颗粒是与如比率为1:1的抗CD61单克隆抗体和抗CD15单克隆抗体偶联的双特异性磁性颗粒。为达到最佳结果，偶联抗体与颗粒的比率可以有所不同，并取决于选定的细胞子集。抗CD61抗体特异性结合血小板且抗CD15抗体结合粒细胞。
CD61.CD15.颗粒、红细胞聚集试剂和全血样品被合并容纳如1.5至45ml体积样品的管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场内分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。
在本发明的其它实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且所用的颗粒是与1:20比率的抗CD61单克隆抗体和抗CD15单克隆抗体偶联的双特异性磁性颗粒。CD61.CD15.珠、红细胞聚集试剂和全血样品被合并在管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场内分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。可以通过例如过滤(死端过滤或者错流/中空纤维组件过滤)浓缩上清液。对于死端过滤，细胞被放到具有如1微米孔径的过滤器上。靶细胞被保留在过滤器上，而液体(即，用缓冲液稀释的血清)滴流通过过滤器。然后通过吸液从过滤器表面回收靶细胞。对于如基因表达谱分析的应用，可以将含有靶细胞的过滤器放置在具有裂解溶液的容器中用于mRNA的分离。
对于错流过滤，细胞被置于注射器中，并经过中空纤维组件进入到第二注射器中。一些液体(通常10-30％)经过膜的孔进入第三注射器中。然后将细胞悬浮液从第二注射器传送到第一注射器并将该过程重复几次，逐渐增加细胞浓度。当达到所需量时，注射器可以旋下中空纤维组件以回收靶细胞。
在本发明的其它实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且所用的颗粒是与2.5:2.5:1比率的例如抗CD14单克隆抗体、抗CD36单克隆抗体和抗CD61单克隆抗体偶联的三特异性磁性颗粒。该CD14.CD36.CD61.珠、红细胞聚集试剂和全血样品被合并在管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场中分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。
在本发明的其它实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且双特异性磁性颗粒是冻干的磁性颗粒，其与例如抗CD61单克隆抗体和抗CD15单克隆抗体偶联。使用前，CD61.CD15.颗粒溶解在液体中，如水或任何非常适合的缓冲液或细胞培养基。然后将CD61.CD15.颗粒、红细胞聚集试剂和全血样品合并在管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场中分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。
在本发明的其它实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且所用的颗粒是双特异性磁性颗粒，其与例如抗CD61单克隆抗体和抗CD15单克隆抗体偶联。该CD61.CD15.颗粒、红细胞聚集试剂和全血样品被合并在管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场中分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。对于第二轮细胞子集的分离，上清液直接地或在细胞洗涤或浓缩后用于适合于分离细胞的方法中，该方法通常用于PBMC或PBMC-样样品，如Dynal-Beads或MicroBeads(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)。例如，通过使用CD3+MicroBeads进行CD3+细胞的富集。对于另一个实例，通过使用T细胞分离试剂盒进行T细胞的富集。
在本发明的其它实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且所用的颗粒是双特异性磁性颗粒，其与例如抗CD61单克隆抗体和抗CD15单克隆抗体偶联。该CD61.CD15.颗粒、红细胞聚集试剂，细胞修饰试剂(如，例如CD3抗体)和全血样品被合并在管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场中分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。对于第二轮的细胞子集的分离，上清液直接地或用于进一步细胞分离的细胞浓缩后应用在MACS柱上。靶细胞可以是正向或反向选择的细胞。
