CN114805550B - 一种用牛皮生产胶原三肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用牛皮生产胶原三肽的方法，是由以下步骤制得的：预处理、变性处理、激发处理、胶原三肽液，将胶原三肽液灭酶、离心，收集上清液，K15活性碳柱脱色脱味，喷雾干燥，得胶原三肽。本发明的方法可以彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，胶原三肽得率高，羟脯氨酸含量高，总氮含量高，灰分含量低，成品细腻，水溶性好，有利于规模化生产。
Description
技术领域
本发明属于活性物质提取技术领域，特别涉及一种用牛皮生产胶原三肽的方法。
背景技术
胶原蛋白富含人体需要的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等胶原蛋白特征氨基酸。胶原蛋白是一种高分子功能性蛋白质，它是皮肤的主要组成部分，占皮肤真皮层80％的比重，它在皮肤中构成了一张细密的弹力网，牢固锁住水分，支撑着皮肤。胶原蛋白是由三条肽链拧成的螺旋纤维状蛋白质，也是人体内含量最丰富的蛋白质，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位，大约占人体总蛋白质的30％以上，是人体细胞特别是肌肤细胞外基质中重要组成部分。胶原蛋白是大分子蛋白质，其分子量在300,000Da以上，不能被人体直接吸收。
胶原的最小单元是胶原三肽(Collagentripeptide)简称CTP，其结构可以表示为(Gly-X-Y)，是一种在N端带有甘氨酸的高纯度的胶原三肽。胶原三肽具有多种生物活性，如促进皮肤再生、骨骼生长、抗氧化、抗动脉粥样硬化等。在应用于皮肤表面时，具有良好的细胞黏结性、吸收性和生物相溶性，在化妆品中作为保湿剂和皮肤保护剂，可促进上皮细胞形成，直接补充人体流失的胶原蛋白，延缓皮肤衰老，可用于祛皱、保湿和修复等。微量射线自动照相法研究表明，CTP具有约280Da的平均分子量。而目前市场上的绝大多数胶原肽，主要由30至100个氨基酸构成多聚氨基酸平均分子量达3000-10000Da，其生物利用率有限。
动物皮因来源丰富、价格低廉而成为提取胶原的常用材料。牛皮作为肉食工业牛肉的加工副产物除部分用于制革工业外，其余有待开发和利用。现有的胶原三肽产率低、纯度不高，严重制约了胶原三肽的深度开发和应用。
发明内容
本发明提供了一种可以彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，胶原三肽得率高，水溶性好的用牛皮生产胶原三肽的方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种用牛皮生产胶原三肽的方法，是由以下步骤制得的：
1)预处理：取鲜牛皮，清洗干净，脱毛，切割成不大于4×4mm的小块，加至质量分数为3-7％的氯化钠溶液中，常温浸泡1h，控干水分，再加至0.1mol/L的NaOH溶液中，3-5℃条件下搅拌均匀，浸泡2-4d，水洗3-5次，得预处理牛皮；
所述的，牛皮与氯化钠溶液、NaOH溶液的重量比为1：4-6：3-5。
牛皮先经氯化钠溶液常温浸泡，去除牛皮上的部分脂肪、杂蛋白等杂质；再经NaOH溶液搅拌处理，去除牛皮中非胶原蛋白的同时，还可以松散牛皮纤维，改善牛皮的组织结构，显著提高其渗透性，缩短提取时间。
2)变性处理：将预处理牛皮和水按照1：5的质量比混合，0.8-1.0MPa条件下，100℃煮沸20-30min，降温至50-60℃，双层纱布滤去残渣，得变性牛皮；
高温高压条件下进行变性处理，使牛皮中的胶原蛋白分子迅速解螺旋并发生断裂，破坏其稳定结构。
3)激发处理：将变性牛皮加至激发液中，35-45℃条件下浸泡30-50min，升温至80-85℃，保持3-5min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得激发牛皮粉；
所述的，变性牛皮与激发液的重量比为1：4-6。
所述的，激发液是由以下重量份的原料制得的：L-精氨酸2-4份、水溶性壳聚糖3-5份、硫酸钠5-7份、三氯蔗糖2份、水100份。
