CN114854695A - 提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法 - Google Patents

提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组蛋白领域，具体公开了一种提高β‑2微球蛋白在HEK‑293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：步骤1，活化HEK‑293细胞并传代培养，选择转染细胞；步骤2，往转染细胞中兑入培养液，稀释细胞密度；步骤3，制备转染溶液以及DNA溶液；步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液；步骤5，将转染溶液以及DNA溶液加入至含有细胞的培养液中培养；其中，培养液包括以下组分：葡萄糖；酚红；谷丙氨酸二肽；维生素C；羟乙基哌嗪乙硫磺酸；碳酸氢钠；肌醇；氯化钙；氯化钾；氯化钠；各类氨基酸；丙酮酸钠；壳寡糖；叶酸。本发明具有减少细胞代谢产物的积累、延长重组蛋白表达周期以及提高重组蛋白的表达水平的优点。

Description

提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养 方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白领域，尤其是涉及一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法。
背景技术
目前的蛋白来源一般包括两个方面，一方面是从动物组织中提取分离以及纯化得到的天然蛋白，另一方面则是通过质粒转染使得工程细胞携带有目的蛋白基因片段，再利用细胞培养表达目标蛋白，形成的重组蛋白。
由于重组蛋白的活性和纯度都比天然蛋白的高，而且更易吸收，安全性也更好，目前已经得到了越来越广泛的应用。
重组蛋白的生产流程主要为细胞转染和细胞培养，转染效率是保证产量的前提，但在保证产量的前提下，细胞的生长以及代谢需求会在整个表达周期中不断增大，从而容易导致营养物质以及生长因子大量被消耗，且有毒代谢产物同时会不断积累，导致细胞可能会产生程序性细胞凋亡，进而影响蛋白在宿主细胞中的表达水平。因此，仍有改进的空间。
发明内容
为了提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中的表达水平，本申请提供一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法。
本申请提供一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，采用如下的技术方案：
一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：
步骤1，取HEK-293细胞稀释传代，保证活率≥90％，并取用密度为4-6×106个/mL、存活率大于98％的细胞作为转染细胞；
步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，将细胞密度稀释成3×106个/mL，形成培养基，备用。
步骤3，取4-6mL转染缓冲液与500-505μL转染试剂混匀，形成转染溶液；另取4-6mL转染缓冲液与100-105μg HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA混匀，形成DNA溶液；
步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液，轻轻混匀，并在室温下静置10-12min，形成质粒-载体复合溶液；
步骤5，将步骤4形成的质粒-载体复合溶液逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养；
步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，并每间隔24h添加一次；
其中，所述培养液包括以下浓度的组分：
葡萄糖70-80g/L；
酚红0.001-0.005mg/L；
谷丙氨酸二肽150-200mg/L；
维生素C 10-15mg/L；
羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5-3g/L；
碳酸氢钠100-120mg/L；
肌醇500-520mg/L；
氯化钙15-18mg/L；
氯化钾300-350mg/L；
