CN108503864A - 一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人β2‑微球蛋白聚合物的制备方法，其中，所述方法包括：制备具有天然活性的重组人β2‑微球蛋白；将所述具有天然活性的重组人β2‑微球蛋白在第一缓冲液中透析；加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2‑微球蛋白聚合物。本发明所提供的制备方法简单，工艺成本低，且稳定性好，大大降低了生产、研发、检测的成本，为生产、研发、检测等方面对于具有天然活性的重组人β2‑微球蛋白及其聚合物的应用带来便利条件。

Description

一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法。
背景技术
β2-微球蛋白(β2-MG)是一种小分子量(约12kD)的蛋白质，它由人体的淋巴细胞、单核细胞、间质细胞以及部分上皮细胞合成。合成后的β2-MG作为主要组织相容性抗原(HLA)的轻链广泛存在于除红细胞和胎盘滋养层细胞以外的其它多种细胞的细胞膜上，血液中半衰期为40min，正常人体每日产生100-200mg，其血中浓度相当稳定，约为2mg/L。尽管β2-MG的变化无特异性，但检测体液中β2-MG，对一些疾病例如白血病、肺癌、肝癌、鼻咽癌和肾脏疾病的筛选、诊断以及疾病程度、治疗效果和预后的评价，有一定意义。
此外，β2-微球蛋白作为一种中分子物质，是体外评价透析器性能的重要试剂，随着高通量透析器及血液滤过器在国内的普及范围不断扩大，使用频率不断增加，高通量透析器及血滤器的品牌和种类也越来越多。作为评价透析器体外性能的重要试剂β2-微球蛋白的需求量也不断增加。但由于来源有限，生产工艺比较复杂等原因，造成β2-微球蛋白的价格十分昂贵。
目前，β2-MG含量的测定时所采用的β2-MG的校准品常常为冻干粉，需要添加生理盐水现配现用。校准品经生理盐水多次稀释后稳定性很差，无法长期存放，下次定标时需重新进行配制，费时费力，且价格昂贵、浪费严重。另外，由于β2-微球蛋白的稳定性很差，在医疗诊断行业，为了获得β2-微球蛋白的抗体，需要采用稳定性更好的β2-微球蛋白作为免疫原来免疫。
目前，获得β2-微球蛋白的途径主要是天然提取和基因工程，天然提取的β2-微球蛋白来源有限，且患者尿液或体液中β2-微球蛋白的半衰期短，因此，天然β2-微球蛋白的制备成本高昂。总之，现有的β2-微球蛋白价格昂贵，制备工艺复杂且稳定性差，给生产、研发、检测的带来了居高不下的成本问题。
发明内容
本发明提供一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，以解决现有的人β2-微球蛋白及其聚合物的价格昂贵，制备方法复杂且稳定性差的问题。
为解决上述问题，本发明提供一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，包括：
制备重组人β2-微球蛋白；
将所述重组人β2-微球蛋白在第一缓冲液中透析；
加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2-微球蛋白聚合物。
优选地，所述“加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2-微球蛋白聚合物”，包括：
将透析的所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白与所述交联剂按照体积比为10μL：15mL的比例混合，在室温条件下反应30分钟，得到反应物；
在所述反应物中加入第二缓冲液，室温放置15分钟终止所述交联反应，得到所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白聚合物。
优选地，所述第一缓冲液为pH7.8的PBS缓冲液；
所述第二缓冲液为终浓度是50mM的pH8.8的Tris-HCl缓冲液。
优选地，所述“制备具有天然活性的重组人β2-微球蛋白”包括：
获取重组人β2-微球蛋白的基因序列并根据所述基因序列构建重组表达质粒，将所述重组表达质粒进行酶切得到目的序列，将切出的目的序列连入原核表达载体中，转化表达宿主细胞，得到所述表达质粒菌株；
对所述表达质粒菌株进行原核表达，得到蛋白上清液；
纯化所述蛋白上清液，得到纯化重组蛋白；
将所述纯化重组蛋白用第三缓冲液透析，按照预设质量比例加入肽链内切酶在23-28℃条件下进行酶切6-8小时，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
优选地，所述原核表达载体为pET-32a原核表达载体；
所述表达宿主细胞为大肠杆菌Origami B DE3。
优选地，所述肽链内切酶为重组人肠激酶。
所述预设质量比例为具有天然活性的重组人β2-微球蛋白：重组人肠激酶＝50：1-100：1。
优选地，所述第三缓冲液为pH8.0的肠激酶酶切缓冲液；
