CN101230088B - 从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，该方法的主要内容是，将去除油脂和杂质并经丙酮浸泡预处理后的动物皮或/和腱原料屑加入反应器用醋酸溶液浸泡，浸泡充分后加入胃蛋白酶，在超声波辐照下进行酶解，酶解后再用醋酸溶液将酶解液稀释，分离去除酶解液中未酶解完全的部分，得到的胶原蛋白粗溶液用2mol/L NaCl或者(NH4)2SO4溶液盐析，分离盐析悬浊液得到的胶原蛋白盐析物用蒸馏水搅拌透析，用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，即得到胶原蛋白产品。采用本发明的方法制取胶原蛋白，能大大节约胶原蛋白提取时间，提高了胶原蛋白的产率，且所得到的胶原蛋白能完整地保留其特有的三股螺旋结构，可适用于生物医药材料。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白制备技术，尤其是涉及一种从健康动物的皮或/和腱中提取未变性天然胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质，占体内蛋白质总量的25％-30％，相当于体重的6％，是腱、软骨、皮肤和血管蛋白质的主要成分，来源十分广泛。并且由于其独特的三股螺旋结构特点，以及良好的生物兼容性和可生物降解性，在烧伤、组织修复、创面止血、眼角膜疾病、矫形、药物控释系统等医药卫生领域都有着广泛的应用。
目前，胶原蛋白的提取及制备方法主要有中性盐法、酸法、碱法和酶法。如CN 1903918A和CN 1155549A分别介绍了以罗非鱼皮和动物结缔组织为原料酸法制备胶原蛋白的方法；CN 1385489A介绍了一种从新鲜鸡胸软骨中碱法提取胶原蛋白的方法；CN 101061827A和CN 101033481A分别介绍了以鱼皮、鱼骨和猪、牛、羊骨为原料提取胶原蛋白的方法。此外，人们还经常将上述几种方法联合使用来提取胶原蛋白，如CN 1915437A介绍了一种以酸、中性盐和酶相结合的胶原蛋白提取法；CN 1653087A介绍了酸、酶法提取动物皮中胶原蛋白的方法。不过，上述这些方法胶原蛋白的提取时间一般都较长，通常要超过30小时，且产率不高，一般不高于1.3mg/mL，造成了能源和资源的浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的从动物皮或/和腱中提取未变性天然胶原蛋白的方法，以克服现有技术从动物皮或/和腱提取胶原蛋白的方法所存在的提取时间长、产率低等不足，所制备的胶原蛋白可以用于医药卫生材料。
本发明的发明人通过研究发现，在一定的超声功率范围，超声波的作用不会引起胶原三股螺旋结构的破坏；而且与通常所用的胶原蛋白提取方法相比，可以大大缩短胶原蛋白的提取时间并提高胶原得率。本发明正是发明人基于这样的发现通过进一步研究而完成的。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现。
从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，包括以下提取步骤：
(1)去除油脂和杂质并经丙酮浸泡预处理后的健康的猪、牛或羊的皮或/和腱原料屑，加入反应器用0.5～1.0mol/L醋酸溶液进行浸泡，浸泡充分后加入胃蛋白酶，将反应器置于超声水浴中，对反应器内的酶解反应物料实施超声波辐照，在有搅拌的条件下进行超声波辐照酶解，酶解温度5～25℃，酶解时间12～30小时，超声波功率100～145W/5g；
(2)用0.5～1.0mol/L醋酸溶液在不断搅拌的条件下将酶解液稀释3～5倍，分离去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液；
(3)胶原蛋白粗溶液用其体积0.8～1.2倍的2mol/LNaCl或者(NH4)2SO4溶液进行盐析，经充分盐析得到盐析悬浊液；
(4)对盐析悬浊液实施分离，将得到的胶原蛋白盐析物用蒸馏水搅拌透析，至透析袋外蒸馏水的电导率接近蒸馏水为止；
(5)用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，即得到胶原蛋白产品。
在上述技术方案中，所说的超声波辐照酶解最好是超声波通过介质水对反应器内的酶解反应物料实施超声波辐照，通常是将反应器置于超声水浴中，对反应器内的酶解反应物料实施超声波辐照。超声波的功率一般控制在85～150W/5g的范围；优选范围为100～145W/5g。
在上述技术方案中，所说的原料屑是由健康动物皮或/和腱去除表面油脂和杂质，制切成小块，经丙酮浸泡12～24hrs后，取出自然干燥，用粉碎机破碎成屑。
在上述技术方案中，所说的原料屑与浸泡醋酸溶液的用量按干重计，原料屑10重量份，浓度为0.5～1.0mol/L醋酸溶液250～800重量份。
在上述技术方案中，所说的原料屑与胃蛋白酶的用量按干重计的比例一般为1/100～1/20，优选比例为1/50～1/30。
