KR101831431B1 - 콜라겐 분해효소 제조방법 및 이를 이용한 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명인 콜라겐 분해효소의 제조방법은, 바실러스 서브틸리스 균주를 원심분리하는 제 1단계와, 원심분리된 상등액을 농축시키는 제 2단계와, 이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 제 3단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하며, 콜라겐 트리펩타이드 제조방법은, 전처리된 어린을 물과 2:8의 중량비로 혼합하는 제 1단계와, 상기 혼합물을 90℃에서 5시간 동안 열처리하는 제 2단계와, 상술한 방법에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 투입하여 35℃에서 12시간동안 분해시키는 제 3단계와, 상기 제 3단계에서의 성분에서 원심분리를 통하여 이물질을 제거하는 제 4단계와, 상기 성분을 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 제 5단계와, 상기 정제된 성분을 농축시키는 제 6단계와, 상기 농축된 성분을 활성탄을 이용하여 정제하는 제 7단계와, 상기 성분을 필터를 이용하여 제균하는 제 8단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 콜라겐 트리펩타이드를 특이적으로 많이 만들어내는 콜라겐 분해효소를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드 함량이 높은 콜라겐 트리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
콜라겐(collagen)은 프롤린, 옥시 프롤린, 글리신, 글루타민산 등 약 18종의 아미노산으로 구성된 동물의 섬유성 단백질로서 사람의 경우인체를 구성하고 있는 5,000 종류의 단백질 중 가장 많은 30%를 차지하고 있는 특수한 구조 단백질이다. 특히, 피부, 뼈, 힘줄에 많이 존재하고 있으며 특히 피부 속 진피층 70%는 콜라겐으로 구성되어 있어 콜라겐이 피부 구성 성분으로서 매우 중요한 역할을 하고 있다. 콜라겐은 각종 아미노산이 폴리펩타이드 형태로 결합하여 세 가닥으로 꼬여 있는 형상을 나타내며 분자량은 대략 300,000 정도로 매우 크다.
저분자콜라겐은 콜라겐 분해효소 등에 의해 분해되어 분자량 5,000이하(보통3,000~5,000)로 저분자화 된 것으로 콜라겐 펩타이드라고 불리기도 하며, 이 저분자콜라겐이 인체에 들어오면 인체내 단백질 분해효소에 의해 더욱 분해되어 최종적으로 아미노산 형태로 인체에 흡수된다. 대부분의 단백질의 분자량이 12,000~70,000인데 비하여 콜라겐의 분자량은 300,000으로 매우 커서 흡수되기가 더욱 어렵기 때문에, 저분자콜라겐으로 인체내 소화, 흡수가 용이하도록 추출, 분리, 정제과정을 거친 후 분해과정을 거쳐 분자량이 5,000이하인 펩타이드 형태로 만든 것이다.
콜라겐 트리펩타이드란 아미노산이 3개(글리신-x-y)가 연결되어 있는 작은 콜라겐(분자량이 보통 200~500)을 말하며, 분자량이 작아 피부를 쉽게 투과하는 것으로 알려져 있다. 한편, 아미노산이 4개 이상 연결되어 있으면 분자구조가 커서 피부를 투과하지 못한다. 콜라겐 트리펩타이드는 피부투과 후 곧바로 서로 다시 연결됨으로써 손상된 콜라겐 조직을 복구하는 시간을 단축시키는 데 기여한다. 예를 들면, 아모레퍼시픽에서는 레이져 시술 후 피부의 재생을 촉진하기 위하여 콜라겐 트리펩타이드를 포함하는 조성물에 대한 특허를 출원하였다 (대한민국 공개번호 10-2013-0122569). 또한 섭취하였을 때에도 저분자콜라겐보다 체내 흡수율이 높아 콜라겐의 생체 효능을 극대화시킬 수 있는 장점이 있다.
일반적으로 콜라겐은 주로 소, 돼지, 생선, 오징어 등을 원료로 하며, 효소에 의해 가수분해되어 콜라겐 펩타이드 조성물을 얻을 수 있다. 그러나 일반적으로 사용되어지는 단백질 분해효소에 의해서는 트리펩타이드의 함량이 매우 낮아 고함량 트피펩타이드 조성물을 얻기에는 어려움이 있었다. 따라서 고함량 트리펩타이드 콜라겐 가수분해물을 제조하기 위한 효율적인 제조 방법이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다.