所述肠激酶酶切缓冲液包括50mM Tris和1mM CaCl。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种具有天然活性的重组人β2-微球蛋白诊断试剂盒，包括具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物制备的标准品。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种如上述所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物在单克隆抗体的应用。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种如上述所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物在制备多克隆抗体的应用，包括：
基于免疫动物，以具有天然活性的重组人β2-微球蛋白和重组人β2-微球蛋白聚合物作为免疫原进行免疫，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白多克隆抗体。
本发明提供一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法。其中，所述方法通过对具有天然活性的重组人β2-微球蛋白透析并进行交联反应，从而得到重组人β2-微球蛋白聚合物。本发明所提供的制备方法简单，工艺成本低，且稳定性好，大大降低了生产、研发、检测的成本，为生产、研发、检测等方面对于具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物的应用带来便利条件。
附图说明
图1为本发明具有天然活性的重组人β2-微球蛋白标准品评价结果；
图2为本发明具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物免疫制备的兔多抗和天然蛋白免疫制备的兔多抗测定标准曲线对比图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面结合具体实施例的方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明，但并不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围之内。
本发明提供一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，包括：
制备具有天然活性的重组人β2-微球蛋白；
上述，需要理解的是，β2微球蛋白是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，分子质量为11800，由99个氨基酸组成的单链多肽。它是细胞表面人白细胞抗原(HLA)的β链(轻链)部分，分子内含一对二硫键，不含糖；与免疫球蛋白稳定区的结构相似。广泛存在于血浆、尿液、脑脊液、唾液以及初乳中。正常人β2-微球蛋白的合成率及从细胞膜上的释放量相当恒定，β2-微球蛋白可以从肾小球自由滤过，99.9％在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中分解破坏；故而正常情况下β2-微球蛋白的排出是很微量的。
上述，需要理解的是，广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。在本实施例中，原核表达为对表达质粒菌株进行的基于构建表达载体并导入该菌株的方法。
上述，在本实施例中，具有天然活性的重组人β2-微球蛋白可以包括如下步骤：
获取重组人β2-微球蛋白的基因序列并根据所述基因序列构建重组表达质粒，得到所述表达质粒菌株；
对所述表达质粒菌株进行原核表达，得到蛋白上清液；
纯化所述蛋白上清液，得到纯化重组蛋白；
将所述纯化重组蛋白进行酶切，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
通过上述步骤，最终得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
将所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白在第一缓冲液中透析；
上述，需要说明的是，透析(dialysis)是通过小分子经过半透膜扩散到水(或缓冲液)的原理，将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。
加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2-微球蛋白聚合物。
上述，需要说明的是，交联剂又称作架桥剂，是聚烃类光致抗蚀剂的重要组成部分，这种光致抗蚀剂的光化学固化作用，依赖于带有双感光性官能团的交联剂参加反应，交联剂曝光后产生双自由基，它和聚烃类树脂相作用，在聚合物分子链之间形成桥键，变为三维结构的不溶性物质。
上述，需要理解的是，交联反应是指2个或者更多的分子(一般为线型分子)相互键合交联成网络结构的较稳定分子(体型分子)的反应。这种反应使线型或轻度支链型的大分子转变成三维网状结构，以此提高强度、耐热性、耐磨性、耐溶剂性等性能，可用于发泡或不发泡制品。