在上述技术方案中，胶原蛋白粗溶液最好是用与其体积基本相等的2mol/L NaCl或者(NH4)2SO4溶液进行盐析。
在上述技术方案中，所说的去除酶解液中未酶解完全部分的分离和获取盐析悬浊液中胶原蛋白盐析物的分离均是采用离心分离。
在上述技术方案中，所说的动物皮为健康猪、牛或羊的皮。
本发明还采取了其他一些技术措施。
本发明所提供的胶原蛋白提取方法与已有技术相比，具有以下优点：
(1)超声波在天然未变性胶原提取中的应用，不仅可以节约提取时间，而且可提高胶原蛋白的得率，有利于节约能源，并提高资源的利用效率，克服了已有研究认为超声波辐照不能改善胶原蛋白的提取过程的偏见。
(2)使用本发明技术得到的胶原蛋白能完整地保留其特有的三股螺旋结构，适用于生物医药材料。
(3)本发明技术对其它胶原蛋白相关产品，如胶原蛋白水解物的制备等也同样具有借鉴意义。
附图说明
图1是通过紫外可见分光光度法测量出的胶原蛋白提取液浓度随时间变化的曲线图，曲线a是采用本发明方法时的提取液浓度随时间变化曲线，曲线b是采用传统方法时的提取液浓度随时间变化曲线。
具体实施方式
下面通过四个实施例对本发明进行具体的描述，但有必要在此指出的是，实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整
实施例1
(1)原料预处理：以清洁新鲜的健康猪皮为原料。尽量去除猪皮表面的油脂和杂质，然后将原料切成小块。在丙酮中浸泡约24hrs后，取出并自然干燥，之后用粉碎机将原料打成屑。
(2)酶解：称取10重量份原料屑，加入装有搅拌机和温度计的反应器中，加入0.5mol/L醋酸溶液500重量份，浸泡约1h后加入胃蛋白酶0.25重量份，然后将反应器置于功率为120W/5g的超声水浴中，在20℃左右下开动搅拌机超声 酶解约24小时。
(3)离心：使用0.5mol/L醋酸溶液将酶解液稀释3倍，并不断搅拌。离心去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液。
(4)盐析：配制与胶原蛋白粗溶液等体积的2mol/L NaCl溶液，与酶解液在搅拌的条件下慢慢共混，之后过夜盐析。
(5)透析：离心盐析后的悬浊液，得胶原蛋白的盐析物。将盐析物在蒸馏水中透析，并不断磁力搅拌，至透析袋外蒸馏水的电导率接近蒸馏水为止。
(6)冻干：用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，得到胶原蛋白。
实施例2
(1)原料预处理：以清洁新鲜的牛跟腱为原料。尽量去除跟腱表面的油脂和杂质，然后将原料切成小块。在丙酮中浸泡约12hrs后，取出并自然干燥，之后用粉碎机将原料打成屑。
(2)酶解：称取10重量份原料屑，加入装有搅拌机和温度计的反应器中，加入0.5mol/L醋酸溶液800重量份，浸泡约1h后加入胃蛋白酶0.2重量份，然后将反应器置于功率为100W/5g超声水浴中，在20℃左右下开动搅拌机超声酶解约12小时。
(3)离心：使用1mol/L醋酸溶液将酶解液稀释5倍，并不断搅拌。离心去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液。
(4)盐析：配制胶原蛋白粗溶液体积1.1倍的2mol/L NaCl溶液，与酶解液在搅拌的条件下慢慢共混，之后过夜盐析。
(5)透析：离心盐析后的悬浊液，得胶原蛋白的盐析物。将盐析物在蒸馏水中透析，并不断磁力搅拌，至透析袋外蒸馏水的电导率接近蒸馏水为止。
(6)冻干：用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，得到胶原蛋白。
实施例3
(1)原料预处理：以清洁新鲜的羊皮原料。尽量去除原料表面的油脂和杂质，然后将原料切成小块。在丙酮中浸泡约24hrs后，取出并自然干燥，之后用粉碎机将原料打成屑。
(2)酶解：称取10重量份原料屑，加入装有搅拌机和温度计的反应器中， 加入1.0mol/L醋酸溶液250重量份，浸泡约1h后加入胃蛋白酶0.3重量份，然后将反应器置于功率为120W/5g超声水浴中，在25℃左右下开动搅拌机超声酶解约12小时。
(3)离心：使用1.0mol/L醋酸溶液将酶解液稀释3倍，并不断搅拌。离心去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液。
(4)盐析：配制胶原蛋白粗溶液体积0.9倍的2mol/L(NH4)2SO4溶液，与酶解液在搅拌的条件下慢慢共混，之后过夜盐析。
(5)透析：离心盐析后的悬浊液，得胶原蛋白的盐析物。将盐析物在蒸馏水中透析，并不断磁力搅拌，至透析袋外蒸馏水的电导率接近蒸馏水为止。
(6)冻干：用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，得到胶原蛋白。
实施例4
(1)原料预处理：以清洁新鲜的猪肌腱为原料。尽量去除肌腱表面的油脂和杂质，然后将原料切成小块。在丙酮中浸泡12hrs后，取出并自然干燥，之后用粉碎机将原料打成屑。