[문헌1] Nagano H et al., " Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2." Biosci Biotehnol Biochem, 2000년, 64(1):181-3
[문헌2] Tran LH et al., " Isolation and Characteristics of Bacillus subtilis CN2 and its Collagenase Production " J Food Sci, 2002년, 67(3):1184-7
상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 콜라겐 트리펩타이드의 수득률이 높은 콜라겐 분해효소의 제조방법을 제공하는 것이다.
그리고, 본 발명의 다른 목적은 수득률이 높은 콜라겐 분해효소를 이용한 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명인 콜라겐 분해효소의 제조방법은, 바실러스 서브틸리스 균주를 원심분리하는 제 1단계와, 원심분리된 상등액을 농축시키는 제 2단계와, 이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 제 3단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 이온교환 크로마토그래피법은, 양이온 교환 크로마토그래피에서를 이용하며 염화나트륨(NaCl)을 0.1 내지 0.3 M 농도로 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 이온교환 크로마토그래피법은, 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하며 염화나트륨(NaCl)을 0.09 내지 0.155 M 농도로 사용하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 본 발명인 다른 실시예인 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법은 상술한 방법으로 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 본 발명의 또 다른 실시예인 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법은, 전처리된 어린을 물과 2:8의 중량비로 혼합하는 제 1단계와, 상기 혼합물을 90에서 5시간 동안 열처리하는 제 2단계와, 상술한 방법에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 투입하여 35에서 12시간동안 분해시키는 제 3단계와, 상기 제 3단계에서의 성분에서 원심분리를 통하여 이물질을 제거하는 제 4단계와, 상기 성분을 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 제 5단계와, 상기 정제된 성분을 농축시키는 제 6단계와, 상기 농축된 성분을 활성탄을 이용하여 정제하는 제 7단계와, 상기 성분을 필터를 이용하여 제균하는 제 8단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 콜라겐 분해효소의 제조방법 및 이를 이용한 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법에서는 다음과 같은 효과가 있다.
기존의 제조공정을 바꾸지 않고 효소를 통한 콜라겐 가수분해 공정에서 트리펩타이드 생산성이 높은 신규효소를 사용함으로써 간단하게 고함량 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 제조할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 양이온 이온수지를 이용한 분리 정제이다. A는 정제된 콜라겐 분해효소의 SDS-PAGE 분석결과이다 (M : protein size marker, conc : 농축 sample, wash : wash, E1~E5 : elution sample 1~5). B는 AKTA prime에서 버퍼의 농도별 변화에 따른 콜라겐 분해효소 정제를 peak으로 나타내고 있다 (화살표는 각각의 elution sample들에 대한 표시이다).
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 음이온 이온수지를 이용한 분리 정제이다. A는 정제된 콜라겐 분해효소의 SDS-PAGE 분석결과이다 (M : protein size marker, P1 : peak 1을 나타냈다). B는 AKTA prime에서 버퍼의 농도별 변화에 따른 콜라겐 분해효소 정제를 peak으로 나타내고 있다 (화살표는 각각의 elution sample에 대한 표시이다).
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 온도별 효소활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 시간에 따른 온도 안정성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 pH별 효소활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소와 일반 단백질 분해효소의 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교한 HPLC 데이터이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 생산하는 제조공정이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 생산된 제품의 콜라겐 트리펩타이드(CTP)함량을 분석한 HPLC 데이터이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 생산된 제품의 글리신-프롤린-하이드록시프롤린 함량을 분석한 HPLC 데이터이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 음이온 이온수지를 이용한 분리 정제이다. A는 정제된 콜라겐 분해효소의 SDS-PAGE 분석결과이다 (M : protein size marker, P1 : peak 1을 나타냈다). B는 AKTA prime에서 버퍼의 농도별 변화에 따른 콜라겐 분해효소 정제를 peak으로 나타내고 있다 (화살표는 각각의 elution sample에 대한 표시이다).
도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 온도별 효소활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 시간에 따른 온도 안정성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소의 pH별 효소활성 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소와 일반 단백질 분해효소의 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교한 HPLC 데이터이다.
도 7은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 생산하는 제조공정이다.
