CN103773828A - 从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，按以下步骤进行：将鱼鳞进破碎、热挤压，加水稀释成鱼鳞浆后，加入鱼鳞重量1～3%的蛋白酶酶进行酶解，在酶解过程中利用超声波辅助酶解，酶解完成后灭酶；将灭酶后的鱼鳞浆过滤，将滤液上大孔树脂柱，依次用乙醇溶液和氨水洗脱，收集氨水洗脱液经超滤膜除杂、纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白。本发明无需酸碱预处理，不会对环境造成污染，分离提纯效果好且不会影响胶原蛋白的生物活性。

Description

从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，主要涉及从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法。
背景技术
胶原蛋白是一种重要的功能性蛋白质，它有多种生物学功能，如促进伤口愈合、止血等，抗原性较低，可促进骨骼的形成，增强皮肤代谢等，它还与细胞增生、运动、分化、免疫等功能密切相关。目前，胶原蛋白已被广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。目前的胶原蛋白都是从牛皮、猪皮或皮革废弃物中提取的，考虑到如疯牛病、口蹄疫等不安全因素的存在，一些发达国家目前正禁止从猪皮或牛皮中提取胶原蛋白。相比之下，水生动物性胶原蛋白比陆生动物性胶原蛋白具有更高的安全性。
中国是世界上最大的淡水鱼养殖国家，每年废弃的淡水鱼鱼鳞高达5万吨，研究显示，鱼鳞中胶原蛋白含量高达45%。我国关于鱼鳞制备胶原蛋白的专利文献较多，传统工艺中提取胶原蛋白之前需要用大量的酸碱浸泡鱼鳞，以脱去鱼鳞中的灰分，便于后续胶原蛋白的提取。如公开号为CN1775950A的中国专利公开了一种鱼鳞胶原蛋白生产工艺，该工艺采用两次酸碱处理鱼鳞，产生大量的酸液、碱液会对环境造成很大的污染，且引入大量的无机盐增大了后续工作中脱盐的压力，并且产品的分子量不易控制。对鱼鳞进行酸碱预处理后加入蛋白酶水解，酶解耗时较长，导致生产效率低下，生产成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，该方法无需酸碱预处理，不会对环境造成污染，分离提纯效果好且不会影响胶原蛋白的生物活性。
本发明要提供的技术方案是从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
1）将洗净后的鱼鳞进行机械破碎处理；
2）将破碎后的鱼鳞加水置于双螺杆蒸煮热挤压机中，在100～121℃、螺杆转速为50～80转/min条件下热挤压0.5～1小时，得到鱼鳞浓浆；
3）加水稀释鱼鳞浓浆得到鱼鳞浆，往鱼鳞浆中加入鱼鳞重量1%～3%的蛋白酶，在45～60℃下进行酶解2～4小时，酶解完毕后加热至90℃，保温10～30min进行酶灭活；在酶解过程中，利用超声波辅助酶解，其作用时间为20～30min，其功率为200～700w；
4）将灭活后的鱼鳞浆降温至50～55℃，静置沉淀，过滤，得滤液；
5）将滤液上大孔树脂柱，依次用乙醇溶液和氨水洗脱，收集氨水洗脱液；所述的乙醇体积浓度为10～40%，氨水的pH值为7.2～7.6；
6）将氨水洗脱液经超滤膜除杂、纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白。
步骤2）中，水的加入量为鱼鳞重量的5%～10%。
步骤3）中，水的加入量为鱼鳞浓浆重量的8～10倍。
步骤3）中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶。
步骤5）中，滤液上大孔树脂柱的条件为：pH5.5～6.5，上柱流速为3～5BV/h，上柱体积为5～7BV。
步骤5）中，乙醇洗脱条件为：上柱流速为1～3BV/h，用量为2～4BV。
步骤5）中，氨水洗脱条件为：上柱流速为1～3BV/h，用量为2～4BV。
