CN105241728B - 一种人糖化血红蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人糖化血红蛋白的制备方法，包括以下步骤：从血液样品中提取红细胞，对所得红细胞进行洗涤，释放红细胞中的血红蛋白，对所得血红蛋白进行分离纯化，即可。现有技术很难获得高纯度糖化血红蛋白，并且存在回收率低和通量低的不足。本发明以成人健康志愿者和糖尿病患者的血液样本为原料，采用自由流等电聚焦模式高效制备。本发明方法可以得到纯度达96％以上的人糖化血红蛋白，并且人糖化血红蛋白的回收率可达到98％以上，比文献报道提高近30％。本发明具有很大的市场前景，制备的人糖化血红蛋白可以作为糖尿病检测标准品、制备多克隆抗体和单克隆抗体的抗原等。

Description

一种人糖化血红蛋白的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种人糖化血红蛋白的制备方法，特别涉及到高效制备人糖化血红蛋白的方法。
背景技术
人糖化血红蛋白(HbA1c)是指人红细胞中血红蛋白的糖基化部分，是血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。它是由血液中葡萄糖附着在红细胞的血红蛋白上形成的，其与血中葡萄糖的含量高低呈正相关关系,血糖水平越高,附着葡萄糖的血红蛋白就越多，糖化血红蛋白水平也就越高。HbA1c可以间接反映血糖浓度的改变,同时也反映了机体糖代谢的状态。人体内的红细胞寿命为120天，在这120天内，血红蛋白不断与糖结合而生成HbA1c,并且这种结合在2周内成为不可逆反应，HbA1c趋于稳定,因此HbA1c可以反映病人在抽血前6-8周的平均血糖水平。HbA1c是糖尿病诊断新标准和治疗监测的“金标准”。
现有的提取人糖化血红蛋白的方法存在回收率、蛋白纯度以及制备通量较低等不足，比如采用非固定化胶条与聚丙烯酰胺等电聚焦的融合技术分离纯化HbA1c，回收率只有73.15％，纯度只能达到69.27％，离子交换层析分离提取HbA1c，纯度也只能达到79.78％。而自由流等电聚焦技术恰好弥补了这些不足，可以得到纯度达96％以上的人糖化血红蛋白，并且人糖化血红蛋白的回收率可达到98％以上，并可以实现连续分离纯化，显著提高了制备通量。
自由流电泳(Free flow electrophoresis，FFE)是一种兼具制备和分析功能的纯液相电泳技术，具有分离条件温和，回收率高，可连续分离的优点。Hanning于1961对FFE的工作原理进行了如下描述：背景缓冲液从装置入口端连续不断注入一个由两块平行板所构成的薄层分离腔内，在垂直于液流方向的电场的作用下，各组分根据其在电场中不同的电泳淌度而发生不同偏移，最后被分开的组分在出口端被连续不断的收集起来以备进一步分析(Hanning,K.,Fresenius J.Anal.Chem.1961,181(1),244-254.)。相较Hanning最初的定义，FFE经过几十年的发展，其形式更加多样，技术也更加成熟。FFE根据分离原理不同，可分为自由流区带电泳、自由流等电聚焦电泳、自由流等速电泳和自由流场梯度电泳。自由流等电聚焦电泳是目前FFE应用最广泛，分离效率最高的分离模式(Burggraf,D.,Weber,G.,Lottspeich,F.,Electrophoresis 1995,16,1010–1015.)。其基本原理就是在分离腔内分布着由一系列不同pH值构成的梯度缓冲体系，当带电物质移动到与其等电点相近的位置时由于其净电荷此时变为零而停止运动，各样品组分于是按照各自不同的等电点而在分离腔中不同的pH梯度处停下来并形成聚焦，整个聚焦分离过程结束后，分开的样品将随载体电解质缓冲液从不同的出口流出并被收集检测。
本发明使用连续式自由流等电聚焦电泳装置即通用型连续式自由流电泳装置高效制备人糖化血红蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种人糖化血红蛋白的制备方法，特别是一种操作简单，回收率高，纯度高的人糖化血红蛋白的制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种人糖化血红蛋白的制备方法，包括以下步骤：从血液样品中提取红细胞，对所得红细胞进行洗涤，释放红细胞中的血红蛋白，对所得血红蛋白进行分离纯化，即可。
优选地，所述血液样品取自成人健康志愿者或糖尿病患者。
优选地，所述洗涤具体采用生理盐水；
所述洗涤的具体操作为：用生理盐水悬浮红细胞，离心弃上清，重复操作至上清液无色。
进一步地，所述离心的条件为4℃、2000-3000g、5-20min；所述重复操作的次数为3-5次。
优选地，所述释放红细胞中的血红蛋白包括对所述红细胞进行裂解、重悬得到血红蛋白浆液的步骤，和对所述血红蛋白浆液进行离心取上清得到血红蛋白溶液的步骤。
优选地，对所述红细胞进行裂解、重悬得到血红蛋白浆液的步骤具体为用超纯水对所述红细胞进行裂解、剧烈重悬5-10min，再用CCl4重悬2-5min。
优选地，所述离心的条件具体为4℃、8000-10000g、10-20min。
优选地，所述分离纯化具体采用自由流等电聚焦分离纯化。
优选地，所述自由流等电聚焦分离纯化的两性电解质pH范围是6-8。
优选地，所述自由流等电聚焦分离纯化的具体操作为：先控制恒定功率10-25W，60-120min；然后再调整为恒压800-1100V，60-120min，整个过程控制温度为4℃，若温度高于4℃，则会加速糖化血红蛋白的降解，进而影响分离纯化效果。
优选地，所述自由流等电聚焦分离纯化的阳极缓冲液为100mM H3PO4、阴极缓冲液为100mM NaOH