在本发明的其它实施方式中，红细胞聚集试剂是HPMC-15且颗粒是单特异性或多特异性磁性颗粒，其与选择用于分离试剂盒的单克隆抗体偶联(实施例18-24)。抗体偶联颗粒、红细胞聚集试剂和全血样品被合并在管中，并将该混合物孵育5至10分钟和轻轻混合，例如在摇床上或通过手动混合。然后将管直立在管架上和将磁性标记细胞在磁场中分离8-15分钟。在这段时间内红细胞沉降到管底部。可以从上清液中回收细胞。对于第二轮的分离，将抗体偶联颗粒(例如CD235a和/或CD15颗粒)加入到上清液中，将该混合物孵育5分钟，将管直立静置在管架上和将磁性标记细胞在磁场中分离5分钟。从上清液中回收细胞。
在本发明的一些实施方式中，细胞分离组合物包含红细胞聚集试剂和一种或多种单特异性和/或多特异性磁性颗粒的集合，其具有与所述颗粒偶联的至少一种抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原。
在本发明的一些实施方式中，细胞分离组合物包含红细胞聚集试剂和一种或多种单特异性和/或多特异性磁性颗粒的集合，其具有与所述颗粒偶联的至少一种抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原，其中所述集合包含粒细胞的抗原识别部分之抗原特异性(如CD15)和血小板的抗原识别部分之抗原特异性(例如CD61)。这在本发明的上清液中产生红细胞、血小板和粒细胞耗竭的细胞组成(实施例18)。
在本发明的其它实施方式中，细胞分离组合物包含红细胞聚集试剂和一种或多种单特异性和/或多特异性磁性颗粒的集合，其具有至少一种与所述颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原，和其中所述集合包含一种或多种，优选全部的，选自于CD2、CD14、CD15、CD36、CD43、CD56、CD61、aIgE的抗原识别部分之抗原特异性。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生B细胞的纯细胞组成(实施例19)。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生T细胞的纯细胞组成(实施例20)。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD3、CD4、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61、CD123、CD193、aIgE、aTCRab。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生NK细胞的纯细胞组成(实施例21)。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD8、CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRg/d。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生T辅助细胞的纯细胞组成(实施例23)。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD4、CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRg/d。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生细胞毒性T细胞的纯细胞组成(实施例24)。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRg/d。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生T细胞受体α/β阳性T细胞的纯细胞组成。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRab。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生T细胞受体γ/δ阳性T细胞的纯细胞组成。
在本发明的其它实施方式中，一种或多种，优选全部的，抗原识别部分之抗原特异性选自于CD61、CD2、CD15、CD19、CD56、CD304、aIgE。使用所有特异性导致在本发明的上清液中产生单核细胞的纯细胞组成(实施例22)。
所提及的细胞分离组分适合于作为试剂盒提供。各个试剂盒包含利用本文描述的方法执行从含血液细胞的样品中分离所需细胞所必需的成分，从而产生上面提到的细胞组成。
关键成分是如本文所述的红细胞聚集试剂和单特异性或多特异性颗粒。在试剂盒中单特异性和/或多特异性颗粒可以在液体中(例如缓冲液中)或以冻干的形式提供。试剂盒可用于分离B细胞、T细胞、T辅助细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、造血干细胞、α/βT细胞和γ/δT细胞。