氯化钠5-7g/L；
L-精氨酸450-470mg/L；
L-天冬氨酸60-70mg/L；
L-谷氨酸200-230mg/L；
L-组氨酸100-110mg/L；
L-异亮氨酸400-420mg/L；
L-赖氨酸450-460mg/L；
L-亮氨酸600-620mg/L；
L-缬氨酸450-460mg/L；
L-脯氨酸300-310mg/L；
丙酮酸钠0.3-0.8mL/L；
壳寡糖1-4mg/L；
叶酸0.05-0.2mg/L。
通过采用特定比例的碳水化合物、无机盐、维生素、微量元素、短肽以及氨基酸等种类的物质作为培养基的营养物质，有利于持续为细胞代谢提供充足的营养物质，从而有利于延长细胞表达周期，使得目的蛋白的表达水平更高；同时，将上述各营养物质维持在一个合适的浓度，还有利于更好地减少细胞代谢废物的产生，从而有利于降低有毒物质的积累，使得目的蛋白的表达时间延长，使得目的蛋白的表达水平更高；另外，通过加入丙酮酸钠、壳寡糖以及叶酸协同，还有利于更好地清除细胞在代谢过程中产生的有毒物质，使得细胞代谢有毒物质的积累减少，从而有利于为细胞的持续生长提供更好的环境，使得细胞密度可达到更大，进而有利于更好地延长目的蛋白的表达周期，使得目的蛋白的表达水平更高。
加入特定比例的羟乙基哌嗪乙硫磺酸以及碳酸氢钠，有利于更好地自动维持培养液的pH平衡，使得培养液在细胞生长以及表达的整个过程中始终处于适宜的pH，从而有利于更好地为细胞代谢以及生长提供更好的环境。
由于L-谷氨酰胺在溶液中会发生降解，且同时又作为细胞代谢的重要能量来源，加入谷丙氨酸二肽，谷丙氨酸二肽在细胞代谢的过程中还会被裂解，并释放L-谷氨酰胺，使得培养基无需加入L-谷氨酰胺，有利于更好地提高培养液的稳定性，同时，还有利于培养液更好地为细胞代谢提供营养物质。
另外，上述特定的培养液配合特定的细胞密度，并在步骤2中直接用培养液稀释细胞密度，有利于更好地为细胞的生长提供足够的生长空间以及充足的营养物质，同时，稀释还不容易造成细胞死亡，不容易对活率造成影响，从而有利于更好地提高转染效率以及目的蛋白的表达水平。
优选的，所述营养添加剂由以下浓度的组分组成：
L-精氨酸450-470mg/L；
L-天冬氨酸60-70mg/L；
L-谷氨酸200-230mg/L；
L-组氨酸100-110mg/L；
L-异亮氨酸400-420mg/L；
L-赖氨酸450-460mg/L；
L-亮氨酸600-620mg/L；
L-缬氨酸450-460mg/L；
L-脯氨酸300-310mg/L；
葡萄糖70-80g/L；
谷丙氨酸二肽20-25mg/L；
大豆水解物3-5g/L；
小麦水解物8-10g/L；
蚕豆水解物7-10g/L。
通过采用特定比例的上述物质协同作为营养物质，有利于更好地与上述培养液协同复配，从而有利于更好地持续为细胞的代谢以及生长提供营养，使得细胞的活性更高，进而有利于更好地延长目的蛋白的表达周期，使得目的蛋白的表达水平提高。
优选的，所述步骤2中，将细胞密度稀释成3×106个/mL后，将转染细胞以及培养液置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养10-12min，形成培养基。
通过先振荡培养转染细胞以及培养液10-12min，有利于转染细胞更好地适应培养液的环境，从而有利于为转染细胞在转染以及表达过程中更好更快地代谢，使得目的蛋白的表达水平更高。
优选的，所述步骤3中的转染试剂为阳离子聚合物转染试剂。
优选的，所述转染试剂为STF02的Sinofection转染试剂。
通过采用特定的转染试剂与上述培养液配合，有利于更好地提高细胞的转染效率，从而有利于更好地为后续的目的蛋白表达提供更好的基础，使得最后的目的蛋白的表达水平更高。
优选的，所述步骤1中，先将HEK-293细胞置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及120r/min的条件下震荡培养，并选择密度为3-6×106个/mL且活率大于90％的细胞进行传代培养。
通过在细胞复苏的过程中选择特定密度的高活率细胞进行传代培养，有利于更好地提高细胞在传代培养过程中的活率，使得转染细胞的活性更高，从而有利于更好地提高转染效率，进而有利于更好地为后续的表达提供更好的细胞基础。
优选的，所述步骤1中的传代频率为每隔3-4天传代1次。
优选的，所述步骤1中的传代后的细胞密度控制为0.3-0.6×106个/mL。
通过进一步控制传代后的细胞密度以及传代频率，有利于更好地培养出活性更高的转染细胞，从而有利于更好地提高转染效率，进而有利于更好地为后续的表达提供更好的细胞基础。