通过激发处理，使得牛皮胶原蛋白上的排斥电荷增多，从而引起胶原蛋白的各种次级键断裂，使变性牛皮由紧密构象变成松散的无序状态；升温至80-85℃，破坏胶原蛋白分子非共价键平衡，显著提高胶原三肽的提取率。
4)胶原三肽液的制备：将激发牛皮粉与水按照1：5的重量比混合均匀，降温至-10℃保持5min；再升温50℃，甲酸调节pH值为6，加入复合蛋白酶和促进剂，50℃条件下酶解3-5h；再加入碱性蛋白酶，60℃条件下酶解2-3h，得胶原三肽液；
所述的，激发牛皮粉、复合蛋白酶、促进剂、碱性蛋白酶的的重量比为100：4-6：0.03：0.7-0.9。
所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按照10：3-5：2-4的重量比制得的。
所述的，促进剂为Fe3O4磁性石墨烯，饱和磁化强度为67.9emu/g。
所述的，Fe3O4磁性石墨烯中，还原氧化石墨烯(＜5μm)，Fe3O4纳米颗粒的粒径为10nm。
本发明中，使用甲酸调解pH值，可以促进酶解反应，使牛皮中的三股螺旋结构被彻底破坏，提高胶原三肽提取率。复合蛋白酶协同配合促进牛皮胶原蛋白的酶解，促进剂可以激发复合蛋白酶的酶活力，提高酶解效率，缩短酶解时间，进而提高胶原三肽的的产率；再添加少量碱性蛋白酶，可实现彻底酶解胶原蛋白的目的，酶解产物分子量小且集中，酶解产物游离氨基酸含量低，低分子量胶原三肽含量高。
5)将胶原三肽液灭酶、离心，收集上清液，K15活性碳柱脱色脱味，喷雾干燥，得胶原三肽。
本发明的有益效果：
1、本发明预处理去除牛皮上的部分脂肪、非胶原蛋白的同时，还可以松散牛皮纤维，缩短提取时间。变性处理使牛皮中的胶原蛋白分子迅速解螺旋并发生断裂，破坏其稳定结构。激发处理可引起胶原蛋白的各种次级键断裂，显著提高胶原三肽的提取率。复合蛋白酶协同配合促进牛皮胶原蛋白的酶解，促进剂可以激发复合蛋白酶的酶活力，提高酶解效率，缩短酶解时间；再添加少量碱性蛋白酶，可实现彻底酶解胶原蛋白的目的，低分子量胶原三肽含量高。
2、本发明的方法可以彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，胶原三肽得率高，羟脯氨酸含量高，总氮含量高，灰分含量低，成品细腻，水溶性好，有利于规模化生产。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。
实施例1
一种用牛皮生产胶原三肽的方法，是由以下步骤制得的：
1)预处理：取鲜牛皮，清洗干净，脱毛，切割成不大于4×4mm的小块，加至质量分数为5％的氯化钠溶液中，常温浸泡1h，控干水分，再加至0.1mol/L的NaOH溶液中，4℃条件下搅拌均匀，浸泡3d，水洗4次，得预处理牛皮；
所述的，牛皮与氯化钠溶液、NaOH溶液的重量比为1：5：4。
2)变性处理：将预处理牛皮和水按照1：5的质量比混合，0.9MPa条件下，100℃煮沸25min，降温至55℃，双层纱布滤去残渣，得变性牛皮；
3)激发处理：将变性牛皮加至激发液中，40℃条件下浸泡40min，升温至83℃，保持4min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得激发牛皮粉；
所述的，变性牛皮与激发液的重量比为1：5。
所述的，激发液是由以下重量份的原料制得的：L-精氨酸3份、水溶性壳聚糖4份、硫酸钠6份、三氯蔗糖2份、水100份。
4)胶原三肽液的制备：将激发牛皮粉与水按照1：5的重量比混合均匀，降温至-10℃保持5min；再升温50℃，甲酸调节pH值为6，加入复合蛋白酶和促进剂，50℃条件下酶解4h；再加入碱性蛋白酶，60℃条件下酶解2.5h，得胶原三肽液；
所述的，激发牛皮粉、复合蛋白酶、促进剂、碱性蛋白酶的的重量比为100：5：0.03：0.8。
所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按照10：4：3的重量比制得的。
所述的，促进剂为Fe3O4磁性石墨烯，饱和磁化强度为67.9emu/g。
所述的，Fe3O4磁性石墨烯中，还原氧化石墨烯(＜5μm)，Fe3O4纳米颗粒的粒径为10nm。
5)将胶原三肽液灭酶、离心，收集上清液，K15活性碳柱脱色脱味，喷雾干燥，得胶原三肽。
实施例2
一种用牛皮生产胶原三肽的方法，是由以下步骤制得的：
