CN105567772A - 一种高抗氧化性蛋白肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产加工及综合利用领域，特别涉及一种高抗氧化性蛋白肽及其制备方法与应用。发明对蟹加工下脚料脱脂干燥后利用碱性蛋白酶和中性蛋白酶分别对蟹加工下脚料进行处理，然后离心分离，得到上清液，上清液经超滤和凝胶色谱过滤，得到分子量为1000～5000的多肽溶液，然后浓缩干燥，得到高抗氧化性蛋白肽，制备方法简单，成本低，适合工业化生产。本发明制备得到的高抗氧化性蛋白肽的DPPH自由基清除率和超氧阴离子清除率分别达到23.5～27.5％、21.2～24.8％，抗氧化活性高，推广利用的价值高。
Description
技术领域
本发明属于水产加工及综合利用领域，特别涉及一种高抗氧化性蛋白肽及其制备方法与应用。
背景技术
研究发现活性肽类在人体内消化吸收机制比游离氨基酸更好，这些氨基酸无法比拟的特点使得生物活性肽成为研究开发的热点。某些海洋生物含有丰富的蛋白质，是提取生物活性肽的理想原材料。海洋生物活性肽来源广泛，生理功能繁多，安全性高，且根据目前的研究报导，海洋生物来源的活性肽具有抗氧化、抗肿瘤、抗高血压、降血脂、抗菌、抗糖尿病、免疫调节、增强骨强度等。制备活性肽的来源包括鱼类、贝类、虾蟹等甲壳类，还有海藻、海葵、海鞘、海绵、海星等，利用不同的原材料以及不同制备条件，可以获得不同生理活性与效价的肽类物质。近年来，制备海洋活性肽的原料资源不断扩展，工艺技术不断改善，其功能性和安全性也不断完善，但总体而言，这些生物活性肽的研究及生产利用滞后于陆地生物活性肽，研究利用也主要以鱼类功能性肽为主，利用软体动物和甲壳动物制备活性肽则较少。
抗氧化肽是基于清除自由基或螯合金属离子的能力而具有抗氧化活性。有研究发现从水产品中提取得到的抗氧化肽可以提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷甘胱肽过氧化物酶的活性，对羟自由基诱导的DNA损伤有保护作用，被认为可抑制癌变以及帕金森氏病和阿兹海默症等神经退行性病变。
在蟹类相关的文献报导中还鲜少看到有抗氧化肽的研究，酶解蟹肉蛋白制备抗氧化肽可以成为制备活性肽的新来源，尤其是从蟹加工下脚料中残留蟹肉制备抗氧化肽，这是变废为宝、综合利用海洋蛋白资源的一个有效途径。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高抗氧化性蛋白肽的制备方法，该方法综合利用水产低值蛋白资源，以我国重要海产蟹类加工下脚料为原料，采用高效水解蛋白酶，定点水解，并采用超滤技术，有针对性地分离高抗氧化性肽段，以获取具有高抗氧化活性的多肽物质。
本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的高抗氧化性蛋白肽。
本发明的再一目的在于提供上述高抗氧化性蛋白肽的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种高抗氧化性蛋白肽的制备方法，包含如下步骤：
(1)预处理
将破碎过筛后的蟹加工下脚料与异丙醇混合均匀后回流加热脱脂，清洗并干燥脱脂后的蟹加工下脚料，得到蟹粉；
(2)蛋白酶水解处理
取步骤(1)制得的蟹粉与水混匀后加热至50～62℃，调整反应体系pH值为8.2～9.0，然后加入碱性蛋白酶，50～62℃酶解1.5～2.5h；酶解结束后将反应体系加热到85～100℃，保温10～15min，使碱性蛋白酶失活；将反应体系冷却到45～60℃，并调整反应体系pH值为6.5～7.5，然后加入中性蛋白酶，45～60℃酶解1.5～2.5h；酶解结束后将反应体系加热到85～100℃，保温10～15min，使酶失活；然后离心分离，得到上清液；
(3)超滤
将步骤(2)制得的上清液加热到40～50℃，然后超滤分离，分离得到分子量小于10kDa的多肽溶液；
(4)凝胶色谱过滤
将步骤(3)超滤得到的多肽溶液过凝胶色谱SephadexG-25M柱，收集得到分子量为1000～5000的多肽分子的溶液；
(5)浓缩及干燥
将步骤(4)收集的溶液经浓缩，然后干燥，得到干态多肽物质，即为高抗氧化性蛋白肽；
步骤(1)中所述的蟹加工下脚料(包括蟹小脚及蟹背壳等)优选用水冲洗1～3次，粉碎过20～50目筛；