도 8은 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 생산된 제품의 콜라겐 트리펩타이드(CTP)함량을 분석한 HPLC 데이터이다.
도 9는 본 발명의 바람직한 실시예에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 이용하여 생산된 제품의 글리신-프롤린-하이드록시프롤린 함량을 분석한 HPLC 데이터이다.
이하, 본 발명에 의한 콜라겐 분해효소의 제조방법 및 이를 이용한 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법의 바람직한 실시예가 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
본 발명인 콜라겐 분해효소의 제조방법은, 바실러스 서브틸리스 균주를 원심분리하는 제 1단계와, 원심분리된 상등액을 농축시키는 제 2단계와, 이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 제 3단계를 포함하여 구성될 수 있다.
그리고, 본 발명의 다른 실시예인 콜라겐 분해효소를 이용한 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법은, 전처리된 어린을 물과 2:8의 중량비로 혼합하는 제 1단계(S10)와, 상기 혼합물을 90℃에서 5시간 동안 열처리하는 제 2단계(S20)와, 제 1항에 의해 제조되는 콜라겐 분해효소를 투입하여 35℃에서 12시간동안 분해시키는 제 3단계(S30)와, 상기 제 3단계에서의 성분에서 원심분리를 통하여 이물질을 제거하는 제 4단계(S40)와, 상기 성분을 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제하는 제 5단계(S50)와, 상기 정제된 성분을 농축시키는 제 6단계(S60)와, 상기 농축된 성분을 활성탄을 이용하여 정제하는 제 7단계(S70)와, 상기 성분을 필터를 이용하여 제균하는 제 8단계(S80)를 포함하여 구성될 수 있다.
먼저, 본 발명인 콜라겐 분해효소를 제조하는 과정에 대한 구체적인 실시예를 설명한다.
<실시예 1> 콜라겐 분해활성 보유 신균주 선별
GRAS(generally recognized as safe)균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 인체에 해가 없는 것으로 알려져 있으며, 다양한 단백질분해효소, 지질분해효소 및 당 전환효소를 생산할 수 있어 식품제조 및 사료첨가용으로 많이 사용되어 왔다. 또한 일부 바실러스 서브틸리스는 콜라겐 분해활성도 지니고 있는 것으로 보고된 바 있다 (Nagano H et al., Biosci Biotehnol Biochem, 2000년, 64(1):181-3; Tran LH et al., J Food Sci, 2002년, 67(3):1184-7). 본 발명에서는 콜라겐 분해활성을 가지고 있는 신규 바실러스 서브틸리스 유래의 콜라겐 분해효소를 분리하여, 콜라겐 분해공정에 적용하고자 시도하였다.
경상남도 진주지역 토양 샘플을 채취하여 토양 30 g을 270 ml의 멸균된 PBS 버퍼에 넣어서 부유화시킨 후 상온에 30분 정도 방치하여 굵은 토양입자 및 불순물 등을 바닥으로 침전시켜 제거하였다. 상등액 10 ml을 90 ml의 멸균된 PBS 버퍼에 충분히 섞어 100 ml을 제조하고, 다시 동일 작업을 계속 반복하여 3차, 4차, 5차 희석액 100 ml을 준비하였다.
준비된 3차, 4차, 5차 희석액 200 ml를 1% 탈지유(skim milk)와 1.5% 한천(agar)이 포함된 LB (1% bacto-tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양한 후에 투명환(clear zone)이 생기는 콜로니를 선별하였다. 선별된 균주들을 LB 액체배지 25℃에 30℃에서 180 rpm으로 24시간 배양한 후 상등액을 취하여 역가를 측정하였다. 역가 측정방법은 다음과 같다. 정제된 돈피를 버퍼 (50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 5 mM CaCl2)에 넣고 56℃에서 녹여 최종 2%의 기질 용액을 만들었다. 기질용액 150 ㎕을 30에서 15분간 pre-heating시킨 후, 효소 100 ㎕를 첨가하여 30℃에서 30분간 반응시켰다. 0.01 N HCl 500 ㎕넣어 효소반응을 중지시키고, 50 ㎕의 2% ninhydrin solution을 넣고 4분간 끓여준 뒤 570 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 효소 unit 값의 정의는 30℃에서 30분간 칼슘이온이 있는 pH 7.4 용액에서 기질과 반응시켰을 때 유리되는 1 μmol L-leucine의 값을 효소의 1 unit이라고 정의 하였다.