1)预处理：取鲜牛皮，清洗干净，脱毛，切割成不大于4×4mm的小块，加至质量分数为3％的氯化钠溶液中，常温浸泡1h，控干水分，再加至0.1mol/L的NaOH溶液中，5℃条件下搅拌均匀，浸泡2d，水洗5次，得预处理牛皮；
所述的，牛皮与氯化钠溶液、NaOH溶液的重量比为1：4：3。
2)变性处理：将预处理牛皮和水按照1：5的质量比混合，1.0MPa条件下，100℃煮沸30min，降温至50℃，双层纱布滤去残渣，得变性牛皮；
3)激发处理：将变性牛皮加至激发液中，35℃条件下浸泡50min，升温至80℃，保持5min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得激发牛皮粉；
所述的，变性牛皮与激发液的重量比为1：6。
所述的，激发液是由以下重量份的原料制得的：L-精氨酸2份、水溶性壳聚糖3份、硫酸钠7份、三氯蔗糖2份、水100份。
4)胶原三肽液的制备：将激发牛皮粉与水按照1：5的重量比混合均匀，降温至-10℃保持5min；再升温50℃，甲酸调节pH值为6，加入复合蛋白酶和促进剂，50℃条件下酶解3h；再加入碱性蛋白酶，60℃条件下酶解2h，得胶原三肽液；
所述的，激发牛皮粉、复合蛋白酶、促进剂、碱性蛋白酶的的重量比为100：6：0.03：0.7。
所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按照10：5：2的重量比制得的。
所述的，促进剂为Fe3O4磁性石墨烯，饱和磁化强度为67.9emu/g。
所述的，Fe3O4磁性石墨烯中，还原氧化石墨烯(＜5μm)，Fe3O4纳米颗粒的粒径为10nm。
5)将胶原三肽液灭酶、离心，收集上清液，K15活性碳柱脱色脱味，喷雾干燥，得胶原三肽。
实施例3
一种用牛皮生产胶原三肽的方法，是由以下步骤制得的：
1)预处理：取鲜牛皮，清洗干净，脱毛，切割成不大于4×4mm的小块，加至质量分数为7％的氯化钠溶液中，常温浸泡1h，控干水分，再加至0.1mol/L的NaOH溶液中，3℃条件下搅拌均匀，浸泡4d，水洗3次，得预处理牛皮；
所述的，牛皮与氯化钠溶液、NaOH溶液的重量比为1：6：5。
2)变性处理：将预处理牛皮和水按照1：5的质量比混合，0.8MPa条件下，100℃煮沸20min，降温至60℃，双层纱布滤去残渣，得变性牛皮；
3)激发处理：将变性牛皮加至激发液中，45℃条件下浸泡30min，升温至85℃，保持3min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得激发牛皮粉；
所述的，变性牛皮与激发液的重量比为1：4。
所述的，激发液是由以下重量份的原料制得的：L-精氨酸4份、水溶性壳聚糖5份、硫酸钠5份、三氯蔗糖2份、水100份。
4)胶原三肽液的制备：将激发牛皮粉与水按照1：5的重量比混合均匀，降温至-10℃保持5min；再升温50℃，甲酸调节pH值为6，加入复合蛋白酶和促进剂，50℃条件下酶解5h；再加入碱性蛋白酶，60℃条件下酶解3h，得胶原三肽液；
所述的，激发牛皮粉、复合蛋白酶、促进剂、碱性蛋白酶的的重量比为100：4：0.03：0.9。
所述的，复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按照10：3：4的重量比制得的。
所述的，促进剂为Fe3O4磁性石墨烯，饱和磁化强度为67.9emu/g。
所述的，Fe3O4磁性石墨烯中，还原氧化石墨烯(＜5μm)，Fe3O4纳米颗粒的粒径为10nm。
5)将胶原三肽液灭酶、离心，收集上清液，K15活性碳柱脱色脱味，喷雾干燥，得胶原三肽。
对比例1
和实施例1不同之处在于，将步骤2)中0.9MPa条件更改为常压条件。
对比例2
和实施例1不同之处在于，将步骤3)中的激发剂更换为水。
对比例3
和实施例1不同之处在于，未使用促进剂。
对比例4
和实施例1不同之处在于，将胶原三肽液的制备中的碱性蛋白酶处理删除，将酶解时间延长至6.5h。
性能测试
将实施例1-3和对比例1-3制备的鱼胶原蛋白肽进行性能测试，分子量分布参照《中华人民共和国国家标准GB/T22729-2008》附录A中的方法进行；羟脯氨酸检测方法参照《中华人民共和国国家标准GB/T9695.23-2008》进行，以干基计；总氮检测方法参照《中华人民共和国国家标准GB/T5009.5-2016》进行，以干基计；灰分检测方法参照《中华人民共和国国家标准GB/T5009.4-2016》进行。结果如下表1所示。