步骤(1)中所述的蟹加工下脚料与异丙醇的质量比优选为10：(10～30)；
步骤(1)中所述的回流加热的条件优选为：温度为50～75℃，时间为20～35min；
步骤(1)中所述的清洗优选为用水清洗1～3次；
步骤(1)中所述的干燥的条件优选为40～65℃烘干至蟹加工下脚料水分含量5～10％；
步骤(2)中所述的蟹粉与水的质量比优选为1：(18～25)；
步骤(2)中所述的调整反应体系pH值为8.2～9.0优选采用0.1M的NaOH溶液调整pH值为8.2～9.0；
步骤(2)中所述的碱性蛋白酶的用量优选为2800～3500U/g蟹粉；
步骤(2)中所述的调整反应体系pH值为6.5～7.5优选采用0.1MHCl调整反应体系pH值为6.5～7.5；
步骤(2)中所述的中性蛋白酶的用量优选为2000～2500U/g蟹粉；
步骤(2)中所述的离心的条件优选为4000～8000转/min离心10～20min；
步骤(3)中所述的超滤的操作压力优选为0.10～0.18MPa；
步骤(4)中过凝胶色谱SephadexG-25M柱的洗脱剂优选为水；
步骤(5)中所述的浓缩优选真空浓缩，真空浓缩的条件优选为：50～60℃，真空度0.080～0.090Mpa；
步骤(5)中所述的溶液真空浓缩后多肽含量优选为15％；
步骤(5)中所述的干燥优选为冷冻干燥；
一种高抗氧化性蛋白肽，通过上述制备方法制备得到；
所述的高抗氧化性蛋白肽优选低湿度保藏；
所述的高抗氧化性蛋白肽在食品和保健品加工领域中的应用；
所述的高抗氧化性蛋白肽的DPPH自由基清除率和超氧阴离子清除率分别达到23.5～27.5％、21.2～24.8％，抗氧化活性高，推广利用的价值高；
本发明的原理：本发明对蟹加工下脚料脱脂后干燥以除去水分后，蟹肉蛋白能与蛋白酶充分接触。脱脂干燥虽然影响蛋白结构而降低了酶解速率，但脱脂干燥减少了酶解过程中脂肪氧化对抗氧化肽的影响，因此获得较高的自由基清除率。脱脂干燥酶解的DPPH自由基清除率高于其他处理方式(微波预热、蒸煮加热及超声波处理)。此外，申请人经过对蛋白酶解液进行组分分离及检测，发现抗氧化活性最高的肽段分子量在1000～3700Da之间，因此采用能透过上述分子量的凝胶色谱填料SephadexG-25M进行过滤分离，得到高抗氧化性蛋白肽。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
蟹加工后的下脚料包括蟹脚及背壳等，其中约含有10％～15％的蟹肉蛋白。对于这些残肉若不进行回收利用，一方面会造成蛋白质资源的极大浪费，另一方面也会对环境造成污染。本发明通过蛋白酶高效水解，分离纯化得到具有高抗氧化活性的特定蛋白质肽段，产品品质高，特别适合当前的营养和保健需求，是变废为宝、综合利用海洋蛋白资源的有效途径。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)原料清洗及粉碎
取冷冻的蟹加工下脚料(包括蟹小脚及蟹背壳等)，解冻后用清水冲洗1次，粉碎至过20目筛；
(2)预处理
取破碎过筛后的梭子蟹加工下脚料10kg，加入30L异丙醇，混合均匀后于75℃下回流加热25min进行脱脂，分离溶剂，不溶物用清水冲洗3次，然后于65℃烘干至水分含量10％，得到蟹粉；
(3)蛋白酶水解处理
取步骤(2)制得的蟹粉1000g，加入18000mL蒸馏水，混匀后加热到62℃，用0.1M的NaOH溶液调整pH值为8.2，然后按照2800U/g蟹粉的比例加入碱性蛋白酶，搅拌均匀后62℃保温酶解2h；酶解结束后将反应体系加热到100℃，保温10min，使碱性蛋白酶失活；将反应体系冷却到45℃，用0.1MHCl调整pH值为6.5，然后按照2500U/g蟹粉的比例加入中性蛋白酶，45℃保温酶解2h；酶解结束后将反应体系加热到85℃，保温15min，使酶失活；将上述反应体系8000转/min离心10min，得到上清液；
(4)超滤
将步骤(3)制得的上清液加热到50℃，然后通过能透过10kDa分子的超滤机进行超滤，操作压力为0.10MPa，分离得到分子量小于10kDa的多肽溶液；
(5)凝胶色谱过滤
将步骤(4)超滤得到的多肽溶液过凝胶色谱SephadexG-25M柱，用去离子水洗脱，收集得到分子量为1000～5000的多肽分子的溶液；
(6)真空浓缩及干燥