本发明提供一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法。其中，所述方法通过对具有天然活性的重组人β2-微球蛋白透析并进行交联反应，从而得到重组人β2-微球蛋白聚合物。本发明所提供的制备方法简单，工艺成本低，且稳定性好，大大降低了生产、研发、检测的成本，为生产、研发、检测等方面对于具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物的应用带来便利条件。
优选地，所述“加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2-微球蛋白聚合物”，包括：
将透析的所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白与所述交联剂按照体积比为10μL：15mL的比例混合，在室温条件下反应30分钟，得到反应物；
在所述反应物中加入第二缓冲液，室温放置15分钟终止所述交联反应，得到所述重组人β2-微球蛋白聚合物。
优选地，所述第一缓冲液为pH7.8的PBS缓冲液；
所述第二缓冲液为终浓度是50mM的pH8.8的Tris-HCl缓冲液。
上述，需要说明的是，PBS缓冲液(全称Phosphate Buffered Saline)在医学词汇中表示磷酸盐缓冲液，用于分子克隆及细胞培养。主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。
上述，Tris-HCl缓冲液，中文别名：三(羟甲基)氨基甲烷；氨丁三醇；缓血酸铵；三羟甲基氨基甲烷；Tris，英文名称：Tris(hydroxymethyl)aminomethane。
将上述酶切后的重组蛋白透析至pH7.8的PBS缓冲中，按照蛋白交联剂和待交联蛋白的体积比为20μL：15mL的比例，向重组人β2-微球蛋白样品中加入交联剂葡聚糖硫酸钠，室温反应30min，再加入终浓度为50mM的pH8.8Tris-HCl，室温放置15min来终止交联反应，最终得到重组人β2-微球蛋白聚合物。
优选地，所述“制备具有天然活性的重组人β2-微球蛋白”包括：
获取重组人β2-微球蛋白的基因序列并根据所述基因序列构建重组表达质粒，将所述重组表达质粒进行酶切得到目的序列，将切出的目的序列连入原核表达载体中，转化表达宿主细胞，得到所述表达质粒菌株；
对所述表达质粒菌株进行原核表达，得到蛋白上清液；
纯化所述蛋白上清液，得到纯化重组蛋白；
将所述纯化重组蛋白用第三缓冲液透析，按照预设质量比例加入肽链内切酶在23-28℃条件下进行酶切6-8小时，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
上述，需要理解的是，广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。在本实施例中，原核表达为对表达质粒菌株进行的基于构建表达载体并导入该菌株的方法。
上述，所述蛋白上清液为进行原核表达过程中，对菌株的扩培后的菌液的固液分离后所得到的上清液。
上述，需要理解的是，酶切是对粘末端的DNA分子和载体分子进行切割，以获得相应的粘末端连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。
上述，对蛋白上清液的纯化可以为多种不同的纯化方法，例如使用葡聚糖凝胶、高速逆流色谱、固相萃取小柱、高效液相色谱法、或者通过层析仪进行层析梯度洗脱等方法。
优选地，所述原核表达载体为pET-32a原核表达载体；
所述表达宿主细胞为大肠杆菌Origami B DE3。
优选地，所述肽链内切酶为重组人肠激酶。
所述预设质量比例为具有天然活性的重组人β2-微球蛋白：重组人肠激酶＝50：1-100：1。
优选地，所述第三缓冲液为pH8.0的肠激酶酶切缓冲液；
所述肠激酶酶切缓冲液包括50mM Tris和1mM CaCl。
在本实施例中，通过DNA序列数据库中找出目标的基因序列，即为人β2-微球蛋白的基因序列，从而建立人β2-微球蛋白的基因数据，并且利用计算机软件对其进行分析，并设计重叠PCR引物人工合成人β2-微球蛋白基因，从而得到目的片段。
上述，需要说明的是，DNA序列数据库可以包括但不限于Genbank、EMBL、DDBJ等等包含已知DNA序列数据的数据库。其中，GenBank是美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，主要是科研人员直接提供或来源于大规模基因组测序计划。在本实施例中，所使用的DNA序列数据库为Genbank。
其中，所获得的目标的基因序列的氨基酸序列为：
MSRSVALAVLALLSLSGLEAIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM。