优选地，所述阳极缓冲液、阴极缓冲液中含有10％(v/v)甘油，3％(v/v)两性电解质(pH 6-8)，0.03％(w/v)羟丙基甲基纤维素。
优选地，所述自由流等电聚焦分离纯化的两性电解质pH范围是6-8，pH范围过宽或过窄都会影响糖化血红蛋白的等电聚焦效果，进而影响分离纯化结果。
优选地，所述自由流等电聚焦分离纯化的两性电解质购买于上海伯楷安生物科技有限公司，货号为CA-6-8。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明提供了一种操作简单，回收率高，纯度高的人糖化血红蛋白的制备方法。本发明方法只需一步等电聚焦即可获得高回收率、高纯度的糖化血红蛋白，大大缩减了人力和物力成本。本发明方法可以使人糖化血红蛋白的回收率高达98％以上，并且得到的人糖化血红蛋白的纯度达96％以上。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为图1是HiCN标准曲线示意图；图1中氰化高铁血红蛋白(HiCN)比色法试剂盒购买于上海荣盛生物药业有限公司，批准文号：沪食药监械(准)字2009第2400300号；
图2是分离纯化后的HbA1c的SDS-PAGE图；
其中，图2中C是购买的商品化糖化血红蛋白，S是自由流等电聚焦分离纯化后的糖化血红蛋白；
图3是HPLC对分离纯化后的HbA1c的检测；
其中，1是HbAl(a+b)，2是HbA1c，3是HbA0。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明在实施过程中，如图1所示的糖化血红蛋白的标准曲线建立方法参照氰化高铁血红蛋白(HiCN)比色法试剂盒，该试剂盒购买于上海荣盛生物药业有限公司，批准文号：沪食药监械(准)字2009第2400300号。
实施例1、提取红细胞
采集成人健康志愿者和糖尿病患者的血液样本，在4℃，2000-3000g离心5-20min，弃上清，保留下层压积红细胞。
实施例2、生理盐水洗涤
用0.9％生理盐水缓慢重悬红细胞，在4℃，2000-3000g离心5-20min，弃上清保留下层压积红细胞，重复上述步骤3-5次，直至上层清液基本无色。
实施例3、血红蛋白释放
取一定量的压积红细胞，加入1-2ml灭菌的超纯水，剧烈重悬5-10min；再加入0.5-1ml CCl4,重悬2-5min，在4℃，8000-10000g离心10-20min，上清即为血红蛋白溶液。
实施例4、分离纯化糖化血红蛋白
使用自由流等电聚焦分离纯化糖化血红蛋白，过程中先控制恒定功率10-25W，60-120min；然后再调整为恒压8000-1100V，60-120min,整个过程控制温度为4℃。分别用100mMH3PO4和100mM NaOH作为阳极缓冲液和阴极缓冲液，背景缓冲液含有10％(v/v)甘油,3％(v/v)两性电解质(pH 3-10),0.03％(w/v)羟丙基甲基纤维素。收集含目标蛋白的组分，结果见表1。
表1是糖化血红蛋白的回收率
实施例5、糖化血红蛋白的纯度检测
自由流等电聚焦分离纯化后的HbA1c分别经SDS-PAGE(结果见图2)和HPLC检测(结果见图3和表2)。
表2是HPLC对分离纯化后的HbA1c的检测结果
1 3.846min 1.34％
2 15.121min 96.70％
3 22.685min 1.96％
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：从血液样品中提取红细胞，对所得红细胞进行洗涤，释放红细胞中的血红蛋白，对所得血红蛋白进行分离纯化，即可；
所述分离纯化具体采用自由流等电聚焦分离纯化；所述自由流等电聚焦分离纯化的两性电解质pH范围是6-8；
所述自由流等电聚焦分离纯化的具体操作为：先控制恒定功率10-25W，60-120min；然后再调整为恒压800-1100V，60-120min，整个过程控制温度为4℃；
所述自由流等电聚焦分离纯化的阳极缓冲液为100mM H3PO4、阴极缓冲液为100mMNaOH。
2.根据权利要求1所述的人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述洗涤具体采用生理盐水。
3.根据权利要求2所述的人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述洗涤的具体操作为：用生理盐水悬浮红细胞，离心弃上清，重复操作至上清液无色。
4.根据权利要求1所述的人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述释放红细胞中的血红蛋白包括对所述红细胞进行裂解、重悬得到血红蛋白浆液的步骤，和对所述血红蛋白浆液进行离心取上清得到血红蛋白溶液的步骤。
5.根据权利要求4所述的人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，对所述红细胞进行裂解、重悬得到血红蛋白浆液的步骤具体为：用超纯水对所述红细胞进行裂解、剧烈重悬5-10min，再用CCl4重悬2-5min。
6.根据权利要求4所述的人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述离心的条件具体为4℃、8000-10000g、10-20min。
7.根据权利要求1所述的人糖化血红蛋白的制备方法，其特征在于，所述阳极缓冲液、阴极缓冲液中含有体积百分比为10％甘油，体积 百分比为3％两性电解质，重量体积比为0.03％羟丙基甲基纤维素。
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