CN104152413A

CN104152413A - 一种适用于临床的高效扩增nk细胞的培养体系的应用

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Publication number: CN104152413A
Application number: CN201410395347.0A
Authority: CN
Inventors: 郑敦武; 莫筱萦; 罗晴燕; 梁心田; 杨燕燕; 胡红; 姜莎莎; 徐文静
Original assignee: Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Race (suzhou) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2014-11-19

Abstract

本发明涉及一种适用于临床的高效扩增NK细胞的培养体系的应用。具体提供了一种不含血清的扩增NK细胞的培养体系的应用，所述的培养体系包含以下各成分：1640培养基、碳酸氢钠、人血清白蛋白、转铁蛋白、亚油酸、油酸、棕榈酸、丙酮酸钠、人重组胰岛素、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、白细胞介素-2。还提供了一种含体积分数1%-12%人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用。本发明的培养体系成分简单，避免了动物血清中的动物成分对细胞治疗带来的风险及动物血清中不确定的成分对细胞培养造成的不确定性，提高了NK细胞得率，所获得的活化的NK细胞肿瘤杀伤效果显著，因此除了能应用于科研，也可应用于临床治疗。

Description

一种适用于临床的高效扩增NK细胞的培养体系的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地说，是一种适用于临床的高效扩增NK细胞的培养体系的应用。

背景技术

NK细胞（natural killer cell）于1975年被发现，属淋巴细胞谱系，是含有穿孔蛋白和粒酶颗粒的细胞毒淋巴细胞，为机体重要的免疫细胞。NK细胞来源于骨髓，在形态上属于大颗粒淋巴细胞，占外周血淋巴细胞总数的5%-10%，其对靶细胞的识别无MHC限制性，无需预先致敏即可直接杀伤肿瘤细胞，也可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能，是机体天然免疫的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及清除非己细胞中发挥重要作用。

目前，基于NK细胞的肿瘤生物治疗取得了较大进展，其中基于NK细胞天然免疫识别的肿瘤生物治疗途径有很多新的设想，人们通过免疫放疗和化疗方案大幅度提高NK细胞的抗癌功效。近期研究证明，适度放疗和化疗可以使肿瘤细胞高表达NK细胞活化受体识别的配基（如NKG2D），使肿瘤细胞易于被NK细胞识别而清除；同时，还发现组蛋白脱乙酰酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂可以诱导肿瘤细胞DR2，从而被NK细胞以TRAIL途径杀伤；另外，基于NK细胞的ADCC效应设计的生物治疗方案，采用治疗性单抗或治疗性双功能抗体结合NK细胞体内运输可以极大地提高临床肿瘤生物治疗的疗效。

目前临床上获得NK细胞的方法一般是从外周血单个核细胞中进行扩增，培养过程中一般需要加入动物血清来提高培养效果。然而，其主要存在以下缺陷：

① NK细胞只占正常外周血淋巴细胞的5%-20%，含量很少，从外周血中分离NK细胞成本高，且分离出来的NK细胞一般处于非活化状态，在很大程度上限制了在临床上的应用。

② 大多数体外扩增和活化NK细胞的方法都需要应用到基因工程细胞，即应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原递呈细胞(aAPC)，然后将4-1BBL(CD137L)和膜固定IL15等导入此细胞中，构建CD64-CD86-41BBL-Mil15-aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5-6周后细胞不再扩增。而且K562细胞是红白血病细胞，这种方法操作复杂，细胞得率低，一定程度上降低了临床使用的安全性。

③ 动物血清成分复杂，含有对细胞有害的成分，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应形成有细胞毒性作用的聚精胺、补体、抗体、细菌毒素等，这些会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡；动物个体不同，血清产地、批次不同，其成分不能保持一致；取材中可能带入支原体、病毒，可能导致实验失败或实验结果不可靠；大规模生产中，血清来源困难，价格昂贵。不能适用于临床细胞治疗体系。