合成目的片段后，用上下游引物进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段经回收之后，用BamHI和EcoRI酶切，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的克隆载体pMD19-T上，转化大肠杆菌，挑取单克隆，PCR鉴定正确的单克隆的阳性质粒，提取该质粒进行酶切鉴定。将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒测序鉴定。将测序正确的质粒用BamHI和EcoRI进行酶切，切出的目的序列连入用相同酶酶切过的pET-32a载体中，构建原核表达质粒pET-32a-BMG，转化表达宿主Origami B，得到重组质粒的表达质粒菌株，备用。
上述，表达宿主细胞为能够表达所述重组β2-微球蛋白表达质粒的宿主细胞，且具有可帮助表达蛋白二硫键形成和增加可溶性的特征，优选表达宿主细胞为大肠杆菌Origami B(DE3)。
将上述表达质粒菌株扩大培养，再取3μL菌液接种于含100μg/mL氨苄青霉素的500mL LB培养基，置于37度200rpm摇床过夜培养，加入IPTG进行诱导，190rpm，28度低温诱导约4h，4℃5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20mL裂解缓冲液重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，分离上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白为可溶性表达。
上述，IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定。
上述，OD是当光经过一个样本时，部分光会被吸收。在光谱学，透光率是出射光和入射光强度的比。在本实施例中，为紫外光吸收度。
上述表达载体为原核表达载体，且该原核表达载体的融合蛋白标签可利用金属螯合原理亲和纯化重组人β2-微球蛋白，优选原核表达载体为pET-32a。
上述，在本实施例中，对于蛋白上清液的纯化需要进行如下步骤：
将所述蛋白上清液用45％硫酸铵沉淀蛋白，离心收集沉淀，用20mM PBS复溶沉淀，用0.45μm的膜过滤备用；
平衡液的配制：20mM Tris-HCl，200mMNaCl，pH8.0；
洗脱液的配制：20mM Tris-HCl，200mMNaCl，再加入250mM咪唑，pH8.0；
配制好平衡液和洗脱液以后，利用层析仪，先用平衡液清洗平衡Ni-NTA亲和柱，Ni-NTA柱平衡好之后，将待上柱样品上柱结合，结合完之后，再用10倍柱体积的平衡液清洗柱子，然后再用洗脱液进行逐步洗脱，收集洗脱峰，进行SDS-PAGE分析目标蛋白的纯度，结果显示目标蛋白的纯度可达95％以上，采用分光光度法测定蛋白浓度，浓度为5.0-6.0mg/mL。
上述，需要说明的是，发明人通过大量实验发现，采用原核表达方式得到的人β2-微球蛋白，在未经酶切处理时，其活性和免疫原性都比天然人β2-微球蛋白要差很多，无法满足其作为免疫试剂原料的要求。而通过将表达后的人β2-微球蛋白通过肠激酶酶切处理，很好地解决了人β2-微球蛋白活性和免疫原性不足的问题，使其具有与天然人β2-微球蛋白相当的活性水平。
因此，在本实施例中，将上述纯化得到的纯化重组蛋白用肠激酶酶切缓冲液过夜透析，收集透析样品，按重组人β2-微球蛋白与肠激酶的质量比为50:1的比例加入重组人肠激酶，25度水浴酶切8h。酶切后的蛋白上Ni-NTA亲和柱，反向亲和除去带有his标签的切除部分和残留的重组人肠激酶，收集结合完后的流穿蛋白样品，即为最终纯化的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
本实施例中，优选肠激酶，且为重组人肠激酶。所述肠激酶酶切中重组人β2-微球蛋白与肠激酶的质量比为50:1-100:1。酶切条件为23-28℃切割6-8h。
此外，为解决上述问题，本发明还提供一种具有天然活性的重组人β2-微球蛋白诊断试剂盒，包括具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物制备的标准品。
上述，本实施例通过具有天然活性的重组人β2-微球蛋白的制备方法制备得到的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物，进而制备得到诊断试剂用标准品，即为将本发明所提供的方法制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白用适当缓冲液稀释到2-30mg/L的浓度，优选24mg/L，以此标准品按梯度稀释，在2mg/L-24mg/L范围内，线性偏差＜8％。
此外，本发明还提供一种如上述所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物在单克隆抗体的应用。
上述，单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤(hybridoma)抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。在本发明中，通过具有天然活性的重组人β2-微球蛋白进行制备对单一抗原表位的特异性抗体。