在本文给出的所有其实施方式中的本发明也可用于临床应用。举例来说，细胞从白细胞分离收获物(leukapheresis harvest)中分离。待处理的血细胞分离量通常将是150-250ml，其在封闭的系统(如血袋)中处理。上清液的移除例如通过血浆分离器手动或自动地进行。直接向患者施用靶细胞(如供体淋巴细胞输注)或者在治疗性应用前进行操作(如培养、刺激和/或扩增或分化)。靶细胞可以来自患者(自体使用)或来自健康供体(同种异体使用)。
靶细胞群体，例如本发明的T-细胞群、NK细胞群、单核细胞可单独施用或作为与稀释剂和/或与其它成分(如IL-2、IL-7、IL-15或者其他细胞因子或细胞群体)组合的药物组合物施用。简言之，本发明的药物组合物可包含如本文中所描述的靶细胞群体，其与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。药物组合物可包含a)T细胞群体，其中所述T细胞根据标准程序增殖至治疗有效量；和b)一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
另一种药物组合物可包含a)单核细胞群体，其中所述单核细胞根据标准程序培育以生成树突细胞；和b)一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
另一种药物组合物可包含a)自然杀伤(NK)细胞群体，其中所述NK细胞根据标准程序增殖至治疗有效量；和b)一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
可以用适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用本发明的药物组合物。给药量和频率将根据例如患者的病情、患者疾病的类型和严重程度的这些因素确定，虽然适当的剂量可以通过临床试验来确定。
实施例
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但该实施例并不意在限制本发明。
实施例1：颗粒的大小
根据实施例4采用不同工艺参数制造磁珠，从而产生不同大小的颗粒。通过Beckman Coulter Delsa Nano仪表征粒径。识别CD15和CD61抗原的单克隆抗体以1:1的比率与磁珠共价偶联，从而在OD450＝10的浓度下得到每ml珠粒悬浮液40ug抗体。
在5mL的FACS管内，将不同量的偶联珠和0.2ml的羟丙基甲基纤维素的2％原液加入1ml来自人全血的血沉棕黄层中，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi Biotec)中混合15分钟，并放置在MACSiMagTM分离器中20分钟。上清液用移液管完全移除，转移到FACS管，细胞用Sysmex KX21血液分析仪进行计数，并使用MACSquant分析仪流式细胞计数器(MiltenyiBiotec)对细胞进行分析。
当使用直径为214um、250um、290um的偶联颗粒时，从全血中除去红细胞、血小板和粒细胞的效率>99％。当使用1400um的颗粒时，血小板和粒细胞的去除效率较低(见图1至图4)。
实施例2：单特异性颗粒
单独地将识别CD15和CD61的单克隆抗体与磁珠(实施例4，平均直径为100nm)偶联。将珠偶联的抗体加入1.3ml全血、0.7ml的PBS缓冲液和200ul的HPMC15原液中。分别地或结合地98％至>99％的粒细胞和血小板被除去(见图5)。
将识别CD19和CD56的单克隆抗体分别与磁珠(实施例4，平均直径为220um)偶联。将珠偶联的抗体加入1.3ml全血、0.7ml的PBS缓冲液和200ul的HPMC15原液中。>98％的B细胞和NK细胞分别被除去(见图6和图7)。
实施例3：多特异性颗粒
以先前评估的抗体比率将2、3、4、6或8种不同的抗体与100nm或200nm的磁珠(见实施例4)偶联。抗体比率通过滴定单特异性偶联物和单独地测定足以完全去除细胞子集的最低抗体量而确定。单个抗体浓度被用于计算比率。将珠偶联的抗体加入1.3ml全血、0.7ml的PBS缓冲液和200ul的HPMC15原液中，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi Biotec)中混合15分钟，并放置在MACSiMagTM分离器中20分钟。上清液用移液管完全移除，转移到FACS管，细胞用SysmexKX21血液分析仪进行计数，并使用MACSquant分析器流式细胞计数器(MiltenyiBiotec)对细胞进行分析。超过92％的所分析细胞群体被耗减，见图8。
实施例4：颗粒的产生
在US5543289中公开了如本文中所使用的超顺磁性颗粒的产生，该文献通过引用在此引入。得到的珠的大小范围可受珠沉淀过程中所使用的葡聚糖浓度和所使用的铁盐影响。
其他珠为市售可得的：250nm的KiskerBeads购自Kisker Biotech(德国)，微米大小的颗粒购自SensScreen Technologies(德国)或Miltenyi Biotec(MACSiBeads)。