측정 결과 5개의 균주(#8, #9, #15, #60, #86)가 콜라겐 분해 활성을 강하게 나타냈다 (표 1). 가장 높은 5개 균주에 대해서 API50CHB 키트(bioMerieux사)을 통해 균주의 생리학적 특성을 분석하여 바실러스 균주인 것을 1종(#86) 선별하였다. 추가적으로 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석을 통해 균주를 동정하였다. 16S rRNA 염기서열 분석 결과 선별균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 99%이상의 상동성을 나타내었다. 이 균주를 바실러스 서브틸리스 BP(Bacillus subtilis BP)으로 명명하였으며, 생명공학연구원 유전자은행에 2015년 7월 13일자로 기탁하였다(수탁번호 KCTC 12866BP).
| Sample | U/ml | Sample | U/ml | Sample | U/ml | Sample | U/ml | Sample | U/ml |
| #1 | 0.51 | #64 | 0.16 | #156 | 1.24 | #232 | 0.57 | #465 | 0.76 |
| #3 | 0.12 | #71 | 0.68 | #158 | 0.98 | #240 | 0.67 | #474 | 1.08 |
| #8 | 4.65 | #86 | 3.41 | #161 | 0.21 | #261 | 0.43 | #568 | 0.60 |
| #9 | 2.90 | #103 | 0.57 | #166 | 0.43 | #263 | 0.38 | #577 | 0.71 |
| #10 | 0.56 | #110 | 0.69 | #169 | 1.42 | #265 | 0.28 | #592 | 0.54 |
| #15 | 2.60 | #115 | 0.45 | #173 | 0.67 | #274 | 1.21 | #603 | 0.31 |
| #36 | 0.55 | #117 | 0.32 | #176 | 0.53 | #394 | 0.89 | #615 | 0.37 |
| #38 | 0.1 | #133 | 0.31 | #201 | 0.45 | #439 | 0.74 | #702 | 0.29 |
| #51 | 0.21 | #140 | 0.86 | #204 | 0.31 | #450 | 0.12 | #716 | 0.51 |
| #60 | 2.92 | #142 | 0.12 | #209 | 0.13 | #463 | 0.36 | #773 | 0.43 |
<실시예 2> 신규 콜라겐 분해효소(BP)의 분리
바실러스 유래 콜라겐 분해효소(BP)의 분리정제를 시도하였다. 균주를 1000 ml의 mTB medium (yeast extract 2.4%, tryptone 1.2%, glycerol 1%, KH2PO4 2.31%, K2HPO4 12.54%)에 30℃에서 180 rpm으로 24시간동안 배양한 뒤 6500 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 나온 상등액을 조심스럽게 새로운 튜브에 옮긴 후 30 kDa filter를 이용하여 5배 농축 하였다. 농축한 상등액을 AKTA prime장치를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피법(ion exchange chromatography)으로 정제하였다.
이때 사용한 정제 조건은 A 버퍼 (50 mM Tris-HCl(pH 7.5))를 binding 버퍼로 사용하였고 B 버퍼 (50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.5 M NaCl)를 이용해 경사(gradient)를 주었다. 유속은 5 ml/min으로 흘려주었다. 정제는 양이온 교환 크로마토그래피와 음이온 교환 크로마토그래피법을 사용하였는데, 이온수지로는 양이온 수지인 SP sepharose resin(GE Healthcare, new-Jersey, USA)와 음이온 수지인 Q sepharose resin(GE Healthcare, new-Jersey, USA)을 각각 사용하였다.
처음 양이온 교환 크로마토그래피에서는 0.5 M NaCl로 경사(gradient)를 주고 각 분획(fraction)별로 정제단백질을 받았다. 도 1B에 나타난 바와 같이, 정제 프로파일에서 단백질 피트가 나타나는 분획(fraction) (E1~E5)의 단백질 정제도를 SDS-PAGE상에서 확인한 결과, E1, E2에서 목적효소로 예상되는 단백질이 포함되어 있었고, 특히, E1에 가장 많은 콜라겐 분해효소가 있는 것을 확인하였다(도 1A의 화살표 표시).