优选的，所述步骤5中的震荡培养的温度为25-28℃。
由于表达产量高的细胞株一般都是利用能量进行代谢而非生长，其生长速率一般也会比较低，通过在低温下培养，有利于更好地限制细胞的生长，同时还不容易对细胞的代谢产生影响，从而有利于更好地提高目的蛋白的表达量，使得目的蛋白的表达水平提高。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、通过采用上述技术方案，有利于更好地为细胞代谢持续提供营养物质，同时，又有利于更好地清除细胞代谢产生的废物以及有毒物质，使得细胞的持续代谢不容易受到影响，从而有利于延长细胞的生命周期，使得细胞生长更好，进而有利于更好地提高目的蛋白在细胞中的表达水平。
2、通过采用特定比例的碳水化合物、无机盐、维生素、微量元素、短肽以及氨基酸等种类的物质作为培养基的营养物质，有利于持续为细胞代谢提供充足的营养物质，有利于延长细胞表达周期，使得目的蛋白在细胞中的表达水平更高。
3、将上述各营养物质维持在一个合适的浓度，有利于更好地减少细胞代谢废物的产生，从而有利于降低有毒物质的积累，使得目的蛋白的表达时间延长，使得目的蛋白的表达水平更高。
4、通过加入丙酮酸钠、壳寡糖以及叶酸协同，还有利于更好地清除细胞在代谢过程中产生的有毒物质，使得细胞代谢有毒物质的积累减少，有利于为细胞的持续生长提供更好的环境，使得细胞密度可达到更大，有利于更好地延长目的蛋白的表达周期，使得目的蛋白的表达水平更高。
5、加入特定比例的羟乙基哌嗪乙硫磺酸以及碳酸氢钠，有利于更好地自动维持培养液的pH平衡，使得培养液在细胞生长以及表达的整个过程中始终处于适宜的pH，有利于更好地为细胞生长以及表达提供更好的环境。
6、由于L-谷氨酰胺在溶液中会发生降解，且同时又作为细胞代谢的重要能量来源，加入谷丙氨酸二肽，谷丙氨酸二肽在细胞代谢的过程中还会被裂解，并释放L-谷氨酰胺，使得培养基无需加入L-谷氨酰胺，有利于更好地提高培养液的稳定性，同时，还有利于培养液更好地为细胞代谢提供营养物质。
附图说明
图1为本申请实施例1转染培养所得的重组蛋白的电泳图。
其中，从左往右起，第一列(左)为本申请所提供转染方法制得的重组β-2微球蛋白，第二列(中)为市售的重组β-2微球蛋白，第三列(右)为用来标记分子量的标记蛋白。
具体实施方式
以下结合附图以及实施例对本申请作进一步详细说明。
制备例1
一种培养液，由以下浓度的组分组成：
葡萄糖70g/L；酚红0.001mg/L；谷丙氨酸二肽150mg/L；维生素C 10mg/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5g/L；碳酸氢钠100mg/L；肌醇500mg/L；氯化钙15mg/L；氯化钾300mg/L；氯化钠5g/L；L-精氨酸450mg/L；L-天冬氨酸60mg/L；L-谷氨酸200mg/L；L-组氨酸100mg/L；L-异亮氨酸400mg/L；L-赖氨酸450mg/L；L-亮氨酸600mg/L；L-缬氨酸450mg/L；L-脯氨酸300mg/L；丙酮酸钠0.3mL/L；壳寡糖1mg/L；叶酸0.05mg/L。
培养液的制备方法如下：称量葡萄糖70g、酚红0.001mg、谷丙氨酸二肽150mg、维生素C10mg、羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5g、碳酸氢钠100mg、肌醇500mg、氯化钙15mg、氯化钾300mg、氯化钠5g、L-精氨酸450mg、L-天冬氨酸60mg、L-谷氨酸200mg、L-组氨酸100mg、L-异亮氨酸400mg、L-赖氨酸450mg、L-亮氨酸600mg、L-缬氨酸450mg、L-脯氨酸300mg、丙酮酸钠0.3mL、壳寡糖1mg、叶酸0.05mg，加水搅拌至完全溶解，最后加水定容至1L，即得培养液。
制备例2
与制备例1的区别在于：
各组分的浓度不同，具体如下：
葡萄糖80g/L；酚红0.005mg/L；谷丙氨酸二肽200mg/L；维生素C 15mg/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸3g/L；碳酸氢钠120mg/L；肌醇520mg/L；氯化钙18mg/L；氯化钾350mg/L；氯化钠7g/L；L-精氨酸470mg/L；L-天冬氨酸70mg/L；L-谷氨酸230mg/L；L-组氨酸110mg/L；L-异亮氨酸420mg/L；L-赖氨酸460mg/L；L-亮氨酸620mg/L；L-缬氨酸460mg/L；L-脯氨酸310mg/L；丙酮酸钠0.8mL/L；壳寡糖4mg/L；叶酸0.2mg/L。
制备例3