将步骤(5)收集的溶液经真空浓缩(50℃，真空度0.090Mpa)，使溶液中多肽分子含量达到15％，然后冷冻干燥，得到干态多肽物质，即为高抗氧化性蛋白肽；该高抗氧化性蛋白肽低湿度保藏；
经测定，通过上述方法得到的高抗氧化性蛋白肽，其DPPH自由基清除率和超氧阴离子清除率分别达到24.5％、21.2％，抗氧化活性高，推广利用的价值高。
实施例2
(1)原料清洗及粉碎
取冷冻的蟹加工下脚料(包括蟹小脚及蟹背壳等)，解冻后用清水冲洗2次，粉碎至过50目筛；
(2)预处理
取破碎过筛后的梭子蟹加工下脚料10kg，加入20L异丙醇，混合均匀后于60℃下回流加热30min进行脱脂，分离溶剂，不溶物用清水冲洗2次，然后于40℃烘干至水分含量8％，得到蟹粉；
(3)蛋白酶水解处理
取步骤(2)制得的蟹粉1000g，加入25000mL温开水，混匀后加热到50℃，用0.1M的NaOH溶液调整pH值为9.0，然后按照3500U/g蟹粉的比例加入碱性蛋白酶，搅拌均匀后50℃保温酶解2.5h；酶解结束后将反应体系加热到85℃，保温15min，使碱性蛋白酶失活；将反应体系冷却到55℃，用0.1MHCl调整pH值为7.5，然后按照2300U/g蟹粉的比例加入中性蛋白酶，55℃保温酶解2.5h；酶解结束后将反应体系加热到100℃，保温10min，使酶失活；将上述反应体系8000转/min离心20min，得到上清液；
(4)超滤
将步骤(3)制得的上清液加热到40℃，然后通过能透过10kDa分子的超滤机进行超滤，操作压力为0.18MPa，分离得到分子量小于10kDa的多肽溶液；
(5)凝胶色谱过滤
将步骤(4)超滤得到的多肽溶液过凝胶色谱SephadexG-25M柱，用去离子水洗脱，收集得到分子量为1000～5000的多肽分子的溶液；
(6)真空浓缩及干燥
将步骤(5)收集的溶液经真空浓缩(60℃，真空度0.080Mpa)，使溶液中多肽分子含量达到15％，然后冷冻干燥，得到干态多肽物质，即为高抗氧化性蛋白肽；该高抗氧化性蛋白肽低湿度保藏；
经测定，通过上述方法得到的高抗氧化性蛋白肽，其DPPH自由基清除率和超氧阴离子清除率分别达到27.5％、23.2％，抗氧化活性高，推广利用的价值高。
实施例3
(1)原料清洗及粉碎
取冷冻的蟹加工下脚料(包括蟹小脚及蟹背壳等)，解冻后用清水冲洗3次，粉碎至过40目筛；
(2)预处理
取破碎过筛后的梭子蟹加工下脚料10kg，加入20L异丙醇，混合均匀后于50℃下回流加热35min进行脱脂，分离溶剂，不溶物用清水冲洗2次，然后于55℃烘干至水分含量7％，得到蟹粉；
(3)蛋白酶水解处理
取步骤(2)制得的蟹粉1000g，加入20000mL蒸馏水，混匀后加热到60℃，用0.1M的NaOH溶液调整pH值为8.5，然后按照3000U/g蟹粉的比例加入碱性蛋白酶，搅拌均匀后60℃保温酶解1.5h；酶解结束后将反应体系加热到90℃，保温12min，使碱性蛋白酶失活；将反应体系冷却到60℃，用0.1MHCl调整pH值为7，然后按照2000U/g蟹粉的比例加入中性蛋白酶，60℃保温酶解2h；酶解结束后将反应体系加热到90℃，保温12min，使酶失活；将上述反应体系8000转/min离心15min，得到上清液；
(4)超滤
将步骤(3)制得的上清液加热到45℃，然后通过能透过10kDa分子的超滤机进行超滤，操作压力为0.15MPa，分离得到分子量小于10kDa的多肽溶液；
(5)凝胶色谱过滤
将步骤(4)超滤得到的多肽溶液过凝胶色谱SephadexG-25M柱，用去离子水洗脱，收集得到分子量为1000～5000的多肽分子的溶液；
(6)真空浓缩及干燥
将步骤(5)收集的溶液经真空浓缩(55℃，真空度0.085Mpa)，使溶液中多肽分子含量达到15％，然后冷冻干燥，得到干态多肽物质，即为高抗氧化性蛋白肽；该高抗氧化性蛋白肽低湿度保藏；
经测定，通过上述方法得到的高抗氧化性蛋白肽，其DPPH自由基清除率和超氧阴离子清除率分别达到25.5％、24.8％，抗氧化活性高，推广利用的价值高。
实施例4
(1)原料清洗及粉碎
取冷冻的蟹加工下脚料(包括蟹小脚及蟹背壳等)，解冻后用清水冲洗3次，粉碎至过20目筛；
(2)预处理
取破碎过筛后的梭子蟹加工下脚料10kg，加入10L异丙醇，混合均匀后于65℃下回流加热20min进行脱脂，分离溶剂，不溶物用清水冲洗1次，然后于60℃烘干至水分含量5％，得到蟹粉；
(3)蛋白酶水解处理