此外，本发明还提供一种如上述所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物在制备多克隆抗体的应用，包括：
基于免疫动物，以具有天然活性的重组人β2-微球蛋白和重组人β2-微球蛋白聚合物作为免疫原进行免疫，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白多克隆抗体。
上述，免疫动物可以选用大鼠、大白兔等实验动物，可选用15只进行实验。以然重组人β2-微球蛋白和重组人β2-微球蛋白聚合物作为免疫原进行免疫，对照免疫原可以为人新鲜血清中提取的天然人β2-微球蛋白，各免疫5只。免疫剂量：基础免疫为1.5mg/只，加强免疫剂量为2mg/只。最终，通过多次免疫，实验动物即可获得高效价的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白在制备多克隆抗体。
此外，本发明还提供一种如上述所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白在制备多克隆抗体的应用，包括：
基于免疫动物，以具有天然活性的重组人β2-微球蛋白和重组人β2-微球蛋白聚合物作为免疫原进行免疫，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白多克隆抗体。
上述，免疫动物可以选用大鼠、大白兔等实验动物，可选用15只进行实验。以然重组人β2-微球蛋白和重组人β2-微球蛋白聚合物作为免疫原进行免疫，对照免疫原可以为人新鲜血清中提取的天然人β2-微球蛋白，各免疫5只。免疫剂量：基础免疫为1.5mg/只，加强免疫剂量为2mg/只。最终，通过多次免疫，实验动物即可获得高效价的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白在制备多克隆抗体。
为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例1：
本实施例提供一种具有天然活性的重组人β2-微球蛋白，通过如下制备方法制备而成：
1.重组人β2-微球蛋白基因的获得和表达质粒的构建
首先在Genbank中搜集人β2-微球蛋白的序列，建立人β2-微球蛋白的基因数据，并且利用计算机软件对其进行分析，并设计重叠PCR引物人工合成人β2-微球蛋白基因。
合成目的片段后，用上下游引物进行PCR扩增，扩增获得的PCR片段经回收(上海华舜生物工程有限公司)之后，用BamHI和EcoRI酶切(大连宝生物工程有限公司)，连接到用BamHI和EcoRI酶切之后的克隆载体pMD19-T上，转化大肠杆菌，挑取单克隆，PCR鉴定正确的阳性质粒，提取质粒进行酶切鉴定。
将PCR鉴定和酶切鉴定都正确的质粒送invagen公司测序，结果和设计序列完全一致。将测序正确的质粒用BamHI和EcoRI进行酶切，切出的目的序列连入用相同酶酶切过的pET-32a(Novagen公司)载体中，构建原核表达质粒pET-32a-BMG，转化表达宿主Origami B(DE3)(美国Invitrogen公司)，得到重组质粒的表达菌株，备用。
2.重组人β2-微球蛋白的原核表达
将上述宿主表达菌扩大培养至OD600＝0.6-0.8，再取3μL菌液接种于含100ug/mL氨苄青霉素(上海生工生物工程技术服务有限公司)的500mL LB培养基，置于37度200rpm摇床过夜培养至菌体浓度为OD600＝1.8-2.3，加入IPTG(终浓度为0.5mM)进行诱导，190rpm，28度低温诱导约4h，4℃5000g离心20分钟收集菌体，每升菌液的菌体用20mL裂解缓冲液(50mM Tirs-HCl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl)重悬，超声破碎，4℃12000g离心20分钟，分离上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳鉴定后，大部分目的蛋白为可溶性表达，故保留上清待进行后续纯化。
3.重组人β2-微球蛋白的纯化
将上述上清用45％硫酸铵沉淀蛋白，离心收集沉淀，用20mM PBS复溶沉淀，用0.45μm的膜过滤备用。
平衡液的配制：20mM Tris-HCl，200mM NaCl，pH8.0；
洗脱液的配制：20mM Tris-HCl，200mMNaCl，再加入250mM咪唑，pH8.0；
配制好平衡液和洗脱液以后，利用ATKA purifier层析仪(GE医疗集团)，先用平衡液清洗平衡Ni-NTA亲和柱(Qiagen公司，货号30210)，Ni-NTA柱平衡好之后，将待上柱样品上柱结合，结合完之后，再用10倍柱体积的平衡液清洗柱子，然后再用洗脱液进行逐步洗脱，收集洗脱峰，进行SDS-PAGE分析目标蛋白的纯度，结果显示目标蛋白的纯度可达95％以上，采用分光光度法测定蛋白浓度，浓度为5.0-6.0mg/mL。
4.肠激酶切割重组人β2-微球蛋白