与制备例1的区别在于：
各组分的浓度不同，具体如下：
葡萄糖75g/L；酚红0.003mg/L；谷丙氨酸二肽175mg/L；维生素C 12mg/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸3g/L；碳酸氢钠110mg/L；肌醇510mg/L；氯化钙16mg/L；氯化钾325mg/L；氯化钠6g/L；L-精氨酸460mg/L；L-天冬氨酸65mg/L；L-谷氨酸215mg/L；L-组氨酸105mg/L；L-异亮氨酸410mg/L；L-赖氨酸455mg/L；L-亮氨酸610mg/L；L-缬氨酸455mg/L；L-脯氨酸305mg/L；丙酮酸钠0.5mL/L；壳寡糖2.5mg/L；叶酸0.1mg/L。
制备例4
一种营养添加剂，由以下浓度的组分组成：
L-精氨酸450mg/L；L-天冬氨酸60mg/L；L-谷氨酸200mg/L；L-组氨酸100mg/L；L-异亮氨酸400mg/L；L-赖氨酸450mg/L；L-亮氨酸600mg/L；L-缬氨酸450mg/L；L-脯氨酸300mg/L；葡萄糖70g/L；谷丙氨酸二肽20mg/L；大豆水解物3g/L；小麦水解物8g/L；蚕豆水解物7g/L。
营养添加剂的制备方法如下：称取L-精氨酸450mg、L-天冬氨酸60mg、L-谷氨酸200mg、L-组氨酸100mg、L-异亮氨酸400mg、L-赖氨酸450mg、L-亮氨酸600mg、L-缬氨酸450mg、L-脯氨酸300mg、葡萄糖70g、谷丙氨酸二肽20mg、大豆水解物3g、小麦水解物8g、蚕豆水解物7g，加水搅拌至完全溶解，最后加水定容至1L，即得营养添加剂。
制备例5
与制备例4的区别在于：
各组分的浓度不同，具体如下：
L-精氨酸470mg/L；L-天冬氨酸70mg/L；L-谷氨酸230mg/L；L-组氨酸110mg/L；L-异亮氨酸420mg/L；L-赖氨酸460mg/L；L-亮氨酸620mg/L；L-缬氨酸460mg/L；L-脯氨酸310mg/L；葡萄糖80g/L；谷丙氨酸二肽25mg/L；大豆水解物5g/L；小麦水解物10g/L；蚕豆水解物10g/L。
制备例6
与制备例4的区别在于：
各组分的浓度不同，具体如下：
L-精氨酸470mg/L；L-天冬氨酸70mg/L；L-谷氨酸230mg/L；L-组氨酸110mg/L；L-异亮氨酸420mg/L；L-赖氨酸460mg/L；L-亮氨酸620mg/L；L-缬氨酸460mg/L；L-脯氨酸310mg/L；葡萄糖80g/L；谷丙氨酸二肽25mg/L；大豆水解物5g/L；小麦水解物10g/L；蚕豆水解物10g/L。
对比制备例1
与制备例1的区别在于：
各组分的浓度不同，具体如下：
葡萄糖65g/L；酚红0.001mg/L；谷丙氨酸二肽140mg/L；维生素C 5mg/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸2g/L；碳酸氢钠90mg/L；肌醇480mg/L；氯化钙11mg/L；氯化钾290mg/L；氯化钠3g/L；L-精氨酸420mg/L；L-天冬氨酸50mg/L；L-谷氨酸190mg/L；L-组氨酸90mg/L；L-异亮氨酸390mg/L；L-赖氨酸440mg/L；L-亮氨酸590mg/L；L-缬氨酸440mg/L；L-脯氨酸290mg/L；丙酮酸钠0.2mL/L；壳寡糖0.5mg/L；叶酸0.01mg/L。
对比制备例2
与制备例1的区别在于：
各组分的浓度不同，具体如下：
葡萄糖85g/L；酚红0.01mg/L；谷丙氨酸二肽210mg/L；维生素C 20mg/L；羟乙基哌嗪乙硫磺酸5g/L；碳酸氢钠130mg/L；肌醇530mg/L；氯化钙20mg/L；氯化钾360mg/L；氯化钠10g/L；L-精氨酸480mg/L；L-天冬氨酸80mg/L；L-谷氨酸240mg/L；L-组氨酸120mg/L；L-异亮氨酸430mg/L；L-赖氨酸470mg/L；L-亮氨酸630mg/L；L-缬氨酸470mg/L；L-脯氨酸320mg/L；丙酮酸钠1.0mL/L；壳寡糖5mg/L；叶酸0.3mg/L。
对比制备例3
与制备例1的区别在于：以等量的水替代丙酮酸钠、壳寡糖以及叶酸。
对比制备例4
与制备例1的区别在于：以等量的水替代壳寡糖以及叶酸。
对比制备例5
与制备例1的区别在于：以等量的水替代丙酮酸钠以及叶酸。
对比制备例6
与制备例1的区别在于：以等量的水替代丙酮酸钠以及壳寡糖。
实施例1
一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：