取步骤(2)制得的蟹粉1000g，加入22000mL蒸馏水，混匀后保温到55℃，用0.1M的NaOH溶液调整pH值为8.5，然后按照3200U/g蟹粉的比例加入碱性蛋白酶，搅拌均匀后55℃保温酶解2h；酶解结束后将反应体系加热到95℃，保温10min，使碱性蛋白酶失活；将反应体系冷却到50℃，用0.1MHCl调整pH值为7，然后按照2400U/g蟹粉的比例加入中性蛋白酶，50℃保温酶解1.5h；酶解结束后将反应体系加热到95℃，保温12min，使酶失活；将上述反应体系8000转/min离心12min，得到上清液；
(4)超滤
将步骤(3)制得的上清液加热到45℃，然后通过能透过10kDa分子的超滤机进行超滤，操作压力为0.15MPa，分离得到分子量小于10kDa的多肽溶液；
(5)凝胶色谱过滤
将步骤(4)超滤得到的多肽溶液过凝胶色谱SephadexG-25M柱，用去离子水洗脱，收集得到分子量为1000～5000的多肽分子的溶液；
(6)真空浓缩及干燥
将步骤(5)收集的溶液经真空浓缩(60℃，真空度0.085Mpa)，使溶液中多肽分子含量达到15％，然后冷冻干燥，得到干态多肽物质，即为高抗氧化性蛋白肽；该高抗氧化性蛋白肽低湿度保藏；
经测定，通过上述方法得到的高抗氧化性蛋白肽，其DPPH自由基清除率和超氧阴离子清除率分别达到23.5％、21.2％，抗氧化活性高，推广利用的价值高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)预处理
将破碎过筛后的蟹加工下脚料与异丙醇混合均匀后回流加热脱脂，清洗并干燥脱脂后的蟹加工下脚料，得到蟹粉；
(2)蛋白酶水解处理
取步骤(1)制得的蟹粉与水混匀后加热至50～62℃，调整反应体系pH值为8.2～9.0，然后加入碱性蛋白酶，50～62℃酶解1.5～2.5h；酶解结束后将反应体系加热到85～100℃，保温10～15min，使碱性蛋白酶失活；将反应体系冷却到45～60℃，并调整反应体系pH值为6.5～7.5，然后加入中性蛋白酶，45～60℃酶解1.5～2.5h；酶解结束后将反应体系加热到85～100℃，保温10～15min，使酶失活；然后离心分离，得到上清液；
(3)超滤
将步骤(2)制得的上清液加热到40～50℃，然后超滤分离，分离得到分子量小于10kDa的多肽溶液；
(4)凝胶色谱过滤
将步骤(3)超滤得到的多肽溶液过凝胶色谱SephadexG-25M柱，收集得到分子量为1000～5000的多肽分子的溶液；
(5)浓缩及干燥
将步骤(4)收集的溶液经浓缩，然后干燥，得到干态多肽物质，即为高抗氧化性蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的蟹加工下脚料与异丙醇的质量比为10：(10～30)。
3.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的回流加热的条件为：温度为50～75℃，时间为20～35min。
4.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的碱性蛋白酶的用量为2800～3500U/g蟹粉。
5.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的中性蛋白酶的用量为2000～2500U/g蟹粉。
6.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的超滤的操作压力为0.10～0.18MPa。
7.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：
步骤(4)中过凝胶色谱SephadexG-25M柱的洗脱剂为水。
8.根据权利要求1所述的高抗氧化性蛋白肽的制备方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的浓缩为真空浓缩，真空浓缩的条件为：50～60℃，真空度0.080～0.090Mpa。
9.一种高抗氧化性蛋白肽，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述的高抗氧化性蛋白肽在食品和保健品加工领域中的应用。
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