图9示出了通过改进的US5543289方法产生的与CD56抗体偶联的磁性颗粒的粒度分布。与CD56抗体偶联的磁性颗粒的偶联物的大小已通过在Beckman Coulter Delsa Nano仪上进行的测量而测定。平均直径为260nm。约95％的珠在直径100nm到1400nm的范围内，约90％的珠在直径200nm至500nm的范围内
实施例5：孵育和沉降时间段
本发明是根据实施例1、2和3中描述的方案使用CD4/CD61磁珠偶联物(200nm直径)进行的。
对0、5、10和15分钟的孵育时间进行比较。沉降时间都是20分钟。5分钟的孵育时间获得与15分钟的孵育时间相当的耗竭。
在第二试验中，比较了在5分钟的孵育时间后8、10、12、15和20分钟的沉降时间。8分钟的沉降时间获得与20分钟沉降时间相当的耗竭。没有评估进一步缩短的沉淀时间，因为在少于8分钟的沉淀时间内红细胞还未完全沉降。
实施例6：通过重力分离
按照实施例1、2和3中所描述的方案使用抗体混合物偶联的磁珠(200nm大小，见实施例19和21)来比较通过重力沉降和通过磁力增强的沉降导致的沉降。
NK细胞从全血中的6.4％分别富集至8.1％和70.2％。B细胞从4.5％分别富集至23.4％和85.5％。
因此，通过非磁力增加的沉降富集靶细胞一般是可能的，但明显不如应用磁力增强的沉降的情况。如果沉降是磁力增强的沉降，靶细胞的纯度显著提高。
实施例7：不同体积的样品的分离
使用类似于实施例1、2和3的方案来比较不同规模的细胞分离。使用来自人全血的血沉棕黄层，分离规模为2mL与13.5mL与45ml，其使用1.3mL/9mL/30mL的用一半体积的磷酸盐缓冲盐水溶液稀释的血沉棕层。使用的抗体偶联物为与100nm和200nm磁珠双特异性偶联的CD61和CD15抗体。
在所有三种规模中，红细胞、血小板和粒细胞的去除是等同的。红细胞去除>99％，血小板去除>99％和粒细胞去除>95％。
实施例8：用培养基代替缓冲液的分离
在稀释步骤用RPMI1640细胞培养基代替PBS缓冲液进行分离，从而得到在67％的自体血清和33％的细胞培养液中的细胞悬浮液，这是可直接用于细胞培养分析的构成。在5mL的FACS管中以2mL的规模评估分离，其中使用人全血，200uL的HPMC15原液和与针对CD3、CD4、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61、CD123抗体的抗体混合物偶联的200nm的磁珠。使用RPMI1640细胞培养基和补充0.5％牛血清白蛋白的PBS缓冲液，分离的NK细胞的纯度和产率是等同的。
实施例9：不同患者样品引起的性能变化
使用本发明从10个供体分离NK细胞，并与市售的全血NK细胞分离试剂盒(RosetteSep NK细胞分离试剂盒,Stem Cell Technologies)比较分离性能。
本发明使用由CD61.CD3珠、CD61.CD14珠、CD61.CD15珠、CD61.CD19珠、CD61.CD4珠组成的双特异性抗体磁珠偶联物(200nm直径)的混合物评价，他们全部具有1:19的抗体比率。使用200μl的2％HPMC15原液。试剂孵育15分钟，使用MACSiMAGTM分离器(MiltenyiBiotec)进行20分钟的磁力增强沉降。淋巴细胞中分离的NK细胞的纯度为76.1％±10.2％，与使用Rosette Sep系统的74.1％±11％相比。NK细胞的产率是66±11％(本发明)相对于44±19％。
NK细胞的纯度和产率相当于或优于市售产品，产率的变异性显著更低。
实施例10：血小板浓度的不相关性
本发明中，对红细胞、血小板和非所需细胞(即非靶白细胞)进行平行耗竭。已经评估了在全血中低或高血小板含量是否影响靶细胞的分离性能和纯度。以200g将血液样品离心10分钟，使红细胞和白细胞成团块并在上清液中留下大部分的血小板。血液样品的上清液或者已被去除或添加到其它样品以降低或提高血小板的浓度。按照实施例1、2和3中所描述的方案进行细胞分离。
靶细胞(NK细胞)的纯度和产率是相同的。因此待处理样品的血小板浓度不影响本发明的分离性能。
实施例11：红细胞聚集试剂
不同量和浓度的红细胞沉降试剂HPMC-15作为NK细胞选择过程的部分进行评估：以2ml规模使用每ml人全血或棕黄层100、200、300、400、500、600ul的2％HPMC15原液。更高浓度的HPMC15降低靶细胞(NK细胞)的产率和提高NK细胞的纯度。2％HPMC15原液的最佳用量为200-250ul/ml全血或血沉棕黄层，从而得到约0.2％HPMC15的终浓度。
使用与200nm磁珠偶联的CD3、CD4、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61和CD123抗体的混合物，将HPMC15与其他红细胞沉降试剂(即葡聚糖T250、葡聚糖T500、PVP360)相比较。所有的组合导致NK细胞的富集，HPMC15产生NK细胞的最高纯度和产率(61.8％纯度和86％产率分别相对于葡聚糖T250、葡聚糖T500和PVP的53.8％、52.0％、49.4％的纯度和63％、63％、66％的产率，图19)。