步骤1，将HEK-293细胞置于5％的CO2恒温摇床中，于37℃以及120r/min的条件下震荡培养，随后做细胞计数并观察细胞活率，选择密度为3×106个/mL且活率为95％的细胞进行传代培养。控制传代后的细胞密度为0.3×106个/mL，且每隔4天传代1次，保证传代细胞的活率均达到≥90％。并在传代后的细胞中选用密度为4×106个/mL且存活率大于98％的细胞作为转染细胞。
步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，使得转染细胞被稀释成3×106个/mL，形成培养基，备用。
步骤3，准备两支15mL无菌离心管，在其中一支加入4mL转染缓冲液与500μL转染试剂轻轻混匀，形成转染溶液；在另外一支加入4mL转染缓冲液与100μg HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA轻轻混匀，形成DNA溶液。
步骤4，将转染溶液倒入至DNA溶液中，轻轻混匀，并在室温下静置10min，形成质粒-载体复合溶液。
步骤5，将步骤4形成的质粒-载体复合溶液缓慢逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养。
步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，且每间隔24h添加一次营养添加剂。
在本实施例中，HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA以及HEK-293细胞均为市售购得；培养液采用制备例1制备所得的培养液；营养添加剂采用制备例4制备所得的营养添加剂；转染缓冲液购自珠海恺瑞生物科技有限公司的货号为K03125L的KPM；转染试剂具体为购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司的货号为12347019的293fectin转染试剂。
实施例2
与实施例1的区别在于：
步骤1中，选择密度为6×106个/mL且活率为95％的细胞进行传代培养。控制传代后的细胞密度为0.6×106个/mL，且每隔3天传代1次；并在传代后的细胞中选用密度为6×106个/mL且存活率大于98％的细胞作为转染细胞。
步骤3中，在其中一支无菌离心管中加入6mL转染缓冲液与505μL转染试剂轻轻混匀，形成转染溶液；在另外一支无菌离心管中加入6mL转染缓冲液与105μg HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA轻轻混匀，形成DNA溶液。
步骤4中，静置时间为12min。
在本实施例中，培养液采用制备例2制备所得的培养液；营养添加剂采用制备例5制备所得的营养添加剂。
实施例3
与实施例1的区别在于：步骤5中的震荡培养温度为25℃。
实施例4
与实施例1的区别在于：步骤5中的震荡培养温度为28℃。
实施例5
与实施例1的区别在于：步骤2的具体操作如下：
步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，使得转染细胞被稀释成3×106个/mL，再将转染细胞以及培养液置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养10min，形成培养基，备用。
实施例6
与实施例1的区别在于：转染试剂具体为购自北京义翘神州生物技术有限公司的货号为STF02的Sinofection转染试剂。
实施例7
一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，包括以下步骤：
步骤1，将HEK-293细胞置于5％的CO2恒温摇床中，于37℃以及120r/min的条件下震荡培养，随后做细胞计数并观察细胞活率，选择密度为5×106个/mL且活率为98％的细胞进行传代培养。控制传代后的细胞密度为0.5×106个/mL，且每隔3天传代1次，保证传代细胞的活率均达到≥90％。并在传代后的细胞中选用密度为5×106个/mL且存活率大于98％的细胞作为转染细胞。
步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，使得转染细胞被稀释成3×106个/mL，再将转染细胞以及培养液置于5％的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养12min，形成培养基，备用。