④ 一些NK细胞培养基产品在使用过程中需要使用大量的抗体包被培养耗材，抗体价格昂贵，增加成本。

中国专利文献CN201410118900.6，公开日2014.06.11，公开了一种适用于培养NK细胞的无血清培养基，由基础培养基组份I、NK细胞特异性培养组份II以及水组成。所述基础培养基组份I是由以下浓度的组分组成的：无水氯化钙28～33.82mg/L，i-肌醇13～19mg/L，L-酪氨酸4～5.9mg/L，L-蛋氨酸3～5mg/L，L-缬氨酸6～13.7mg/L，L-苯丙氨酸4～7mg/L，D-葡萄糖1789～1802mg/L，盐酸吡哆醇（维生素B6）0.055～0.066mg/L，次黄嘌呤3～5mg/L，L-丝氨酸7～15mg/L，氯化钠7200～7599mg/L，核黄素0.022～0.048mg/L，亚油酸0.077～0.094mg/L，L-苏氨酸10～13.9mg/L，磷酸氢二钠120～149mg/L，盐酸硫胺0.22～0.34mg/L，硫辛酸0.12～0.29mg/L，L-天门冬酰胺7～18.01mg/L，L-精氨酸盐酸盐198～213mg/L，L-天门冬氨酸6～19.3mg/L，1，4－丁二胺二盐酸盐0.11～0.19mg/L，L-半胱氨酸盐酸盐22～39.12mg/L，L-谷氨酰胺113～149mg/L，L-谷氨酸2～17.7mg/L，丙酮酸钠100～110mg/L，氯化胆碱12～13.99mg/L，甘氨酸6～8mg/L，L-亮氨酸11～13.4mg/L，维生素H0.004～0.008mg/L，L-赖氨酸盐酸盐34～39.5mg/L，L-组氨酸盐酸盐9～25mg/L，L-脯氨酸25～34.5mg/L；所述NK细胞特异性培养组份II是由以下浓度的组分组成的：表皮生长因子1～100mg/L，CD16单抗20～100mg/L，神经生长因子1～10mg/L，IL-21 20～100mg/L，成纤维素细胞生长因子1～100mg/L，IL-18 50～150mg/L，卵泡刺激因子50～500mg/L，IL-12 50～500mg/L，CD3单抗50～500mg/L，CD125单抗50～500mg/L。经实验证明，该无血清培养基培养NK细胞，能够得到数量更多，纯度更高且杀伤效果更好的NK细胞。然而，上述培养基的成分十分复杂。

综上所述，亟需一种成分更简单的临床级别的高效扩增NK细胞的完全培养基。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种不含人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用。

本发明再一的目的是，提供一种含人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种不含人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

优选地，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

更优选地，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种含人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

优选地，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

更优选地，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

关于上述两种培养体系，优选地，所述的1640 培养基的成分为：

。

优选地，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

更优选地，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

优选地，所述的培养体系pH：7.0-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素：<0.5EU/ml。

本发明提供了一种新的NK细胞培养体系的用途，所述的培养体系（含人自体血清）具备以下优点：

① 使用自身血清，避免了动物血清中的动物成分对细胞治疗带来的风险及动物血清中不确定的成分对细胞培养造成的不确定性；

② 简化了现有无血清培养基的成分，操作简单，使用方便；

③ 很大程度上提高了NK细胞的得率，降低成本；

④ 所获得的活化的NK细胞肿瘤杀伤效果显著。

所述的培养体系（不含人自体血清）具备以下优点：

① 不使用血清，避免了动物血清中的动物成分对细胞治疗带来的风险及动物血清中不确定的成分对细胞培养造成的不确定性；

② 简化了现有无血清培养基的成分，操作简单，使用方便；

③ 获得的活化的NK细胞肿瘤杀伤效果显著。

本发明的培养体系除了能应用在科研之外，也可作为细胞治疗中的配套体系，为细胞治疗提供高纯度和有活力的细胞，在细胞治疗领域体现出巨大的发展潜力。

附图说明

附图1是流式细胞仪检测结果（10d）。

附图2是流式细胞仪检测结果（20d）。

附图3是NK细胞培养0天、7天、10天、20天的细胞增殖情况。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明不含人自体血清的培养体系各成分的含量可以在以下范围内：

。

其中，所述的1640 Medium为动物细胞培养常规基础培养基，以下实施例中具体使用的是Gibco公司的产品，其具体成分为：

。

但本领域技术人员应当知晓，凡是1640 Medium均可用于本发明，并不限于Gibco公司的上述产品。

其中，所述的NEAA为非必需氨基酸，以下实施例所使用的NEAA具体成分为：

。

但不仅限于此，只要在下述范围内均可：

。

其中，其他组分，包括碳酸氢钠、人血清白蛋白、转铁蛋白、亚油酸、油酸、棕榈酸、丙酮酸钠、人重组胰岛素均为现有技术已有试剂，可以通过生物试剂公司购买得到，所述的2-巯基乙醇1000×购于Sigma公司，货号为M7522。

本发明不含人自体血清的培养体系的各参数如下：

pH：7.0-7.4；

渗透压：260-320mOsm/kg；

细菌、真菌检测：阴性；

衣原体、支原体检测：阴性；

内毒素：<0.5EU/mL。

本发明含人自体血清的培养体系各成分的含量以及各参数与本发明不含人自体血清的培养体系相同，仅在本发明不含人自体血清的培养体系的基础上添加人自体血清，所述的人自体血清制备方法为：将血液盛于离心管中，37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心，3000rpm，10min，得到的上清液即为人自体血清，分装备用。人自体血清在本发明含人自体血清的培养体系中的终浓度为1%~12%（体积浓度）。