也比较了在不与抗体偶联磁性颗粒相结合时红细胞聚集试剂。使用HPMC-15血小板含量下降了76％，使用葡聚糖T250仅下降8％，使用葡聚糖T500仅下降13％以及使用PVP下降仅47％。HPMC-15的高血小板去除效率可以协同地与偶联到磁性颗粒的血小板结合抗体(例如CD61)相结合。
实施例12：与抗体间接偶联的颗粒
偶联于第二抗体的抗体识别恒定区或抗体偶联物的荧光染料的磁珠(直径<100nm)加载识别CD3和CD19抗原的第二抗体/抗体偶联物。使用CD3-PE和CD19-PE分别耗竭T细胞和B细胞91.5％和99.1％，使用CD3-APC和CD19-APC为94％和99.9％，使用CD3-FITC和CD19-FITC为95.3％和98.6％，使用CD3和CD19抗体(及抗-IgG磁珠)为94.1％和99.4％，使用CD3-生物素和CD19-生物素分别为88％和98.6％。
与使用直接偶联于磁珠的抗体相比，所有间接分离系统表现出等同的分离性能。
实施例13：使用不同的样品
已经在不同的含红细胞的细胞产品(即白细胞分离收获物、脐带血、骨髓抽吸物)上，使用与200nm磁珠偶联的CD15和CD61抗体评估了本发明。在所有情况下，去除了>99％的粒细胞和>96％的血小板。
使用与200nm磁珠偶联的CD19和CD56抗体，本发明在骨髓抽吸物上评估。除去了99％的B细胞和87％的NK细胞。
已经使用与100nm磁珠偶联的CD61和CD15抗体以及与100nm磁珠偶联的CD61和CD19抗体在来自全血的血沉棕黄层制剂对本发明进行评估。除去了99.7％的血小板和97％的粒细胞以及99.4％的血小板和97％的B细胞。
因此，本发明可以成功地用于如全血、血沉棕黄层制剂、白细胞分离收获物、脐带血和骨髓抽吸物的样品，但不限于这些样品。本发明可以用于含有红细胞和其他细胞成分的任何样品。这样的样品也可以是人工产生的，例如通过向最初不包含红细胞的样品(如细胞培养基)中添加红细胞。
实施例14：无离心的Rosette sep原理
为了评估本技术在没有离心步骤的情况下是否可用于直接从全血分离细胞，根据美国专利6,872,567B2中所提供的实施例使用葡聚糖或HPMC15作为红细胞聚集试剂评估了红细胞玫瑰花结法(RosetteSep，Stem Cell Technologies)。将RosetteSep单核细胞分离混合物与5ml来自人全血的血沉棕黄层以及葡聚糖T500或HPMC15一起孵育10分钟。红细胞不沉降，虽然他们在没有抗体混合物的对照实验中沉降。
以50×g将细胞悬浮液离心5分钟。回收上清液，并通过流式细胞术分析。单核细胞分别从8.92％富集至37.9％(葡聚糖)和35.2％(HPMC)，产率为28.3％/11.5％，相比于使用采用Ficoll方法的试剂盒时供应商提供的参考值71±9％的纯度和57±23％的产率。
红细胞沉降和红细胞的非靶细胞玫瑰花结的结合在没有离心的情况下完全没有作用且在离心后没有提供足够的分离性能。
实施例15：有与无CD235a抗体的全血分离方法
抗体的混合物(见实施例3，特异性见实施例21)与磁性颗粒(>200nm)偶联，并按照实施例1、2和3中提供的方案使用，并且将分离性能与其中CD235a(GlycophorinA)抗体与同种磁性颗粒偶联和在第二步中使用以进一步降低红细胞含量或与偶联的抗体混合物结合的试验相比较。通过加入CD235a偶联物并没有显著改善分离的NK细胞的纯度(94.2％对92.8)。最后的细胞制备物中的红细胞含量只降低44％(4.6E+06RBC对8.2E+06，即初始数值的0.073％对0.130％)。与此相反，通过在第二步中耗减CD235a阳性红细胞可以将红细胞含量降低到检测限以下。即添加CD235a偶联珠对于获得高纯度不是必要的，且不足以完全除去红细胞。完全去除红细胞可以通过在第二分离步骤中使用CD235a磁珠来实现。
实施例16：冻干试剂与液体试剂
根据本发明配制了NK细胞分离试剂盒(见实施例21)。试剂保存在4℃，在冷冻后在-70℃下或者利用本领域已知的补充剂和方法冻干。用0.75x的磷酸盐缓冲盐水重构冻干试剂。根据本发明的组合物用于NK细胞分离。NK细胞分别被纯化至90％、92％、90％纯度，分别具有72％、71％、83％的产率(见图10)。
实施例17：用不同的缓冲液重构的冻干试剂
根据本发明配制了NK细胞分离试剂盒(见实施例21)。试剂已经利用本领域已知的补充剂和方法冻干。用0.75x的磷酸盐与不同的补充剂重构冻干的试剂：
-0.3125％的BSA/0.75％的HPMC
-0.3125％的BSA/0.75％的HPMC/0.03％的Pluronic/0.05％叠氮化钠
-0.75％的HPMC/0.03％的Pluronic/0.05％叠氮化钠
-0.75％的HPMC/0.03％的Pluronic
-0.75％的HPMC/缓冲盐水。
根据本发明的组合物已用于NK细胞分离。NK细胞纯化至87-88％的纯度，产率为63-71％(见图11)。