步骤3，准备两支15mL无菌离心管，在其中一支加入5mL转染缓冲液与500μL转染试剂轻轻混匀，形成转染溶液；在另外一支加入5mL转染缓冲液与100μg HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA轻轻混匀，形成DNA溶液。
步骤4，将转染溶液倒入至DNA溶液中，轻轻混匀，并在室温下静置11min，形成质粒-载体复合溶液。
步骤5，将步骤4形成的质粒-载体复合溶液缓慢逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5％的CO2恒温摇床中，并于26℃以及135r/min的条件下震荡培养。
步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，且每间隔24h添加一次营养添加剂。
在本实施例中，HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA以及HEK-293细胞均为市售购得；培养液采用制备例3制备所得的培养液；营养添加剂采用制备例6制备所得的营养添加剂；转染缓冲液购自珠海恺瑞生物科技有限公司的货号为K03125L的KPM；转染试剂具体为购自北京义翘神州生物技术有限公司的货号为STF02的Sinofection转染试剂。
对比例1
与实施例1的区别在于：培养液为市售购得。在本实施例中，具体为购自上海益启生物科技有限公司的货号为A21501的Quacell Wayne293培养基。
对比例2
与实施例1的区别在于：培养液采用对比制备例1制备所得的培养液。
对比例3
与实施例1的区别在于：培养液采用对比制备例2制备所得的培养液。
对比例4
与实施例1的区别在于：培养液采用对比制备例3制备所得的培养液。
对比例5
与实施例1的区别在于：培养液采用对比制备例4制备所得的培养液。
对比例6
与实施例1的区别在于：培养液采用对比制备例5制备所得的培养液。
对比例7
与实施例1的区别在于：培养液采用对比制备例6制备所得的培养液。
实验1
在以上实施例以及对比例的培养液培养6天后，将含有细胞的培养液进行离心，弃去沉淀细胞，取上清液，并采用ELISA实验检测离心所得的上清液的重组β-2微球蛋白的表达量(mg/L)。
以上实验的检测数据详见表1。
表1
重组蛋白表达量(mg/L)
实施例1 98
实施例2 99
实施例3 106
实施例4 104
实施例5 101
实施例6 102
实施例7 110
对比例1 68
对比例2 72
对比例3 75
对比例4 60
对比例5 55
对比例6 65
对比例7 63
根据表1中实施例1与对比例1的数据对比可得，只有采用本申请的特定的培养液与特定的营养添加剂组合使用，才有利于更好地为细胞代谢以及细胞生长持续提供营养物质，从而有利于延长细胞的生命周期，使得细胞的表达周期延长，从而有利于更好地提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中的表达水平。
根据表1中实施例1与对比例2-3的数据对比可得，只有采用特定比例的物质协同复配，才有利于更好地为细胞代谢持续提供营养物质，同时，才有利于更好地清除细胞代谢所产生的废物以及有毒物质，为细胞的生长提供更良好的环境，使得细胞代谢的速度以及废物清除的速度更好地达到平衡，从而为细胞的生长提供更合适的环境，既不容易使得细胞过快生长而影响代谢，又不容易使得环境过于恶劣而导致细胞过早凋亡。
根据表1中实施例1与对比例4-7的数据对比可得，通过加入丙酮酸钠，有利于更好地为细胞代谢提供营养物质，从而使得细胞代谢增多，进而加剧了细胞生长环境的破坏，使得细胞过早凋亡，导致细胞的表达水平降低；通过分别加入壳寡糖以及叶酸，有利于更好地清除细胞代谢所产生的废物以及有毒物质，从而有利于为细胞的生长提供更合适的环境，进而有利于更好地延长细胞的表达周期，使得细胞的表达水平更高；只有同时加入丙酮酸钠、壳寡糖以及叶酸，才有利于更好地调节培养液中的营养物质以及代谢废物的量，使得营养物质以及代谢废物处于一个平衡的状态，从而有利于细胞更好地代谢的同时还有利于细胞更好地生长，使得细胞的表达周期更长，进而使得细胞的表达水平更高。
根据表1中实施例1与实施例3-4的数据对比可得，通过控制培养温度，有利于抑制细胞的生长，使得细胞的代谢更加不容易受影响，从而有利于更好地提高细胞的表达水平。
根据表1中实施例1与实施例5的数据对比可得，通过先震荡培养转染细胞以及培养液的混合液，有利于转染细胞更好地适应培养液的环境，从而有利于更好地提高转染效率，进而有利于进一步地提高细胞的表达水平。
根据表1中实施例1与实施例6的数据对比可得，通过采用特定的转染试剂与本申请特定的培养液以及营养添加剂配合，有利于更好地提高转染效率，从而有利于为后续的细胞表达提供更好的基础，进而有利于提高细胞的表达水平。
