CN105198962A - 脱脂蟹壳抗氧化多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脱脂蟹壳抗氧化多肽，具体讲是以蟹壳下脚料为原料，通过脱脂、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶双酶酶解制备酶解液，酶解液采用超滤、大孔树脂纯化、阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化多肽Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp，ESI-MS测定分子量为979.15Da。本发明制备的抗氧化多肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。

Description

脱脂蟹壳抗氧化多肽
技术领域
本发明涉及到一种蛋白抗氧化肽，尤其涉及脱脂蟹壳抗氧化多肽。
背景技术
中国水产品产量约占世界总产量的三分之一，但加工率约30%，与美国等国家的80%差距较大，水产品加工和综合利用技术还需进一步提高。目前，我国水产品加工副产物利用率较低，而国外己经达到根据副产物化学组成和生化特性进行有效分类利用，加工产值甚至超过鱼肉的几倍到几十倍。虾蟹类水产品加工过程中产生大量的虾头、虾壳、蟹壳、蟹腿等下脚料，仍含有大量蛋白质、不饱和脂肪酸、有机钙、甲壳素等多种营养成份和活性物质，有较好利用前景。
抗氧化剂可以减弱或祛除自由基对人体的损害，或者保护食品免受氧化损伤变质。化学合成抗氧化剂，如叔丁基对苯二酚、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、二丁基羟基甲苯等，价格便宜，广泛地应用到食品工业中。但是，化学合成抗氧化剂不同程度上损伤人体的肝脏、肾脏等器官，部分国家和地区已经明确限量或禁止使用。因此，研发高效、安全的天然抗氧化剂成为热点。抗氧化肽由于其食用安全、利用度高、无毒副作用等优点受到广泛重视。
申请人发现以蟹壳下脚料为原料，利用酶解技术制备脱脂蟹壳抗氧化多肽的工艺研究处于空白阶段，而以蟹壳下脚料酶解产物为材料制备高活性抗氧化肽及其应用更是未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的脱脂蟹壳抗氧化多肽，该抗氧化多肽为七肽化合物，氨基酸序列为Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)，ESI-MS测定分子量为979.15Da。
上述脱脂蟹壳抗氧化多肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
1）蟹壳下脚料预处理：取过100目筛的蟹壳下脚料，按照料液比1g:5~10mL加入异丙醇，于40~50℃脱脂8~10h，然后于8000~10000rpm离心10~15min除去异丙醇，收集脱脂蟹壳下脚料固形物。
）蟹壳下脚料的酶解：将上述脱脂蟹壳下脚料固形物按固液比1g:10~15mL加入磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH6.5~7.5），混合液温度升至45~50℃、超声处理10~15min；然后按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的1.0~1.5%加入中性蛋白酶，在45~50℃酶解4~6h；将酶解液升温至90~95℃后恒温保持10~15min，酶解液温度降至50~60℃，按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的2.0~2.5%加入木瓜蛋白酶，在50~60℃酶解4~6h，冷却至室温，于9000~10000rpm离心10~15min，除去沉淀物，得到酶解液。
）脱脂蟹壳抗氧化多肽的制备：将上述酶解液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得到超滤酶解液；将超滤酶解液按照体积比加入到装有6～8倍DA201-C大孔树脂的层析柱中，用4～5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到脱脂蟹壳抗氧化多肽。
与现有技术相比，本发明所提供的脱脂蟹壳抗氧化多肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用；Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点。
附图说明
图1是本发明葡聚糖凝胶制备酶解物的RP-HPLC分析；
图2是本发明Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp的质谱图；
图3是本发明的阴离子交换树脂层析图；
图4是本发明的葡聚糖凝胶层析图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种脱脂蟹壳抗氧化多肽的制备方法，制备工艺流程如下：蟹壳下脚料-脱脂-酶解-酶解物-超滤-大孔树脂纯化-阴离子交换层析-凝胶过滤层析-反相高效液相色谱制备-抗氧化肽。
具体步骤为：
1）蟹壳下脚料预处理：取过100目筛的三疣梭子蟹（Portunustrituberculatus）蟹壳下脚料，按照料液比1g:8mL加入异丙醇，于45℃脱脂8h，然后于9000rpm离心10min除去异丙醇，收集脱脂蟹壳下脚料固形物。
）蟹壳下脚料的酶解：将上述脱脂蟹壳下脚料固形物按固液比1g:10mL加入磷酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH7.0），混合液温度升至45℃、超声处理15min；然后按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的1.2%加入中性蛋白酶，在45℃酶解5h；将酶解液升温至90℃后恒温保持15min，酶解液温度降至55℃，按脱脂蟹壳下脚料固形物质量的2.2%加入木瓜蛋白酶，在55℃酶解4h，冷却至室温，于10000rpm离心10min，除去沉淀物，得到酶解液。
）脱脂蟹壳抗氧化多肽的制备：将上述酶解液采用1kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得到超滤酶解液；将超滤酶解液按照体积比加入到装有8倍DA201-C大孔树脂的层析柱中，用5倍柱体积双蒸水洗脱除去杂质，然后用8倍柱体积的70%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经阴离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到脱脂蟹壳抗氧化多肽。
①阴离子交换树脂层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为50mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂（DEAESepharoseFF）层析柱分离，用水、0.30mol/L、和0.50mol/LNaCl溶液进行洗脱，根据215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对羟基自由基清除活性最高组分为离子交换层析酶解物Fr.5（图3）。
②凝胶色谱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据215nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高羟基自由基清除活性的峰为凝胶层析酶解物Fr.5-III（图4）。
③高效液相色谱精制：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80~100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件为：进样量8~10μL；色谱柱HypersilBDSC18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：25%乙腈（含0.1%三氟乙酸）；洗脱速度0.5~0.8mL/min；紫外检测波长215nm)，根据对羟基自由基的清除活性得1个高抗氧化活性多肽（图1）。
④结构检测：收集羟基自由基清除活性最高的1个抗氧化肽，经RP-HPLC检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)，ESI-MS测定分子量为979.15Da（[M+H]+980.11Da）（图2）。
将制得的脱脂蟹壳抗氧化多肽Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)进行自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验，实验结果表明：Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)对DPPH自由基（EC501.561mg/mL）、羟基自由基（EC500.145mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC500.102mg/mL）具有良好的清除作用；同时，Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp(IWMECNW)亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>浙江海洋学院
<120>脱脂蟹壳抗氧化多肽
<130>zjou-wb07-01
<160>1
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>7
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1
IleTrpMetGluCysAsnTrp
15

Claims (1)

1.脱脂蟹壳抗氧化多肽，其特征在于：该抗氧化肽为七肽化合物，其氨基酸序列为Ile-Trp-Met-Glu-Cys-Asn-Trp，ESI-MS测定分子量为979.15Da。
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