发明内容
本发明的目的在于提供一种提取胶原的方法。
本发明的另一目的在于用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法。
本发明用罗非鱼皮提取胶原以及用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白,与已有的报道的不同,其中包括罗非鱼皮的预处理,胶原的低温提取,以获得未变性的高纯度的胶原,同时以高纯度的胶原为原料进行水解胶原蛋白的酶解制备,获得高纯度小分子量的胶原蛋白。
为此,本发明采用的技术方案如下。
一种提取胶原的方法,步骤如下:
(1)以罗非鱼皮为原料,将鱼皮剪碎后按鱼皮与正已烷的质量体积比1∶10~1∶20g/ml加入正已烷,在温度3℃~25℃下脱脂48~72h;
(2)脱脂后用0.05~0.2mol/L的NaOH溶液,在25℃下除杂蛋白2~5h,重复两次;
(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白,醋酸溶液的浓度为0.6mol/L,除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1:10~1:15g/ml,提取时间为24~48h,提取温度为15~30℃,重复提取二次;
(4)按提取物与水的质量体积比1:2.5g/ml加入水,进行水洗,经纯化、浓缩后,冷冻干燥得到胶原。
所述步骤(3)中可在用醋酸溶液提取的基础上再加超声波辅助提取,功率条件为20~80w/5g预处理的鱼皮,可提高提取效率。
用提取的胶原制备胶原蛋白的方法,步骤如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用蛋白酶进行酶解;
(2)酶解结束后,升温至90~100℃,保温5~10min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白。
所述步骤(1)中蛋白酶不同其酶解作用条件也不同,胰蛋白酶酶解作用条件为:E/[S]为500~900u/g、酶解时间为90min、酶解温度为35~45℃、pH为7.5~8.5;Alcalase2.4L酶解作用条件为:E/[S]为1000~2000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为50~60℃、pH为7.0~8.5;木瓜蛋白酶酶解作用条件为:E/[S]为5000~6400u/g、酶解时间为3h、酶解温度为55~65℃、pH为5.0~7.0。
上述方法制备的胶原蛋白中,分子量为500~20000的含量高,其中分子量分布范围为2000~7000的胶原蛋白占较高比例。
本发明制备的胶原及胶原蛋白可用于医药及化妆品中。
本发明与现有技术相比,具有如下优点和有益效果:
(1)本发明以罗非鱼加工的下脚料罗非鱼鱼皮为原料,提取胶原蛋白,并制备水解胶原蛋白,能使罗非鱼鱼皮得到充分的利用,实现罗非鱼鱼皮的高值利用;
(2)本发明采用正已烷脱脂,用NaOH除杂蛋白,除去鱼皮中所含的脂肪和杂蛋白,提高提取胶原的纯度;采用醋酸溶液为提取液及温和的提取工艺,保持胶原的不变性;
(3)本发明可选用不同的蛋白酶对胶原进行酶解,并采用不同的酶解工艺,酶解产物分子量范围为500~20000的含量高,且产物中分子量分布范围为2000~7000的胶原蛋白占较高比例。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例对本发明作进一步地描述,但本发明的保护范围不限于此。
实施例1
提取胶原的方法如下:
(1)以罗非鱼皮为原料,将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1:10g/ml加入正已烷,在温度25℃下脱脂72h;
(2)脱脂后用0.05mol/L的NaOH溶液,在25℃下除杂蛋白5h,重复两次;
(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白,醋酸溶液的浓度为0.6mol/L,除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1:10g/ml,提取时间为48h,提取温度为30℃,重复提取二次;
(4)按提取物与水的质量体积比1:2.5g/ml加入水,进行水洗,经纯化、浓缩后,冷冻干燥得到胶原,胶原的得率为44%。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用胰蛋白酶进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为700u/g、酶解时间为90min、酶解温度为35℃、pH为8.5;
(2)酶解结束后,升温至90℃,保温10min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44%。
实施例2
提取胶原的方法同实施例1。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用胰蛋白酶进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为500u/g、酶解时间为90min、酶解温度为40℃、pH为8.0;
(2)酶解结束后,升温至95℃,保温8min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的91%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的43%。
实施例3
提取胶原的方法同实施例1。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用胰蛋白酶进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为900u/g、酶解时间为90min、酶解温度为45℃、pH为7.5;
(2)酶解结束后,升温至100℃,保温5min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44%。
实施例4
提取胶原的方法如下:
(1)以罗非鱼皮为原料,将鱼皮剪碎后按鱼皮与正已烷的质量体积比1:20g/ml加入正已烷,在温度3℃下脱脂48h;
(2)脱脂后用0.2mol/L的NaOH溶液,在25℃下除杂蛋白2h,重复两次;
(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白,醋酸溶液的浓度为0.6mol/L,除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1:15g/ml,提取时间为24h,提取温度为15℃,重复提取二次;
(4)按提取物与水的质量体积比1:2.5g/ml加入水,进行水洗,经浓缩后,冷冻干燥得到胶原,胶原的得率为43%。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用Alcalase2.4L进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为2000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为50℃、pH为8.5;
(2)酶解结束后,升温至90℃,保温10min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44%。
实施例5
提取胶原的方法同实施例4。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用Alcalase2.4L进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为1000u/g、酶解时间为60min、酶解温度为55℃、pH为8.0;
(2)酶解结束后,升温至95℃,保温8min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的91%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的43%。
实施例6
提取胶原的方法同实施例4。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用Alcalase2.4L进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为1500u/g、酶解时间为60min、酶解温度为60℃、pH为7.0;
(2)酶解结束后,升温至100℃,保温5min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44%。
实施例7
提取胶原的方法如下:
(1)以罗非鱼皮为原料,将鱼皮剪碎后按鱼皮与正己烷的质量体积比1:15g/ml加入正已烷,在温度15℃下脱脂60h;
(2)脱脂后用0.1mol/L的NaOH溶液,在25℃下除杂蛋白3h,重复两次;
(3)用醋酸溶液提取胶原蛋白,醋酸溶液的浓度为0.6mol/L,除杂蛋白后的鱼皮与醋酸溶液的质量体积比为1:12g/ml,提取时间为36h,提取温度为25℃,重复提取二次;
(4)按提取物与水的质量体积比1:2.5g/ml加入水,进行水洗,经浓缩后,冷冻干燥得到胶原,胶原的得率为44%。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用木瓜蛋白酶进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为6400u/g、酶解时间为3h、酶解温度为55℃、pH为5.0;
(2)酶解结束后,升温至90℃,保温10min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44%。
实施例8
提取胶原的方法同实施例7。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用木瓜蛋白酶进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为5000u/g、酶解时间为3h、酶解温度为65℃、pH为7.0;
(2)酶解结束后,升温至95℃,保温8min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的91%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的43%。
实施例9
提取胶原的方法同实施例7。
用提取的胶原制备小分子量胶原蛋白的方法如下:
(1)将提取得到的胶原加入6倍的水溶解,然后利用木瓜蛋白酶进行酶解,酶解作用条件为:E/[S]为5800u/g、酶解时间为3h、酶解温度为60℃、pH为6.0;
(2)酶解结束后,升温至100℃,保温5min;
(3)经浓缩、喷雾干燥后得到水解胶原蛋白,得到的分子量为500~20000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的90%,其中分子量为2000~7000的胶原蛋白占胶原蛋白总质量的44%。
实施例1~9中,提取胶原方法中的步骤(3)可在用醋酸溶液提取的基础上再加超声波辅助提取,功率条件为20~80w/5g预处理的鱼皮,如20w/5g、40w/5g、80w/5g等预处理的鱼皮,这样可提高提取效率。