表1实施例1-3和对比例1-4制备的胶原三肽性能测试结果
由表1可知，实施例1-3制备的酶解产物分子量小且集中，酶解产物中小于200Da的游离氨基酸含量低，分子量小于1000Da的胶原三肽比例高达100％，介于200-500Da的胶原蛋白三肽比例达到86％以上，羟脯氨酸含量大于10.5g/100g，总氮含量高于17g/100g，灰分含量小于0.5g/100g。由以上内容可知，本发明的方法可以彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，低分子量胶原三肽得率高，羟脯氨酸含量高，总氮含量高，灰分含量低。
透光率试验
分别将实施例1-3和对比例1-4制备的胶原三肽粉末8g倒入不同杯中，用300mL 60℃左右温开水溶解，得胶原三肽溶解液，5s后肉眼观察溶解液，紫外分光光度计在620nm下检测胶原三肽溶解液的透光率，结果如表2所示。
澄清透明、无任何沉淀。1s时间内即全部溶解，
表2透光率试验结果
| 项目 | 溶解时间/s | 形态 | 透光率/％ |
| 实施例1 | 1 | 澄清透明、无沉淀 | 96 |
| 实施例2 | 1 | 澄清透明、无沉淀 | 96 |
| 实施例3 | 1 | 澄清透明、无沉淀 | 95 |
| 对比例1 | 2 | 澄清透明、无沉淀 | 90 |
| 对比例2 | 1 | 澄清透明、无沉淀 | 92 |
| 对比例3 | 1 | 澄清透明、少许沉淀 | 88 |
| 对比例4 | 2 | 澄清透明、少许沉淀 | 86 |
由表2可知，本发明制备的胶原三肽溶解时间短，极易溶于水，溶于水后的溶解液澄清透明，无任何沉淀，透光率高。
最后应说明的是：以上具体实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述具体实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施方式和具体实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种用牛皮生产胶原三肽的方法，其特征在于，是由以下步骤制得的：
1)预处理：取鲜牛皮，清洗干净，脱毛，切割成不大于4×4mm的小块，加至质量分数为3-7％的氯化钠溶液中，常温浸泡1h，控干水分，再加至0.1mol/L的NaOH溶液中，3-5℃条件下搅拌均匀，浸泡2-4d，水洗3-5次，得预处理牛皮；
所述牛皮与氯化钠溶液、NaOH溶液的重量比为1：4-6：3-5；
2)变性处理：将预处理牛皮和水按照1：5的质量比混合，0.8-1.0MPa条件下，100℃煮沸20-30min，降温至50-60℃，双层纱布滤去残渣，得变性牛皮；
3)激发处理：将变性牛皮加至激发液中，35-45℃条件下浸泡30-50min，升温至80-85℃，保持3-5min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80-100目筛，得激发牛皮粉；
所述变性牛皮与激发液的重量比为1：4-6；
所述激发液是由以下重量份的原料制得的：L-精氨酸2-4份、水溶性壳聚糖3-5份、硫酸钠5-7份、三氯蔗糖2份、水100份；
4)胶原三肽液的制备：将激发牛皮粉与水按照1：5的重量比混合均匀，降温至-10℃保持5min；再升温50℃，甲酸调节pH值为6，加入复合蛋白酶和促进剂，50℃条件下酶解3-5h；再加入碱性蛋白酶，60℃条件下酶解2-3h，得胶原三肽液；
所述激发牛皮粉、复合蛋白酶、促进剂、碱性蛋白酶的的重量比为100：4-6：0.03：0.7-0.9；
所述复合蛋白酶是由酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶按照10：3-5：2-4的重量比制得的；
所述促进剂为Fe3O4磁性石墨烯，饱和磁化强度为67.9emu/g；
5)将胶原三肽液灭酶、离心，收集上清液，K15活性碳柱脱色脱味，喷雾干燥，得胶原三肽。
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