实施例 1 本发明不含人自体血清的培养体系（一）

培养体系配方如下表所示：

。

实施例 2 本发明不含人自体血清的培养体系（二）

培养体系配方如下表所示：

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实施例 3 本发明不含人自体血清的培养体系（三）

培养体系配方如下表所示：

。

实施例 4 本发明含人自体血清的培养体系（一）

培养体系配方如下表所示：

。

实施例 5 本发明含人自体血清的培养体系（二）

培养体系配方如下表所示：

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实施例 6 本发明含人自体血清的培养体系（三）

培养体系配方如下表所示：

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对比例 1

培养体系配方如下表所示：

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实施例 7 本发明培养体系的效果实验

1 、实验材料

① 人外周血单个核细胞（PBMC）的提取方法如下：

a 收集人外周血样品10mL，用2-4倍体积的PBS稀释样品；50mL离心管中加入15mL淋巴细胞分离液；

b 将稀释的血液样品缓慢加入到淋巴分离液上，尽量使血液样品保持在淋巴分离液上层；

c 室温×400g×30min，收集云雾层的PBMC细胞；

d 40mL无菌的PBS重悬PBMC，室温×200g×10min，去上清；

e 40mL无菌的PBS重悬一次，室温×200g×10min，用冻存液重悬分装冻存。

② 基础培养基（BM）：配方同实施例1（不含IL-2）；

③ Lonza vivo-15，购于美国Lonza公司，商品名：X-VIVO™ 15 Chemically Defined, Serum-free Hematopoietic Cell Medium；

④ 白细胞介素-2（IL-2），购于上海普欣生物科技有限公司；

⑤ 人自体血清（human serum），制备方法为：将血液盛于离心管中，37℃环境中促其凝固，待血液凝固后，将其平衡后离心，3000rpm，10min，得到的上清液即为人自体血清，分装备用。

、实验方法

2.1 实验分组

注：IL-2，450IU/mL；人自体血清，体积浓度6%。

实验步骤

1) 复苏PBMC，按照7.4×10⁵ 细胞/孔，接种到24孔板中。培养条件为：培养基+10ng/mL anti-CD3 antibody（购于Biolegend公司），37℃，5% CO₂；

2) 培养5天之后，去掉anti-CD3 antibody，并更换新鲜培养基；

3) 每2~3天分别添加新鲜实验组培养基；

4) 培养数天后取部分细胞进行流式检测；细胞计数检测免疫细胞的增殖；检测NK细胞对人白血病细胞K562的杀伤效果。

、实验结果

3.1 流式细胞仪检测

① 体外培养PBMC，10天后流式细胞仪检测结果如图1所示。数据分析：CD3-CD56+ NK细胞在使用本发明含人自体血清培养体系的培养条件下所占比例最高达14.8%，明显高于Lonza vivo-15培养基培养的结果（<5%）；本发明不含人自体血清培养体系培养的细胞中CD3-CD56+ NK细胞只占2.5%，明显低于含有血清的培养条件（14.8%）；而Lonza vivo-15培养基在有无血清的条件下CD3-CD56+ NK细胞所占比例并无明显变化。

② 体外培养PBMC，20天后流式细胞仪检测结果如图2所示。数据分析：体外培养20天后，本发明含人自体血清培养体系培养条件下CD3-CD56+ NK细胞所占的比例由培养10天的14.8%增加到29.2%；而本发明不含人自体血清培养体系和Lonza vivo-15培养基对CD3-CD56+ NK细胞的增殖并无促进作用。

细胞增殖情况

NK细胞培养0天、7天、10天、20天，增殖情况如图3。数据分析：在本发明含人自体血清培养体系培养条件下，细胞增殖倍数高达120倍，而在Lonza vivo-15培养基培养条件下，细胞增殖倍数只有27倍，且添加血清后对增殖有明显的促进作用。

杀伤测试

采用promega CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒，检测体外培养20天的NK细胞对K562细胞的杀伤性，其中K562的细胞数为3,000个/孔（96孔板）。实验结果如表1。

表1 NK细胞对K562细胞的杀伤测试

数据分析：本发明含人自体血清培养体系培养的NK细胞在效应细胞与靶细胞比例为80:1时，对K562的杀伤力达到32%，Lonza vivo-15培养基培养的细胞对靶细胞无杀伤性。本发明不含人自体血清培养体系培养的NK细胞在效应细胞与靶细胞比例为80:1时，对K562的杀伤力达到33%。

、实验结论

本发明含人自体血清培养体系对NK细胞的增殖及对靶细胞的杀伤力都有明显效果，且添加的是人自体血清，避免了动物血清对临床治疗带来的负面影响。本发明不含人自体血清培养体系对靶细胞的杀伤力也具有明显效果。

实施例 8 本发明含人自体血清的培养体系与对比例 1 培养体系的比较

按照实施例7的方法比较实施例5的含人自体血清培养体系与对比例1培养体系的培养效果。实验分组为：E组，实施例5配方；F组，对比例1配方。细胞计数检测免疫细胞的增殖。结果：NK细胞培养20天时，E组细胞增殖倍数为106倍，F组细胞增殖倍数为72倍，差异显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种不含人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用，其特征在于，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

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2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

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3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

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4.一种含人自体血清的扩增NK细胞的培养体系的应用，其特征在于，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的培养体系包含以下质量比的各成分：

。

7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述的1640 培养基的成分为：

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8.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述的非必需氨基酸的成分为：

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9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的非必需氨基酸的成分为：

。

10.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述的培养体系pH：7.0-7.4；渗透压：260-320mOsm/kg；细菌、真菌检测：阴性；衣原体、支原体检测：阴性；内毒素：<0.5EU/ml。