实施例18：外周血单核细胞试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD15和CD61的抗体偶联。抗体珠偶联物用人全血滴定并且测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光染料偶联抗体的组合，在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)上分析分离的外周血单核细胞。
实施例19：B细胞试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD2、CD14、CD15、CD36、CD43、CD56、CD61和aIgE的抗体偶联。抗体珠偶联用人全血滴定并且测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光染料偶联抗体的组合在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)上分析分离的B细胞。
实施例20：T细胞试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE的抗体偶联。抗体珠偶联物用人全血滴定并测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光染料偶联抗体的组合在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)中分析分离的T细胞。
实施例21：NK细胞试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD3、CD4、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61、CD123、CD193、aIgE、aTCRab的抗体偶联。抗体珠偶联物用人全血滴定并且测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光染料偶联抗体的组合在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)上分析分离的NK细胞。
实施例22：单核细胞试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD3、CD7、CD15、CD19、CD56、CD61、CD123、CD193、CD304、CD335、aIgE的抗体偶联。抗体珠偶联物用人全血滴定并且测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光染料偶联抗体的组合在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)上分析分离的单核细胞。
实施例23：T辅助细胞试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD8、CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRg/d的抗体偶联。抗体珠偶联物用人全血滴定并且测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光染料偶联抗体的组合在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)上分析分离的T辅助细胞。
实施例24：细胞毒性T细胞的试剂盒组合
磁性颗粒(实施例4)与识别CD4、CD11b、CD14、CD15、CD19、CD36、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRg/d的抗体偶联。抗体珠偶联物用人全血滴定并且测定最佳浓度。磁珠抗体偶联物以先前确定的量与混合物合并。
向1.5mL的人全血加入抗体混合物，混合，在MACSmixTM管混旋器(Miltenyi BiotecGmbH)中孵育5分钟，并放置在磁体(图17)中8分钟。通过移液将上清液回收到新管中。使用荧光偶联抗体的组合在MACSquant Analyzer流式细胞计数器(Miltenyi Biotec)上分析分离的细胞毒性T细胞。
实施例25：两参数分选
按照实施例18使用所公开的发明从20mL人全血中分离外周血单核细胞。用300×g离心步骤洗涤分离的外周血单核细胞并施加到平衡的MACS LS柱(Miltenyi Biotec)上。收集穿流物，计数细胞和根据制造商(Miltenyi Biotec GmbH)的说明使用CD19微珠在100ul中磁性标记1E7白细胞。使用MACS MS柱将B细胞纯化至81.2％的纯度，产率为79.8％。为进行比较，使用本发明根据实施例18分离外周血单核细胞。使用MACS B细胞分离试剂盒将1E7分离的外周血单核细胞在100ul中磁性标记。B细胞已被纯化至89.7％，产率为95％。