以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，取HEK-293细胞稀释传代，保证活率≥90%，并取用密度为4-6×106个/mL、存活率大于98%的细胞作为转染细胞；
步骤2，直接往转染细胞中兑入培养液，将细胞密度稀释成3×106个/mL，形成培养基，备用；
步骤3，取4-6mL转染缓冲液与500-505μL转染试剂混匀，形成转染溶液；另取4-6mL转染缓冲液与100-105μg HUMAN Beta-2-microglobulin无菌质粒DNA混匀，形成DNA溶液；
步骤4，混合转染溶液以及DNA溶液，轻轻混匀，并在室温下静置10-12min，形成质粒-载体复合溶液；
步骤5，将步骤4形成的质粒-载体复合溶液逐滴滴加至步骤2制得的培养基中，并边滴加边轻轻摇动，滴加完成后，置于5%的CO2恒温摇床中，并于25-37℃以及135r/min的条件下震荡培养；
步骤6，培养24h后，添加100μL营养添加剂，并每间隔24h添加一次；
其中，所述培养液包括以下浓度的组分：
葡萄糖70-80g/L；
酚红0.001-0.005mg/L；
谷丙氨酸二肽150-200mg/L；
维生素C 10-15mg/L；
羟乙基哌嗪乙硫磺酸2.5-3g/L；
碳酸氢钠100-120mg/L；
肌醇500-520mg/L；
氯化钙15-18mg/L；
氯化钾300-350mg/L；
氯化钠5-7g/L；
L-精氨酸450-470mg/L；
L-天冬氨酸60-70mg/L；
L-谷氨酸200-230mg/L；
L-组氨酸100-110mg/L；
L-异亮氨酸400-420mg/L；
L-赖氨酸450-460mg/L；
L-亮氨酸600-620mg/L；
L-缬氨酸450-460mg/L；
L-脯氨酸300-310mg/L；
丙酮酸钠0.3-0.8mL/L；
壳寡糖1-4mg/L；
叶酸0.05-0.2mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述营养添加剂由以下浓度的组分组成：
L-精氨酸450-470mg/L；
L-天冬氨酸60-70mg/L；
L-谷氨酸200-230mg/L；
L-组氨酸100-110mg/L；
L-异亮氨酸400-420mg/L；
L-赖氨酸450-460mg/L；
L-亮氨酸600-620mg/L；
L-缬氨酸450-460mg/L；
L-脯氨酸300-310mg/L；
葡萄糖70-80g/L；
谷丙氨酸二肽20-25mg/L；
大豆水解物3-5g/L；
小麦水解物8-10g/L；
蚕豆水解物7-10g/L。
3.根据权利要求1所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述步骤2中，将细胞密度稀释成3×106个/mL后，将转染细胞以及培养液置于5%的CO2恒温摇床中，并于37℃以及135r/min的条件下震荡培养10-12min，形成培养基。
4.根据权利要求2所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述步骤3中的转染试剂为阳离子聚合物转染试剂。
5.根据权利要求4所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述转染试剂为STF02的Sinofection 转染试剂。
6.根据权利要求1-5任一所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述步骤1中，先将HEK-293细胞置于5%的CO2恒温摇床中，并于37℃以及120r/min的条件下震荡培养，并选择密度为3-6×106个/mL且活率大于90%的细胞进行传代培养。
7.根据权利要求6所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述步骤1中的传代频率为每隔3-4天传代1次。
8.根据权利要求7所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述步骤1中的传代后的细胞密度控制为0.3-0.6×106个/mL。
9.根据权利要求1-5任一所述的一种提高β-2微球蛋白在HEK-293细胞中表达水平的细胞转染培养方法，其特征在于：所述步骤5中的震荡培养的温度为25-28℃。
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