步骤6）中，所述的超滤膜的膜孔径为3000～4000Dal。
步骤6）中，所述的纳滤膜的膜孔径为150～500Dal。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）本发明采用高压蒸煮将胶原蛋白与鱼鳞分离，无需酸碱预处理，不会对环境造成污染。
2）本发明利用超声波的空化效应、机械效应能促使动物组织破壁或变性，使目标分子充分溶出，具有减少酶解时间、提高酶解效率的优点。
3）采用大孔树脂、超滤、纳滤技术能有效分离纯化胶原蛋白，所得产品纯度高达90%以上，生物活性好且没有腥味。
具体实施方式
以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1）将洗净后的鱼鳞进行机械破碎处理；
2）将破碎后的鱼鳞和鱼鳞重量5%的水一并置于双螺杆蒸煮热挤压机中，在100℃、螺杆转速为50转/min条件下热挤压0.5小时，得到鱼鳞浓浆；
3）加鱼鳞浓浆重量8倍的水将鱼鳞浓浆稀释成鱼鳞浆，往鱼鳞浆中加入鱼鳞重量1%的木瓜蛋白酶，在45℃下进行酶解2小时，酶解完毕后加热至90℃，保温10min进行酶灭活；在酶解过程中，利用超声波辅助酶解，其作用时间为20min，其功率为200w；
4）将灭活后的鱼鳞浆降温至50℃，静置沉淀，过滤，得滤液；
5）将滤液上大孔树脂柱，上柱条件为：pH5.5，上柱流速为3BV/h，上柱体积为5BV，上柱结束后，依次用体积浓度为10%的乙醇溶液和pH值为7.2的氨水洗脱，乙醇的洗脱速度为1BV/h，用量为2BV；氨水的洗脱速度为1BV/h，用量为2BV；收集氨水洗脱液；
6）将氨水洗脱液经膜孔径为3000Dal的超滤膜除杂、膜孔径为150Dal的纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白，检测胶原蛋白的纯度为90.45%。
实施例2
1）将洗净后的鱼鳞进行机械破碎处理；
2）将破碎后的鱼鳞和鱼鳞重量10%的水一并置于双螺杆蒸煮热挤压机中，在121℃、螺杆转速为80转/min条件下热挤压1小时，得到鱼鳞浓浆；
3）加鱼鳞浓浆重量10倍的水将鱼鳞浓浆稀释成鱼鳞浆，往鱼鳞浆中加入鱼鳞重量3%的胰蛋白酶，在60℃下进行酶解4小时，酶解完毕后加热至90℃，保温30min进行酶灭活；在酶解过程中，利用超声波辅助酶解，其作用时间为30min，其功率为700w；
4）将灭活后的鱼鳞浆降温至55℃，静置沉淀，过滤，得滤液；
5）将滤液上大孔树脂柱，上柱条件为：pH6.5，上柱流速为5BV/h，上柱体积为7BV，上柱结束后，依次用体积浓度为40%的乙醇溶液和pH值为7.6的氨水洗脱，乙醇的洗脱速度为3BV/h，用量为4BV；氨水的洗脱速度为3BV/h，用量为4BV；收集氨水洗脱液；
6）将氨水洗脱液经膜孔径为4000Dal的超滤膜除杂、膜孔径为500Dal的纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白，检测胶原蛋白的纯度达92.57%。
实施例3
1）将洗净后的鱼鳞进行机械破碎处理；
2）将破碎后的鱼鳞和鱼鳞重量8%的水一并置于双螺杆蒸煮热挤压机中，在110℃、螺杆转速为65转/min条件下热挤压0.8小时，得到鱼鳞浓浆；
3）加鱼鳞浓浆重量9倍的水将鱼鳞浓浆稀释成鱼鳞浆，往鱼鳞浆中加入鱼鳞重量2%的菠萝蛋白酶，在55℃下进行酶解3小时，酶解完毕后加热至90℃，保温20min进行酶灭活；在酶解过程中，利用超声波辅助酶解，其作用时间为25min，其功率为400w；
4）将灭活后的鱼鳞浆降温至52℃，静置沉淀，过滤，得滤液；
5）将滤液上大孔树脂柱，上柱条件为：pH6.0，上柱流速为4BV/h，上柱体积为6BV，上柱结束后，依次用体积浓度为30%的乙醇溶液和pH值为7.4的氨水洗脱，乙醇的洗脱速度为2BV/h，用量为3BV；氨水的洗脱速度为2BV/h，用量为3BV；收集氨水洗脱液；
6）将氨水洗脱液经膜孔径为3500Dal的超滤膜除杂、膜孔径为350Dal的纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白，检测胶原蛋白的纯度为91.21%。