将上述纯化得到的重组蛋白用肠激酶酶切缓冲液(50mM Tris，1mM CaCl，pH8.0)过夜透析，收集透析样品，按重组人β2-微球蛋白与肠激酶的质量比为50:1的比例加入重组人肠激酶，25度水浴酶切8h。酶切后的蛋白上Ni-NTA亲和柱，反向亲和除去带有his标签的切除部分和残留的重组人肠激酶，收集结合完后的流穿蛋白样品，即为最终纯化的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
SDS-PAGE电泳分析，蛋白纯度达95％以上，测定最终蛋白浓度，一般为2.0-2.5mg/mL。
实施例2：
本实施例提供一种重组人β2-微球蛋白聚合物，通过如下制备方法制备而成：
基于上述实施例1中所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白，对所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白透析至pH7.8的PBS缓冲中，按照蛋白交联剂和待交联蛋白的体积比为20μL：15mL的比例，向重组人β2-微球蛋白样品中加入交联剂葡聚糖硫酸钠，室温反应30min，再加入终浓度为50mM的pH8.8Tris-HCl，室温放置15min来终止交联反应，最终得到重组人β2-微球蛋白聚合物。
进一步的，对所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物的活性进行检测，检测方法包括如下：
琼脂板的制备：将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂4mL，倾注于载玻片上，使其自然流成水平面。待琼脂凝固后，用打孔器在中间打一孔，周围对称打6孔，孔径3mm，孔距15mm。
加样：于中央孔加入羊抗人β2-微球蛋白血清(购自MBC)，将未经酶切处理的重组人β2-微球蛋白、酶切处理后的重组人β2-微球蛋白及其聚合物与天然人β2-微球蛋白(人新鲜血清中提取)分别以起始1.0mg/mL，由1:2开始对倍稀释加入周围5孔中，6孔加入生理盐水作对照。
扩散：将琼脂板放入湿盒内置37℃温箱中24h后取出观察结果，具体见表1。
表1pET-32a-BMG酶切前后及其聚合物活性比较
表1结果显示，经肠激酶酶切处理得到的重组人β2-微球蛋白及其聚合物，其抗原活性与天然人β2-微球蛋白一致，即经1:32的比例稀释后仍可见免疫沉淀线；而未经酶切处理的重组人β2-微球蛋白，其抗原活性明显低于天然人β2-微球蛋白和酶切处理后的重组人β2-微球蛋白及其聚合物，可见其免疫沉淀线的稀释倍数仅为1:8。
表2重组人β2-微球蛋白及其聚合物37℃考核后活性比较
在本实施例中，将所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白、重组人β2-微球蛋白聚合物以及对照人β2-微球蛋白分别置于37度考核7天，同时分别与各自的4℃样品进行活性和免疫原性对比，进行免疫双扩散实验，结果如表2所示：重组人β2-微球蛋白聚合物活性保持最好，基本与其4℃对照活性一致，重组人β2-微球蛋白和天然人β2-微球蛋白活性均有所下降。
实施例3：
在本实施例中，利用实施例1中所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及实施例2中所制备的重组人β2-微球蛋白聚合物作为具有天然活性的重组人β2-微球蛋白诊断试剂盒的标准品。
标准品配制方法如下：
取实施例1中制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物，用缓冲液(20mM PB，150mM NaCl，5％BSA，pH7.4)稀释成24mg/L制成标准品。
在本实施例中，分贝对上述标准品进行活性测定和稳定性测定，包括如下方法和结果：
1、在本实施例中，对上述标准品进行活性测定，包括如下步骤：
该标准品做不同梯度稀释后，用Dako人β2-微球蛋白检测试剂盒评价结果。
从图1中可知，具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物的线性趋势重合，且回归方程R2达到0.9999，说明测量值与理论值一致程度高，活性非常接近天然蛋白。
2、在本实施例中，对具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物的标准品进行稳定性的测定，包括如下步骤：
将具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物的标准品分别置于4℃和37℃考察1周，同时采用Dako人β2-微球蛋白检测试剂盒评价各样品活性。
从表3中，可知，具有天然活性的重组人β2-微球蛋白和天然人β2-微球蛋白制备的校准品活性37℃考核1周后活性明显下降，重组蛋白单体下降12.02％，天然蛋白下降12.87％，但重组人β2-微球蛋白聚合物37℃考核1周后活性下降不明显，下降4.43％。
表3具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物制备的诊断标准
品37℃考核后活性比较
实施例4：
本实施例提供一种具有天然活性的重组人β2-微球蛋白的多克隆抗体血清，通过如下方法制备而成：