E1~E5의 NaCl농도는 E1: 0.1~0.2 M, E2: 0.2~0.3 M, E3: 0.3~0.4 M. E4: 0.4~0.5 M, E5: 0.5 M이기 때문에, 양이온 교환 크로마토그래피에서 목적효소를 분리할 수 있는 NaCl농도는 0.1~0.3 M인 것을 알 수 있었고 가장 좋게는 E1부분인 0.1~0.2 M의 NaCl 농도에서 목적효소의 회수율이 가장 좋은 것을 알 수 있었다. 다음으로는, E1을 음이온 교환 크로마토그래피법으로 정제하였다.
이때 사용된 버퍼는 0.25 M의 NaCl를 사용하였고 양이온교환 크로마토그래피와 동일하게 경사(gradient)를 주었다. 도 2B에 나타난 바와 같이 정제프로파일에서 음이온교환수지는 0.09~0.155 M의 NaCl에서 단백질 피크가 나타나는 것을 확인하였다(도 2B의 화살표 표시).
이 분획(fraction)의 정제도를 SDS-PAGE상에서 확인한 결과, 목적효소가 대부분 깨끗하게 정제된 것을 확인하였다(도 2A의 P1). 따라서 음이온 교환 크로마토그래피에서는 0.09~0.155 M의 NaCl에서 목적효소의 회수율이 가장 좋은 것을 알 수 있었다. 이후, 정제된 신규 콜라겐 분해효소는 BP로 명명하였다.
<실시예 3> BP의 효소반응 조건 실험
최적온도 실험으로 20~70℃의 온도에서 효소반응을 진행하여 역가를 측정하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 실험 결과 30~55℃에서 효소활성을 지니고 있으며, 특히 50℃에서 가장 높은 비활성(specific activity)과 상대적 활성(relative activity)을 보이고 60℃부터는 활성이 급격하게 떨어지는 것으로 확인되었다.
실제 대량생산에 적용하기 위한 온도 안정화 실험을 실시하였다. 온도는 30℃, 35℃, 40℃, 그리고 50℃로 맞추어 주었고 각각의 온도별 시료를 0시간부터 12시간까지 시간별로 sampling하여 각각의 잔존 활성을 확인하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 그 결과 온도가 낮을수록 효소의 안정화가 지속되는 것이 보였고, 35℃와 40℃에서는 12시간이 지나면 효소의 활성이 59.3%정도 남아 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 미루어 보아 현재 콜라겐 트리펩타이드의 생산 공정을 35로 셋팅하는 것이 바람직하였다.
다음으로, 최적 pH에서 대해서 알아보았다. 돈피 젤라틴 기질을 각각의 pH별로 만들어진 버퍼(50 mM citrate-Na2HPO4(pH 5.0~6.0), 50 mM Tris-HCl(pH 6.0~9.0), 50 mM Na2CO3-Na2HCO3(pH 9.0~10.0))에 녹인 뒤 효소의 활성을 측정하여 최적 pH를 확인하였다. BP는 pH 7.4에서 가장 높은 활성을 보였고 pH 6~10까지 중성대의 영역에서 높은 활성을 보였다. 그러나, 도 5에 도시된 바와 같이, 산성이나 염기성으로 갈수록 효소의 활성은 비슷하게 떨어지는 것이 확인되었다.
이하, 상술한 콜라겐 분해효소(BP)를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드를 제조하는 과정에 대해 설명한다.
<실시예 4> BP의 콜라겐 트리펩타이드 생산성 확인
전처리된 어린(물고기 비늘)을 교반기가 장착되어 있는 반응기에 어린과 물 의 중량비율을 20:80의 비율로 균일하게 혼합하여 약 90℃에서 5시간 열처리를 실시하여 각 4개의 시료를 준비하였다. 4개의 시료에 BP (제조사: 아미코젠), Alcalase 2.4L FG (제조사: 노보자임, 구입처: 바이오시스), Flavourzyme 1,000L (제조사: 노보자임, 구입처: 바이오시스), Collupμlin MG (제조사: 노보자임, 구입처: 대종상사)의 효소를 사용하여 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교하였다.
각 효소의 반응 조건(온도, pH, 효소사용량, 반응시간)는 다음과 같다.
- BP: 35℃, pH 7.4, 30 unit/g(어린), 12시간
- Alcalase 2.4L FG: 60℃, pH 7.0, 30 unit/g(어린), 12시간
- Flavourzyme 1,000L: 55℃, pH 6.0, 30 unit/g(어린), 12시간
- Collupμlin MG: 60℃, pH 7.0, 30 unit/g(어린), 12시간
효소처리 후, 80℃에서 30분간 열처리하여 효소를 실활하였다. 다음으로, 4가지 효소를 비교 분석하여 BP의 콜라겐 트리펩타이드 생상성을 확인하였다.
제조된 콜라겐 펩타이드 분석은 HPLC(gilson사)를 사용하였으며, SuperdexTM Peptide 10/300GL 컬럼, 이동상(10 mM Tris-Cl(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl2), 유속: 0.5 ml/min의 조건에서 콜라겐 트리펩타이드(collagen tripeptide, CTP)를 분석하였다. CTP의 표준물질로는 세 개의 아미노산으로 구성된 글리신-프롤린-하이드록시프롤린(glycine-proline-hydroxyproline, GPH)를 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 분석결과, CTP표준물질의 경우에는 약 55분대에서 피크가 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 4가지 효소의 분해활성을 비교한 결과, BP의 경우에는 피크가 대부분 늦은 시간에 나와 콜라겐이 저분자화 되었다는 것을 알 수 있었고, 표준물질에 동일한 시간대에서 커다란 피크가 보여, CTP의 함량이 높음을 알 수 있었다. Alcalase 2.4L FG는 다른 Flavourzyme 1000L,collupin MG에 비해 저분자 함량이 높았지만, CPT의 함량은 거의 없는 것으로 나타났다. 이 결과로 BP가 콜라겐 트리펩타이드 생산에 매우 효과적임을 알 수 있었다.
<실시예 5> BP를 이용한 고함량 콜라겐 트리펩타이드 제조공정 확립
고함량 콜라겐 트리펩타이드가 함유된 제품을 생산하기 위해 BP를 이용한 제조방법을 확립하였다. 전처리된 어린(생선 비늘)을 교반기가 장착되어 있는 반응기에 어린과 물의 중량비율을 20:80의 비율로 균일하게 혼합하여 약 90℃에서 5시간 열처리를 실시하였다.
열처리된 상기액을 35℃에서 10% NaOH를 투입하여 용액내 pH 7.4가 되도록 보정하였다. 보정된 상기액에 BP를 약 30 unit/g(어린) 투입 후 35℃에서 12시간동안 반응시켰다. 효소반응 후 80℃에서 30분간 열처리하여 효소를 실활하였다. 효소처리된 콜라겐 펩타이드액을 초고속 연속원심분리기를 이용하여 이물질을 제거한 후 이온칼럼정제 통해서 금속이온 등 이물질을 제거하였다.
상기의 액을 진공감압농축기를 이용하여 Brix 35%까지 농축 후 활성탄정제를 통해서 탈색, 탈취를 실시하였다. 활성탄정제액을 필터프레스 여과 및 정밀여과(membrane filtration)로 제균 후 분무건조기로 분말화하여 품질검사를 시행하였고 포장 단계를 거쳐 고함량 트리펩타이드를 제조하였다(도 7).
<비교예> : 일반 단백질분해효소를 이용한 고함량 콜라겐 트리펩타이드 제조
신규 BP를 이용한 제조공정과 비교를 위해 일반적으로 저분자 콜라겐 분해공정에 사용되는 Alcalase 2.4L FG (제조사: 노보자임, 구입처: 바이오시스)를 이용하여 콜라겐 트리펩타이드 생산성을 비교하였다. 전처리된 어린(생선 비늘)을 교반기가 장착되어 있는 반응기에 어린과 물의 중량비율을 20:80의 비율로 균일하게 혼합하여 약 90℃에서 5시간 열처리를 실시하였다.
열처리된 상기액을 55℃에서 10% NaOH를 투입하여 용액내 pH 7.5가 되도록 보정하였다. 보정된 상기액에 Alcalase효소를 약 30 unit/g(어린) 투입 후 35℃에서 12시간동안 처리하였다. 효소반응 후 80에서 30분간 열처리하여 효소를 실활하였다.
효소처리된 콜라겐 펩타이드액을 초고속 연속원심분리기를 이용하여 이물질을 제거한 후 이온칼럼정제 통해서 금속이온 등 이물질을 제거하였다. 상기의 액을 진공감압농축기를 이용하여 Brix 35%까지 농축 후 활성탄정제를 통해서 탈색, 탈취를 실시하였다. 활성탄정제액을 필터프레스 여과 및 정밀여과(membrane filtration)로 제균 후 분무건조기로 분말화하여 품질검사를 시행한 한 후 CTP함량과 GPH함량을 비교하였다.
CTP함량은 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 수행하였으며, GPH함량 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. HPLC(gilson사)를 사용하였으며, Jupiter 4u Proteo 90A컬럼, 이동상 10 mM Tris-Cl(pH 7.4), 5 mM CaCl2, 유속: 0.5 ml/min의 조건에서 GPH의 함량을 분석하였다. 시료는 BP 및 Alcalase를 사용하여 제조된 콜라겐 가수분해물과 일본 Jellice사에서 구입한 타사제품을 분석하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, CTP함량의 경우, BP를 사용하여 제조된 콜라겐 가수분해물에서 CTP 표준물질과 동일한 위치에서 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 타사제품에도 동일한 위치에 피크가 발생하였으나, BP시료에 비해 피크의 크기가 작아 함량이 적음을 알 수 있었다.
도 9에 나타난 바와 같이, GPH함량의 경우에도 CTP의 결과와 마찬가지로, Alcalase에서는 GPH의 피트가 나타나지 않았으며, 타사제품에 비해 BP시료의 피크가 커서 함량이 매우 높음을 알 수 있었다.
BP와 Alcalase를 이용하여 생산된 제품의 콜라겐 트리펩타이드(CTP) 함량을 정량적으로 비교한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, BP는 56%, Alcalase는 0%, 타사제품은 18.1%의 함량을 보유하고 있었으며, CTP의 표준물질인 글리신-프롤린-하이드록시프롤린(glycine-proline-hydroxyproline, GPH)의 경우에는, BP는 13.1%, Alcalase는 0%, 타사제품은 2.6% 함유하고 있었다. 이 결과는 BP를 사용하면 기존의 판매 중인 제품에 비해 콜라겐 트리펩타이드의 함량이 높은 콜라겐 가수분해물을 제조할 수 있음을 보여주고 있다.
| 효소 종류 | CTP함량(%) | GPH함량(%) |
| BP | 56.0 | 13.1 |
| Alcalase | 0 | 0 |
| 타사제품(일본) | 18.1 | 2.6 |
본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.
Claims (5)
- 바실러스 서브틸리스 균주를 원심분리하는 제 1단계;
원심분리된 상등액을 농축시키는 제 2단계 및
이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 제 3단계를 포함하여 구성되고,
상기 제 3단계의 이온교환크로마토그래피법은 이온수지를 SP sepharose 수지를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피와 이온수지를 Q sepharose 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피로 구분되며,
상기 양이온 교환 크로마토그래피에는 염화나트륨(NaCl)을 0.1 내지 0.2 M 농도로 사용하는 것을 특징으로 하고,
상기 음이온 교환 크로마토그래피에는 염화나트륨(NaCl)을 0.09 내지 0.155 M 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해효소의 제조방법 - 삭제
- 삭제
- 기탁번호 KCTC12866BP의 바실러스 서브틸리스 균주를 원심분리하는 제 1단계;
원심분리된 상등액을 농축시키는 제 2단계 및
이온교환 크로마토그래피법을 이용하여 정제하는 제 3단계를 포함하여 구성되고,
상기 제 3단계의 이온교환크로마토그래피법은 이온수지를 SP sepharose 수지를 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피와 이온수지를 Q sepharose 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피로 구분되며,
상기 양이온 교환 크로마토그래피에는 염화나트륨(NaCl)을 0.1 내지 0.2 M 농도로 사용하는 것을 특징으로 하고,
상기 음이온 교환 크로마토그래피에는 염화나트륨(NaCl)을 0.09 내지 0.155 M 농도로 사용하는 것을 특징으로 하는 콜라겐 분해효소를 이용하는 콜라겐 트리펩타이드의 제조방법.
- 삭제
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