实施例4
1）将洗净后的鱼鳞进行机械破碎处理；
2）将破碎后的鱼鳞和鱼鳞重量5%的水一并置于双螺杆蒸煮热挤压机中，在121℃、螺杆转速为50转/min条件下热挤压1小时，得到鱼鳞浓浆；
3）加鱼鳞浓浆重量8倍的水将鱼鳞浓浆稀释成鱼鳞浆，往鱼鳞浆中加入鱼鳞重量3%的木瓜蛋白酶，在45℃下进行酶解4小时，酶解完毕后加热至90℃，保温10min进行酶灭活；在酶解过程中，利用超声波辅助酶解，其作用时间为30min，其功率为200w；
4）将灭活后的鱼鳞浆降温至55℃，静置沉淀，过滤，得滤液；
5）将滤液上大孔树脂柱，上柱条件为：pH5.5，上柱流速为5BV/h，上柱体积为5BV，上柱结束后，依次用体积浓度为40%的乙醇溶液和pH值为7.2的氨水洗脱，乙醇的洗脱速度为3BV/h，用量为2BV；氨水的洗脱速度为3BV/h，用量为2BV；收集氨水洗脱液；
6）将氨水洗脱液经膜孔径为4000Dal的超滤膜除杂、膜孔径为150Dal的纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白，检测胶原蛋白的纯度为90.47%。

Claims (9)

1.从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）将洗净后的鱼鳞进行机械破碎处理；
2）将破碎后的鱼鳞加水置于双螺杆蒸煮热挤压机中，在100～121℃、螺杆转速为50～80转/min条件下热挤压0.5～1小时，得到鱼鳞浓浆；
3）加水稀释鱼鳞浓浆得到鱼鳞浆，往鱼鳞浆中加入鱼鳞重量1%～3%的蛋白酶，在45～60℃下进行酶解2～4小时，酶解完毕后加热至90℃，保温10～30min进行酶灭活；在酶解过程中，利用超声波辅助酶解，其作用时间为20～30min，其功率为200～700w；
4）将灭活后的鱼鳞浆降温至50～55℃，静置沉淀，过滤，得滤液；
5）将滤液上大孔树脂柱，依次用乙醇溶液和氨水洗脱，收集氨水洗脱液；所述的乙醇体积浓度为10～40%，氨水的pH值为7.2～7.6；
6）将氨水洗脱液经超滤膜除杂、纳滤膜浓缩、喷雾干燥后，即为胶原蛋白。
2.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤2）中，水的加入量为鱼鳞重量的5%～10%。
3.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤3）中，水的加入量为鱼鳞浓浆重量的8～10倍。
4.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤3）中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝蛋白酶。
5.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤5）中，滤液上大孔树脂柱的条件为：pH5.5～6.5，上柱流速为3～5BV/h，上柱体积为5～7BV。
6.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤5）中，乙醇洗脱条件为：上柱流速为1～3BV/h，用量为2～4BV。
7.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤5）中，氨水洗脱条件为：上柱流速为1～3BV/h，用量为2～4BV。
8.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤6）中，所述的超滤膜的膜孔径为3000～4000Dal。
9.根据权利要求1所述的从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤6）中，所述的纳滤膜的膜孔径为150～500Dal。
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