实验动物：采用15只健康的新西兰大白兔为免疫动物；
实验免疫原、分组及剂量：
免疫原为实施例1所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白和实施例2中的所制备的重组人β2-微球蛋白聚合物本实验；
对照免疫原为人新鲜血清中提取的天然人β2-微球蛋白。
实验分组包括：具有天然活性的重组人β2-微球蛋白组、重组人β2-微球蛋白聚合物组合天然人β2-微球蛋白组；每组各免疫5只；
免疫剂量：基础免疫为1.5mg/只，加强免疫剂量为2mg/只。
免疫的步骤如下：
用稀释液稀释适量免疫原，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，在兔子耳朵上进行静脉注射首免；
2周后，取抗原加弗氏不完全佐剂乳化后背部皮下多点注射，每2周加强免疫一次；从加强免疫第3次开始，在每次免疫后第7天采血检测效价，第5次免疫后，兔子获得了高效价的抗体，重组人β2-微球蛋白聚合物的抗血清滴度为1:243×104，重组人β2-微球蛋白和天然人β2-微球蛋白的抗血清滴度为1:81×104。以此兔多抗配制的人β2-微球蛋白检测试剂比较结果见图2，从图中可以看出，用重组人β2-微球蛋白聚合物制备的兔多抗配制的检测试剂比用重组人β2-微球蛋白和天然人β2-微球蛋白免疫制备的兔多抗具有更高的活性。

Claims (10)

1.一种重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，包括：
制备具有天然活性的重组人β2-微球蛋白；
将所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白在第一缓冲液中透析；
加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2-微球蛋白聚合物。
2.如权利要求1所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，所述“加入交联剂，进行交联反应，得到重组人β2-微球蛋白聚合物”，包括：
将透析的所述具有天然活性的重组人β2-微球蛋白与所述交联剂按照体积比为10μL：15mL的比例混合，在室温条件下反应30分钟，得到反应物；
在所述反应物中加入第二缓冲液，室温放置15分钟终止所述交联反应，得到所述重组人β2-微球蛋白聚合物。
3.如权利要求2所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，
所述第一缓冲液为pH7.8的PBS缓冲液；
所述第二缓冲液为终浓度是50mM的pH8.8的Tris-HCl缓冲液。
4.如权利要求1所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，所述“制备具有天然活性的重组人β2-微球蛋白”包括：
获取重组人β2-微球蛋白的基因序列并根据所述基因序列构建重组表达质粒，将所述重组表达质粒进行酶切得到目的序列，将切出的目的序列连入原核表达载体中，转化表达宿主细胞，得到所述表达质粒菌株；
对所述表达质粒菌株进行原核表达，得到蛋白上清液；
纯化所述蛋白上清液，得到纯化重组蛋白；
将所述纯化重组蛋白用第三缓冲液透析，按照预设质量比例加入肽链内切酶在23-28℃条件下进行酶切6-8小时，得到具有天然活性的重组人β2-微球蛋白。
5.如权利要求4所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，所述原核表达载体为pET-32a原核表达载体；
所述表达宿主细胞为大肠杆菌Origami B DE3。
6.如权利要求4所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，所述肽链内切酶为重组人肠激酶。
所述预设质量比例为具有天然活性的重组人β2-微球蛋白：重组人肠激酶＝50：1-100：1。
7.如权利要求6所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法，其特征在于，所述第三缓冲液为pH8.0的肠激酶酶切缓冲液；
所述肠激酶酶切缓冲液包括50mM Tris和1mM CaCl。
8.一种具有天然活性的重组人β2-微球蛋白诊断试剂盒，其特征在于，包括具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物制备的标准品。
9.一种如权利要求1-7中任一项所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物在单克隆抗体的应用。
10.一种如权利要求1-7任一项所述重组人β2-微球蛋白聚合物的制备方法所制备的具有天然活性的重组人β2-微球蛋白及其聚合物在制备多克隆抗体的应用，包括：
基于免疫动物，以重组人β2-微球蛋白和重组人β2-微球蛋白聚合物作为免疫原进行免疫，得到重组人β2-微球蛋白多克隆抗体。
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