实施例26：沉降速度
通过测定可被除去的上清液的体积对补充有红细胞聚集溶液(HPMC-15)或者红细胞聚集溶液和与单克隆抗体的混合物(CD3、CD14、CD15、CD19、CD36、CD61、CD123、抗IgE)偶联的不同大小的(50nm、200nm、3500nm)磁珠的人全血的沉降速度进行了评估。令人惊讶的是，与仅使用红细胞聚集溶液(HPMC)时的8.5分钟相比，HPMC-15和200nm大小的抗体偶联磁珠的组合导致在3分钟内红细胞的完整沉降。当使用较小或较大的磁珠时，沉降较慢。图18示出了实验的结果。
实施例27：CD36偶联的磁珠的使用
通过本发明，使用HPMC-15和与CD4、CD11b、CD14、CD15、CD19、CD56、CD61、CD123、aIgE、aTCRg/d抗体偶联的单特异性磁性颗粒(220nm)的混合物，将2.5ml全血用于分离CD8阳性细胞毒性淋巴细胞。将CD36抗体偶联的磁珠添加到混合物中或者混合物在不添加CD36抗体的情况下使用。使用无CD36抗体偶联颗粒的方法可以回收2.4mL的上清液，其含有73％的初始量的CD8阳性细胞，纯度为80.4％。团块形状如图13中所描绘，在沉降的团块和上清液相之间提供平坦界面。当使用CD36抗体偶联磁性颗粒时，沉降的团块的指数形状(exponential shape)(图14)允许回收较大体积的上清液(2.6ml；+8％)，产率增加至78％，纯度为80.7％。
实施例28：比较磁体设计
使用本发明(以1:1比率的与200nm磁性颗粒偶联的CD61和CD15抗体，用4mL的含HPMC-15的缓冲液进行稀释)结合不同的磁体，将8ml来自全血的血沉棕黄层去除红细胞、血小板和粒细胞。MACSiMAG分离器耗减99.1％的粒细胞和99.2％的血小板，磁性水箱玻璃清洁器分别为97.6％和98.7％，具有U形磁轭的3个磁体的设计分别为99.7％和98.0％，SensScreen磁体分别为96.7％和98.6％。
使用1ml的全血、含HPMC-15的PBS缓冲液、由与240nm磁性颗粒偶联的非NK细胞结合抗体组成的NK细胞分离试剂盒，将根据图17的磁体与MACSiMAG分离器相比较。血液与试剂孵育5分钟，沉降时间为8分钟。使用根据图17的磁体，NK细胞被纯化至81％的纯度，产率为67％，而使用MACSiMAG分离器NK细胞被纯化至77.6％的纯度，产率为66％。
实施例29：用50nm的磁性颗粒耗竭B细胞
将识别B细胞上的CD19的单克隆抗体与磁珠(实施例4，平均直径50nm，MicroBeads，Miltenyi Biotec)偶联。将珠偶联的抗体加入1.3ml的来自全血的血沉棕黄层、0.7ml的PBS缓冲液和200微升的HPMC15原液中。B细胞未充分耗减，超过75％的B细胞保留在样品中(见图12)。

Claims (7)

1.一种用于从含有所需细胞、红细胞和不需要的细胞的样品中富集和/或回收所需细胞的方法，包括：
a)将所述样品与组合物接触，其中所述组合物包含：
i)红细胞聚集试剂，
ii)至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分，其中具有所述至少一种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于一种或多种的不需要的细胞成分特异性的至少一种抗原；
b)对所述样品同时应用
i)用于红细胞沉降的重力沉降；和
ii)磁场梯度以用于固定所述磁性颗粒，从而产生沉淀和上清液相，并
c)从所述上清液相回收所需的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述组合物另外包含iii)一种或多种的修饰所述所需细胞的细胞修饰剂。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述颗粒的大小在100nm至1400nm之间。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述组合物包含识别红细胞的细胞表面上的抗原，且还识别在至少一种其它的不需要的细胞成分的细胞表面上的抗原的所述至少一种抗原识别部分，且其中所述组合物不包含仅识别红细胞的细胞表面蛋白的抗原识别部分。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述红细胞聚集试剂选自于羟乙基淀粉、甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述至少一种与磁性颗粒偶联的抗原识别部分是抗体。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述颗粒与两种或更多种抗原识别部分偶联，并且其中具有所述两种或更多种抗原识别部分的所述颗粒特异性地结合对于不同的不需要的细胞成分特异性的至少两种抗原。
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