(2)酶解：称取10重量份原料屑，加入装有搅拌机和温度计的反应器中，加入0.5mol/L醋酸溶液800重量份，浸泡约1h后加入胃蛋白酶0.1重量份，然后将反应器置于功率为85W/5g超声水浴中，在20℃左右下开动搅拌机超声酶解约20小时。
(3)离心：使用1mol/L醋酸溶液将酶解液稀释5倍，并不断搅拌。离心去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液。
(4)盐析：配制与胶原蛋白粗溶液等体积的2mol/L(NH4)2SO4溶液，与酶解液在搅拌的条件下慢慢共混，之后过夜盐析。
(5)透析：离心盐析后的悬浊液，得胶原蛋白的盐析物。将盐析物在蒸馏水中透析，并不断磁力搅拌，至透析袋外蒸馏水的电导率接近蒸馏水为止。
(6)冻干：用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，得到胶原蛋白。
Claims (7)
1.一种从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于包括以下提取步骤：
(1)去除油脂和杂质并经丙酮浸泡预处理后的健康的猪、牛或羊的皮或/和腱原料屑，加入反应器用0.5～1.0mol/L醋酸溶液进行浸泡，浸泡充分后加入胃蛋白酶，将反应器置于超声水浴中，对反应器内的酶解反应物料实施超声波辐照，在有搅拌的条件下进行超声波辐照酶解，酶解温度5～25℃，酶解时间12～30小时，超声波功率100～145W/5g；
(2)用0.5～1.0mol/L醋酸溶液在不断搅拌的条件下将酶解液稀释3～5倍，分离去除酶解液中未酶解完全的部分，得到胶原蛋白粗溶液；
(3)胶原蛋白粗溶液用其体积0.8～1.2倍的2mol/LNaCl或者(NH4)2SO4溶液进行盐析，经充分盐析得到盐析悬浊液；
(4)对盐析悬浊液实施分离，将得到的胶原蛋白盐析物用蒸馏水搅拌透析，至透析袋外蒸馏水的电导率接近蒸馏水为止；
(5)用冷冻干燥机将透析后的产物冻干，即得到胶原蛋白产品。
2.如权利要求1所述的从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于原料屑是由健康的猪、牛或羊的皮或/和腱去除表面油脂和杂质，制切成小块，经丙酮浸泡12～24小时后，取出自然干燥，用粉碎机破碎成屑。
3.如权利要求1所述的从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于原料屑与浸泡醋酸溶液的用量按干重计，原料屑10重量份，浓度为0.5～1.0mol/L醋酸溶液250～800重量份。
4.如权利要求1所述的从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于原料屑与胃蛋白酶的用量按干重计的比例为1/100～1/20。
5.如权利要求4所述的从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于原料屑与胃蛋白酶的用量按干重计的比例为1/50～1/30。
6.如权利要求1所述的从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于胶原蛋白粗溶液用与其体积基本相等的2mol/L NaCl或者(NH4)2SO4溶液进行盐析。
7.如权利要求1所述的从动物皮或/和腱提取未变性天然胶原蛋白的方法，其特征在于分离去除酶解液中未酶解完全的部分和分离盐析悬浊液得到胶原蛋白盐析物均是采用离心分离。
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Address after: 214000, Jiangsu province Wuxi Binhu District Mashan biological pharmaceutical industry park (business premises):No. 132, Meiliang Road, Mashan District, Wuxi Patentee after: Wuxi Betty biological engineering Limited by Share Ltd Address before: 214092, Mashan biological pharmaceutical industry park (Ziyun Road), Binhu District, Jiangsu, Wuxi Province Patentee before: Wuxi Biot Bio-technology Co., Ltd. |
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Addressee: Wei Ling Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |